專利名稱：一種快速檢測發(fā)酵液琥珀酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及琥珀酸發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體地，涉及一種基于琥珀酸與硫酸銅顯色反應(yīng)快速檢測發(fā)酵液中琥珀酸含量的方法。
背景技術(shù)：
琥珀酸(Succinic acid)是重要的有機酸產(chǎn)品，目前主要應(yīng)用于以下四個領(lǐng)域 一是作為表面活性劑、清潔劑添加劑和起泡劑；二是作為離子鰲合劑，用于電鍍行業(yè)防止金屬的溶蝕和點蝕；三是應(yīng)用于食品行業(yè)作為酸化劑、PH改良劑、風(fēng)味物質(zhì)和抗菌劑；四是應(yīng)用醫(yī)藥、抗生素、氨基酸和維生素的生產(chǎn)。琥珀酸在這四大領(lǐng)域中的銷售量每年超過4億美元。近年，我國中科院理化技術(shù)研究所工程塑料國家工程研究中心利用琥珀酸為聚合單體， 與丁二醇縮聚合成高性能聚酯材料聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)取得突破性進展，并經(jīng)過了萬噸級生產(chǎn)裝置驗證，PBS有望成為我國第一種全生物降解材料，這對作為聚合原料的琥珀酸的市場擴大產(chǎn)生巨大的推動。此外，以琥珀酸為原料，還可直接合成1，4_ 丁二醇、四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、γ-丁內(nèi)酯等重要的大宗化學(xué)品。鑒于琥珀酸日益增大的市場需求和廣泛的用途，美國能源部2004年發(fā)布的報告《Top Value Added Chemicals From Biomass》將琥珀酸列為12種最有潛力的生物基平臺化合物之首。目前工業(yè)上生產(chǎn)琥珀酸的方法主要是以石油基產(chǎn)品丁烷為原料的化學(xué)合成方法， 但化學(xué)法存在生產(chǎn)工藝要求嚴格，產(chǎn)品得率和純度都不高，易造成環(huán)境污染，且使用原料不可再生等不足，采用環(huán)境友好的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸將逐漸成為化學(xué)法的替代方案。 在琥珀酸發(fā)酵生產(chǎn)菌的分離或選育過程中，需要及時、高通量地分析不同菌株發(fā)酵液中的琥珀酸含量，以快速鑒別挑取高產(chǎn)菌株；在琥珀酸發(fā)酵過程中，必須經(jīng)常性的對發(fā)酵液中琥珀酸含量進行分析，以合理的控制發(fā)酵進程。目前，琥珀酸的分析檢測方法包括液相色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法、薄層色譜法等。其中液相色譜法(中華人民共和國國家標準GB/T 5009. 157-2003;曹劍磊等.產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌的構(gòu)建和發(fā)酵性能.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2010，16(6) 851-857.)具有檢出限低、重現(xiàn)性好、精密度高等優(yōu)點，是目前發(fā)酵液琥珀酸的準確定量分析的常用方法，但HPLC需使用價格昂貴的液相色譜儀，成本高、檢測時間長，而且對系統(tǒng)的各項要求也很高；毛細管電泳法(韋壽蓮等.毛細管電泳對葉下珠中有機酸的分離檢測.分析測試學(xué)報，2009，28 (6) :692-696.)，氣相色譜法(趙大云等.雪里蕻腌菜鹵汁中有機酸成分氣相色譜分析.上海交通大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2003，21 (3) =220-225,245.) 都存在使用設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜繁瑣、檢測分析耗時久的相似問題，而且氣相色譜法還需對琥珀酸進行衍生化處理，因此，這兩種方法較少應(yīng)用于發(fā)酵液琥珀酸的檢測分析；有報道使用薄層層析法(何凌云等.薄層掃描法測定不同產(chǎn)區(qū)半夏藥材中琥珀酸的含量.中成藥， 2002,24(4) =290-292.；王光忠等.薄層掃描法測定地龍類藥材中琥珀酸的含量.藥物分析雜志，1997，17 (4) =274-275.)分析中藥成分中琥珀酸的含量，但檢測分析過程需要較長時間的層析展開，由于使用酸堿指示劑類顯色劑染色，定量分析容易受發(fā)酵液中其他有機酸的干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前技術(shù)的不足，提供一種利用硫酸銅與琥珀酸顯色反應(yīng)快速檢測發(fā)酵液中琥珀酸含量的方法。這一方法根據(jù)銅試劑與琥珀酸在固體支持物上反應(yīng)顯色，在一定濃度范圍內(nèi)，琥珀酸濃度與顯色斑的吸光值成線性關(guān)系，通過外標兩點法計算琥珀酸的含量。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明專利采用的技術(shù)方案是(1)琥珀酸發(fā)酵液的預(yù)處理使用無機酸堿調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，使發(fā)酵液中琥珀酸充分溶解。離心除去發(fā)酵液中的固形物，用蒸餾水制備成適當稀釋倍數(shù)的待測樣。(2)薄層掃描快速分析琥珀酸含量①配制硫酸銅-甲醇溶液稱取適量硫酸銅加入甲醇中，搖勻，至硫酸銅完全溶解。試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。②檢測波長的選擇取標準琥珀酸溶液，點樣于硅膠板(或醋酸纖維薄膜等固體支持物上)，加熱固定后使用硫酸銅-甲醇溶液進行顯色反應(yīng)。使用薄層掃描儀對樣品斑點及空白進行光譜掃描，以樣品斑點最強吸收峰波長為測定波長，以空白最小光吸收為參比波長。③繪制工作曲線精確配制標準琥珀酸溶液，點樣于硅膠板(或醋酸纖維薄膜等固體支持物上)，加熱固定后與硫酸銅-甲醇溶液進行顯色反應(yīng)。設(shè)定測定波長為 600-750nm，參比波長為450-550nm，薄層掃描分析樣品點光吸收值。以峰面積積分值為縱坐標，標準琥珀酸含量為橫坐標繪制工作曲線。④樣品中琥珀酸含量分析將待測樣點樣于硅膠板(或醋酸纖維薄膜等固體支持物上)，加熱固定后與硫酸銅_甲醇溶液進行顯色反應(yīng)。設(shè)定測定波長為600-750nm，參比波長為450-550nm，薄層掃描分析樣品點光吸收值。選擇合適的稀釋率，使檢樣峰面積積分值位于標準曲線線性范圍內(nèi)，按外標兩點法，根據(jù)檢樣稀釋倍數(shù)即可計算出發(fā)酵液中琥珀
酸含量。本發(fā)明的優(yōu)點在于琥珀酸發(fā)酵液中主要的副產(chǎn)物甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、乳酸都不與硫酸銅發(fā)生顯色反應(yīng)，只有琥珀酸與硫酸銅發(fā)生顯色反應(yīng)；此外，上述副產(chǎn)物揮發(fā)性強，在顯色前進行加熱固定處理階段使其大部分揮發(fā)，對琥珀酸顯色反應(yīng)的干擾很小。因此，本發(fā)明方法不用對發(fā)酵液進行層析分離，節(jié)省了分析檢測的時間，提高了效率。利用薄層掃描儀檢測顯色斑的吸光值，操作簡單，提高檢測結(jié)果的精確度。整個分析檢測不需要貴重試劑，成本低。本發(fā)明方法尤其適用于對琥珀酸發(fā)酵野生菌種或突變菌種大規(guī)模篩選的快速分析。


圖1檢樣的全波段薄層掃描分析圖。圖中曲線1、2、3琥珀酸濃度分別為2g/L、4g/ L、6g/L。圖2硫酸銅顯色法繪制琥珀酸含量工作曲線
具體實施例方式為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明做進一步的描述。(1)配制硫酸銅-甲醇溶液稱取Ig硫酸銅加入干燥的錐形瓶中，量取20_200mL 甲醇與硫酸銅混合，搖勻，至硫酸銅完全溶解。試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。(2)標準琥珀酸溶液稱取80 °C烘干至恒重的分析純琥珀酸(sigma公司)2000mg，加入蒸餾水溶解，定容至IOOmL,然后用蒸餾水稀釋配制成濃度為0、2、4、6、8、 10、12g/L的標準琥珀酸溶液。(3)掃描波長的確定用微量進樣器各吸取2ul濃度為2g/L、4g/L、6g/L的琥珀酸標準溶液，點樣于硅膠板(或醋酸纖維薄膜等固體支持物上)，60-80°C加熱固定l-5min，將硅膠板浸入硫酸銅_甲醇溶液進行顯色反應(yīng)l_5s后(也可將硫酸銅-甲醇溶液噴于硅膠板上進行顯色反應(yīng))，40-60°C干燥l-5min。將顯色好的硅膠板置于薄層掃描儀內(nèi)掃描，先進行普通掃描定位待測物，再對定位的顯色斑進行光譜掃描，波長范圍從300nm-800nm。結(jié)果如下圖1所示。選擇薄層掃描檢測的測定波長為680nm，參比波長為500nm。(4)繪制工作曲線用微量進樣器準確吸取2μ L標準琥珀酸溶液，點樣于硅膠板上(或醋酸纖維薄膜等固體支持物)，每個標準濃度設(shè)3個平行，60-80°C加熱固定l-5min， 將硅膠板浸入硫酸銅_甲醇溶液進行顯色反應(yīng)l_5s后，40-60°C干燥l-5min。設(shè)定測定波長為680nm，參比波長為500nm，進行薄層掃描分析點樣電光吸收值。以峰面積積分值為縱坐標，標準琥珀酸含量為橫坐標繪制工作曲線，線性回歸方程為Y = 1159. 5X+2258，決定系數(shù)R2 = 0. 9946。結(jié)果見圖2。對空白測定20次，方法的檢出限(3s/k)為0. 028mg/L。(5)制備微生物發(fā)酵液配制發(fā)酵培養(yǎng)基(初糖濃度20g/L)，高壓蒸汽滅菌后按照 5%的接種量接入經(jīng)紫外誘變獲得的6株Actinobacillus succinogenes突變菌。在適宜的溫度下厭氧發(fā)酵20h，獲得發(fā)酵液。(6)琥珀酸發(fā)酵液的預(yù)處理取I-IOmL發(fā)酵液加適量氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為 6. 8-7. 0，使發(fā)酵液中琥珀酸充分溶解。在3000-10000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10-20min后，取上清，用蒸餾水制備成稀釋倍數(shù)分別為1、5、10倍的待測樣。(7)樣品中琥珀酸含量分析用微量進樣器準確吸取2 μ L發(fā)酵20h的發(fā)酵液待測樣物，點樣于硅膠板(每個樣品3個平行)，60-80°C加熱固定l-5min，將硅膠板浸入硫酸銅_甲醇溶液進行顯色反應(yīng)l_5s后，40-60°C加熱干燥l-5min。設(shè)定測定波長為680nm，參比波長為500nm，進行薄層掃描分析樣品點光吸收值。按外標兩點法計算出發(fā)酵液中琥珀酸含量。檢測結(jié)果發(fā)酵液中琥珀酸的濃度分別為7. 87,5. 94,6. 38,6. 41,7. 19,7. 93g/L(8)加標回收試驗分別吸取0. 5ml濃度為2、4、6g/L的琥珀酸標準液與0. 5ml發(fā)酵液樣品(琥珀酸濃度約為6. 38g/L)混合均勻。用微量進樣器準確吸取2 μ L上述樣品，點樣于硅膠板上(每個樣品5個平行)，60-80°C加熱固定l-5min，將硅膠板浸入硫酸銅-甲醇溶液進行顯色反應(yīng)l_5s后，40-60°C加熱干燥l-5min。設(shè)定測定波長為680nm，參比波長為500nm，進行薄層掃描分析樣品點光吸收值。按外標兩點法，計算上述樣品中琥珀酸的檢測含量。結(jié)果見表1?？梢?，本檢測方法的精密度和回收率都較高。表1回收實驗結(jié)果(η = 5)
權(quán)利要求
1.一種快速檢測發(fā)酵液琥珀酸含量的方法，包括琥珀酸發(fā)酵液的預(yù)處理，琥珀酸與硫酸銅的顯色反應(yīng)，薄層掃描法快速分析琥珀酸含量，其特征在于發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后，點樣固定于支持物上，使用硫酸銅-甲醇溶液進行特異性的顯色反應(yīng)，薄層掃描分析顯色斑的光吸收值，根據(jù)外標法計算發(fā)酵液中琥珀酸的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于發(fā)酵液經(jīng)調(diào)節(jié)PH并適當稀釋預(yù)處理，使發(fā)酵液中琥珀酸充分溶解，并使發(fā)酵液檢樣中琥珀酸濃度位于工作曲線線性范圍內(nèi)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于琥珀酸濃度位于工作曲線線性范圍為 l-12g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用硅膠板、醋酸纖維薄膜、層析濾紙或其他的固體物作為點樣顯色的支持物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于點樣于固體支持物后，在40-80°C加熱固定 l-5min。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于顯色劑硫酸銅_甲醇溶液濃度為5-50g/L。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用薄層掃描儀分析顯色斑的光吸收值，測定波長為600-750nm，參比波長為450_550nm。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速檢測發(fā)酵液琥珀酸含量的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后，直接點樣子支持物上(可使用硅膠板、醋酸纖維薄膜、或者層析濾紙等)，經(jīng)過干燥固定后，使用硫酸銅-甲醇溶液中進行顯色反應(yīng)，充分干燥后，利用薄層掃描儀分析顯色斑的吸光值，根據(jù)琥珀酸含量與吸光值的線性關(guān)系計算出發(fā)酵液中琥珀酸的含量。本發(fā)明方法簡單易行，分析速度快、準確性高、重現(xiàn)性好、檢測費用低，適合琥珀酸發(fā)酵的實驗研究及實際生產(chǎn)的分析檢測所需，是一種很好的琥珀酸檢測分析方法。
文檔編號G01N21/78GK102323263SQ201110238698
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月19日
發(fā)明者余運玲, 林日輝, 黃文勤 申請人:南寧奕德環(huán)境科技有限公司