專利名稱：結(jié)合cd40的apc激活分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一系列新型分子及單克隆抗體，它們通過表達(dá)在抗原呈遞細(xì)胞上的CD40受體結(jié)合并刺激抗原呈遞細(xì)胞。
近來，據(jù)信完全激活CTL需要一種輔助性T細(xì)胞，它可以與CTL識別相同APC上的相同抗原。特異的輔助性T細(xì)胞一經(jīng)激活，就產(chǎn)生激活CTL需要的細(xì)胞因子，如IL-2。然而，Guerder和Matzinger(J.Exp.Med.176553(1992))提出了CTL激活的“許可(Licensing)”模型。在此模型中提示，當(dāng)輔助性T細(xì)胞識別專用的APC表面的抗原時，它就會傳遞激活信號給APC，從而激活CTL，而不再需要輔助性T細(xì)胞的參與。最近，許可模型的分子機理已經(jīng)清楚。Schoenberger等(Nature 393480(1998))表明，CD40L-CD40通路在許可模型中起著關(guān)鍵作用。樹突狀細(xì)胞(DC)對輔助性T細(xì)胞的激活引起CD40L表達(dá)的上調(diào)，從而提供通過觸發(fā)DC上的CD40分子使DC能激發(fā)CTL的信號。
DC循環(huán)并駐留在機體組織及抗原沉積或引入位點。當(dāng)攝入抗原后，它們遷移到引流(draining)淋巴結(jié)，在此將抗原呈遞給T細(xì)胞。眾所周知，必須將DC激活以發(fā)揮最佳功能。靜息DC僅表達(dá)低水平的MHC和共刺激分子，它只是T細(xì)胞較弱的刺激因子。DC可被炎性細(xì)胞因子和細(xì)菌產(chǎn)物所激活，引起MHC和共刺激分子的上調(diào)。因此，當(dāng)在炎癥條件下遇到抗原的DC到達(dá)引流淋巴結(jié)時很容易激活輔助性T細(xì)胞。因此，將抗原攝取位點的炎性細(xì)胞因子與輔助性T細(xì)胞相互作用期間的CD40L-CD40相互作用相結(jié)合，就有可能最佳地發(fā)揮DC激活CTL的能力。CD40分子和TNF受體家族CD40分子屬于I型跨膜蛋白的TNF受體家族。這個基因家族的成員(包括TNF的兩個受體、低親和力的神經(jīng)生長因子受體和T細(xì)胞激活抗原CD27，CD30，及CD95等)的特征是在富含半胱氨酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域具有序列同源性(Armitage et al.，Current Opinion inImmunology 6407(1994))。TNF受體家族成員的已知配體也具有同源性。盡管TNF-α為可溶性細(xì)胞因子，它最初合成為膜相關(guān)分子。大多數(shù)TNF/CD40L受體和TNF/CD40家族成員屬于II型跨膜蛋白，包括hTNF-α，hLT，hLT-β，hCD40L，hCD27L，hCD30L，cfECP1，myx VRh，mCD30，hCD27，hFas，m4-1BB，rOX-40，hTNFR-h，hTNFR-II，hTNFR-1及hLNGFR。CD40在B細(xì)胞激活方面的功能是最眾所周知的。CD40分子在所有B細(xì)胞中組成性表達(dá)。CD40L-CD40相互作用能刺激純化B細(xì)胞增殖，如果同時使用細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)免疫球蛋白產(chǎn)生。最近的研究表明，CD40分子的分布并不象最初估計的那樣受到限制。新鮮分離的人單核細(xì)胞表達(dá)低水平的CD40，IFN-α存在時對其進(jìn)行培養(yǎng)，使CD40的表達(dá)上調(diào)(Alderson et al.，J.Exp.Med.178669(1993))。通過CD40刺激單核細(xì)胞能引起促炎細(xì)胞因子如IL-1和TNF-α及有毒的自由基中間體如一氧化氮的分泌并引起B(yǎng)7共刺激分子的上調(diào)。從人外周血分離的DC也能表達(dá)CD40分子(Caux et al.，J.Exp.Med.180263(1994))。當(dāng)體外培養(yǎng)的DC表面結(jié)合有CD40分子時，將大大增強其存活能力。正如單核細(xì)胞一樣，用CD40刺激DC也會引起促炎細(xì)胞因子如IL-12和TNF-α的分泌及CD80/86共刺激分子的上調(diào)。此外，最近表明CD40的激活能夠刺激殺傷T細(xì)胞的激活(Schoenberger et al.，Nature393480(1998))。因此將CD40分子和其配體結(jié)合，如和抗體結(jié)合而激活CD40，將誘導(dǎo)許多體液和細(xì)胞毒性效應(yīng)，在抑制腫瘤方面具有重要作用。
本發(fā)明包括這些分子，它們能結(jié)合并激活專用的和非專用的抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)的CD40。這些激動劑分子，在和細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，引起表達(dá)CD40的抗原呈遞細(xì)胞的激活。本發(fā)明所涉及的分子包括單克隆抗體及其片段、肽、寡核苷酸及其他的化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明也包括誘導(dǎo)表達(dá)抗CD40抗體表達(dá)的肽和基因。
這些分子能夠以組合、雙特異性或多價的形式進(jìn)行使用，正如雙特異性抗體一樣，既可與相同細(xì)胞上的CD40交聯(lián)，也可與不同細(xì)胞上的CD40交聯(lián)。通過這樣的交聯(lián)產(chǎn)生協(xié)同或加和激動效應(yīng)。
圖2表明用抗CD40單克隆抗體(克隆7、15、21、48、64和70)誘導(dǎo)單核細(xì)胞衍生的DC的成熟。將單核細(xì)胞衍生的未成熟樹突狀細(xì)胞在有抗CD40單克隆抗體或同種型匹配的對照抗體的情況下培養(yǎng)兩天，用FACS分析法研究其CD80、CD83及CD86表達(dá)的上調(diào)以及甘露糖受體表達(dá)的下調(diào)。圖中列出了一個典型實驗的數(shù)據(jù)CD80(圖2a)、CD86(圖2c)及甘露糖受體(圖2d)的表達(dá)以平均熒光強度表示，而對成熟的樹突狀細(xì)胞而言，CD83的表達(dá)以表達(dá)這個標(biāo)記的細(xì)胞的百分比表示(圖2b)。
圖3表明用CD40激動劑抗體和INF-γ刺激單核細(xì)胞衍生的DC后，誘導(dǎo)IL-12p70的分泌。單核細(xì)胞衍生的未成熟DC在抗CD40單克隆抗體或同種型對照抗體單獨使用或與INF-γ結(jié)合使用的情況下培養(yǎng)兩天。結(jié)果表明，IL-12p70的產(chǎn)生要求結(jié)合使用兩種不同的刺激物。
圖4表明，如果用CD-40 Fc片段預(yù)先溫育，CD40激動劑抗體和INF-γ誘導(dǎo)的IL-12p70產(chǎn)生將受到阻礙。用過量的CD40-Fc片段和CD40激動劑抗體進(jìn)行預(yù)先溫育，將消除抗CD40單克隆抗體和IFN-g的結(jié)合誘導(dǎo)單核細(xì)胞衍生的DC中IL-12產(chǎn)生的能力。
圖5表明CD40激動劑單克隆抗體促使DC增強誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的能力。單核細(xì)胞衍生的DC要么是未刺激的，要么在有或無INF-γ時用CD40激動劑抗體預(yù)先激活，然后，在CD8+T細(xì)胞識別的具顯性HLA-A2限制性表位的流感基質(zhì)肽存在的情況下，和純化的自體CD8+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。通過分析流感肽特異的CD8+T細(xì)胞的擴增(圖5a)和產(chǎn)生INF-γ的CD8+T細(xì)胞的增加(圖5b)研究CD40激活的DC對CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)情況。
發(fā)明詳述本發(fā)明所描述和要求專利保護(hù)的分子包括單克隆抗體及其片段、肽和其他的化學(xué)物質(zhì)。單克隆抗體的制備方法是用常規(guī)的方法免疫哺乳動物，分離產(chǎn)生所需單克隆抗體的B細(xì)胞并和骨髓瘤細(xì)胞融合。優(yōu)選的單克隆抗體包括嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、DeimmuizedTM抗體、單鏈抗體和抗體片段，包括Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v及其他一些保留了親本抗體的抗原結(jié)合能力的片段。有關(guān)單鏈抗體(“ScFv”)及其構(gòu)建方法見美國專利4,946,778號。
用本領(lǐng)域所熟知的重組方法制備嵌合抗體，其包括動物的可變區(qū)和人的恒定區(qū)。人源化抗體比嵌合抗體更接近于人的抗體序列，其中只有負(fù)責(zé)抗原結(jié)合和特異性的互補決定區(qū)(CDRs)是非人源的，因而具有相應(yīng)于非人源抗體的氨基酸序列，而人源化抗體的其他部分(除了在某些情況下，可變區(qū)的少部分骨架區(qū)除外)基本上都是人源的，具有相應(yīng)于人抗體的氨基酸序列。見L.Riechmann et al.，Nature332323-327 1988；美國專利5,225,539(Medical Research Council)；美國專利5,585,089；5,693,761；5,693,762(Protein Design Labs，Inc.)。
可用幾種不同的方法制備人抗體，包括用人免疫球蛋白表達(dá)庫(Stratagene Corp.，La Jolla，California；Cambridge AntibodyTechnology Ltd.，London，England)產(chǎn)生人抗體片段(VH，VL，F(xiàn)v，F(xiàn)d，F(xiàn)ab或(Fab)2)，用類似于制備嵌合抗體的技術(shù)，將這些片段的適當(dāng)部分融合起來，由此構(gòu)建出整個人抗體。人抗體也可用人免疫球蛋白基因組在轉(zhuǎn)基因鼠中產(chǎn)生。轉(zhuǎn)基因鼠可從如下公司買到，如Abgenix，Inc.，F(xiàn)remont，California和Medarex，Inc.，Annandale，New Jersey。除了將重鏈和輕鏈Fv區(qū)連接構(gòu)建單鏈抗體外，也可用類似的方法構(gòu)建和表達(dá)Fab片段(M.J.Evans et al.，J.Immunol.Meth.，184123-138 1995)。
DeImmunizedTM抗體是指除去了潛在的T細(xì)胞表位的抗體，如國際專利申請PCT/GB98/01473所描述。因此，當(dāng)它們用于人體時，其免疫原性將完全消除或大大降低。
以上所述的所有完全或部分人抗體將同抗體片段和單鏈抗體一樣，比完全鼠抗體或非人源抗體具有更低的免疫原性。因此，所有這些分子(或其衍生物)將很少可能引起人的免疫反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)。它們比完全非人抗體更適合對人體內(nèi)給藥，特別是重復(fù)和長期給藥，如對治療牛皮癬和其他炎癥性皮膚病等可能都是必須的。
雙特異性抗體可用于相同或不同細(xì)胞上CD40分子間的交聯(lián)劑。這些雙特異性抗體具有對CD40分子上兩個不同表位的每一個的特異性。一個特異性是sCD40L與CD40結(jié)合的強激活劑，而另一特異性是sCD40L與CD40結(jié)合的部分或非抑制劑，從而對交聯(lián)產(chǎn)生協(xié)同的激動效應(yīng)。
這些抗體及制備抗體的方法公開于美國專利5,534,254(Creative Biomolecules，Inc.)。本專利所描述的雙特異性抗體的不同實施方案包括將單鏈Fv和肽偶聯(lián)劑連接，偶聯(lián)劑包括Ser-Cys，(Gly)4-Cys，(His)6-(Gly)4-Cys，螯合劑，以及包括雙馬來酰亞氨基己烷和雙馬來酰亞氨基己酰的化學(xué)或二硫橋連接。
非抗體分子可用常規(guī)的方法從化合物庫中分離和篩選得到。用來產(chǎn)生和篩選化合物庫的自動系統(tǒng)請參考美國專利5,901,069和5,463,564。一個更精確的方法是結(jié)合位點的三維結(jié)構(gòu)模擬，然后構(gòu)建適合該模型的分子家族。然后從這個分子家族中篩選出具有最佳結(jié)合特性的分子。
另外一種方法是構(gòu)建重組肽庫，從肽庫中篩選能和感興趣的CD40表位結(jié)合的分子。見美國專利5,723,322。該表位和實施例中所描述的單克隆抗體結(jié)合的表位相同。實際上，一旦表位已知，根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)是相對容易制備和分離這些分子的。
另一種方法是誘導(dǎo)所需抗CD40抗體的內(nèi)源性產(chǎn)生，主要是通過給予能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的肽或抗體，或者通過基因治療的方法，給予能編碼合適的抗CD40抗體分子及其片段的基因。有關(guān)制備和引入這些分子的方法是本領(lǐng)域公知的。
這些分子的給藥途徑有很多。如果是肽或抗體，容易在胃腸道被降解，應(yīng)優(yōu)選注射的方式。本發(fā)明的其他化合物，也可用注射的方式給藥。注射方式包括肌肉、血管及皮下注射。
本發(fā)明的非肽分子也可口服，包括混懸液，藥片等。液體制劑可通過吸入凍干或氣溶膠化的微膠囊的方式給藥。也可用栓劑的方式給藥。
可使用控制本發(fā)明的分子發(fā)揮作用持續(xù)時間的其他藥物載體。具體的制備方法是，在膠體藥物遞送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒及納米膠囊)或乳液中，用凝聚技術(shù)或界面聚合(羥甲基纖維素或明膠微膠囊)的方式，將分子包入微膠囊中。
賦形劑，例如鹽、各種填充劑、其它緩沖劑、螯合劑、抗氧化劑、共溶劑等都可包括在最終的制劑之中。特殊的例子包括三-(羥甲基)氨基甲烷鹽(“Tris緩沖液”)和依地酸鈉。
制劑的劑量和給藥方案可用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)程序測定。該程序包括從動物模型外推一個估計的劑量方案，然后在對人的臨床劑量范圍研究中確定最佳劑量。
本發(fā)明分子的實施例如下制備和使用激動性單克隆抗體A.材料和方法下面所要列舉的實施例中，用了以下一些實驗方法，見實施例中。細(xì)胞系和培養(yǎng)條件將EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系JY和骨髓源細(xì)胞系THP1培養(yǎng)在裝有IMDM(Iscove’s改良Dulbecco’s培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的T75培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基中補加有50μg/ml慶大霉素和2％熱滅活的胎牛血清(FCSi；BioWhittaker，Verviers，Belgium)。將細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，含5％CO2的濕化孵育箱中，一周分瓶一到兩次(1/20~1/100)。貯存細(xì)胞系時，使安瓿中每毫升HBSS(Hank’s平衡鹽溶液)中含5-10×106個細(xì)胞，HBSS中補加有20％FCSi和10％DMSO，并貯于液氮中。外周血單核細(xì)胞的分離和貯存外周血單核細(xì)胞(PBMC)是通過LymphoprepTM(1.077g/ml)密度離心及重懸在無Ca2+/Mg2+的PBS-0.1％BSA溶液中，從健康供血者血沉?xí)r的棕黃層中分離出來的。將自體外周血單核細(xì)胞保存在補加有2mM L-谷氨酰胺，10％FCSi，50μg/ml慶大霉素和10％DMSO的1640培養(yǎng)基中，貯于-196℃(CD8 T細(xì)胞的純化見下文)。單核細(xì)胞富集和單核細(xì)胞衍生的未成熟DC的產(chǎn)生通過免疫磁珠分離從PBMC中純化單核細(xì)胞(富集單核細(xì)胞所用的混合物包括抗CD2、CD3、CD16、CD19、CD56、CD66b及血型糖蛋白A的單克隆抗體，StemSepTM來自StemCell Technologies，Vancouver，Canada)。將除去了嗜中性粒細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的單核細(xì)胞(＞90％CD14+)制備物培養(yǎng)在無血清的培養(yǎng)基-StemSpan(StemCell Technologies)中，培養(yǎng)基中補加有10ng/ml GM-CSF和20ng/ml IL-4(兩種細(xì)胞因子來自PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)，在37℃/5％CO2培養(yǎng)6-7天。以1×106/2m/10cm2的密度將單核細(xì)胞接種于聚苯乙烯板上(覆蓋有12mg/ml/10cm2聚丙烯酸羥乙基酯)，在第二天和第五天分別加入新鮮的GM-CSF/IL-4。6-7天以后，收集非粘連細(xì)胞(具樹突狀)，顯示出以下的表型分布(用流式細(xì)胞儀檢測)CD1a+，CD14-，CD40+，CD80+，CD83-，CD86+，HLA-DR+及甘露糖受體++。CD8 T淋巴細(xì)胞分離將自體外周血單核細(xì)胞解凍，用免疫磁珠除去其它細(xì)胞，將CD8 T淋巴細(xì)胞純化(CD8富集混合物含有抗CD4、CD14、CD16、CD56及血型糖蛋白A的單克隆抗體；StemCell Technologies)。通過此純化步驟后，得到了純度＞90％的CD3+/CD8+淋巴細(xì)胞，其中不含單核細(xì)胞、噬中性粒細(xì)胞、血小板、B和CD4淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞(0.1×106cells/100μl PBS-0.1％BSA/樣品)和偶聯(lián)的(與異硫氰酸熒光素藻紅素或多甲藻黃素葉綠素蛋白偶聯(lián))單克隆抗體(Becton &Dickinson，Woerden，The Netherlands)一起溫育，在21℃溫育15分鐘，然后在PBS-0.1％BSA中徹底洗滌，并在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析(FACSCaliburTM；Becton & Dickinson，Woerden，TheNetherlands).JY細(xì)胞上CD40配體和抗-CD40單克隆抗體的競爭目前，已用表達(dá)高水平CD40的JY細(xì)胞證明了抗-CD40單克隆抗體(Mabs)對可溶性CD40配體(sCD40L)結(jié)合的阻斷。這些細(xì)胞預(yù)先和抗-CD40單克隆抗體在21℃溫育15分鐘，然后徹底用PBS-0.1％BSA洗滌，再和可溶性融合蛋白在21℃溫育15分鐘，此可溶性融合蛋白由融合于鼠CD8α(CD40L-mCD8α來自Kordia，Leiden，TheNetherlands and Tanox Phama BV，Amsterdam，The Netherlands)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的人CD40L細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域組成。隨后，用偶聯(lián)到藻紅素的大鼠抗小鼠CD8α的抗體檢測CD40L-mCD8α，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
將精確鑒定的單克隆抗體作為對照進(jìn)行溫育，M2和G28-5競爭CD40L結(jié)合位點，5C3結(jié)合于和CD40L結(jié)合位點不同的區(qū)域。EA-5部分抑制CD40L對其受體的結(jié)合(Pound et al.，Int Immunol 1999，11，p11-20)。CD40-Fc(IgG4)抑制抗CD40單克隆抗體與膜CD40L的結(jié)合激活的CD4+T細(xì)胞被用作膜CD40L的來源。為此，通過在IMDM+5％人混合AB型血清中在PMA和離子霉素存在下培養(yǎng)塑性非粘連外周血單核細(xì)胞6小時以誘導(dǎo)T細(xì)胞，使其表達(dá)CD40L。直接將飽和劑量的CD40-Fc(IgG4由Tanox Inc Houston USA生產(chǎn))加入激活的T細(xì)胞中，或者將CD40-Fc和過量的抗-CD40單克隆抗體預(yù)先溫育后加到激活的T細(xì)胞中。當(dāng)用PE偶聯(lián)的山羊抗人IgG-Fc、FITC偶聯(lián)的CD3和PERCP偶聯(lián)的CD8后染色，用FACS分析法檢測CD40-Fc與CD40L激活的CD4+(CD3+CD8-)T細(xì)胞的結(jié)合。CD40的ELISA分析用0.5μg/ml山羊抗人IgG(Fc)包被ELISA板(Immunon 2)，50μl/孔，室溫過夜。接著，用1％BLOTTO在室溫處理60分鐘。用PBS/Tween洗滌四次后，每孔加入50μl CD40-Fc和50μl融合孔上清，室溫溫育1小時。用PBS/Tween洗滌四次，加入50μl山羊抗小鼠IgG(Fc)-HRP偶聯(lián)物，溫育1小時。洗滌四次后，將底物TMB加入已溫育30分鐘的ELISA板中，每孔100μl。每孔加入50μl 0.2M H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀監(jiān)測在450/590nm處的讀數(shù)。THP-1測定THP-1細(xì)胞的刺激在有5×102U/ml IFN-g存在時，將3×106個THP-1細(xì)胞在10mlIMDM+2％人AB型血清中培養(yǎng)兩天。然后將IFN-g處理過的THP-1細(xì)胞用IMDM+2％人AB型血清洗滌一次。向96孔板每孔的104個THP-1細(xì)胞中加入120μl用雜交瘤培養(yǎng)上清按1∶2稀釋的培養(yǎng)基，培養(yǎng)兩天。以最大量40μg/ml及2×稀釋度的CD154-mCD8及最大量20ng/ml及2×稀釋度的LPS作為對照。IL-8的測定用5μg/ml小鼠抗人IL-8抗體(Serotec)包被ELISA板，每孔100μl，在ELISA板搖床上，室溫振蕩2小時。用1％BLOTTO溫育ELISA板，室溫振蕩1小時。用PBS/Tween洗滌四次后，將從THP-1板收集到的80μl上清液加入ELISA板中。IL-8標(biāo)準(zhǔn)液的制備如下用1％BLOTTO將IL-8稀釋到1000pg/ml，300pg/ml，100pg/ml，30pg/ml，3pg/ml，1pg/ml。將ELISA板在室溫振蕩溫育1小時。用PBS/Tween洗滌四次后，每孔加入100μl用1％BLOTTO按1∶1000稀釋的小鼠抗IL-8的生物素偶聯(lián)物(Serotec)，室溫溫育1小時。用PBS/Tween洗滌四次，每孔加入100μl用1％BLOTTO按1∶1000稀釋的AMDXSA-HRP，室溫振蕩溫育1小時。用PBS/Tween洗滌四次，每孔加入100μlTMB底物，在室溫振蕩溫育30分鐘。每孔加入50μl 0.2M H2SO4，以終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測在450/590nm處的讀數(shù)。成熟DC的誘導(dǎo)將未成熟的DC(見上文)在有抗CD40單克隆抗體的無血清培養(yǎng)基(StemSpanTM)中，37℃/5％CO2下培養(yǎng)48小時。另外，將CD40L-mCD8α，LPS以及IL-1β和TNF-α的結(jié)合作為DC成熟的對照。DC從未成熟到成熟的改變由以下因素確定(1)表型(CD1a+，CD14-，CD40+++，CD80+++，CD83+，CD86+++，HLA-DR+++，甘露糖受體-)，(2)IL-12p70的產(chǎn)生(商用試劑盒)，和(3)誘導(dǎo)對流感基質(zhì)肽(influenza-matrix peptide)特異的自體細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞的能力(見下文)。IL-12p70的ELISA分析在有抗CD40單克隆抗體(1μg/ml)，有或無IFN-g(1000U/ml)的情況下，將未成熟DC培養(yǎng)48小時，用商用試劑盒(來自DiacloneResearch，Becanson，F(xiàn)rance)測定培養(yǎng)物的上清，以檢測所分泌的IL-12p70。將抗CD40單克隆抗體和10倍過量的CD40-Fc(IgG4來自Tanox Inc Houston USA)在室溫預(yù)先溫育15分鐘，可抑制IL-12的產(chǎn)生。用成熟DC誘導(dǎo)細(xì)胞毒CD8+T淋巴細(xì)胞向激動性抗CD40單抗誘導(dǎo)產(chǎn)生的成熟DC加入合成流感基質(zhì)肽(Flu-peptide58-66)；(1×106DC/流感基質(zhì)肽5μg/ml StemSpanTM)并與0.5×106個純化的自體CD8+T淋巴細(xì)胞在37℃/5％CO2中共培養(yǎng)7天。CD8+T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性由以下的方法測定(1)計算產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞的數(shù)量，以此表示激活的CTL(用來自MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，Germany公司的IFN-γ消除試劑盒，用流式細(xì)胞術(shù)測定)，和(2)用一種常規(guī)的測定方法測定CTL對攜帶有流感基質(zhì)肽的靶細(xì)胞的裂解。
第二種免疫方案是用2.5×106個單核細(xì)胞衍生的未成熟DC注入BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)。在第14，33和35天時，用來自不同供體的單核細(xì)胞衍生的DC對小鼠進(jìn)行加強注射。在大約第100-120天，分離脾細(xì)胞，用上述的方法與鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。用ELISA法篩選含有生長中的雜交瘤的加樣孔上清液，以檢測CD40結(jié)合抗體的存在。繼續(xù)篩選含有CD40結(jié)合抗體的雜交瘤上清液以測定潛在的激動劑活性，這和用表達(dá)CD40的SF-9細(xì)胞免疫BALB/c小鼠，并從免疫小鼠分離B細(xì)胞制備雜交瘤一樣。
許多雜交瘤細(xì)胞系已經(jīng)被克隆，從這些克隆產(chǎn)生的單克隆抗體已在THP-1分析中進(jìn)行了檢測。大多數(shù)(但不是所有的)克隆保留了相應(yīng)母代細(xì)胞系的活性模式(數(shù)據(jù)未列出)。實施例3測定CD40反應(yīng)性抗體克隆促使未成熟DC的成熟、IL-12p70產(chǎn)生及激發(fā)CTL活化的能力與GM-CSF和IL-4一起培養(yǎng)后的單核細(xì)胞衍生的DC代表未成熟的DC。已經(jīng)測定了抗-CD40單克隆抗體對誘導(dǎo)表達(dá)CD40的未成熟DC成熟的能力。其他一些研究人員的試驗也表明，用sCD40L刺激單核細(xì)胞衍生的DC能促使其分化為具有成熟表型的DC。而且，將sCD40L和IFN-γ結(jié)合使用，可刺激單核細(xì)胞衍生的DC分泌IL-12p70。和未成熟DC相比，成熟DC表達(dá)CD83。另外，和未成熟的DC相比，成熟的DC表現(xiàn)出基于每個細(xì)胞的共刺激分子CD80和CD86表達(dá)的增強，甘露糖受體表達(dá)降低，以及喪失了有效攝取分子的能力(正如葡聚糖-FITC所示)。首先，通過FACS-分析監(jiān)測伴隨未成熟DC分化為成熟DC的表型改變，以此顯示抗-CD40單克隆抗體對DC成熟過程的誘導(dǎo)。首先將抗體獨立地用于刺激單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞。如

圖1(表明CD83上調(diào)及甘露糖受體下調(diào)的幾個實驗的綜合結(jié)果)和圖2(一個表示誘導(dǎo)CD80，CD83，及CD86表達(dá)的典型實驗)所示，通過檢測結(jié)合CD40的抗體，發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)單核細(xì)胞衍生的DC的表型成熟，這正如表達(dá)CD83標(biāo)記分子的細(xì)胞百分比的增加，基于每個細(xì)胞的CD80和CD86表達(dá)的增加(平均熒光強度，MFI)以及甘露糖受體表達(dá)的降低所顯示的那樣。顯然，在THP-1細(xì)胞中，一些不能誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8的克隆能夠誘導(dǎo)DC的成熟，這表明在表達(dá)CD40的不同細(xì)胞類型中，CD40單克隆抗體的激動特性是不同的(數(shù)據(jù)未列出)。
另外，通過用CD40單克隆抗體和IFN-γ刺激單核細(xì)胞衍生的DC后，檢測其產(chǎn)生IL-12p70的情況，這是因為要求用至少兩種不同的途徑誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞，使其產(chǎn)生IL-12p70(Kalinski et al Blood 1997901926)。我們的實驗結(jié)果表明，除了誘導(dǎo)表型成熟外，CD40激動劑抗體和IFN-γ一起使用，還可誘導(dǎo)DC產(chǎn)生IL-12(圖3)。我們發(fā)現(xiàn)CD40單克隆抗體和過量的CD40-Fc一起預(yù)先溫育會抑制IL-12產(chǎn)生的誘導(dǎo)，表明抗體的激動作用是通過CD40發(fā)揮作用，而不是通過DC上其它的膜表達(dá)分子發(fā)揮作用的(圖4)。
在小鼠中，T細(xì)胞輔助CTL是通過CD40激活的DC介導(dǎo)的。輔助性T細(xì)胞和DC間的抗原依賴性相互作用不僅引起輔助性T細(xì)胞的激活，而且通過CD40L-CD40相互作用引起DC的激活。只有在激活階段，DC才能激發(fā)CTL應(yīng)答。在沒有輔助性細(xì)胞的情況下，沒有DC的激活，因此也就沒有激發(fā)CTL應(yīng)答。然而，通過用一種抗小鼠CD40刺激性抗體進(jìn)行體內(nèi)給藥，可以有效地繞過輔助性T細(xì)胞而直接將DC激活。
為了將CTL激活的同樣機理應(yīng)用于人類，進(jìn)行了一項體外研究。在這個研究中，用一個由純化的人CD8+T細(xì)胞、作為抗原呈遞細(xì)胞的單核細(xì)胞衍生的DC、以及作為抗原且來源于流感病毒基質(zhì)蛋白的最小肽組成的共培養(yǎng)體系來研究CTL激活。這個肽組成了一個顯性HLA-A2限制的CTL表位。進(jìn)行此實驗的目的是確定抗-CD40單克隆抗體是否能使單核細(xì)胞衍生的DC具有比未處理的對照DC更強的刺激CTL應(yīng)答的能力。在這個實驗中，通過測量激活的CTL產(chǎn)生的IFN-Y及用PE偶聯(lián)的HLA-A2/流感基質(zhì)肽四聚體對CTL擴增進(jìn)行計數(shù)，來分析CTL的激活。如圖5a和圖5b所示，用CD40單克隆抗體刺激單核細(xì)胞衍生的DC會導(dǎo)致這些細(xì)胞誘導(dǎo)流感肽指導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答能力的增加。除了單克隆抗體外，對于大多數(shù)抗體，當(dāng)IFN-γ用于樹突狀細(xì)胞的預(yù)激活時，都會使此效應(yīng)增強。
同檢測DC成熟的實驗相似，關(guān)于抗CD40抗體樣品單獨或與sCD40L一起使用時激活CTL的效果，有待在將來的實驗中作進(jìn)一步的評價。由于來自DC更有效的刺激，預(yù)計對CTL激活的協(xié)同效應(yīng)也會發(fā)生在與成熟測定所使用的相同的sCD40L和單克隆抗體的組合之間。同樣，在CTL激活時，兩個不同的抗CD40的抗體間也發(fā)生協(xié)同效應(yīng)。
以上描述和實施例只是舉例說明，而不是限定范圍。本發(fā)明應(yīng)由其后所附的權(quán)利要求所明確說明，并包括此權(quán)利要求主題的所有等同的，已知的和未知的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.能結(jié)合和刺激專用或非專用的人APCs的激動劑抗CD40分子。
2.權(quán)利要求1的激動劑抗CD40分子，其中專用的人APCs為人樹突狀細(xì)胞。
3.增強CD40L對CD40陽性細(xì)胞刺激作用的激動劑抗CD40分子。
4.誘導(dǎo)單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞表型和功能成熟的激動劑抗CD40分子。
5.權(quán)利要求1、2、3或4的激動劑抗CD40分子，其中所述分子能和CD40L同時結(jié)合到CD40，這由它們不能抑制CD40L結(jié)合CD40或不能抑制sCD40結(jié)合CD40L所確定。
6.權(quán)利要求1、2、3或4的激動劑抗CD40分子，它完全抑制CD40L結(jié)合CD40。
7.一種組合物，其中含有根據(jù)權(quán)利要求1～5中任何一項的激動劑抗CD40分子的組合。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中包含至少一種激動劑抗CD40分子，它是sCD40L結(jié)合CD40的強激活劑，和至少一種激動劑抗CD40分子，它是sCD40L結(jié)合CD40及sCD40結(jié)合CD40L的部分抑制劑或非抑制劑。
9.權(quán)利要求1～6中任何一項的激動劑抗CD40分子，它們是單克隆抗體。
10.一種雙特異性的激動劑抗CD40分子，其中每種特異性針對CD40上的不同表位。
11.權(quán)利要求10的雙特異性單克隆抗體，其中一種特異性是sCD40L結(jié)合CD40的強激活劑，另一種特異性是sCD40L結(jié)合CD40的部分或非抑制劑。
12.權(quán)利要求9的單克隆抗體，它們是嵌合的、人源化的、DeimmunisedTM或人單克隆抗體。
13.權(quán)利要求12的單克隆抗體或其片斷、類似物或同源物、或與這些抗體結(jié)合到相同表位的肽、寡核苷酸、肽模擬物或有機化合物。
14.權(quán)利要求13的片段，它們是Fab，F(xiàn)(ab’)2Fv或單鏈Fv。
15.產(chǎn)生權(quán)利要求9的單克隆抗體或其片段的細(xì)胞系。
16.產(chǎn)生權(quán)利要求12的單克隆抗體或其片段的細(xì)胞系。
17.編碼權(quán)利要求12中任一分子的基因構(gòu)建體。
18.編碼權(quán)利要求13中任一分子的基因構(gòu)建體。
19.用權(quán)利要求17的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。
20.用權(quán)利要求18的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開抗CD40分子的激動劑，包括單克隆抗體，這些激動劑能結(jié)合并刺激專用的和非專用的人抗原呈遞細(xì)胞(“APCs”)，增強CD40L對CD40陽性細(xì)胞的刺激效果和/或誘導(dǎo)單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞的表型成熟。本發(fā)明提供幾種這樣的單克隆抗體，產(chǎn)生這些單克隆抗體的細(xì)胞系已經(jīng)保存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心。
文檔編號A61K38/00GK1443077SQ01807245
公開日2003年9月17日 申請日期2001年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月1日
發(fā)明者D·托馬斯, M·德博爾, P·C·J·M·雷斯, P·J·西蒙斯 申請人:泰諾士公司