一種LKB1mRNA檢測(cè)方法、試劑盒及基因芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種LKB1mRNA檢測(cè)方法，包括以下步驟：制備LKB1mRNA原位雜交探針；用量子點(diǎn)標(biāo)記LKB1mRNA原位雜交探針，得到量子點(diǎn)LKB1mRNA原位雜交探針；用量子點(diǎn)LKB1mRNA原位雜交探針與標(biāo)本進(jìn)行原位雜交；將雜交后的標(biāo)本置于顯微鏡下觀察。本發(fā)明還提供了包含上述量子點(diǎn)LKB1mRNA原位雜交探針的試劑盒及基因芯片。本發(fā)明的檢測(cè)方法使用量子點(diǎn)LKB1mRNA原位雜交探針，量子點(diǎn)比其他熒光染料毒性小，使用更安全，著色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，進(jìn)行重復(fù)觀察；操作簡(jiǎn)單、靈敏度高。
【專利說(shuō)明】—種LKBImRNA檢測(cè)方法、試劑盒及基因芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種LKBlmRNA檢測(cè)方法、試劑盒及基因芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]人LKBl (Liver Kinase BI)基因或稱 STKll (Serine-Threonine kinasell)基因，定位于人染色體19pl3.3位置，含10個(gè)外顯子，編碼的LKBl蛋白由433個(gè)氨基酸組成，分子量約為50kDa，包括激酶區(qū)域(44-309)、N端調(diào)節(jié)域和C端調(diào)節(jié)域。N端調(diào)節(jié)域含一個(gè)核定位序列，使LKBl蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。LKBl基因編碼一種絲-蘇氨酸蛋白激酶，參與多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞周期阻滯、P53介導(dǎo)的凋亡、細(xì)胞極性誘導(dǎo)等，介導(dǎo)TGF-β、G蛋白偶聯(lián)等信號(hào)通路，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，在人體多種組織中均有表達(dá)，以上皮、睪丸生精小管、肝臟、小腸和骨骼肌最多。LKBl基因是腫瘤易患綜合癥，即PJ綜合征(Peutz-Jeghers syndrome,PJS)的致病基因,在高達(dá)90%的PJS病人中可檢測(cè)到LKBl基因的胚系突變。LKBl基因的功能異常還與全身多種散發(fā)性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如在30-40%的非小細(xì)胞肺癌、20%的宮頸癌、19%鱗狀細(xì)胞癌及13%乳腺侵潤(rùn)性導(dǎo)管癌中均有LKBl基因的失活。另外，LKBl基因在惡性腫瘤發(fā)生中起著重要作用，研究證實(shí)LKBl能夠使細(xì)胞周期停滯在Gl期，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。LKBl基因是一個(gè)較為普遍的抑癌基因。LKBl基因表達(dá)情況為腫瘤發(fā)生和預(yù)后影響的一個(gè)重要中間指標(biāo)，對(duì)揭示LKBl基因抑制細(xì)胞惡性增殖的分子背景有重要的意義，因此，LKBl基因表達(dá)情況的檢測(cè)，即LKBl蛋白水平檢測(cè)或LKBlmRNA的水平檢測(cè)是亟待解決的問題。
[0003]目前，現(xiàn)有技術(shù)中LKBl基因表達(dá)情況的檢測(cè)主要為L(zhǎng)KBl蛋白的檢測(cè)，一種現(xiàn)有技術(shù)利用兔源多克隆抗體作為一抗，然后用標(biāo)記了化學(xué)顯色試劑或者熒光基團(tuán)的二抗對(duì)一抗進(jìn)行標(biāo)記，一抗與LKBl蛋白結(jié)合后再用化學(xué)顯色試劑的顏色或者熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)來(lái)判斷LKBl蛋白的豐度。這種間接的檢測(cè)方法步驟繁瑣耗時(shí)長(zhǎng)，并且由于多克隆抗體的特異性不強(qiáng)導(dǎo)致非特異性信號(hào)的產(chǎn)生，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有很大影響。還有一種現(xiàn)有技術(shù)是利用DAB顯色的原理，對(duì)LKBl鼠源單克隆抗體進(jìn)行顯色標(biāo)記，然后LKBl抗原免疫組化染色，再用光學(xué)顯微鏡觀察，出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的為陽(yáng)性，綜合考慮陽(yáng)性細(xì)胞著色深淺和陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞的比例兩項(xiàng)指標(biāo)，進(jìn)行半定量判斷結(jié)果。這種方法中使用的DAB染色劑有毒性，為疑似致癌物質(zhì)，不安全，另外，顯色劑顯色反應(yīng)受溫度影響大，且顯色時(shí)間受到限制，不能長(zhǎng)期保存，實(shí)驗(yàn)人員無(wú)法將組織切片保存進(jìn)行重復(fù)觀察。LKBlmRNA水平檢測(cè)方法還未見報(bào)道。
[0004]量子點(diǎn)具有寬的激發(fā)光譜和窄的發(fā)射光譜(光譜寬在20_40nm之間)，通過改變量子點(diǎn)的尺寸或者改變量子點(diǎn)內(nèi)核的組分可以在很大范圍內(nèi)調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的發(fā)射光譜。量子點(diǎn)與有機(jī)熒光團(tuán)相比有幾個(gè)突出的光學(xué)特點(diǎn):窄的發(fā)射光譜能減少光譜重疊，能同時(shí)區(qū)別多個(gè)熒光團(tuán)；寬的激發(fā)光譜能在單一波長(zhǎng)下激發(fā)多種顏色的光譜。此外量子點(diǎn)具有光穩(wěn)定性和抗降解性，對(duì)細(xì)胞的毒性小。這些獨(dú)特的性質(zhì)使量子點(diǎn)能在體內(nèi)跟蹤多個(gè)細(xì)胞和制備體外多個(gè)分子生物傳感器，由于量子點(diǎn)具有可調(diào)諧的發(fā)光波長(zhǎng)，量子點(diǎn)能促進(jìn)組織深層的細(xì)胞成像。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提出一種LKBlmRNA檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0006]制備LKBlmRNA原位雜交探針；
[0007]用量子點(diǎn)標(biāo)記LKBlmRNA原位雜交探針，得到量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針；
[0008]用量子點(diǎn)LKBl mRNA原位雜交探針與標(biāo)本進(jìn)行原位雜交；
[0009]將雜交后的標(biāo)本置于顯微鏡下觀察，
[0010]其中，所述的LKBlmrNA原位雜交探針為一段與LKBlmRNA特異性結(jié)合的單鏈DNA或單鏈RNA ;所述的標(biāo)本為細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本,所述的細(xì)胞標(biāo)本為組織印片、細(xì)胞爬片或細(xì)胞涂片，所述的組織標(biāo)本為石蠟切片或冰凍切片。
[0011]優(yōu)選地,所述的用量子點(diǎn)標(biāo)記LKBlmRNA原位雜交探針包括以下步驟:
[0012]將量子點(diǎn)表面用COOH和OH進(jìn)行修飾，得到0H/C00H-量子點(diǎn)；
[0013]將LKBlmRNA原位雜交探針用氨基修飾，得到氨基-LKBlmRNA原位雜交探針；
[0014]0H/C00H-量子點(diǎn)與氨基-LKBlmRNA原 位雜交探針反應(yīng)，得到量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針。
[0015]優(yōu)選地，所述的將量子點(diǎn)表面用COOH和OH進(jìn)行修飾的步驟為:
[0016]在DHLA與巰基乙醇的混合液中加入量子點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)，得到第一反應(yīng)液；
[0017]在第一反應(yīng)液中加入氯仿，再離心，收集沉淀；
[0018]將所得沉淀用水溶解，得到第二液體；
[0019]將第二液體過濾，得到0H/C00H-量子點(diǎn)。
[0020]優(yōu)選地，所述的0H/C00H-量子點(diǎn)與氨基-LKBlmRNA原位雜交探針反應(yīng)步驟為:
[0021]將EDC與sulfo-NHS溶于磷酸緩沖液，再加入0H/C00H-量子點(diǎn)，反應(yīng)，得到第三反應(yīng)液；
[0022]在第三反應(yīng)液中加入氨基-LKBlmRNA原位雜交探針，反應(yīng)，得到第四反應(yīng)液；
[0023]將第四反應(yīng)液進(jìn)行層析，得到量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針。
[0024]優(yōu)選地，所述的LKBlmRNA原位雜交探針為L(zhǎng)KBl基因cDNA、LKBl基因cRNA或靶向LKBlmRNA的特異性寡核苷酸序列。
[0025]本發(fā)明還提供了一種LKBlmRNA檢測(cè)試劑盒，包括量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針。
[0026]優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括緩沖液、打孔液、消化液、洗滌液和預(yù)雜交工作液。
[0027]優(yōu)選地，所述的洗滌液包括第一洗滌液、第二洗滌液和第三洗滌液。
[0028]優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括甘油。
[0029]本發(fā)明另提供了一種LKBlmrNA檢測(cè)基因芯片，通過將量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針固定在固相載體表面形成。
[0030]優(yōu)選地，所述的固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微?；蛩芰掀?br> [0031]本發(fā)明的LKBlmRNA檢測(cè)方法利用量子點(diǎn)對(duì)靶向LKBlmRNA的特異性單鏈DNA或RNA進(jìn)行修飾，形成量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針，利用量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針與LKBlmRNA結(jié)合，將量子點(diǎn)標(biāo)記到LKBlmRNA上，利用量子點(diǎn)發(fā)出的熒光對(duì)LKBlmRNA進(jìn)行定位、定性及定量研究。細(xì)胞樣品或組織樣本被制成標(biāo)本后，加入量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針進(jìn)行原位雜交，將雜交后的標(biāo)本置于熒光顯微鏡下觀察。LKBlmRNA與量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針特異性的結(jié)合后，LKBlmRNA發(fā)出熒光，能夠發(fā)出熒光的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，不能發(fā)出熒光的為陰性細(xì)胞，還可通過綜合考慮陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞的比例兩項(xiàng)指標(biāo)，進(jìn)行半定量判斷結(jié)果。
[0032]本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的檢測(cè)方法使用量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針，量子點(diǎn)比其他熒光染料毒性小，使用更安全，著色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，進(jìn)行重復(fù)觀察；本發(fā)明的檢測(cè)方法的有益效果還在于操作簡(jiǎn)單、靈敏度高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1是熒光顯微鏡下正常乳腺細(xì)胞涂片熒光原位雜交結(jié)果圖。
[0034]圖2是熒光顯微鏡下正常胃細(xì)胞涂片熒光原位雜交結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本申請(qǐng)的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請(qǐng)實(shí)施例中的附圖，對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。
[0036]本發(fā)明的LKBl蛋白檢測(cè)方法采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0037]制備LKBlmRNA原位雜交探針；
[0038]用量子點(diǎn)標(biāo)記LKBlmRNA原位雜交探針，得到量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針；
[0039]用量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針與標(biāo)本進(jìn)行原位雜交；
[0040]將反應(yīng)后的標(biāo)本置于顯微鏡下觀察，
[0041]其中，所述的LKBlmRNA原位雜交探針為一段與LKBlmRNA特異性結(jié)合的單鏈DNA或單鏈RNA序列；所述的標(biāo)本為細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本,所述的細(xì)胞標(biāo)本為組織印片、細(xì)胞爬片或細(xì)胞涂片，所述的組織標(biāo)本為石蠟切片或冰凍切片。
[0042]LKBlmRNA原位雜交探針可選用LKBl基因cDNA、LKBl基因cRNA或靶向LKBlmRNA的特異性寡核苷酸序列。
[0043]量子點(diǎn)可選用CdSe、CdTe, CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CdSe/CdZnS、CdSe:Mn2+、CdTe:Mn2+、CdSe:Zn2+或 CdTe:Zn2+，不限于以上。本實(shí)施例中使用的量子點(diǎn)是CdSe/ZnS。
[0044]本實(shí)施例中，量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針的制備包括以下步驟:
[0045]將量子點(diǎn)表面用COOH和OH進(jìn)行修飾，得到0H/C00H-量子點(diǎn)；
[0046]將LKBlmRNA原位雜交探針用氨基修飾，得到氨基-LKBlmRNA原位雜交探針；
[0047]0H/C00H-量子點(diǎn)與氨基-LKBlmRNA原位雜交探針反應(yīng)，得到量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針。
[0048]優(yōu)選地，所述的將量子點(diǎn)表面用COOH和OH進(jìn)行修飾的步驟為:
[0049]DHLA (Dihydrolipoic Acid, 二氫硫辛酸)分子一端為巰基,另一端為羧基(C00H);疏基乙醇分子的一端為疏基，另一端為羥基(OH), DHLA與疏基乙醇的疏基與量子點(diǎn)通過金硫鍵結(jié)合，形成表面被COOH和OH共同包被的0H/C00H-量子點(diǎn)。
[0050]0H/C00H-量子點(diǎn)與氨基-LKBlmRNA原位雜交探針通過氨基與COOH交聯(lián)以及氨基與OH交聯(lián)結(jié)合，形成量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針。
[0051]氨基的交聯(lián)是按以下方式實(shí)現(xiàn)的，EDC (l-ethyl-3- (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide, 1- (3- 二甲氨基丙基)-3_ 乙基碳二亞胺)、sulfo-NHS(N-Hydroxysulfosuccinimide, N-羥基玻拍酸亞胺)與 0H/C00H-量子點(diǎn)混合，0H/C00H-量子點(diǎn)與sulfo-NHS在EDC催化下形成活性中間體0H/C00H-量子點(diǎn)-NHS，再加入氨基-LKBlmRNA原位雜交探針，氨基-LKBlmRNA原位雜交探針的氨基末端與0H/C00H-量子點(diǎn)的C00H和OH連接反應(yīng)，得到量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針。
[0052]另外,量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針與標(biāo)本進(jìn)行原位雜交包括以下步驟:
[0053]緩沖液處理標(biāo)本，使組織細(xì)胞恢復(fù)水性；
[0054]用孔液中處理標(biāo)本，改變組織細(xì)胞的通透性，用洗滌液洗滌；
[0055]消化液處理標(biāo)本，用第一洗滌液和第二洗滌液沖洗；
[0056]預(yù)雜交處理:預(yù)雜交工作液處理標(biāo)本，蓋上原位雜交專用蓋玻片，防止預(yù)雜交液干掉；
[0057]預(yù)雜交處理后用第二洗滌液沖洗；
[0058]量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針雜交工作液混合，量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針變形處理，得到混合液；
[0059]將上述所得混合液處理標(biāo)本，用第二洗滌液和第三洗滌液沖洗；
[0060]將標(biāo)本用甘油封片于熒光顯微鏡下觀察雜交結(jié)果。
[0061]其中，所述的緩沖液優(yōu)選為枸櫞酸緩沖液；所述的第一洗滌液優(yōu)選為PBS溶液；所述的第二洗滌液優(yōu)選為SSC溶液；所述的第三洗滌液優(yōu)選為TBS溶液；所述的預(yù)雜交工作液的配方優(yōu)選為:4 X SSC, 50% 甲酰胺，IOOng/μ I BSA, I XDehardt solution, 0.3%TritonX-100, 0.5
[0062]mMribonuc leosidevanady I comp I exes andlng/ml 鮭魚精 DNA。
[0063]本發(fā)明還提供了 LKBlmRNA檢測(cè)試劑盒，包括量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針，還包括緩沖液、打孔液、消化液、洗滌液和預(yù)雜交工作液以及甘油，所述的洗滌液包括第一洗滌液、第二洗滌液和第三洗滌液。
[0064]本發(fā)明的LKBlmRNA檢測(cè)試劑盒的使用方法如下:
[0065]將標(biāo)本用緩沖液浸泡；
[0066]用打孔液處理標(biāo)本；
[0067]用消化液處理標(biāo)本；
[0068]用預(yù)雜交工作液處理標(biāo)本；
[0069]量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針與標(biāo)本進(jìn)行原位雜交；
[0070]甘油封片后顯微鏡下觀察。
[0071]本發(fā)明另提供了一種LKBlmRNA檢測(cè)基因芯片，通過將量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針固定在固相載體表面形成，所述的固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒或塑料片。
[0072]本發(fā)明的LKBlmRNA檢測(cè)基因芯片的使用方法如下:[0073]待測(cè)樣品總RNA提??；
[0074]總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成總cDNA ；
[0075]LKBIcDNA 的擴(kuò)增；
[0076]LKBIcDNA 的標(biāo)記；
[0077]將經(jīng)標(biāo)記的LKBlcDNA與基因芯片上的量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針進(jìn)行雜交。
[0078]以下為實(shí)施例。
[0079]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0080]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0081]實(shí)施例1
[0082]本實(shí)施例中選用LKBl的cDNA第一鏈作為L(zhǎng)KBlmRNA原位雜交探針，LKBl的cDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0083]LKBlmRNA 檢測(cè)步驟:
[0084](I)量子點(diǎn)的0H/C00H修飾
[0085]a.0.6ml DHLA和0.9ml巰基乙醇與1.4ml甲醇混勻，隨后加入130mgCdSe/ZnS量子點(diǎn)，65°C攪拌過夜，得到0H/C00H-量子點(diǎn)溶液；加入3ml氯仿使其沉淀；14000rpm離心5min收集沉淀；
[0086]b.將步驟a中收集的沉淀溶 于Iml甲醇,再用3ml氯仿沉淀，14000rpm離心5min再次收集沉淀；
[0087]c.將步驟b中所得沉淀溶于1.6ml水，用0.2 μ m濾膜過濾，得到0H/C00H-量子
占.[0088](2) 0H/C00H-量子點(diǎn)與LKBlmRNA原位雜交探針共價(jià)結(jié)合
[0089]a.將 2.5mg EDC、1.25mgSulfo_NHS 溶于 60 μ I 磷酸緩沖液中；
[0090]b.用步驟a中所得溶液溶解0H/C00H-量子點(diǎn)，0H/C00H-量子點(diǎn)濃度為3 μ mol/L，室溫放置15min ；
[0091]C.60 μ 150 μ M氨基_LKBl_cDNA原位雜交探針與步驟b中所得溶液混勻，于30°C下反應(yīng)30min ；
[0092]d.用NAP5柱層析除去過量的EDC和Sulfo-NHS，得到量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針；
[0093](3)量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行原位雜交
[0094]a.用0.lmol/L枸櫞酸緩沖液浸泡標(biāo)本，于室溫下放置IOmin ；
[0095]b.用打孔液浸泡標(biāo)本,于室溫下放置IOmin,再用I XPBS溶液沖洗三次；
[0096]c.用0.5“8/!111蛋白酶1(處理標(biāo)本，于421:下放置201^11，再用1\?85溶液沖洗三次，后用0.2 X S SC溶液于室溫下沖洗3min ；
[0097]d.用預(yù)雜交工作液處理標(biāo)本，于42°C濕盒孵育4_8h，孵育期間用原位雜交專用蓋玻片覆蓋標(biāo)本；
[0098]e.孵育后，用0.2 X SSC溶液于室溫下沖洗標(biāo)本三次，每次沖洗時(shí)間5min ；
[0099]f.量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針溶于預(yù)雜交工作液中混合加熱至70°C變性15min,量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針的濃度為lnmol/L ；
[0100]g.用步驟f所得溶液覆蓋標(biāo)本于42°C濕盒孵育8-12h，孵育期間用原位雜交專用蓋玻片覆蓋標(biāo)本；
[0101]h.孵育后，用2XSSC溶液，于37°C沖洗標(biāo)本三次，每次沖洗時(shí)間5min，重復(fù)上述沖洗步驟一次，再用0.lmol/L TBS溶液于37°C沖洗3_5次，每次沖洗時(shí)間5min ；
[0102]1.甘油封片于熒光顯微鏡下觀察雜交結(jié)果。
[0103]其中，CdSe/ZnS量子點(diǎn)的合成過程為:將30mg CdO與600mg月桂酸(dodecanoicacid)混勻后，連同4g99%T0P0和4g90%HDA放入三頸燒瓶中，充入氬氣，加熱至300°C恒溫至CdO溶解；將180mg Se溶于2ml TOP，快速注入反應(yīng)燒瓶中，再加入IOml甲苯終止反應(yīng)；退火至150°C恒溫30min ;將所得產(chǎn)物用無(wú)水甲醇冷卻并使CdSe量子點(diǎn)沉淀，將所得沉淀于7g90%T0P0重懸，得到CdSe量子點(diǎn)溶液；將所得CdSe量子點(diǎn)溶液加熱至80°C，再加入2.5mlZnS,充入氬氣，繼續(xù)加熱至180°C恒溫30min，使CdSe量子點(diǎn)外形成ZnS外殼，后退火至120°C恒溫2.5h，得到CdSe/Zns量子點(diǎn)；用甲醇使CdSe/Zns量子點(diǎn)沉淀，收集沉淀，并保存于氯仿中備用。
[0104]預(yù)雜交工作液配方:4XSSC溶液、50%甲酰胺、IOOng/μ I BSA溶液、I X Dehardt 溶液、0.3%Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)、0.5mmol/Lribonucleosidevanadylcomplexes (核糖核苷氧f凡復(fù)合物)和 lng/ml 鮭魚精 DNA。
[0105]LKBlmRNA探針的制備:根據(jù)SEQ ID N0.1進(jìn)行DNA合成獲得LKBlcDNA第一鏈，以此作為L(zhǎng)KBlmrNA探針。
[0106]應(yīng)用例I
[0107]將正常乳腺細(xì)胞制成細(xì)胞涂片，用實(shí)施例1中的LKBlmRNA檢測(cè)方法對(duì)正常乳腺細(xì)胞涂片進(jìn)行觀察。圖1為熒光顯微鏡下的觀察到的與量子點(diǎn)-LKBlmRNA探針原位雜交的正常乳腺細(xì)胞。
[0108]應(yīng)用例2
[0109]將正常胃細(xì)胞制成細(xì)胞涂片，用實(shí)施例1中的LKBlmRNA檢測(cè)方法對(duì)正常胃細(xì)胞涂片進(jìn)行觀察。圖2為熒光顯微鏡下的觀察到的與量子點(diǎn)-LKBlmRNA探針原位雜交正常胃細(xì)胞。
[0110]實(shí)施例2
[0111]按照以下配方制作LKBlmRNA檢測(cè)試劑盒:
[0112]量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針:按照實(shí)施例1步驟(1)-(3)合成量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針；
[0113]緩沖液:0.lmol/L枸櫞酸緩沖液；
[0114]打孔液；
[0115]消化液:0.5 μ g/ml蛋白酶K ;
[0116]洗滌液:所述的洗滌液包括第一洗滌液、第二洗滌液和第三洗滌液，
[0117]預(yù)雜交工作液:4XSSC溶液、50%甲酰胺、lOOng/μ I BSA溶液、I XDehardt溶液、
0.3%Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)、0.5mmol/Lribonuc leosidevanady I comp I exes(核糖核苷氧釩復(fù)合物)和lng/ml鮭魚精DNA ；
[0118]甘油。
[0119]LKBlmRNA檢測(cè)試劑盒的使用方法按照實(shí)施例1步驟(3)。
[0120]實(shí)施例3[0121]按照以下配方制作LKBlmRNA檢測(cè)基因芯片:
[0122]量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針制備:按照實(shí)施例1步驟(1)-(3)合成量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針；
[0123]用0.5mol/L NaHCO3溶液稀釋量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針，將稀釋后的探針加入到微孔板中，加入等體積的點(diǎn)樣液，充分混合；
[0124]將BiodyneC尼龍膜裁剪至合適大??；
[0125]用16%w/v EDTA與BiodyneC尼龍膜于室溫下孵育5min,后用去離子水漂洗,并用濾紙吸干；
[0126]用點(diǎn)樣儀取探針溶液在制備好的BiodyneC尼龍膜上點(diǎn)樣，于室溫下孵育1Omin ；
[0127]吸除BiodyneC尼龍膜表面液體，將BiodyneC尼龍膜放入0.lmol/L NaOH中浸泡IOmin,后用2*SSPE漂洗5min，再用EDTA溶液清洗；
[0128]將BiodyneC尼龍膜放入潔凈塑料袋中，并加入EDTA，密封保存，備用。
[0129]上述制備的固定有量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針的BiodyneC尼龍膜即為L(zhǎng)KBlmRNA檢測(cè)基因芯片。
[0130]利用本實(shí)施例的LKBlmRNA檢測(cè)基因芯片檢測(cè)胃癌細(xì)胞BGC823中LKBlmRNA，步驟如下:
[0131]胃癌細(xì)胞BGC823總RNA提?。?br> [0132]總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成總cDNA ；
[0133]LKBlcDNA雙鏈制備:根據(jù)GenBank中人LKBl基因的cDNA序列，用01igo5.0軟件輔助分析，設(shè)計(jì)引物SEQ ID N0.2與SEQ ID N0.3，以總cDNA為模版進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性Imin，55°C退火Imin，72°C延伸Imin，以上進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，所得純化產(chǎn)物即為L(zhǎng)KBlcDNA雙鏈；
[0134]LKBlcDNA雙鏈標(biāo)記:將LKBlcDNA用聯(lián)吡啶釕進(jìn)行標(biāo)記，得到聯(lián)吡啶釕-LKBlcDNA ；
[0135]將聯(lián)吡啶釕-LKBlcDNA與LKBlmRNA檢測(cè)基因芯片雜交。
[0136]聯(lián)吡啶釕存在時(shí)，與量子點(diǎn)發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移，量子點(diǎn)熒光被抑制，檢測(cè)不到任何信號(hào)，聯(lián)吡啶釕-LKBlcDNA含量越高，被抑制的量子點(diǎn)熒光信號(hào)越多，而聯(lián)吡啶釕-LKBlcDNA的量與LKBlmRNA含量成正比，即LKBl_mRNA含量越高，量子點(diǎn)熒光被抑制越多，信號(hào)越弱。
[0137]雖然本發(fā)明參照當(dāng)前的較佳實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能理解，上述較佳實(shí)施方式僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并非用來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，任何在本發(fā)明的精神和原則范圍之內(nèi)，所做的任何修飾、等效替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種LKBlmRNA檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 制備LKBlmRNA原位雜交探針； 用量子點(diǎn)標(biāo)記LKBlmRNA原位雜交探針，得到量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針； 用量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針與標(biāo)本進(jìn)行原位雜交； 將雜交后的標(biāo)本置于顯微鏡下觀察， 其中，所述的LKBlmRNA原位雜交探針為一段與LKBlmRNA特異性結(jié)合的單鏈DNA或單鏈RNA ;所述的標(biāo)本為細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本,所述的細(xì)胞標(biāo)本為組織印片、細(xì)胞爬片或細(xì)胞涂片，所述的組織標(biāo)本為石蠟切片或冰凍切片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的用量子點(diǎn)標(biāo)記LKBlmRNA原位雜交探針包括以下步驟: 將量子點(diǎn)表面用COOH和OH進(jìn)行修飾，得到0H/C00H-量子點(diǎn)； 將LKBlmRNA原位雜交探針用氨基修飾，得到氨基-LKBlmRNA原位雜交探針； 0H/C00H-量子點(diǎn)與氨基-LKBlmRNA原位雜交探針反應(yīng)，得到量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的將量子點(diǎn)表面用COOH和OH進(jìn)行修飾的步驟為: 在DHLA與巰基乙醇的混合液中加入量子點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)，得到第一反應(yīng)液； 在第一反應(yīng)液中加入氯仿，再離心，收集沉淀； 將所得沉淀用水溶解，得到第二液體； 將第二液體過濾，得到0H/C00H-量子點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的0H/C00H-量子點(diǎn)與氨基-LKBlmRNA原位雜交探針反應(yīng)步驟為: 將EDC與sulfo-NHS溶于磷酸緩沖液，再加入0H/C00H-量子點(diǎn)，反應(yīng)，得到第三反應(yīng)液； 在第三反應(yīng)液中加入氨基-LKBlmRNA原位雜交探針，反應(yīng)，得到第四反應(yīng)液； 將第四反應(yīng)液進(jìn)行層析，得到量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的LKBlmRNA原位雜交探針為L(zhǎng)KBl基因cDNA、LKBl基因cRNA或靶向LKBlmRNA的特異性寡核苷酸序列。
6.一種LKBlmRNA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括緩沖液、打孔液、消化液、洗滌液和預(yù)雜交工作液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的洗滌液包括第一洗滌液、第二洗滌液和第三洗滌液。
9.一種LKBlmRNA檢測(cè)基因芯片，其特征在于，通過將量子點(diǎn)LKBlmRNA原位雜交探針固定在固相載體表面形成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因芯片，其特征在于，所述的固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微?；蛩芰掀?。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882099SQ201210562544
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】萬(wàn)曉春, 王偉, 粟武 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院