一種甘油磷脂酰肌醇的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甘油磷脂酰肌醇的制備方法，屬于脂質(zhì)開發(fā)應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明以粗PI作為催化底物，采用堿性催化劑如甲醇鈉為催化劑醇解制備GPI，該方法具有催化效率高、產(chǎn)品純度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，解決了直接以粉末磷脂為催化底物的反應(yīng)效率低、后續(xù)分離純化操作復(fù)雜、產(chǎn)品回收率低等問題。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，純化步驟簡(jiǎn)單，催化效率高，得到的GPI純度達(dá)到98％以上，是一種方便、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的制備方法，能夠?yàn)槲磥砩虡I(yè)生產(chǎn)高純度GPI提供技術(shù)參考。
【專利說明】一種甘油磷脂酰肌醇的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種甘油磷脂酰肌醇(Glycerylphosphoinositol，GPI)的制備方法，屬于脂質(zhì)開發(fā)應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]甘油磷脂酰肌醇(Glycerylphosphoinositol，GPI)普遍存在于真核生物中，GPI和有關(guān)的糖結(jié)合物可對(duì)宿主的先天和獲得性免疫系統(tǒng)起到調(diào)節(jié)作用，對(duì)血栓、肝硬化及癲癇的發(fā)作等起到預(yù)防作用。同時(shí)，GPI在人體內(nèi)的生物合成與維持血液凝固和保證神經(jīng)系統(tǒng)的正常息息相關(guān)。因此，GPI的研宄對(duì)于保健和醫(yī)藥等行業(yè)具有重要的價(jià)值。
[0003]目前，GPI合成方法的報(bào)道很少，而關(guān)于磷脂衍生物甘油磷脂酰膽堿(Glycery Iphosphory I choline, GPC)和甘油磷脂酰乙醇胺(glycerylphosphorylcholine，GPE)的研宄較多，主要方法有化學(xué)水解法、非水相酶法、化學(xué)合成法等。近年來，一些學(xué)者對(duì)化學(xué)水解制備GPC的方法研宄較多。已有研宄以氫氧化四丁基銨為催化劑，甲醇為溶劑，催化制備GPC，產(chǎn)物收率可達(dá)89.20%。化學(xué)水解法常以大豆粉末磷脂為原料，要得到較高純度的產(chǎn)品需對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行后續(xù)分離和純化，工藝步驟復(fù)雜。
[0004]本發(fā)明提供了一種化學(xué)法制備GPI方法，以粗磷脂酰肌醇(Phosphtidylinositol, PI)作為催化底物，采用甲醇鈉為催化劑醇解制備GPI，該方法具有催化效率高、產(chǎn)品純度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，解決了直接以粉末磷脂為催化底物的反應(yīng)效率低、后續(xù)分離純化操作復(fù)雜、產(chǎn)品回收率低等問題。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，純化步驟簡(jiǎn)單，催化效率高，是一種方便、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的制備方法，能夠?yàn)槲磥砩虡I(yè)生產(chǎn)高純度GPI提供技術(shù)參考。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供的制備甘油磷脂酰肌醇的方法，是利用甲醇鈉對(duì)PI進(jìn)行醇解反應(yīng)，在甲醇鈉的作用下PI上的兩個(gè)脂肪?；淮冀夂笊蒅PI，然后用陽離子交換樹脂除去反應(yīng)液中的陽離子，再用硅膠柱色譜對(duì)GPI進(jìn)行純化，去除PI和其他雜質(zhì)，真空濃縮，得到GPI
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[0006]本發(fā)明提供了一種甘油磷脂酰肌醇的制備方法，是將磷脂酰肌醇(Phosphtidylinositol, PI)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%以上的粗PI溶解于甲醇中，再添加甲醇鈉進(jìn)行反應(yīng)，得到醇解反應(yīng)液，然后去除醇解反應(yīng)液中的陽離子，再進(jìn)行純化即得到GPI產(chǎn)品。
[0007]所述方法包括:⑴制備PI質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%以上的粗PI ；⑵將粗PI按照質(zhì)量與體積比1:1?1:7溶解于甲醇中，然后添加每10mL溶液中添加0.49-2.15g甲醇鈉或者含有0.49-2.15g甲醇鈉的甲醇鈉甲醇溶液，反應(yīng)60?480min，得到醇解反應(yīng)液；(3)去除醇解反應(yīng)液中的陽離子后采用硅膠柱色譜純化，即得到GPI產(chǎn)品。
[0008]所述粗PI的制備方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中是:以PI純度在25%以上的磷脂混合物為原料，加入到堿性乙醇中混合，攪拌，離心分離上清液，將不溶物干燥即得到粗PI產(chǎn)品。
[0009]所述粗PI的制備方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體是:以PI純度在25%以上的磷脂混合物為原料，加入到5?10倍體積的堿性乙醇中混合，攪拌，離心分離上清液，將不溶物干燥即得到粗PI產(chǎn)品。
[0010]所述磷脂混合物，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為大豆粉末磷脂。
[0011]所述粗PI，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，PI的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%以上。
[0012]所述堿性乙醇，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是無水乙醇與氨水按體積比100:1 ~ 100:5混合得到的O
[0013]所述甲醇鈉甲醇溶液，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其甲醇鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%?30%。
[0014]所述醇解反應(yīng)的反應(yīng)溫度，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為30_50°C。
[0015]所述陽離子的去除，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式是使用陽離子交換樹脂，得到洗脫液先干燥再進(jìn)行硅膠柱色譜純化。
[0016]所述硅膠柱色譜，是以硅膠為固定相，醇溶液為洗脫劑，洗脫劑流速為0.8?3mL/min，收集洗脫有GPI的組分，經(jīng)濃縮、干燥即得到GPI產(chǎn)品。
[0017]所述硅膠柱色譜中的洗脫劑為任意一種:甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、戊醇、己醇。
[0018]所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體包括:
[0019](I)粗PI制備:以PI純度在25%以上的磷脂混合物為原料，加入到5?10倍體積的堿性乙醇中混合，攪拌，離心分離上清液，將不溶物干燥即得到粗PI產(chǎn)品；所述堿性乙醇是無水乙醇與氨水按體積比100:1?100:5混合得到的；
[0020](2)醇解粗PI得到GP1:將粗PI按照質(zhì)量與體積比1:1?1:7溶解于甲醇中，然后添加甲醇鈉溶液1.5?5.5mL/100mL，反應(yīng)60?480min，得到醇解反應(yīng)液；
[0021](3)去除陽離子:采用陽離子交換樹脂去除醇解反應(yīng)液中的陽離子，流速為I?3mL/min ；
[0022](4)硅膠柱色譜純化，即得到GPI產(chǎn)品。
[0023]所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體包括:(I)制備PI含量在50%以上的粗PI ; (2)將粗PI按照質(zhì)量與體積比1:1?1:7溶于甲醇中，攪拌，每10mL溶液中加入1.5?5.5mL的甲醇鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25-30%的甲醇鈉甲醇溶液，反應(yīng)溫度為30?50°C，反應(yīng)60?480min即得到醇解反應(yīng)液；(3)采用陽離子交換樹脂去除醇解反應(yīng)液中的鈉離子，并將洗脫液干燥得到粗GPI樣品；(4)將硅膠裝柱后，將粗GPI樣品溶于甲醇中，上柱，使用醇溶液洗脫，收集含有GPI的洗脫液，將洗脫液真空濃縮干燥，即得到GPI產(chǎn)品。
[0024]所述陽離子交換樹脂，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是H型強(qiáng)酸性陽離子樹脂。
[0025]所述反應(yīng)時(shí)間，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為60-480min。
[0026]本發(fā)明提供的甲醇鈉催化粗PI和樹脂硅膠柱色譜純化制備GPI的方法，工藝簡(jiǎn)單，得到的GPI產(chǎn)品純度為98%以上，能夠?yàn)槲磥砩虡I(yè)生產(chǎn)高純度GPI提供技術(shù)參考。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是粉末磷脂和粗PI的色譜圖(a粉末磷脂，其中，P1、PE、PC、LPC分別代表磷脂酰肌
[0028]醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿；b粗PI);
[0029]圖2 是純化后 GPI 的 HPLC-ELSD ；
[0030]圖3是純化后GPI的核磁碳譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0031 ] GPI 的 HPLC-ELSD 檢測(cè)方法:
[0032]取待測(cè)樣品溶于2mL氯仿:甲醇(2:l，v:v)中，經(jīng)渦旋振蕩器混勻，在lOOOOr/min下離心5min，然后取上清液存放在冰箱中，待HPLC-ELSD分析檢測(cè)。具體色譜條件為:硅膠柱，Z0RBAXRX-SIL(4.6X250mm，5 μπι)，柱溫 35°C，漂移管溫度 30°C ;進(jìn)樣量 20 μ L ;檢測(cè)方法:采用二元梯度洗脫，流動(dòng)相A (甲醇:水=8:1，V/V)，流動(dòng)相B(甲醇)，流速1.0mL/min ；A相的梯度，開始lOmin，以40%梯度增加到60%，保持5min，之后3min，以60%梯度降低到40%。
[0033]實(shí)施例1按以下步驟制備甘油磷脂酰肌醇
[0034]所用的原料為大豆粉末磷脂(純度多96 %;磷脂酰膽堿30 %、磷脂酰乙醇胺25 %、磷脂酰肌醇25%、溶血磷脂酰乙醇胺0.5%)。其色譜圖如圖1(a)所示。
[0035]粗PI的制備:稱取一定量粉末磷脂，加入到40°C，10倍體積的堿性乙醇(無水乙醇:氨水=100:3，V/V)中，攪拌60min，離心分離上清液，將沉淀與堿性乙醇再混合，重復(fù)同樣操作2次。將不溶物在60°C下真空干燥可得到粗PI。得到的粗PI的色譜圖如圖1(b)所示。
[0036]醇解反應(yīng):稱取15.0g粗PI溶于10mL甲醇，在室溫水浴中均質(zhì)，35°C水浴中攪拌，添加3.5mL 30%甲醇鈉甲醇溶液，反應(yīng)240min，得到醇解反應(yīng)液。
[0037]樹脂柱色譜出去反應(yīng)液中陽離子:采用001X7強(qiáng)酸H型陽離子交換樹脂裝柱，醇解反應(yīng)液過柱除去Na+，600C，真空濃縮，離子交換樹脂再生。
[0038]硅膠柱色譜純化GP1:通過硅膠柱色譜將GPI與其他產(chǎn)物及雜質(zhì)分開，稱取GPI
0.3g，溶于甲醇，將活化后的硅膠15g溶于甲醇，勻漿、過夜、裝柱、壓實(shí)、上樣，用甲醇進(jìn)行洗脫，流速2mL/min，每30mL洗脫餾分進(jìn)行收集，用HPLC-ELSD進(jìn)行檢測(cè)，直到?jīng)]有GPI的響應(yīng)值為止，將同類型的餾分進(jìn)行合并，60°C，真空濃縮，得到GPI純度為98.71%。純化后GPI的HPLC-ELSD圖如圖2所示?；厥展枘z，在120°C活化180min進(jìn)行硅膠再生。
[0039]實(shí)施例2按以下步驟制備甘油磷脂酰肌醇
[0040](I)稱取磷脂酰肌醇PI純度在50%以上的粗PI ;
[0041](2)將粗PI按照質(zhì)量與體積比1:7溶于甲醇中，攪拌，每10mL中加入1.5mL的28%甲醇鈉甲醇溶液，反應(yīng)溫度為30?50°C，反應(yīng)480min即得到醇解反應(yīng)液；
[0042](3)采用陽離子樹脂去除醇解反應(yīng)液中的鈉離子，并將洗脫液干燥得到粗GPI樣品;
[0043](4)將硅膠裝柱后，將粗GPI樣品溶于甲醇中，上柱，使用醇溶液洗脫，收集含有GPI的洗脫液，將洗脫液真空濃縮干燥，即得到GPI產(chǎn)品。
[0044]制備得到的GPI純度為99.01%，其核磁碳譜圖見圖3。
[0045]實(shí)施例3按以下步驟制備甘油磷脂酰肌醇
[0046](I)稱取磷脂酰肌醇PI純度在65%以上的粗PI ;
[0047](2)將粗PI按照質(zhì)量與體積比1:3溶于甲醇中，攪拌，每10mL中加入5.5mL的25%的甲醇鈉甲醇溶液，反應(yīng)溫度為50°C，反應(yīng)60min即得到醇解反應(yīng)液；
[0048](3)采用陽離子樹脂去除醇解反應(yīng)液中的陽離子，并將洗脫液干燥得到粗GPI樣品;
[0049](4)將硅膠裝柱后，將粗GPI樣品溶于甲醇中，上柱，使用醇溶液洗脫，收集含有GPI的洗脫液，將洗脫液真空濃縮干燥，即得到GPI產(chǎn)品。
[0050]制備得到的GPI純度為98.23%。
[0051 ] 實(shí)施例4粗GPI樣品的色譜純化
[0052]將活化后的硅膠溶于甲醇，勻漿、過夜、裝柱、壓實(shí)、GPI甲醇溶液上樣，用甲醇進(jìn)行洗脫，流速0.8?3mL/min，每10?50mL洗脫餾分進(jìn)行收集，用HPLC-ELSD進(jìn)行檢測(cè)，直到?jīng)]有GPI的響應(yīng)值為止，將同類型的餾分進(jìn)行合并，60°C，真空濃縮、干燥，得到產(chǎn)品。硅膠再生條件:在100?150°C活化120?360min，再生次數(shù)I?8次。
[0053]所述硅膠，使用前可以經(jīng)預(yù)處理，預(yù)處理方法為:取適量硅膠置于120°C烘箱中活化 40_60min。
[0054]所述硅膠柱色譜中的洗脫劑可以是以下任意一種:甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、戊醇、己醇。
[0055]實(shí)施例5粗PI的制備
[0056]以PI純度在25%以上的磷脂混合物為原料，加入到30?45°C，5?10倍體積的堿性乙醇(無水乙醇:氨水=100:1?100:5，V/V)中，攪拌30?60min，離心分離上清液，將沉淀與堿性乙醇再混合，重復(fù)同樣操作2次。將不溶物在60°C下真空干燥可得到粗PI。
[0057]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種甘油磷脂酰肌醇(Glycerylphosphoinositol，GPI)的制備方法，其特征在于，所述方法是將磷脂酰肌醇(Phosphtidylinositol，PI)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%以上的粗PI溶解于甲醇中，再添加甲醇鈉進(jìn)行反應(yīng)，得到醇解反應(yīng)液，然后去除醇解反應(yīng)液中的陽離子，再進(jìn)行純化即得到GPI產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)制備PI質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%以上的粗PI; (2)將粗PI按照質(zhì)量與體積比1:1?1:7溶解于甲醇中，然后每100mL溶液中添加0.49-2.15g甲醇鈉或者含有0.49-2.15g甲醇鈉的甲醇鈉甲醇溶液，反應(yīng)60?480min，得到醇解反應(yīng)液； (3)去除醇解反應(yīng)液中的陽離子，然后采用硅膠柱色譜純化，即得到GPI產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟3是使用陽離子交換樹脂去除陽離子，得到洗脫液先干燥再進(jìn)行硅膠柱色譜純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟2中醇解反應(yīng)的反應(yīng)溫度為30-50。。。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述甲醇鈉甲醇溶液中甲醇鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%?30%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟1中粗ΡΙ的制備方法是:以ΡΙ純度在25%以上的磷脂混合物為原料，加入到一定體積的堿性乙醇中混合，攪拌，離心分離上清液，將不溶物干燥即得到粗ΡΙ產(chǎn)品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述原料是加入到5-10倍體積的堿性乙醇中；所述堿性乙醇是無水乙醇與氨水按體積比100:1?100:5混合得到的。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟3中的硅膠色譜純化，是以硅膠為固定相，醇溶液為洗脫劑，洗脫劑流速為0.8?3mL/min，收集洗脫有GPI的組分，經(jīng)濃縮、干燥即得到GPI產(chǎn)品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述洗脫劑為以下低碳鏈醇中的任意一種:甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、戊醇、己醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括:(1)制備PI含量在50%以上的粗PI ； (2)將粗PI按照質(zhì)量與體積比1:1?1:7溶于甲醇中，攪拌，每100mL溶液中加入1.5?5.5mL的甲醇鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25-30%的甲醇鈉甲醇溶液，反應(yīng)溫度為30?50°C，反應(yīng)60?480min即得到醇解反應(yīng)液；(3)采用陽離子交換樹脂去除醇解反應(yīng)液中的鈉離子，并將洗脫液干燥得到粗GPI樣品；(4)將硅膠裝柱后，將粗GPI樣品溶于甲醇中，上柱，使用醇溶液洗脫，收集含有GPI的洗脫液，將洗脫液真空濃縮干燥，即得到GPI產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】C07F9/117GK104447856SQ201410764836
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】張康逸, 宋范范, 何夢(mèng)影, 張薇薇 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所