純化抗體的方法
【專利摘要】一種純化抗體組合物的方法，其包括在純化過程后期應(yīng)用陰離子交換色譜。對(duì)經(jīng)超濾/滲濾純化的抗體組合物進(jìn)行陰離子交換色譜(AEX)以形成藥學(xué)純的抗體組合物。
【專利說明】純化抗體的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及純化抗體的方法。特別地，所述方法包括在抗體純化過程的后期使用 陰離子交換色譜。

【背景技術(shù)】
[0002] 單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb)是醫(yī)藥工業(yè)中最重要的藥劑之一。mAb 一般使用培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生，其中通常使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞以確保獲得期望的折疊和糖基化。 在過去十年內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已進(jìn)行了改進(jìn)，包括生產(chǎn)培養(yǎng)基和給料策略的進(jìn)步。這些改進(jìn) 已導(dǎo)致高的細(xì)胞培養(yǎng)物效價(jià)。但是，通常需要將表達(dá)的抗體與宿主細(xì)胞和表達(dá)培養(yǎng)基中的 其它組分（雜質(zhì)）分離以用于其預(yù)期的目的。
[0003] 由于mAb -般通過發(fā)酵產(chǎn)生，因此它們伴隨有大量的過程相關(guān)的雜質(zhì)，例如宿主 細(xì)胞蛋白質(zhì)（HCP)、宿主細(xì)胞DNA和培養(yǎng)基成分。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)由剪切應(yīng)力引起的 破壞敏感，并且這可導(dǎo)致雜質(zhì)（例如蛋白酶（即HCP))的釋放，其可影響產(chǎn)品穩(wěn)定性和/或 純度。特別地，HCP是一種重要的污染物，因?yàn)槠淇稍诘偷陌偃f分率（parts per million) 水平下引起免疫應(yīng)答。根據(jù)發(fā)酵條件，產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)（例如降解的、截短的和聚集的mAb) 也可見于細(xì)胞培養(yǎng)物上清中。因此，從細(xì)胞培養(yǎng)基中有效回收和純化抗體是抗體純化過程 的一個(gè)重要部分，特別是在醫(yī)藥應(yīng)用中。
[0004] 目前，mAb純化過程一般包括色譜精制（polishing)步驟，其目標(biāo)是減少/除去產(chǎn) 品相關(guān)的以及過程相關(guān)的雜質(zhì)，例如HCP和DNA、高分子量（molecular weight，MW)聚集 體、低MW降解產(chǎn)物和滲出物（Ieachables)。可將純化過程分解成一系列單元操作，但是所 述操作（和其中的步驟）可同時(shí)或相繼發(fā)生。常用的涵蓋廣泛抗體和條件的基于蛋白A的 抗體純化過程包括下述單元操作：蛋白A捕獲一低pH病毒滅活一離子交換色譜（IEX)精制 (一般是兩個(gè)離子交換色譜，接著進(jìn)行陰離子交換色譜）一病毒過濾一以及最后的超濾-滲 濾（UF/DF)?？贵w純化技術(shù)的更多細(xì)節(jié)可見于由Uwe Gottschalk編輯的Process Scale Purification of Antibodies，John Wiley&Sons，Inc. 2009 中。最后的 UF/DF 步驟被認(rèn)為 完成了純化，并將抗體置于適于終端用途（end-use)應(yīng)用的組合物中，例如大量填充（bulk fill)和完成、用于醫(yī)藥應(yīng)用、體內(nèi)測(cè)試、臨床用途等的冷凍干燥。
[0005] 因此，期望提供一種替代的純化過程來純化抗體組合物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)：常規(guī)的抗體純化過程不如先前認(rèn)為的那樣有效，特別是對(duì) 于HCP，而在純化過程后期使用陰離子交換色譜（AEX)可改進(jìn)純化過程和/或提供更高質(zhì)量 的抗體組合物。因此，本發(fā)明的第一方面涉及純化抗體組合物的方法，其包括對(duì)經(jīng)UF/DF純 化的抗體組合物進(jìn)行陰離子交換色譜（AEX)以形成藥學(xué)純（pharmaceutically pure)的抗 體組合物。此處的"藥學(xué)純"在下文中有定義。經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物的抗體濃度一 般為至少 lmg/ml，例如至少 5mg/ml、至少 10mg/ml、5mg/ml 至 250mg/ml、10mg/ml 至 150mg/ ml、15mg/ml 至 100mg/ml、20mg/ml 至 50mg/ml 和 30mg/ml 至 35mg/ml。經(jīng) UF/DF 純化的抗 體組合物一般通過對(duì)部分純化的抗體組合物進(jìn)行UF/DF獲得。所述部分純化的抗體組合物 可通過捕獲和/或精制步驟形成。
[0007] 本發(fā)明的另一方面涉及純化抗體組合物的方法，其包括：對(duì)抗體細(xì)胞培養(yǎng)收獲物 經(jīng)進(jìn)行例如蛋白A色譜的親和色譜以捕獲粗制的抗體組合物；對(duì)所述粗制的抗體組合物進(jìn) 行至少一個(gè)精制步驟以形成部分純化的抗體組合物；對(duì)所述部分純化的抗體組合物進(jìn)行 UF/DF步驟以形成經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物；以及對(duì)所述經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物進(jìn) 行陰離子交換色譜（AEX)以形成藥學(xué)純的抗體組合物。所述精制步驟通常為陽離子交換色 譜，以及任選的隨后的陰離子交換色譜。
[0008] 本發(fā)明的又一方面涉及純化抗體組合物的方法，其包括對(duì)抗體組合物進(jìn)行足以降 低所述抗體組合物中宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)之量的陰離子交換色譜（AEX)，所述抗體組合物的抗 體濃度為至少 lmg/ml，例如至少 5mg/ml、至少 10mg/ml、5mg/ml 至 250mg/ml、10mg/ml 至 150mg/ml、15mg/ml 至 100mg/ml、20mg/ml 至 50mg/ml 和 30mg/ml 至 35mg/ml，并且具有腸胃 外可用的緩沖劑和pH。

【具體實(shí)施方式】
[0009] 本發(fā)明涉及純化抗體的方法，相對(duì)于先前已知的純化技術(shù)，所述方法在純化后期 使用AEX。常規(guī)的mAb純化過程使用捕獲步驟，接著使用IEX精制步驟，并以最后的UF/DF步 驟結(jié)束，然后進(jìn)行大量填充，所述過程被認(rèn)為擅長(zhǎng)于獲得期望的低水平HCP。在最后的UF/ DF步驟之后，常用的基于ELISA的HCP檢測(cè)試劑盒通常顯示適當(dāng)?shù)土康腍CP。但是，在換成 更新的、更靈敏的基于ELISA的HCP檢測(cè)試劑盒之后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)HCP的量實(shí)際上比之前 認(rèn)為的高得多，并且超出期望的純度界限?；谠摪l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人試圖找到將提供更高純度 之抗體組合物的純化過程。
[0010] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，AEX可在最后的UF/DF步驟之后進(jìn)行，同時(shí)提高了純化效果。如下 文的實(shí)施例所示，將AEX從UF/DF精制階段之前移至UF/DF之后可使在其它測(cè)量雜質(zhì)不發(fā) 生任何不期望的增加的情況下提供出眾的HCP去除。與常規(guī)過程相比，將AEX步驟置于UF/ DF之后提高了純化效果。從經(jīng)濟(jì)和/或時(shí)間方面來講，在最后的超濾之后進(jìn)行AEX也是有 利的。通常，與之前（即在精制階段期間）相比，在UF/DF之后可更快速地進(jìn)行AEX步驟，因 為抗體組合物在最后的UF/DF之后更加濃縮（例如體積更?。?。本發(fā)明的另一益處是病毒 控制增強(qiáng)；已知AEX去除一些病毒。當(dāng)將AEX作為精制步驟（UF/DF之前）進(jìn)行時(shí)，后續(xù)過 程以及操作具有再引入病毒的風(fēng)險(xiǎn)。該風(fēng)險(xiǎn)可通過在純化方案較后期進(jìn)行AEX來最小化。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物進(jìn)行AEX。"經(jīng)UF/DF純化的抗 體組合物"為已進(jìn)行一定程度的純化并且已進(jìn)行UF/DF步驟的抗體組合物。在上文描述的 典型現(xiàn)有技術(shù)純化過程中，最后的UF/DF步驟產(chǎn)生經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物。所述組合 物不一定是，并且一般不是完全或足夠純的。而是已進(jìn)行一定程度的雜質(zhì)去除，并且已通過 UF/DF對(duì)抗體組合物進(jìn)行一定程度的濃縮。這使本發(fā)明中使用的經(jīng)UF/DF純化的抗體組合 物與在捕獲之前已經(jīng)進(jìn)行UF/DF的抗體組合物區(qū)別開來，例如作為促進(jìn)捕獲步驟的澄清或 準(zhǔn)備步驟的一部分，至少因?yàn)檫@樣的澄清或準(zhǔn)備步驟產(chǎn)生不適于終端用途的濃度不足夠低 的組合物。這樣的抗體組合物一般也具有低濃度。
[0012] 本發(fā)明的經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物的抗體濃度一般為至少lmg/ml，更一般地為 至少5mg/ml，優(yōu)選為至少10mg/ml，包括至少15mg/ml。出于實(shí)際原因，所述抗體濃度一般 不大于250mg/ml。因此，所述抗體濃度一般在5mg/ml至150mg/ml的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施 方案中，所述濃度在l〇mg/ml至65mg/ml的范圍內(nèi)，包括15mg/ml至50mg/ml，例如30mg/ml 至35mg/ml。在另一些實(shí)施方案中，所述抗體濃度在50mg/ml至150mg/ml的范圍內(nèi)，包括 75mg/ml 至 100mg/ml〇
[0013] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物含有腸胃外可用的緩沖 劑和pH中的抗體。在這樣的實(shí)施方案中，抗體濃度一般為至少10mg/ml，并且包括上述范 圍，例如15mg/ml至50mg/ml，例如30mg/ml至35mg/ml。常規(guī)地，利用色譜步驟處理接近最 終形式的抗體組合物（例如具有適于藥物注射的緩沖介質(zhì)）以進(jìn)行進(jìn)一步純化是與直覺相 反的。UF/DF步驟被認(rèn)為是最后的步驟，并且其將經(jīng)純化的抗體組合物置于合適的濃度和緩 沖劑中。在UF/DF之后的進(jìn)一步純化步驟被認(rèn)為是不利的，例如，由于與后期損失的產(chǎn)量相 關(guān)的高費(fèi)用和/或由于在純化過程后期引入滲出物和/或可提取物的風(fēng)險(xiǎn)。
[0014] 腸胃外可用的緩沖劑為一般含有適于腸胃外施用之量（一般為1至50毫摩爾） 的醋酸鹽、磷酸鹽、組氨酸和/或檸檬酸鹽緩沖劑的水性組合物。所述組合物的pH同樣與 腸胃外制劑和施用相一致，其一般為pH 4至pH 8,優(yōu)選為pH 6至pH 8。相反地，腸胃外可 用的緩沖劑不合危險(xiǎn)的或腸胃外不可用的量的現(xiàn)有純化試劑。在一些實(shí)施方案中，腸胃外 可用的緩沖組合物還含有針對(duì)抗體的表面活性劑和/或穩(wěn)定劑。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，對(duì)經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物進(jìn)行AEX。為了清楚，陰離子交換色譜 或"AEX"指以電荷差異為基礎(chǔ)，使用陰離子交換基質(zhì)通過其可分離含有抗體的組合物和一 種或更多種雜質(zhì)（例如，過程相關(guān)的雜質(zhì)，例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA和/或內(nèi)源或外源病 毒（例如MulV或MVM))的方法。陰離子交換基質(zhì)一般包含共價(jià)結(jié)合的帶正電荷的基團(tuán)。 可采用強(qiáng)或弱陰離子交換基質(zhì)。強(qiáng)陰離子交換基質(zhì)的實(shí)例包括具有季銨離子的那些。弱陰 離子交換基質(zhì)的實(shí)例包括具有叔胺或仲胺官能團(tuán)的那些，例如DEAE(二乙氨乙基）。在某 些實(shí)施方案中，可使用多模式陰離子交換基質(zhì)（multimodal anion exchange matrices)， 其引入額外的結(jié)合機(jī)制以及離子相互作用，例如一種或更多種氫鍵相互作用和疏水相互作 用。合適的陰離子交換基質(zhì)的實(shí)例在本領(lǐng)域中是已知的，其可包括，但不限于Sartobind Q、 Natrix Q、Chromasorb Q和Mustang Q。一種優(yōu)選的陰離子交換基質(zhì)為Mustang Q0
[0016] 如本領(lǐng)域中公知的那樣，針對(duì)抗體可采用結(jié)合模式或流過模式（flow-through mode)的陰離子交換色譜過程。在結(jié)合模式中，目的抗體被吸附至陰離子交換基質(zhì)，而一種 或更多種雜質(zhì)則不結(jié)合，從而使抗體與雜質(zhì)分離。在一些實(shí)施方案中，在從陰離子交換基質(zhì) 移出吸附的抗體之前，用緩沖劑洗滌陰離子交換基質(zhì)一次或更多次以除去額外的雜質(zhì)。利 用結(jié)合模式的陰離子交換色譜從組合物中除去一種或更多種雜質(zhì)后，可從陰離子交換基質(zhì) 移出（洗脫）吸附的抗體。相比之下，流過模式意指目的抗體不被顯著吸附至陰離子交換 基質(zhì)，而一種或更多種雜質(zhì)則被吸附（或被阻攔）至基質(zhì)。抗體流過柱，同時(shí)雜質(zhì)被結(jié)合， 由此導(dǎo)致雜質(zhì)與抗體分離。周期性地，基質(zhì)需要通過去除結(jié)合的雜質(zhì)來再生或用新的基質(zhì) 材料替換。
[0017] 在本發(fā)明中，AEX的應(yīng)用對(duì)抗體組合物具有純化作用。因此，經(jīng)UF/DF純化的抗體 組合物在進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的AEX后成為藥學(xué)純的抗體組合物。本文所用的"藥學(xué)純的抗體 組合物"意指其產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)（例如抗體片段、低聚物等）和過程相關(guān)的雜質(zhì)（例如宿主 細(xì)胞DNA和HCP等）低于可藥用水平的組合物。對(duì)于將向人或動(dòng)物施用的組合物，這樣的 水平為被醫(yī)藥領(lǐng)域中的工作人員廣泛接受的那些水平。對(duì)于已批準(zhǔn)的抗體產(chǎn)品，美國FDA 或歐洲EM采用的用于限制這些雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)可限定藥學(xué)純的上限（如果美國和歐洲的界限 不同，取較高者）。通常，藥學(xué)純的抗體組合物無需對(duì)產(chǎn)品相關(guān)的或過程相關(guān)的雜質(zhì)進(jìn)行進(jìn) 一步純化，但是可能需要進(jìn)行無菌過濾或其它的改性以形成最終劑型。簡(jiǎn)而言之，純化行為 基本完成。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥學(xué)純的抗體組合物一般滿足以下規(guī)格：（1) HCP濃度為IOppm (百萬分率）或更低，優(yōu)選5ppm或更低，并且更優(yōu)選2ppm或更低；和（2) DNA濃度為20ppb (十億分率）或更低，優(yōu)選IOppb或更低，更優(yōu)選5ppb或更低并且通常低 于lppb。如果在純化過程上游使用蛋白A或其它蛋白質(zhì)試劑，那么通常期望的是（滲出的） 蛋白A的量被限制在濃度為20ppm或更低，一般為IOppm或更低，通常為5ppm或更低，并且 在一些實(shí)施方案中為Ippm或更低。而且，在一些實(shí)施方案中，藥學(xué)純的抗體組合物一般具 有基于抗體、二聚體和聚集體的總量的不超過5%，優(yōu)選不超過2%，并且通常不超過1 %的 二聚體和聚集體。這些雜質(zhì)的量還可相對(duì)于抗體的量表示。例如，藥學(xué)純的抗體組合物中 HCP的量一般低于約每mg抗體10ng，優(yōu)選低于約每mg抗體5ng，更優(yōu)選低于約每mg抗體 2ng〇
[0018] 適用于進(jìn)行AEX步驟的條件在本領(lǐng)域中是公知的，并且可使用常規(guī)的技術(shù)和方法 確定或最優(yōu)化。本發(fā)明中使用的AEX步驟降低至少一種雜質(zhì)的濃度或量。因此，通過對(duì)經(jīng) UF/DF純化的抗體組合物進(jìn)行AEX，從而減少至少一種雜質(zhì)來將其轉(zhuǎn)變成藥學(xué)純的抗體組 合物。通常，但不一定，被減少的雜質(zhì)為HCP。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案包括對(duì)經(jīng)UF/DF 純化的抗體組合物（濃度為至少l〇mg/mi，并且具有腸胃外可用的緩沖劑和pH)進(jìn)行AEX從 而降低HCP的濃度或量。在所有實(shí)施方案中，降低程度不受特別限制，并包括由此滿足純度 規(guī)格的小的但是可檢測(cè)的純度提高，例如25ppm至20ppm等。然而，純度增加的程度一般較 為顯著。
[0019] 可在本發(fā)明中純化的抗體不受特別限制。為了清楚，"抗體"以其最廣泛的含義 使用，包括任何免疫球蛋白（Ig)、其活性或所需變體以及其活性或所需片段（例如，F(xiàn)ab片 段、駱蛇科抗體（camelid antibody，單鏈抗體）和納米抗體（nanobody))?？贵w可以是多 克隆的或單克隆的，并且可以是天然存在的或重組產(chǎn)生的。因此，人、非人、人源化和嵌合抗 體均包括在術(shù)語"抗體"內(nèi)。通常，在本發(fā)明的過程中純化的抗體為屬于下述類別之一的單 克隆抗體：IgG、IgE、IgM、IgD和IgA，且更通常為IgG或IgA。如本領(lǐng)域中公知的那樣，抗 體可針對(duì)多種抗原，包括但不局限于癌癥相關(guān)的抗原（例如，HER-2)或促炎抗原（例如，諸 如TNF-α的促炎細(xì)胞因子）。合適的抗炎抗體的實(shí)例包括，但不限于抗TNF-α抗體例如阿 達(dá)木單抗、英夫利昔單抗、依那西普、格里木單抗和賽妥珠單抗；抗ILl-β抗體例如卡那單 抗；抗IL12/23(p40)抗體例如優(yōu)特克單抗（ustekinumab)和布雷奴單抗（briakinumab); 以及抗IL2R抗體，例如達(dá)利珠單抗。合適的抗癌抗體的實(shí)例包括，但不限于，抗BAFF抗體 例如貝利單抗（belimumab);抗CD20抗體例如利妥昔單抗；抗CD22抗體例如依帕珠單抗； 抗CD25抗體例如達(dá)利珠單抗；抗CD30抗體例如伊妥木單抗；抗CD33抗體例如吉妥單抗； 抗CD52抗體例如阿侖單抗；抗CD152抗體例如伊匹單抗；抗EGFR抗體例如西妥昔單抗；抗 HER2抗體例如曲妥珠單抗和帕妥珠單抗；抗IL6抗體例如司妥昔單抗；以及抗VEGF抗體例 如貝伐單抗。
[0020] 抗體在培養(yǎng)基中的細(xì)胞中常規(guī)產(chǎn)生或表達(dá)。如本領(lǐng)域中公知的那樣，所述細(xì)胞可 以是細(xì)菌、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體在例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 真核細(xì)胞中產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)目的抗體的特點(diǎn)選擇合適的細(xì)胞系。合適的哺 乳動(dòng)物細(xì)胞包括，例如 CHO、VERO、BHK、HeLa、CV1、MDCK、293、3T3、C127、PC12、HEK-293、PER C6、Sp2/0、NS0、W138細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系（特別是鼠類）。還可使用來自任意前述細(xì)胞的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體由CHO細(xì)胞產(chǎn)生。
[0021] 可使細(xì)胞在其中產(chǎn)生抗體的培養(yǎng)基是廣泛公知的，其可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。 如本領(lǐng)域中公知的那樣，培養(yǎng)基一般基于宿主細(xì)胞和克隆的特別需求而設(shè)計(jì)。培養(yǎng)基可含 有多種成分，例如無機(jī)鹽、碳水化合物（例如諸如葡萄糖、半乳糖、麥芽糖或果糖的糖類）、 氨基酸、維生素（例如B族維生素（例如B12)、維生素 A、維生素 E、核黃素、硫胺素和生 物素）、脂肪酸和脂質(zhì)（例如膽固醇和類固醇）、蛋白質(zhì)和肽或二肽（例如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋 白、纖連蛋白和胎球蛋白）、血清（例如含有白蛋白、生長(zhǎng)因子和生長(zhǎng)抑制劑的組合物，例 如胎牛血清、新生小牛血清和馬血清）、痕量元素（例如鋅、銅、硒和三羧酸中間體）以及 其組合。培養(yǎng)基通常含有緩沖劑，存在的常用緩沖劑包括PBS、Hanks BSS、Earles鹽類、 DPBS、HBSS、EBSS。培養(yǎng)基中存在的其它組分可包括抗壞血酸鹽、檸檬酸鹽、半胱氨酸/胱 氨酸、谷氨酰胺、葉酸、谷胱甘肽、亞油酸、亞麻酸、硫辛酸、油酸、棕櫚酸、卩比唆醛/吡哆素、 核黃素、硒、硫胺素、轉(zhuǎn)鐵蛋白。培養(yǎng)基可商購自，例如Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis，Mo. )、HyClone(Logan，Utah)、Invitrogen Corporation (Carlsbad，Cal if.)、 Cambrex Corporation(E. Rutherford，N. J. )、JRH Biosciences(Lenexa，Kans.)、Irvine Scientific (Santa Ana，Calif.)及其它公司。
[0022] 抗體的產(chǎn)生一般導(dǎo)致存在大量的不需要物質(zhì)。例如，諸如HCP、核酸（例如染色體 或染色體外DNA、核糖核酸（tRNA或mRNA))和脂質(zhì)（例如細(xì)胞壁物質(zhì)）的過程相關(guān)的雜質(zhì) 即為來自抗體產(chǎn)生細(xì)胞（也稱為"宿主細(xì)胞"）的不需要物質(zhì)（細(xì)胞碎片）的實(shí)例。此外， 例如其它緩沖劑、培養(yǎng)基添加劑或微生物污染物（例如細(xì)菌和/或病毒）的培養(yǎng)基組分也 為應(yīng)與目的抗體分離的不需要物質(zhì)。產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)，例如多聚體（例如二聚體、三聚體 等）、目的抗體的截短形式和凝集（agglomerate)形式（例如錯(cuò)誤折疊或變性形式）一般 為不需要的物質(zhì)。將抗體組合物中的這些不需要物質(zhì)稱為雜質(zhì)。通常，在產(chǎn)生（培養(yǎng)）后 立即獲得的抗體組合物的濃縮程度最低，并且具有最多的雜質(zhì)。使該初始或原始抗體（raw antibody)組合物進(jìn)行純化以回收不含一種或更多種雜質(zhì)的目的抗體。一般情況下，純化至 少包括捕獲步驟和通常至少一個(gè)精制步驟以形成部分純化的抗體組合物。
[0023] 在捕獲步驟之前，有時(shí)通過常規(guī)方法使原始抗體組合物澄清。為了方便起見，在本 文中將原始和澄清的抗體組合物共同稱為"初始抗體組合物"，無論抗體組合物是否澄清。
[0024] 捕獲步驟在本領(lǐng)域中是公知的。其目的是快速分離、穩(wěn)定和濃縮抗體。理想地，高 度去除可對(duì)活性或產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響的主要或有害雜質(zhì)。適用于進(jìn)行捕獲步驟的技術(shù)包括 多種類型的色譜，例如親和色譜（AC)、疏水相互作用色譜（HIC)、離子交換色譜（IEX)(例如 陽離子交換色譜（CEX))、疏水電荷誘導(dǎo)色譜（HCIC)和混合模式色譜。出于本發(fā)明的目的， 在捕獲步驟后獲得的抗體組合物為"部分純化的抗體組合物"。為了命名方便起見，有時(shí)也 將該捕獲的抗體組合物稱為"粗制的抗體組合物"。
[0025] 可對(duì)粗制的抗體組合物進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)精制步驟。精制的目的是除去大部分雜 質(zhì)。適用于精制的技術(shù)包括離子交換色譜（IEX)、疏水相互作用色譜（HIC)和羥基磷灰石色 譜。
[0026] 盡管上述技術(shù)在本領(lǐng)域中均是公知的，但是下文將對(duì)兩種優(yōu)選的技術(shù)親和色譜 (用于捕獲）和IEX(用于捕獲和/或精制）作詳細(xì)描述。
[0027] 親和色譜指這樣的分離方法，通過所述方法使抗體借助于其特異性結(jié)合特性與抗 體的親和配體結(jié)合?？蓪⑺龉δ苄杂H和配體固定在固體或半固體的支持物上，使得當(dāng)含 有抗體的組合物通過配體和固體支持物時(shí)，對(duì)配體具有特異性結(jié)合親和力的抗體吸附至配 體，而一種或更多種其它雜質(zhì)則不被吸附（或者以較低的親和力結(jié)合）并與抗體分離。一 般不結(jié)合（或不能良好結(jié)合）的雜質(zhì)的實(shí)例包括過程相關(guān)的雜質(zhì)（例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、 DNA、培養(yǎng)基組分）和一些產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)（例如抗體片段）。在一些實(shí)施方案中，在從配 體和支持物移出吸附的抗體之前，用緩沖劑洗滌含有配體的固體支持物一次或更多次以除 去額外的雜質(zhì)。在已經(jīng)除去一種或更多種雜質(zhì)之后，可從配體和支持物移出（洗脫）吸附 的抗體，從而導(dǎo)致抗體與初始組合物分離。從配體和支持物移出抗體的方法取決于配體， 并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，其可包括，例如改變環(huán)境（例如pH)、添加離液劑或變性劑或 者添加市售的洗脫緩沖劑。在一些實(shí)施方案中，可對(duì)抗體組合物使用一種以上親和純化 方法。多種親和配體是已知的。兩種最常用的為蛋白A和蛋白G(以及其組合）。固定化 配體在市場(chǎng)上有售。例如，蛋白A親和系統(tǒng)包括MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect Xtra、MabSelect SuRe LX、Sepaharose CL-4B、ProSep vA、ProSep vA Ultra、ProSep vA UltraPlus 和 Ceramic HyperD0
[0028] 本發(fā)明的捕獲步驟一般使用蛋白A親和色譜，特別使用MabSelect SuRe、ProSep vA Ultra 或 Poros MabSelect。MabSelect 和 MabSelect SuRe 兩者均使用高度交聯(lián)的瓊脂 糖基質(zhì)。MabSelect SuRe被開發(fā)來更好地耐受強(qiáng)堿性條件，所述條件通常被用于清洗柱。對(duì) 蛋白A樹脂進(jìn)行改性防止其與抗體的可變結(jié)構(gòu)域發(fā)生不需要的相互作用。ProS印vA Ultra 是一種基于多孔玻璃珠的樹脂。ProSep vA Ultra使高結(jié)合力與高通量組合，但是它也可具 有缺點(diǎn)，例如高度的蛋白A泄漏并且需要特殊的清洗劑。通常，親和捕獲的最優(yōu)選實(shí)施方案 包括 MabSelect SuRe。
[0029] 離子交換色譜包括陽離子交換色譜（CEX)和陰離子交換色譜（AEX)。AEX在上文 中已描述。CEX與之類似并在下文中對(duì)其進(jìn)行描述。陽離子交換色譜指以電荷差異為基礎(chǔ)， 利用陽離子交換基質(zhì)通過其可分離抗體和某種雜質(zhì)或某些雜質(zhì)的任何方法。陽離子交換基 質(zhì)一般含有共價(jià)結(jié)合的帶負(fù)電荷的基團(tuán)?？刹捎萌趸驈?qiáng)陽離子交換樹脂。根據(jù)PH，強(qiáng)陽離 子交換樹脂通常包含含有磺酸或磺酸鹽/酯基團(tuán)的支持性有機(jī)基團(tuán)。根據(jù)PH，弱陽離子交 換樹脂通常包含含有羧酸或羧酸鹽/酯基團(tuán)的支持性有機(jī)基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，可使 用多模式陽離子交換樹脂，其引入額外的結(jié)合機(jī)制以及離子相互作用，例如一種或更多種 氫鍵相互作用和疏水相互作用。合適的陽離子交換樹脂的實(shí)例在本領(lǐng)域中是公知的，其可 包括，但不限于，F(xiàn)ractogel、羧甲基（CM)、磺乙基（SE)、磺丙基（SP)、磷酸鹽/酯（P)和磺酸 鹽/ 酯（S)、PROPAC WCX-IOTM(Dionex)、Capto S、S-S印harose FF、Fractogel EMD S03M、 Toyopearl Megacap II SP 550C、Poros 50HS和SP-瓊脂糖凝膠基質(zhì)。在一些優(yōu)選實(shí)施方 案中，陽離子樹脂選自 Capto S、S_Sepharose FF、Fractogel EMD S03M、Toyopearl Megacap II SP 550C、Poros 50HS，最優(yōu)選Poros 50HS。在一些實(shí)施方案中，可對(duì)組合物使用一種以 上的陽離子交換色譜方法。
[0030] 如本領(lǐng)域中公知的那樣，對(duì)于抗體，可采用結(jié)合模式或流過模式的陽離子交換色 譜過程。在結(jié)合模式中，目的抗體被吸附至陽離子交換基質(zhì)，而一種或更多種雜質(zhì)則不結(jié) 合，由此使抗體與雜質(zhì)分離。在一些實(shí)施方案中，在從陽離子交換基質(zhì)移出吸附的抗體之 前，用緩沖劑洗滌陽離子交換基質(zhì)一次或更多次以除去另外的雜質(zhì)。利用結(jié)合模式的陽離 子交換色譜從組合物中除去一種或更多種雜質(zhì)后，可從陽離子交換基質(zhì)移出（洗脫）吸附 的抗體。相比之下，流過模式意指目的抗體不被顯著吸附至陽離子交換基質(zhì)，而一種或更多 種雜質(zhì)則被吸附（或被阻攔）至基質(zhì)?？贵w流過柱，同時(shí)雜質(zhì)被結(jié)合，從而導(dǎo)致雜質(zhì)與抗體 分離。周期性地，基質(zhì)需要通過去除結(jié)合的雜質(zhì)來再生或用新的基質(zhì)材料替換。
[0031] 將從捕獲步驟或精制步驟得到的抗體組合物視為部分純化的抗體組合物。一般如 下形成所述部分純化的抗體組合物：對(duì)初始抗體組合物進(jìn)行作為捕獲步驟的親和色譜（例 如蛋白、CEXA或混合模式色譜），接著進(jìn)行至少一個(gè)精制步驟。所述精制步驟通常為IEX，特 別是CEX步驟。在一些實(shí)施方案中，精制步驟包括以任意順序的CEX和AEX (即AEX在CEX 之后、CEX在AEX之后）。然后，通常對(duì)部分純化的抗體組合物（經(jīng)或不經(jīng)其它處理）進(jìn)行 UF/DF從而形成經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物。
[0032] 除上文討論的捕獲和精制步驟外，可對(duì)抗體組合物進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)病毒去除步 驟。當(dāng)病毒被滅活或通過物理方法將其從組合物中去除（或兩者）時(shí)，病毒被"去除"。在本 發(fā)明的一些實(shí)施方案中，病毒去除步驟在捕獲過程之后與精制之前和/或精制之后與UF/ DF之前進(jìn)行。通常，病毒滅活步驟在捕獲之后與精制之前進(jìn)行。病毒物理去除步驟通常在 精制之后與UF/DF之前進(jìn)行。
[0033] 當(dāng)涉及病毒的滅活時(shí)，所述病毒可保留在最終產(chǎn)品中，但以非感染性形式。病毒滅 活步驟可包括PH滅活步驟和/或化學(xué)滅活步驟。pH滅活步驟可包括將組合物的pH調(diào)節(jié) 至pH為約5. 0或更小，通常為約4. 0或更小，且一般為約1. 5至約4. 5,更一般為約2. 0至 約4.0。pH滅活步驟可包括在足以發(fā)生病毒去除（例如病毒滅活）的多種時(shí)間長(zhǎng)度范圍內(nèi) (例如1分鐘至2小時(shí)，且一般為45分鐘至75分鐘）的一個(gè)或更多個(gè)pH值下孵育組合物。 化學(xué)滅活步驟可包括用溶劑或去污劑處理、輻射和/或?qū)⑵涠虝罕┞对谧阋詼缁畈《镜母?溫下。病毒滅活的這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的 處理?xiàng)l件。
[0034] 當(dāng)病毒去除步驟包括通過從組合物中物理去除病毒時(shí)，一般涉及過濾。特別地，納 米過濾包括使組合物通過孔尺寸為例如，小于75nm例如小于50nm，甚至小于15nm的基質(zhì)， 從而使病毒與抗體分離。多種納米過濾器在市場(chǎng)上有售，并且在本領(lǐng)域中是已知的。
[0035] 可對(duì)部分純化的抗體組合物（經(jīng)或不經(jīng)病毒去除步驟）進(jìn)行UF/DF從而形成經(jīng) UF/DF純化的抗體組合物。UF/DF是超濾和滲濾（diafiltration)的組合操作。所述步驟 去除顆粒、濃縮抗體并更換/改性抗體組合物的水性或緩沖組合物。盡管在本領(lǐng)域中是公 知的，但是為了清楚，術(shù)語"超濾"指通過使組合物通過具有特定孔尺寸直徑的一種或更多 種半滲透過濾器（或膜或介質(zhì)）使雜質(zhì)與抗體分離的過程，其中較大的分子（一般> l〇3Da 至> 106Da)被保留在過濾器上，而水和較低分子量的分子則通過過濾器。這些較低分子量 的分子可以是培養(yǎng)基組分、抗體片段和/或其它污染物（雜質(zhì)）例如脂多糖類。通常，本發(fā) 明的抗體基本在滯留流（retentate stream)中，而雜質(zhì)基本在滲透流（permeate stream) 中。當(dāng)指過濾時(shí)，術(shù)語"滲透流"指在過濾期間通過過濾器的組合物級(jí)分。當(dāng)指過濾時(shí)，術(shù) 語"滯留流"指在過濾期間留在過濾器上或不能通過過濾器孔的組合物級(jí)分。該過程還濃 縮抗體組合物。
[0036] 合適的UF/DF裝置類型是本領(lǐng)域人員已知的，并且可基于多種因素進(jìn)行選擇， 例如待過濾抗體的分子量、待過濾組合物組分的量和尺寸、待過濾組合物的體積以及 待過濾組合物的細(xì)胞密度和生存力。在一些實(shí)施方案中，可使用諸如膜超濾器、板式 超濾器、筒式（cartridge)超濾器、袋式超濾器或真空超濾器的過濾器?？刹捎玫氖?售超濾器由多個(gè)供應(yīng)商制造，例如 Millipore Corporation (Billerica，Mass. )、Pall Corporation(East Hills，Ν·Y. )、GE Healthcare Sciences(Piscataway, N. J.)和 Sartorius Corporation(Goettingen，Germany)〇
[0037] 滲濾的作用是準(zhǔn)備抗體組合物以用于其終端用途，例如儲(chǔ)存、冷凍干燥、腸胃外制 劑等。緩沖體系一般通過添加/去除/替換緩沖劑和/或其濃度來更換和/或改性。可引 入額外的添加劑，以例如調(diào)節(jié)PH、張力、溶解度和/或穩(wěn)定性。穩(wěn)定性可指使抗體組合物穩(wěn) 定在液體狀態(tài)或可指在冷凍干燥或重構(gòu)期間保護(hù)抗體。例如，可在曲妥珠單抗組合物中添 加海藻糖作為穩(wěn)定劑。
[0038] 如果抗體組合物的終端用途是腸胃外制劑，那么可通過滲濾步驟添加一些或所 有的所需制劑賦形劑。這些賦形劑可包括磷酸鹽緩沖液（例如磷酸鈉溶液）、鹽水（例如 0.8% )、Ringei^ s葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸Ringei^ s、電解質(zhì)、表面活性劑（聚山 梨醇酯）、穩(wěn)定劑和防腐劑例如抗微生物劑或抗氧化劑。
[0039] 滲濾不必使組合物處于最終的藥物形式也不必提供每一種賦形劑?？稍赨F/DF之 后或接下來的AEX處理步驟之后添加賦形劑或完成組合物改變。然而，UF/DF步驟通常使 抗體組合物置于接近最終藥物形式，并因此可在UF/DF期間向經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物 中引入一種或更多種上述添加劑。
[0040] 對(duì)經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物進(jìn)行上述AEX以減少例如HCP的一種或更多種雜 質(zhì)，并形成藥學(xué)純的抗體組合物。出于效率原因，AEX處理通常直接跟著UF/DF步驟進(jìn)行。 然而，可能發(fā)生插入步驟（intervening step)。這些步驟可包括額外的UF步驟或病毒去 除步驟。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，不在UF/DF步驟和AEX步驟之間插入其它色譜純化步驟。 該優(yōu)選不排除多個(gè)AEX步驟。
[0041] 在本發(fā)明的AEX步驟之后，可對(duì)抗體組合物進(jìn)行進(jìn)一步改性以用于其終端用途。 盡管在AEX步驟之后進(jìn)行額外的步驟是可能的，但是一般不進(jìn)行另外的色譜純化步驟。可 進(jìn)行病毒去除步驟以及組合物改性。在填充到塊（bulk)或填充到小瓶之前，可進(jìn)行任意的 下述步驟中：(a)向所述藥學(xué)純的抗體組合物中添加賦形劑；(b)濃縮所述藥學(xué)純的抗體組 合物；（c)稀釋所述藥學(xué)純的抗體組合物；（d)調(diào)節(jié)所述藥學(xué)純的抗體組合物的pH ;和/或 (e)無菌過濾所述藥學(xué)純的抗體組合物。在進(jìn)行或不進(jìn)行額外的步驟的情況下，可將抗體組 合物作為腸胃外制劑準(zhǔn)備用于大量填充或分散在小瓶中?；蛘?，可冷凍干燥所述組合物以 用于儲(chǔ)存和后期重構(gòu)。
[0042] 在一些實(shí)施方案中，已經(jīng)進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明之AEX的藥學(xué)純的抗體組合物的抗體濃 度為 5mg/ml 至 150mg/ml，例如 15mg/ml 至 50mg/ml 和 20mg/ml 至 25mg/ml。
[0043] 含有通過本發(fā)明方法制備之抗體的藥物組合物可含有可藥用載體（carrier)，包 括例如離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白（例如人血清白蛋白）、緩沖物質(zhì) (例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀）、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽類 或電解質(zhì)（例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態(tài)二氧化硅、三硅 酸鎂）、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、聚乙 烯-聚氧丙烯嵌段聚合物和聚乙二醇。用于腸胃外施用的制劑包括無菌水或非水溶液、混 懸劑和乳劑。非水溶劑的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、例如橄欖油的植物油和例如油酸乙酯的 可注射有機(jī)酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳劑或混懸劑，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃 外制劑可以是單一的推注（bolus)劑量、輸注或負(fù)荷推注劑量繼之以維持劑量。
[0044] 在分離抗體時(shí)，在一些實(shí)施方案中，可存在大體積的組合物，例如在商業(yè)制造過程 期間。表達(dá)待分離之抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物可在尺寸適合用于大規(guī)模制造的容器（例如生物反 應(yīng)器）中生長(zhǎng)。大體積對(duì)分離過程提出了許多挑戰(zhàn)。例如，使用大體積時(shí)，可放大通過過濾 器的流速（flow rate)的小變化對(duì)回收分離的抗體的影響。同樣地，使用大體積時(shí)，還可放 大提高初始組合物中的細(xì)胞密度對(duì)回收產(chǎn)品的影響。因此，使用大體積組合物存在著可被 放大的獨(dú)特問題，并且與使用更小的體積相比，其具有更大的后果。因此，在一些實(shí)施方案 中，本發(fā)明涉及分離在大體積組合物中存在之抗體的方法。術(shù)語"大體積"指與抗體的商業(yè) 和/或工業(yè)生產(chǎn)相關(guān)的體積。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語"大體積"指10升至2, 000升、20升 至1，000升或50升至500升。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語"大體積"指至少500升、至少750 升、至少1，000升、至少1，250升、至少1，500升、至少2, 000升、至少5, 000升或至少10, 000 升。
[0045] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過本文所述的任意方法制備的抗體。
[0046] 在一些實(shí)施方案中，所述抗體或含有通過本文所述的任意方法制備的抗體的組合 物是可藥用的。"可藥用"指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)、適于與人類和動(dòng)物組織接觸且不會(huì) 有過度的毒性或其它并發(fā)癥，同時(shí)具有合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比的抗體或組合物。
[0047] 在一些實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法分離的抗體可用于治療對(duì)象。本文所用的 "對(duì)象"指歸類為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人類和非人類，例如，但不限于，家養(yǎng)和農(nóng)場(chǎng)動(dòng) 物、動(dòng)物園動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物和寵物。在一些實(shí)施方案中，對(duì)象指人。
[0048] 術(shù)語"治療"及類似用語指治療性治療和預(yù)防性、維持性或防御性措施兩種，其中 目的是預(yù)防或緩解（減輕）不期望的生理病癥、障礙或疾病，或者獲得有益的或期望的臨床 結(jié)果。
[0049] 本發(fā)明方法分離之抗體產(chǎn)品的施用途徑可以是，經(jīng)由例如經(jīng)口、腸胃外、吸入或表 面模式的施用。
[0050] 通過下述非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0051] 實(shí)施例
[0052] 實(shí)施例1
[0053] 常規(guī)純化
[0054] 使用下述方法純化四次。使含有由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的曲妥珠單抗的組合物在蛋白A 柱上進(jìn)行捕獲、病毒滅活、使用AEX隨后使用CEX的精制、病毒過濾，然后進(jìn)行UF/DF。如下 進(jìn)行所述步驟：
[0055] 如下進(jìn)行蛋白 A 步驟(MabSelect SuRe,GE Healthcare):開始用 0. IM 的 NaOH清 洗柱15分鐘，接著用經(jīng)Milli Q純化的水（MQ)漂洗。然后，用pH 7. 4的PBS平衡柱。將 收獲物以每ml MabSelectSure彡25mg曲妥珠單抗的比加樣到柱上。然后，用平衡緩沖劑 洗滌柱，接著用25mM NaAc pH 5.0洗滌。然后，用25mM醋酸鹽pH 3.0洗脫抗體。
[0056] 隨后進(jìn)行病毒滅活。用0. IM HCl將蛋白A洗脫池 （elution pool)的pH調(diào)至pH 3. 5,并使其在該pH下保持60分鐘至75分鐘。用0. IMNaOH將pH再升至pH 4. 5,接著用 0. 22 μ m過濾器進(jìn)行無菌過濾。
[0057] 隨后進(jìn)行陰離子交換色譜。用MQ預(yù)沖洗陰離子交換膜（Mustang Q過濾器，Pall)， 然后用5個(gè)膜體積（MV)的I. OM NaOH清洗。用25mM H3P04+1M NaCl中和，然后用pH 4. 5的 25mM NaAc+lOmM NaCl平衡過濾器。將來自上述病毒滅活步驟的最多（彡）3. 0g(ml MV)-1 抗體加樣至過濾器。抗體流過過濾器，同時(shí)例如殘留的CHO蛋白和DNA的污染物則結(jié)合至 過濾器。用25mM NaAc+lOmM NaCl pH 4. 5沖洗過濾器，并通過0. 22μπι無菌過濾器過濾洗 脫的產(chǎn)品。
[0058] 隨后進(jìn)行陽離子交換色譜。用0.5Μ NaOH清洗陽離子交換色譜柱（Poros HS 50 柱；Applied Biosystems)，并用 MQ 漂洗。用 25mMNaAcpH 4. 5+10mM NaCl 完成平衡。以 IOg 至20g抗體/ml樹脂的濃度，加樣經(jīng)陰離子交換色譜過程純化的抗體塊。然后，用平衡緩沖 劑洗滌柱，接著用25mM NaAc pH 4. 5+200mM NaCl洗滌。然后，使用3個(gè)柱體積的25mM NaAc pH 4. 5+200mM NaCl 至 25mM pH 4. 5NaAc+290mM NaCl 的梯度洗脫抗體產(chǎn)品。用 25mM NaAc pH 4. 5+290mM NaCl 繼續(xù)洗脫。
[0059] 隨后進(jìn)行病毒過濾。利用使用加壓過濾系統(tǒng)的Viresolve Pro膜（Millipore)，根 據(jù)供應(yīng)商的說明書對(duì)陽離子交換色譜抗體產(chǎn)品進(jìn)行病毒過濾。用MQ預(yù)沖洗Viresolve pro 裝置，并用 25mM NaAc+290mM NaCl pH 4. 5 平衡。在應(yīng)用加樣量為< 565g m-2(Planova)、 <2kg m-2(Viresolve Pro)的 CEX 塊后，用 25mM NaAc+290mM NaCl pH 4.5 沖洗過濾器。 停止過濾后，使用0. 22 μ m過濾器對(duì)抗體產(chǎn)品進(jìn)行病毒過濾。
[0060] 使用分子量截?cái)酁?0kDa的Biomax 50KD (運(yùn)行1)或30KD (運(yùn)行2至4)的UFDF 過濾器（Millipore)進(jìn)行超濾/滲濾（UF/DF)。用MQ預(yù)沖洗過濾器，用0. IM NaOH清洗，然 后用MQ漂洗以除去NaOH。然后，用25mM醋酸鹽pH 4. 5+290mM NaCl平衡過濾器。隨后，以 < 730g抗體/m2膜的加樣量，將經(jīng)病毒過濾的抗體產(chǎn)品加樣至過濾器。在濃度達(dá)到25mg/ ml至35mg/ml后，將抗體產(chǎn)品的緩沖劑更換成50mM海藻糖+4. 2mM組氨酸（pH 6. 0)。使用 10個(gè)滲濾體積來更換緩沖劑。
[0061] 測(cè)定每次運(yùn)行（run)之最終產(chǎn)品的含量、產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)（二聚體、聚集體）和過 程相關(guān)的雜質(zhì)（HCP、殘留蛋白A、殘留DNA)。將這些結(jié)果總結(jié)于表1中（L0Q意指量化的界 限）。
[0062] 表1 :從4次運(yùn)行獲得之結(jié)果的總結(jié)
[0063]

【權(quán)利要求】
1. 一種純化抗體組合物的方法，其包括對(duì)經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物進(jìn)行陰離子交換 色譜（AEX)以形成藥學(xué)純的抗體組合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物的抗體濃度為至 少lmg/ml，例如至少5mg/ml和至少10mg/ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物的抗體濃度為 5mg/ml 至 250mg/ml，例如 10mg/ml 至 150mg/ml 以及 15mg/ml 至 100mg/ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物的抗體濃度不大 于 250mg/ml〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物的抗體濃度為 20mg/ml 至 50mg/ml，例如 30mg/ml 至 35mg/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括將所述藥學(xué)純的抗體組合物填 充到小瓶中。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其還包括在所述填充步驟之前無菌過濾所述藥學(xué)純的 抗體組合物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其還包括在所述填充步驟之前的至少一個(gè)下述步驟： (a)向所述藥學(xué)純的抗體組合物添加賦形劑；(b)濃縮所述藥學(xué)純的抗體組合物；（c)稀釋 所述藥學(xué)純的抗體組合物；和/或（d)調(diào)節(jié)所述藥學(xué)純的抗體組合物的pH。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括對(duì)部分純化的抗體組合物進(jìn)行 UF/DF以形成所述經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其還包括使抗體細(xì)胞培養(yǎng)收獲物進(jìn)行抗體捕獲步驟 和任選的至少一個(gè)精制步驟以形成所述部分純化的抗體組合物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述捕獲步驟利用親和色譜，例如蛋白A色譜。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述捕獲步驟利用陽離子交換色譜（CEX)、疏水 電荷誘導(dǎo)色譜（HCIC)或混合模式色譜。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述捕獲步驟之后進(jìn)行至少一 個(gè)精制步驟。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述至少一個(gè)精制步驟選自離子交換色譜 (IEX)、疏水相互作用色譜（HIC)和羥基磷灰石色譜。
15. -種純化抗體組合物的方法，其包括： 對(duì)抗體細(xì)胞培養(yǎng)收獲物進(jìn)行例如蛋白A色譜的親和色譜以形成粗制的抗體組合物； 對(duì)所述粗制的抗體組合物進(jìn)行至少一個(gè)精制步驟以形成部分純化的抗體組合物； 對(duì)所述部分純化的抗體組合物進(jìn)行UF/DF步驟以形成經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物；以 及 對(duì)所述經(jīng)UF/DF純化的抗體組合物進(jìn)行陰離子交換色譜（AEX)以形成藥學(xué)純的抗體組 合物。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其還包括對(duì)所述藥學(xué)純的抗體組合物進(jìn)行例如納米 過濾的病毒去除步驟。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述至少一個(gè)精制步驟包括使所述粗制的抗體 組合物進(jìn)行至少一個(gè)離子交換色譜（IEX)步驟。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體為曲妥珠單抗或帕妥珠 單抗。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。
20. -種純化抗體組合物的方法，其包括對(duì)抗體組合物進(jìn)行足以降低所述抗體組合物 中例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的至少一種雜質(zhì)之量的陰離子交換色譜（AEX)，所述抗體組合物的 抗體濃度為至少l〇mg/ml，例如20mg/ml至50mg/ml和30mg/ml至35mg/ml，并且具有腸胃 外可用的緩沖劑和pH。
【文檔編號(hào)】C07K1/36GK104487448SQ201280074129
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月21日
【發(fā)明者】巴斯蒂安·彼特·阿里安·科克, 埃韋爾迪娜·約瑟菲娜·威廉明娜·維克-巴斯滕萬, 托馬斯·安東尼厄斯·貝納杜斯·貝耶爾德, 馬里亞·馬爾扎佩雷茲, 米歇爾·亨德里克斯·馬里亞·埃平克 申請(qǐng)人:斯索恩生物制藥有限公司