殼聚糖酶的純化、基因克隆及其酶學特性的鑒定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明殼聚糖酶的純化、基因克隆及其酶學特性的鑒定是從被污染的酵母培養(yǎng)液中分離到一菌株，經鑒定為一種革蘭氏陽性桿菌，其所分泌的主要蛋白產物經純化后，測定了它的N-端氨基酸序列，與已知的幾種內切殼聚糖酶十分類同。根據其同源DNA序列，通過PCR方法克隆了其全長基因。該菌株生長極快，其組成型分泌產物主要為內切殼聚糖酶。該酶通過疏水層析和分子篩兩步即得到純化。進一步研究了該酶的酶學性質及其催化殼聚糖降解為殼寡糖的條件。提高該殼聚糖酶的產率后，有望用于殼寡糖的生產，有實際應用價值。
【專利說明】殼聚糖酶的純化、基因克隆及其酶學特性的鑒定
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一株革蘭氏陽性桿菌，該菌分泌一種殼聚糖酶，特別涉及對該殼聚糖酶的純化、基因克隆及其酶學特性的鑒定。
【背景技術】
[0002]幾丁質(chitin)主要是N-乙酰葡萄糖胺通過β-1，4_糖苷鍵形成的鏈狀多聚物，主要存在于水生甲殼動物、軟體動物和節(jié)肢動物的外殼中(如蝦、蟹等)，每年產量超過10億噸，僅次于纖維素，是一類豐富的自然資源。但幾丁質不溶于常用溶劑，直接利用非常困難。將丁質用堿液處理后得到脫乙?；a物(脫乙酰度為65%~99%，以70%~80%最常見)，即殼聚糖(chitosan)。殼聚糖在自然界中也存在，主要在一些真菌和一些綠藻的細胞壁中。但目前生產中應用的殼聚糖基本上是幾丁質的脫乙?；a物。與幾丁質相比，殼聚糖可溶于酸性溶劑并帶正電荷，可用于食品、制藥、紡織、污水處理等行業(yè)。殼聚糖可進一步通過化學法或酶法降解成殼寡糖(一般由幾個到十幾個糖殘基組成)。殼寡糖的水溶性好，而且具有多種生物活性，例如可以抑制細菌和真菌生長，具有抗腫瘤與調節(jié)免疫活性，可增強植物抗病性等。所以殼寡糖的研究近年來受到越來越多的重視，可能成為一個新興產業(yè)。
[0003]殼聚糖酶(chit0SanaSe，EC 3.2.1.123)可以水解殼聚糖中的β_1，4_糖苷鍵，將殼聚糖降解。已發(fā)現(xiàn)的殼聚糖酶絕大部分為內切酶，可以將殼聚糖降解為殼寡糖。目前研究最多的是來源于細菌和真菌的殼聚糖酶。相對于化學水解法，利用殼聚糖酶酶解生產殼寡糖有其獨特的優(yōu)勢，例如殼寡糖的得率高，對環(huán)境污染小等。但其前提是要開發(fā)出廉價的殼聚糖酶，所以尋找合適的殼聚糖酶對酶解法生產殼寡糖非常重要。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于得到了一株革蘭氏陽性桿菌，該菌分泌一種殼聚糖酶，能夠降解殼聚糖得到殼聚二糖和殼聚三糖。
[0005]我們從被污染的酵母培養(yǎng)液中分離到一雜菌，為革蘭氏陽性桿菌，其分泌的主要蛋白產物，經分離純化后，測定其N-端氨基酸序列與已知的幾種殼聚糖酶極相似，據此克隆了其全長基因，并研究其酶學性質。該酶能快速高效地將殼聚糖降解為殼寡糖，由于該桿菌生長快，主要分泌產物為殼聚糖酶，有望用于殼寡糖的生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1:Bacillus sp.ΤΚ-02 革蘭氏染色。
[0007]圖2 =SDS-PAGE分析發(fā)酵上清(A)和純化產物(B):M為蛋白分子量標準；
[0008]Sup為發(fā)酵上清；1為初步純化產物；2為二次純化產物。
[0009]圖3 =HPLC進行純度鑒定結果。
[0010]圖4:電噴霧質譜進行分子質量測定結果?！揪唧w實施方式】:
[0011]實施例1:
[0012]殼聚糖酶生產菌株的培養(yǎng):我們從被污染的酵母培養(yǎng)液中分離到一雜菌，革蘭氏染色以及形態(tài)觀察表明它是一種革蘭氏陽性桿菌(圖1)，暫命名為Bacillussp.TK-02。該菌株先在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜(30°C )，然后挑取單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中于30°C震蕩培養(yǎng)24h。將菌液離心(5000g，IOmin)，收集上清。
[0013]實施例2:
[0014]殼聚糖酶的純化與N-端氨基酸序列測定:該菌發(fā)酵液上清組成相對簡單，分泌表達產物主要為該殼聚糖酶(圖2A)。將培養(yǎng)液上清濃縮后進行分離純化，首先用疏水層析的方法將該殼聚糖酶從大體積的發(fā)酵液上清中分離出來，SDS-PAGE鑒定表明該步純化得到的殼聚糖酶主要含有一種分子質量較大的雜蛋白(圖2B，lane I)。據此，再通過分子篩進行純化，便得到了高純度的殼聚糖酶(圖2B，lane2)。該殼聚糖酶的純度進一步用C3反相HPLC進行鑒定。如圖3所示，該酶在HPLC上只有一個峰，其純度大于95%。洗脫的殼聚糖酶用電噴霧質譜測定其分子質量(圖4):測定的分子質量(44017U)與預期的分子質量(45780U)有較大出入，測定的分子質量比理論值小1763u。分析該殼聚糖酶的C端序列發(fā)現(xiàn)其含有雙堿性氨基酸(KK)，推測純化到的該殼聚糖酶在該雙堿性氨基酸處被剪切，由此得到的殼聚糖酶的理論分子質量為44040U，與測定的分子質量基本相符，誤差僅千分之一左右。[0015]在SDS-PAGE上得到單一蛋白條帶，其測定的N-端氨基酸序列為:AAAKEMKPFPQQ。通過網上蛋白質序列檢索(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST),找到11條相同的序列，它們都是殼聚糖酶，而且全部來源于桿菌屬(Bacillus)。根據殼聚糖酶活力測定，我們推測純化到的蛋白是一種殼聚糖酶。
[0016]實施例3:
[0017]殼聚糖酶基因的克隆:根據其它殼聚糖酶的DNA序列，取其信號肽前及終止信號TAA的保守基因序列,設計引物如下:Primer I:
[0018]5， _tta_aaaggagctgacaacataat3， ；Primer 2:5， —ttaatatcgtatccttcataaattgca-3’。以菌體基因組DNA為模版，用上述引物進行PCR擴增。擴增出一約1.3kb的序列，再克隆到T-載體后進行DNA序列測定。通過網上檢索(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST)其序列與其它11種殼聚糖酶有高度同源，達96 %~98 %，它們在GenBank的編號分別是:AAQ 75085、ZP00240544、AAK 07481、YP 084010、NP 832437、NP845032、BAB 19277、AAQ 75084, AAQ 19679、AA049750和AAQ 19678。它們都屬于糖苷水解酶8家族，而且全部來源于桿菌屬(Bacillus)。該基因編碼453個氨基酸，其中N-端46個殘基為前導肽，在分泌的成熟酶中被切除。
[0019]實施例4:
[0020]殼聚糖酶最適溫度和最適pH的測定:對該殼聚糖酶在不同溫度下的反應速度進行了測定。如圖6所示，該酶在65°C活性最高，但在50°C的活性也達到了最大活力的70%。綜合考慮活力與熱穩(wěn)定性，該酶的其它活力測定均在50°C進行，此時該酶既保持較高的活力又比較穩(wěn)定。此外，該殼聚糖酶在ρΗ4.5~ρΗ6.0活力最高，pH低于4.5時活力迅速下降。在PH高于6.0時，由于殼聚糖的溶解度降低，所以測得的酶活力也隨之降低。該酶在酶解反應緩沖液中(0.1moI/LNaAc-HAc, pH4.5)于60°C時半衰期很短，只有幾分鐘(雖然在該溫度下活力高)，而在50°C比較穩(wěn)定，半衰期約3h。在室溫下(23°C )，該酶在反應緩沖液中(0.lmol/L NaAc-HAc,pH4.5)可保存數天而活力不喪失。該酶的底物飽和曲線達到最大反應速度一半時的底物濃度約為0.04mg/ml。酶活力測定在不同溫度下進行，底物為
0.5mg/ml殼聚糖(溶于0.lmol/L NaAc-HAc, ρΗ4.5)。殼聚糖酶活力測定在50°C進行，殼聚糖溶解在0.lmol/L NaAc-HAc (pH4.5)緩沖液中。
[0021]測定最適溫度時，將0.5mg/ml殼聚糖溶于0.lmol/L NaAc-HAc，pH4.5緩沖液中作為底物，測定該酶在不同溫度下的反應速度。測定最適PH時，先將殼聚糖溶解在0.lmol/LHA c中(0.5mg/ml)，然后用4mol/L NaOH調到所需pH值。酶解反應在50°C下測定。
[0022]實施例5:
[0023]內切殼聚糖酶活性的鑒定:內切或外切殼聚糖酶活性通過測定殼聚糖溶液黏度判斷，溶液黏度用烏氏黏度計測定。將10mg/ml殼聚糖溶液(溶于0.1moI/LNaAc-HAc, pH4.5)加入到烏氏黏度計中，于50°C水浴預熱。隨后加入純化的殼聚糖酶，混勻，殼聚糖溶液的粘度迅速下降，30nim內下降超過70% ;而此時還原糖的產生量卻很少，約I %。因此可確定該殼聚糖酶為內切酶。酶解反應在50°C進行，于不同時間測定溶液黏度變化，并在不同時間取樣測定還原糖的生成量。
[0024]實施例6:
[0025]殼聚糖水解產物 的薄層層析分析:于10mg/ml殼聚糖溶液(溶于0.1mol/LNaAc-HAc, pH4.5)中加入一定量的殼聚糖酶(Img殼聚糖酶水解200g殼聚糖)，50°C下保溫反應，于不同反應時間取樣在硅膠薄板上層析。薄層層析用正丙醇:30%氨水(體積比2: I)展開，用0.1%印三酮(溶于正丙醇飽和水中)顯色。
[0026]該酶水解殼聚糖得到的最終產物為二糖和三糖，而不是單糖。這也進一步說明它是內切殼聚糖酶。通過控制酶解時間，可以得到不同鏈長的殼寡糖混合物，即該酶可以用來把殼聚糖轉化為殼寡糖，可有望用于殼寡糖的生產。
【權利要求】
1.一株革蘭氏陽性桿菌，暫命名為Bacillus sp.TK-02。
2.如權利要求1所述的桿菌(Bacillussp.TK-02),其特征在于 1)該菌生長快； 2)其分泌的主要蛋白產物N-端氨基酸序列與已知的幾種殼聚糖酶極相似； 3)其核酸序列與其它11種殼聚糖酶有高度同源，達96%~98%； 4)能夠非誘導性分泌胞外殼聚糖酶； 5)能夠分泌胞外殼聚糖酶，降解殼聚糖得到二糖和三糖； 6)該酶的反應溫度為50°C，在PH4.5~PH6.0時活力最高。
3.一種降解殼聚糖生產二糖和三糖的方法，其特征在于利用生物殼聚糖酶降解殼聚糖。
4.一種以內切的方式降 解殼聚糖做種產生殼聚二糖和殼聚三糖。
【文檔編號】C12N1/20GK103881943SQ201210563604
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月24日 優(yōu)先權日:2012年12月24日
【發(fā)明者】楊艷菊, 何勝祥 申請人:蘇州中同生物科技有限公司