合成型轉(zhuǎn)錄因子VP64-linker-0s03gll370在改良水稻籽粒性狀方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種融合蛋白（VP16)4-linker-0s03gll370，其中，linker由39個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成；VP16為來(lái)自單純皰疹病毒的VP16蛋白；0s03gll370為水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03gll370。本發(fā)明還提供了編碼所述融合蛋白的基因及其在增加水稻粒長(zhǎng)、粒寬及千粒重中的應(yīng)用。本發(fā)明將轉(zhuǎn)錄因子基因0s03gll370的⑶S序列通過(guò)Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到4個(gè)VP16序列下游，轉(zhuǎn)化水稻，使轉(zhuǎn)基因水稻的籽粒變長(zhǎng)，變寬。本發(fā)明的改善水稻籽粒性狀，使籽粒變長(zhǎng)，變寬的方法，對(duì)于詳細(xì)闡明水稻籽粒變化調(diào)控的分子機(jī)理，具有重要的理論價(jià)值；通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段，使水稻籽粒變長(zhǎng)，變寬，在生產(chǎn)中對(duì)于提高水稻產(chǎn)量具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】合成型轉(zhuǎn)錄因子VP64-1 i nker-〇S〇3g11370在改良水稻籽 粒性狀方面的應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03gll370基因的應(yīng)用，具體地， 涉及合成型轉(zhuǎn)錄因子VP64-linker-0s03gll370在改良水稻籽粒性狀方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003] 水稻（0ryza sativa L.)是我國(guó)和全世界重要的糧食作物，世界1/2以上人口以 水稻為主食，因此水稻產(chǎn)量性狀一直以來(lái)倍受科學(xué)家們的關(guān)注，而水稻籽粒大小則是影響 產(chǎn)量的主要因素之一。另外，水稻作為農(nóng)作物基因功能研究的模式植物，與其相關(guān)的遺傳學(xué) 和分子生物學(xué)研究一直受到研究者們的重視。水稻籽粒的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)有次序的、選擇 性的基因表達(dá)過(guò)程，轉(zhuǎn)錄因子在其基因表達(dá)的精確調(diào)控中起到了關(guān)鍵性的作用。
[0004] 近些年，有關(guān)籽粒大小性狀的分子遺傳調(diào)控機(jī)制研究，已取得了一定進(jìn)展，如：研 究者們利用QTL定位了一些籽粒大小相關(guān)基因，其中GS3編碼一個(gè)膜蛋白，是籽粒大小和器 官大小的負(fù)調(diào)控因子；張啟發(fā)等研究發(fā)現(xiàn)GS5編碼一個(gè)調(diào)節(jié)籽粒大小的絲氨酸羧肽酶，是 控制籽粒大小的正調(diào)節(jié)因子，過(guò)表達(dá)GS5可使水稻籽粒明顯變大；轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控籽粒大 小方面起著非常重要的作用，0sWRKY78可以調(diào)節(jié)水稻莖的伸長(zhǎng)和種子的發(fā)育，0sWRKY78突 變體可以使莖桿變矮化影響籽粒發(fā)育；螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（bHLH)類轉(zhuǎn)錄因子能通過(guò)調(diào)控 外稃和內(nèi)稃細(xì)胞的長(zhǎng)度影響谷粒的大小；PGLl堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（bHLH)異源二聚 體作為結(jié)合DNA的bHLH的抑制子過(guò)表達(dá)后可增加籽粒長(zhǎng)度和重量。
[0005] VP16最早在動(dòng)物病毒基因中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到植物中，主要用于植物基因 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究中。轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)的作用大體上可以分成兩種：一種為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子， 另一種為轉(zhuǎn)錄抑制子。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子和VP16功能域基序融合之后，它就會(huì)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的功 能，從而在轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)更明顯的表型變化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03gll370基因的應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種融合蛋白（VP16) 4_1 inker-0s03gl 1370， 其中，linker由39個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成；VP16為來(lái)自單純皰疫病毒（Herpes simplex virus)的 VP16 蛋白；0s03gll370 為水稻轉(zhuǎn)錄因子 0s03gll370。
[0008] 優(yōu)選地，所述融合蛋白（VP16) 4-linker-0s03gll370 為：
[0009] (I) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0010] (2)SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有 同等功能的由（1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述融合蛋白（VP16)4-linker-0s03gll370的編碼基因，優(yōu)選地， 所述基因?yàn)?VP64-linker-0s03gll370。
[0012] 所述基因 VP64-linker-0s03gll370的核苷酸序列為：
[0013] (I) SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；
[0014] (2)在嚴(yán)格條件下，能夠與（1)所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列；其中，所述嚴(yán) 格條件為65°C，在0.1XSSPE或0.1XSSC、0.1%SDS的溶液中雜交并洗膜。
[0015] 其中，所述0s03gll370的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，其氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示；所述linker (連接子）的核苷酸序列如SEQ IDNo. 5所示，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 6所示；所述VP64(4XVP16)的核苷酸序列如SEQ IDNo. 7所示，其氨基酸序列 如 SEQ ID No. 8 所不，其氨基酸序列中，Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 代表VP16序列，Gly Ser為連接VP16的間隔序列。
[0016] 本發(fā)明還提供含有VP64-linker-0s03gll370基因的表達(dá)載體。所述載體為任一 種可引導(dǎo)外源基因在宿主中表達(dá)的載體。優(yōu)選地，所述載體為植物雙元表達(dá)載體(例如， PCAMBIA1301)。在將本發(fā)明編碼所述融合蛋白的基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，可在其轉(zhuǎn) 錄起始核苷酸前添加任一種強(qiáng)啟動(dòng)子(例如，玉米強(qiáng)啟動(dòng)子Ub i qui t in )或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。此 夕卜，在將本發(fā)明編碼所述融合蛋白的基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，還可以使用增強(qiáng)子，且 這些增強(qiáng)子區(qū)域必須與編碼序列的閱讀框相同，以確保整條序列的翻譯。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述載體為表達(dá)載體ubi :VP64-0s03gll370,其構(gòu)建方法包括如 下步驟：
[0018] (1)以水稻日本晴的葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。
[0019] (2)根據(jù)Gateway克隆技術(shù)，進(jìn)行兩輪PCR，第一輪PCR模板為cDNA，引物為正向 引物Fl和反向引物Rl ;第二輪PCR模板為第一輪的PCR產(chǎn)物，引物為attB5'adaptor和 attB3' adaptor ;將第二輪的PCR產(chǎn)物克隆到pDONER載體上，測(cè)序鑒定正確后通過(guò)LR反應(yīng) 將 0s03gll370 構(gòu)建到載體 nVP64-hyg-asRED 上，獲得載體 ubi :VP64-linker-0s03gll370 (下簡(jiǎn)稱為 ubi :VP64-0s03gll370);
[0020] 正向引物 Fl :5,-caaaaaagca ggcttcatgg aggaccagat ggctaacc-3，（SEQ ID No·9);反向引物Rl:5，-caagaaagctgggtcctcgagggtggtgccgtc-3，（SEQIDNo·10);
[0021] attB5'adaptor :5'-gtggggacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttc_3'（SEQ IDNo. 11); attB3' adaptor ：5' -gtggggacca ctttgtacaa gaaagctggg tc_3' (SEQID No. 12)〇
[0022] 步驟（I)中所述方法為常規(guī)方法，具體地，反轉(zhuǎn)錄得cDNA的步驟如下：
[0023] (1)在冰上向不含核酸酶的PCR反應(yīng)管中依次加入下列物質(zhì)：總RNA6y 1 (0· lng-5y g)，01igo(dT)18 引物 1μ 1，不含核酸酶的 CldH2O 5μ 1，置于 PCR 儀中 65°C反應(yīng) 5min ;(2)然后再加入下列物質(zhì)：5X反應(yīng)緩沖液4μ l，RNase抑制劑1μ l，10mM dNTP2y 1， Μ-Μμ IV反轉(zhuǎn)錄酶1μ 1，輕輕混勻，在PCR儀中45°C反應(yīng)60min ;(3)PCR儀中，70°C 5min， 終止反應(yīng)。
[0024] 步驟（2)中，第一輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2X反應(yīng)緩沖液25 μ 1，dNTP4 μ 1， ddH2018. 5μ 1，Taq DNA 聚合酶 0· 5μ 1，1 μ I cDNA、正反向引物各 0· 5μ 1。
[0025] 反應(yīng)程序?yàn)椋簾釂?dòng)98°C預(yù)變性3min ;起始反應(yīng)98°C 10s，57°C 5s，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，最后25°C反應(yīng)結(jié)束。
[0026] 第二輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系與第一輪PCR相同。
[0027] 第二輪PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋簾釂?dòng)98°C預(yù)變性3min ;起始反應(yīng)98°C 10s，57°C 5s， 72°C lmin，6個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，最后25°C反應(yīng)結(jié)束。
[0028] 第一輪PCR所述正向引物Fl和反向引物Rl為加部分adaptor attB接頭的引 物，產(chǎn)物為0s03gll370全序列+部分attB接頭；第二輪PCR所述引物attB5'adaptor和 attB3' adaptor 為完整的 adaptor attB 引物，產(chǎn)物為 0s03gll370+ 完整 attB 接頭。
[0029] 植物表達(dá)載體nVP64-hyg-asRED的構(gòu)建過(guò)程為：以雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300左 右邊界包含的序列為骨架序列，通過(guò)體外重組，將ubi promoter-VP64_Gateway表達(dá)單元、 35S promoter-asRED表達(dá)單元和35S promoter-hyg表達(dá)單元與之融合構(gòu)建得到。
[0030] nVP64-hyg-asRED 載體全序列如 SEQ ID No. 13 所示；載體 ubi :VP64-0s03gll370 全序列如SEQ ID No. 14所示。
[0031] 本發(fā)明還提供了含有VP64-linker-0s03gll370基因或所述表達(dá)載體的宿主細(xì) 胞。
[0032] 本發(fā)明還提供含有VP64-linker-0s03gll370基因或所述表達(dá)載體的工程菌。
[0033] VP64-linker-0s03gll370基因?yàn)楹铣尚娃D(zhuǎn)錄因子，其能夠改善水稻籽粒的性狀。 本發(fā)明還提供VP64-linker-0s03gll370基因在增加水稻粒長(zhǎng)、粒寬及千粒重中的應(yīng)用。所 述應(yīng)用為將VP64-linker-0s03gll370基因或含有VP64-linker-0s03gll370基因的表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入水稻細(xì)胞中，篩選并最終獲得轉(zhuǎn)基因水稻。
[0034] 本發(fā)明進(jìn)一步提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03gll370基因的應(yīng)用，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子 0s03gll370基因的⑶S序列（完整翻譯區(qū)）構(gòu)建到4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下游，轉(zhuǎn) 化植物，篩選并最終獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0035] 前述的應(yīng)用，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03gl 1370基因的CDS序列通過(guò)Gateway系統(tǒng) 構(gòu)建到4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下游，轉(zhuǎn)化水稻(例如，水稻品種'kitaake'），篩選并 最終獲得轉(zhuǎn)基因水稻，從而使轉(zhuǎn)基因水稻籽粒變長(zhǎng)、變寬。其中，水稻轉(zhuǎn)錄因子〇s〇3gll370 基因 CDS序列的核苷酸如SEQ ID No. 3所示，4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的核苷酸序列如 SEQ ID No. 7 所示。
[0036] VP64-linker-0s03gl 1370 基因或攜帶有編碼 VP64-linker-0s03gl 1370 基因的 表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技 術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中（Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII， Academy Press，New York，第 411-463 頁(yè)；Geiserson 和 Corey，1998，Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
[0037] 本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64 (即4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16)與水稻 轉(zhuǎn)錄因子0s03gll370基因融合構(gòu)建得到合成型轉(zhuǎn)錄因子，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物（如水稻)，并使 轉(zhuǎn)基因水稻種子明顯變長(zhǎng)、變寬、千粒重增加，具有較好的增產(chǎn)潛力。
[0038] 本發(fā)明獲得的改善籽粒性狀，使籽粒變長(zhǎng)，變寬的方法，對(duì)于詳細(xì)闡明水稻籽粒變 化調(diào)控的分子機(jī)理，具有重要的理論價(jià)值，并且可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段，使水稻籽粒變長(zhǎng)，變 寬，因此在生產(chǎn)中對(duì)于提高水稻產(chǎn)量具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中nVP64-hyg_asRED載體圖譜。
[0040] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中ubi :VP64-0s03gll370載體圖譜。
[0041] 圖3為本發(fā)明Western blot檢測(cè)ubi :VP64-0s03gll370轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，其中 WT 為野生型水稻 'kitaake'，V1475H-08、V1475H-12 為 ubi :VP64-0s03gll370 轉(zhuǎn)基因水稻 株系。
[0042] 圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的粒長(zhǎng)性狀的表型，其中WT為野生型水稻 'kitaake'，V1475H-08、V1475H-12 為 ubi :VP64-0s03gll370 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0043] 圖5為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的粒寬性狀的表型，其中WT為野生型水稻 'kitaake'，V1475H-08、V1475H-12 為 ubi :VP64-0s03gll370 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0044] 圖6為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因水稻籽粒性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，其中WT為野生型水稻 'kitaake'，V1475H-08、V1475H-12 為 ubi :VP64-0s03gll370 轉(zhuǎn)基因水稻株系。

【具體實(shí)施方式】
[0045] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0046] 若未特別指明，本發(fā)明實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器等均可市售獲得，若 未具體指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0047] 日本晴水稻、水稻'kitaake'為本領(lǐng)域公知公用品種。
[0048] pDONER 載體購(gòu)自 Invitrogen 公司。
[0049] 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。
[0050] 潮霉素購(gòu)自上海紐津生物技術(shù)有限公司。
[0051] 實(shí)施例10s03gll370基因的分離和植物表達(dá)載體構(gòu)建
[0052] 1、設(shè)計(jì)引物
[0053] 在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)（http://planttfdb. cbi. edu. cn/index. php?sp=0sj)中 找到0s03gl 1370基因 ，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，其中正向引物Fl :5' -caaaaaagca ggcttcatgg aggaccagat ggctaacc-3，（SEQ ID Νο·9);反向引物 Rl :5，_caagaaagct gggtcctcga gggtggtgcc gtc-3' (SEQ ID No. 10)；
[0054] 2、植物表達(dá)載體 ubi :VP64-0s03gll370 構(gòu)建
[0055] 以水稻日本晴的葉片為材料，TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，反轉(zhuǎn)錄的反 應(yīng)步驟如下：（1)在冰上向不含核酸酶的PCR反應(yīng)管中依次加入下列物質(zhì)：總RNA6y 1 (0· lng-5y g)，01igo (dT)18 引物 1μ 1，不含核酸酶的(ΜΗ205 μ 1，置于 PCR 儀中 65°C反應(yīng) 5min ;(2)然后再加入下列物質(zhì)：5X反應(yīng)緩沖液4μ l，RNase抑制劑1μ l，10mM dNTP2y 1， Μ-Μμ IV反轉(zhuǎn)錄酶1μ 1，輕輕混勻，在PCR儀中45°C反應(yīng)60min ;(3)PCR儀中，70°C 5min， 終止反應(yīng)。
[0056] 按照PrimeSTAR聚合酶擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR。根據(jù)Gateway克隆技術(shù)的 要求，此過(guò)程中包含兩輪PCR，第一輪PCR以cDNA為模板，引物為加部分adaptor attB接頭 的引物（正向引物Fl和反向引物R1)，產(chǎn)物為0s03gll370全序列+部分attB接頭；第一輪 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2X反應(yīng)緩沖液25μ 1，dNTP4y 1，ddH2018. 5μ 1，Taq DNA聚合酶 0. 5μ1，1μ1 cDNA、正反向引物各0. 5μ1。反應(yīng)程序?yàn)闊釂?dòng)98°C預(yù)變性3min;起始反應(yīng) 98°C 10s，57°C 5s，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin，最后 25°C反應(yīng)結(jié)束。
[0057] 第二輪PCR的模板為第一輪的PCR產(chǎn)物，引物為完整的adaptor attB引物： attB5'adaptor ：5'-gtggggacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttc-3' (SEQ ID No. 11)； attB3, adaptor :5,-gtggggacca ctttgtacaa gaaagctggg tc_3，（SEQ ID No. I2)，產(chǎn)物為 0s03gll370+ 完整 attB 接頭。
[0058] 第二輪PCR的擴(kuò)增體系與第一輪PCR的擴(kuò)增體系相同。
[0059] 第二輪PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋簾釂?dòng)98°C預(yù)變性3min ;起始反應(yīng)98°C 10s，57°C 5s， 72°C lmin，6個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，最后25°C反應(yīng)結(jié)束。
[0060] 將第二輪的PCR產(chǎn)物克隆到pDONER載體上，經(jīng)測(cè)序鑒定得到與目的基因完全 相同的序列。通過(guò)LR反應(yīng)將0s03gll370構(gòu)建到nVP64-hyg_asRED (圖1，載體全序列 如 SEQ ID No. 13 所示）上，獲得載體 ubi :VP64-linker-0s03gll370,以下簡(jiǎn)稱為 ubi : VP64-0s03gll370 (圖2,載體全序列如SEQ ID吣.14所示）。
[0061] 植物表達(dá)載體nVP64-hyg-asRED的構(gòu)建過(guò)程為：以雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300左 右邊界包含的序列為骨架序列，通過(guò)體外重組，將ubi promoter-VP64_Gateway表達(dá)單元、 35S promoter-asRED表達(dá)單元和35S promoter-hyg表達(dá)單元與之融合構(gòu)建得到。
[0062] 融合蛋白（VP16)4-linker-0s03gll370的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，基因 VP64-linker-0s03gll370的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；0s03gll370全序列的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示；所述linker (連接子）的核苷 酸序列如SEQ IDNo. 5所示，其氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示；所述VP64 (4XVP16)的核 苷酸序列如SEQ IDNo. 7所示，其氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示。
[0063] 實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得
[0064] 取水稻'kitaake'成熟種子，人工或機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無(wú)菌斑的種子經(jīng)消毒 之后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長(zhǎng)力好的水稻愈傷組織為受體 材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ubi :VP64-0s03gll370轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含有100 μ M的 乙酰丁香酮和〇. D.值為0. 7的農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化液浸泡過(guò)的愈傷組 織置于共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d，每IOd繼代 一次。然后將篩出的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出 綠色小苗的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根，待約7d長(zhǎng)出發(fā)達(dá)根系后煉苗，并計(jì)算轉(zhuǎn)化 所獲轉(zhuǎn)基因苗數(shù)。煉苗7d后轉(zhuǎn)移至大田生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)潮霉素篩選共獲得轉(zhuǎn)基因水稻26株。 [0065] 其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基、共培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基的配方均為本 領(lǐng)域常規(guī)配方。
[0066] 其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0067] IL銅鈷母液（2000 X )配方：
[0068] KU. 5g
[0069] Na2MoO4 · 2Η200· 5g
[0070] CuSO4 · 5Η200· 05g
[0071] CoCl2 · 6Η200· 05g。
[0072] 共培養(yǎng)基配方為：Ν6大量+Β5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰 胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，調(diào)pH至5. 2后加入植物 凝膠4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮）100?200μ8/ιΛ。
[0073] 篩選培養(yǎng)基配方為：Ν6大量+Β5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素。
[0074] 分化培養(yǎng)基配方為：MS大量+MS微量+MS有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+0. 05mg/L NAA+2. Omg/L Kinetin (激動(dòng)素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L鹿糖，以水配制， 調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0075] 生根培養(yǎng)基：MS大量+MS微量+MS有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+水解酪蛋白（lg/L) + 蔗糖（30g/L)，調(diào)pH5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的鑒定
[0076] 為檢測(cè)ubi :VP64-0s03gll370在T2代（T0代為初次轉(zhuǎn)化再生苗，由該TO代繁殖 產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株為Tl代，由該Tl代繁殖產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株 為T2代）轉(zhuǎn)基因水稻中的過(guò)表達(dá)情況，利用VP64抗體對(duì)其在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行鑒定，經(jīng)過(guò) SDS-PAGE蛋白電泳一免疫印記一免疫熒光反應(yīng)，Western Blot鑒定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株存 在目的蛋白，而野生型未雜出條帶（圖3, Rubisco為內(nèi)參)。
[0077] 具體的Western Blot實(shí)驗(yàn)流程如下：將T2代轉(zhuǎn)基因水稻（ubi :VP64-0s03gll370 轉(zhuǎn)基因水稻株系）V1475H-08、V1475H-12的葉片和野生型'kitaake'葉片放入液氮冰凍后 研磨成粉末，加入適量上樣緩沖液混勻，12000rpm離心10分鐘；取5 μ 1上清加樣，以90V 電壓SDS-PAGE電泳30分鐘后，120V電泳60-90分鐘，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底端即可停止 電泳；電泳后采用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，并用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果；轉(zhuǎn)膜 完畢后，將膜放入含5%的脫脂奶粉的PBST溶液中封閉室溫封閉60分鐘或4°C過(guò)夜；室溫 下一抗（VP64抗體）孵育1小時(shí)或4°C孵育過(guò)夜，然后用PBST洗滌3次，每次5分鐘；室溫 下二抗(羊抗兔，購(gòu)自Abmart，貨號(hào)M21002S)孵育1小時(shí)，然后用PBST洗滌3次，每次5分 鐘；在膜上加入底物，進(jìn)行曝光。
[0078] 其中，VP64抗體是由艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海）有限公司根據(jù)VP64的氨基酸序列 合成多肽作為特異抗原而制備的兔源多抗。
[0079] 實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻表型分析和考種分析
[0080] 將本發(fā)明獲得的T2代轉(zhuǎn)基因水稻V1475H-08、V1475H-12的種子和野生型 ('kitaake'）水稻種子進(jìn)行比較，圖4為本發(fā)明T2代轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的粒長(zhǎng)性狀的表型，圖 5為本發(fā)明T2代轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的粒寬性狀的表型，如圖4和圖5所示，T2代轉(zhuǎn)基因水稻 的籽粒明顯變長(zhǎng)、變寬，因此，毫無(wú)疑義，T2代轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的千粒重也明顯增加。
[0081] 圖6為本發(fā)明T2代轉(zhuǎn)基因水稻V1475H-08、V1475H-12的籽粒性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 數(shù)據(jù)分析表明，T2代轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的長(zhǎng)、寬均顯著大于野生型水稻'kitaake'籽粒。 [0082] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、【具體實(shí)施方式】及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描 述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的 范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為（％16)4-1化1?51-〇8〇3811370 ; 其中，linker由39個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成；VP16為來(lái)自單純皰疹病毒的VP16蛋白； 0s03gll370為水稻轉(zhuǎn)錄因子0s03gll370。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為： (1) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (2) SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等 功能的由（1)衍生的蛋白質(zhì)。
3. 編碼權(quán)利要求1或2所述融合蛋白的基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因?yàn)閂P64-linker-0s03gll370,其 核苷酸序列為： (1) SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列； (2) 在嚴(yán)格條件下，能夠與（1)所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列；其中，所述嚴(yán)格條 件為65°C，在0.1XSSPE或0.1XSSC、0.1%SDS的溶液中雜交并洗膜。
5. 含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達(dá)載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，所述載體為表達(dá)載體ubi : VP64-0s03gll370,其構(gòu)建方法包括如下步驟： (1) 以水稻日本晴的葉片為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA ; (2) 根據(jù)Gateway克隆技術(shù)，進(jìn)行兩輪PCR，第一輪PCR模板為cDNA，引物為正向引 物Fl和反向引物Rl ;第二輪PCR模板為第一輪的PCR產(chǎn)物，引物為attB5' adaptor和 attB3' adaptor ;將第二輪的PCR產(chǎn)物克隆到pDONER載體上，測(cè)序鑒定正確后通過(guò)LR反應(yīng) 將 0s03gll370 構(gòu)建到 nVP64-hyg-asRED 上，獲得載體 ubi :VP64-0s03gll370 ; 正向引物Fl :5' -caaaaaagca ggcttcatgg aggaccagat ggctaacc-3', 反向弓I物 Rl :5'-caagaaagct gggtcctcga gggtggtgcc gtc_3' ； attB5' adaptor ：5' -gtggggacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttc-3', attB3' adaptor ：5'-gtggggacca ctttgtacaa gaaagctggg tc-3' 〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，步驟（2)中，第一輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系 為：2X 反應(yīng)緩沖液 25μ 1，dNTP4y 1，ddH2018. 5μ 1，Taq DNA 聚合酶 0· 5μ 1，1μ I cDNA、 正反向引物各〇. 5μ1 ;反應(yīng)程序?yàn)闊釂?dòng)98°C預(yù)變性3min;起始反應(yīng)98°C 10s，57°C 5s， 72°C lmin，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，最后25°C反應(yīng)結(jié)束； 第二輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系與第一輪PCR相同；第二輪PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋簾釂?dòng)98°C 預(yù)變性 3min ;起始反應(yīng) 98°C 10s，57°C 5s，72°C lmin，6 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin，最后 25°C 反應(yīng)結(jié)束。
8. 含有權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述載體的宿主細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求3或4所述的基因或權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述載體在增加水稻粒長(zhǎng)、粒寬 及千粒重中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，其是將權(quán)利要求3或4所述的基因或權(quán) 利要求5-7任一項(xiàng)所述載體轉(zhuǎn)化水稻，篩選獲得轉(zhuǎn)基因水稻。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK104211809SQ201310214040
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月31日
【發(fā)明者】李宏宇, 張春雨, 劉斌, 趙濤, 劉軍, 林辰濤 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所