醫(yī)療用途的雙特異性抗體的制作方法
【專利摘要】一種雙特異性抗體形式，其缺少活性Fc部分，包含用于死亡受體的單價結(jié)合位點(diǎn)和用于B細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的至少一個結(jié)合位點(diǎn)，其用于治療或預(yù)防B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。
【專利說明】醫(yī)療用途的雙特異性抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及雙特異性抗體用于B細(xì)胞依賴性自身免疫疾病的新醫(yī)療用途，所述雙 特異性抗體不具有Fc部分或具有受損的Fc部分，并具有用于死亡受體的單價結(jié)合位點(diǎn)以 及用于在B細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的至少一個結(jié)合位點(diǎn)。

【背景技術(shù)】
[0002] ⑶95/Fas/Apo-l是能夠誘導(dǎo)人類細(xì)胞凋亡的細(xì)胞表面受體。類似于這種受體的生 理性配體，CD95L、激動性抗CD95抗體可誘導(dǎo)凋亡，如果與CD95以多聚體形式結(jié)合，例如作 為五聚體IgM或自聚集IgG3?；蛘撸耿?5抗體可由附近的細(xì)胞上的Fc受體交聯(lián),或由二 級抗體交聯(lián)，以獲得激動活性。
[0003] 許多腫瘤細(xì)胞都表達(dá)⑶95,因此，初步鑒定出原型⑶95抗體之后，使用激動性抗 CD95抗體用于腫瘤治療已得到大力推行。但是，很快就變得明顯的是，至少以其非常簡單的 形式對患者施用激動性抗CD95抗體或重組CD95L，這種方法是失敗的，因為許多類型的正 常細(xì)胞都表達(dá)功能性CD95并可被激動性抗體殺死。
[0004] ⑶20是許多淋巴瘤和自身免疫疾?。ɡ纾喟l(fā)性硬化癥（MS)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (RA)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE))中涉及的B細(xì)胞的標(biāo)記。
[0005] 針對B細(xì)胞相關(guān)⑶20表面抗原的抗體可以以正常和惡性B細(xì)胞為目標(biāo)。它 們分別成功用于治療B細(xì)胞源性白血病和淋巴瘤以及抗體介導(dǎo)自身免疫疾病。利妥昔 (Rituximab)(商品名為Rituxan和MabThera)是抗⑶20蛋白的嵌合單克隆抗體。利妥昔 破壞B細(xì)胞，因此用以治療特征為B細(xì)胞數(shù)目過多、B細(xì)胞過度活躍或B細(xì)胞功能失調(diào)的疾 病。這包括許多淋巴瘤、白血病、移植排斥和一些自身免疫紊亂。
[0006] 然而，利妥昔非特異性地殺死⑶20陽性細(xì)胞，并證明在MS中臨床有效，但受到副 作用損害（例如進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病，PML)。
[0007] 以前證明了雙功能F(ab'）2片段（bs_F(ab'）2)對CD95和淋巴瘤細(xì)胞上的不同 目標(biāo)抗原例如CD20和CD40具有特異性，其誘導(dǎo)對CD95和相應(yīng)目標(biāo)抗原呈陽性的細(xì)胞的凋 亡。表達(dá)⑶95但不表達(dá)目標(biāo)抗原的淋巴瘤細(xì)胞未被殺死（Jung等人，Cancer Research (《癌 癥研究》）61，1846-1848 (2001))。
[0008] Herrmann 等人（Cancer Research (《癌癥研究》）68 (4) : 1221-7 (2008))評估了抗 體形式和目標(biāo)抗原的性質(zhì)對腫瘤細(xì)胞中選擇性CD95介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。
[0009] US2003/0232049A1描述了多特異性試劑用于選擇性刺激細(xì)胞表面受體。雙特異 性抗體被描述用以殺死癌癥細(xì)胞，所述雙特異性抗體由抗原結(jié)合抗體片段構(gòu)成，帶有用于 細(xì)胞表面受體如死亡受體例如CD95的第一結(jié)合位點(diǎn)和用于相同細(xì)胞目標(biāo)抗原例如CD20或 ⑶40的第二結(jié)合位點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供B細(xì)胞相關(guān)疾病或紊亂特別是自身免疫疾病的選擇性免疫 療法。
[0011] 可通過本發(fā)明要求保護(hù)的主題來實(shí)現(xiàn)這個目標(biāo)。
[0012] 本發(fā)明提供了一種雙特異性抗體形式，其缺乏活性Fc部分，包含用于死亡受體的 單價結(jié)合位點(diǎn)和用于在B細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的至少一個結(jié)合位點(diǎn)，其用于治療或 防止自身反應(yīng)性B細(xì)胞紊亂。
[0013] 特別地，該抗體形式包含如圖1A或圖1B描繪的結(jié)構(gòu)。
[0014] 特別地，死亡受體選自：⑶95、TRAIL受體和TNF受體，優(yōu)選⑶95。
[0015] 特別地，細(xì)胞表面抗原選自：⑶19、⑶20和⑶40,優(yōu)選⑶20。
[0016] 根據(jù)一個特定的實(shí)施方式，該形式包含特異性結(jié)合CD95的單價結(jié)合位點(diǎn)和特異 性結(jié)合⑶19、⑶20或⑶40的至少一個結(jié)合位點(diǎn)。
[0017] 根據(jù)一個特定的方面，提供了根據(jù)本發(fā)明使用的雙特異性抗體形式，其中自身反 應(yīng)性B細(xì)胞紊亂由異常、過度或不希望的免疫反應(yīng)導(dǎo)致。特別地，待治療的疾病由正常的、 激活的B細(xì)胞而非惡性B細(xì)胞導(dǎo)致。
[0018] 本發(fā)明特別地涉及對抗自身反應(yīng)性B細(xì)胞和治療或預(yù)防與其相關(guān)的疾病狀況。B 細(xì)胞源性白血病和淋巴瘤與任何其它癌癥類似，與B細(xì)胞過量產(chǎn)生和相關(guān)疾病狀況有關(guān)， 不論B細(xì)胞的特異性或反應(yīng)活性如何。因此，這種白血病、淋巴瘤或癌癥的預(yù)防和治療特別 地排除在本發(fā)明的疾病治療之外。
[0019] 特別地，自身反應(yīng)性B細(xì)胞紊亂為自身免疫紊亂，優(yōu)選選自：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 Sjogren綜合癥、硬皮病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、移植體對抗宿主疾病、皮肌炎、 I型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯氏病、阿迪森氏病、脂泄病、克羅恩病、惡性貧血、尋 常型天皰瘡、白癜風(fēng)、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、巨細(xì)胞性動脈炎、 重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥（MS)，優(yōu)選復(fù)發(fā)緩解型MS(RRMS)、血管球性腎炎、古德帕斯丘綜 合癥、大皰性類天皰瘡、潰瘍性結(jié)腸炎、格林-巴利綜合癥、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神 經(jīng)病、抗磷脂綜合癥、發(fā)作性睡病、結(jié)節(jié)病以及韋格納氏肉芽腫。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個具體方面，雙特異性形式是重組分子，所述重組分子包含至少2 個抗體域，優(yōu)選至少3、4、5、6、7或8個抗體域，以及可選的鉸鏈區(qū)。圖1B描繪了一種優(yōu)選 的重組雙特異性抗體形式?？贵w或抗體片段可包含或由這樣的抗體域和鉸鏈區(qū)構(gòu)成，優(yōu)選 單克隆抗體、單克隆抗體片段或其它單克隆抗體形式，其包含天然的氨基酸序列或包含氨 基酸序列、三級結(jié)構(gòu)和可選的糖基化的一種或多種突變，例如以改善與目標(biāo)結(jié)合的特異性、 親和力和/或親合力，或改善該形式的穩(wěn)定性，或提高重組分子的產(chǎn)生能力。
[0021] 特別地，抗體域是哺乳動物來源的，例如嚙齒目動物如鼠科動物，或人來源的，或 非人的哺乳動物來源的嵌合或人化抗體域。
[0022] 雙特異性抗體形式特別地包含至少2個結(jié)合位點(diǎn)，所述結(jié)合位點(diǎn)由互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)形成，優(yōu)選由獲自選自VH和VH/VL域?qū)Φ目贵w域的CDR形成，優(yōu)選至少一個或兩個VH 域和/或至少一個或兩個VH/VL域?qū)?。特別地，如Jung等人在Eur J Immunol (《歐洲免疫 學(xué)雜志》)21:2431，1991中所描述的，雙特異性抗體形式通過具有不同特異性的兩個Fab片 段的化學(xué)雜交獲得。雙特異性抗體形式還可通過雜交-雜交瘤技術(shù)或重組抗體技術(shù)獲得。
[0023] 特別地，該形式包含至少一個VH/VL結(jié)合位點(diǎn)和/或scFv結(jié)合位點(diǎn)，以及可選的 至少一個抗體恒定域，特別是CHI、CL、CH2或CH3域。
[0024] 根據(jù)一個優(yōu)選的實(shí)施方式，該形式包含至少一個VH/VL抗體域?qū)椭辽僖粋€scFv 結(jié)合位點(diǎn)，可選地帶有任何恒定域，特別地包括CH2、CH1和CL域，其優(yōu)選用作包含特異性結(jié) 合位點(diǎn)的可變域之間的連接物。
[0025] 根據(jù)另一個優(yōu)選的實(shí)施方式，該形式包含至少兩個單VH抗體域，優(yōu)選單VHH域。
[0026] 特別地，該形式選自scFv、Fab或F(ab'）片段與一個或多個抗體可變域的組合、 F(ab'）2，以及它們的組合，優(yōu)選采用至少一個抗體恒定域作為連接物。
[0027] 根據(jù)一個特定的實(shí)施方式，所述形式的構(gòu)造包含或由以下構(gòu)成：
[0028] a)由VL/VH域?qū)虲L/CH1域?qū)?gòu)成的Fab片段，其中Fab片段包含第一結(jié)合位 占.
[0029] b)由相互連接的VH/VL域構(gòu)成的scFv,以及
[0030] c)將a)的Fab片段的CH1域連接至b)的scFv的VH域的CH2域。
[0031] 根據(jù)另一特定實(shí)施方式，提供了用于本發(fā)明的雙特異性抗體形式，其包含或由以 下構(gòu)成：
[0032] -包含用于第一抗原的第一結(jié)合位點(diǎn)的Fab片段；
[0033] -包含用于第二抗原的第二結(jié)合位點(diǎn)的scFv片段；
[0034] -CH2域，其中Fab片段和scFv片段通過CH2域連接，其中
[0035] a)第一抗原是⑶95,第二抗原選自⑶19、⑶20和⑶40,優(yōu)選⑶20 ;或
[0036] b)第一抗原選自⑶19、⑶20和⑶40,優(yōu)選⑶20,第二抗原是⑶95。
[0037] 特別地，與⑶20結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)包含抗體可變域的六個互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1至 CDR6)，其中
[0038] A)
[0039] i)CDRl 包含氨基酸序列 RASSSVSYM(SEQ ID 12);
[0040] ii)CDR2 包含氨基酸序列 APSNLAS(SEQ ID 13);
[0041] iii)CDR3 包含氨基酸序列 QQWSFNPPT(SEQ ID 14);
[0042] iv)CDR4 包含氨基酸序列 SYNMH(SEQ ID 16);
[0043] v)CDR5 包含氨基酸序列 AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17);以及
[0044] vi)CDR6 包含氨基酸序列 VVYYSNSYWYFDV(SEQ ID 18);
[0045] 或者
[0046] B)其功能活性變體，其中至少一個：
[0047] i)CDRl包含與氨基酸序列RASSSVSYM(SEQID12)至少70%，或至少80%或至少 90%的序列一致性的氨基酸序列；
[0048] ii)CDR2包含與氨基酸序列APSNLAS(SEQID13)至少70%，或至少80%或至少 90%的序列一致性的氨基酸序列；
[0049] i i i) CDR3包含與氨基酸序列QQWSFNPPT (SEQ ID 14)至少70 %，或至少80 %或至 少90%的序列一致性的氨基酸序列；
[0050] iv) CDR4包含與氨基酸序列SYNMH (SEQ ID 16)至少70 %，或至少80 %或至少90 % 的序列一致性的氨基酸序列；
[0051] v)CDR5 包含與氨基酸序列 AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17)至少 70%，或至少 80%或至少90%的序列一致性的氨基酸序列；和/或
[0052] vi)CDR6包含與氨基酸序列VVYYSNSYWYFDV(SEQID18)至少70%，或至少80%或 至少90 %的序列一致性的氨基酸序列。
[0053] 本發(fā)明特別地考慮使用包含⑶20結(jié)合位點(diǎn)的任何抗體形式，所述⑶20結(jié)合位點(diǎn) 獲自上面的序列A i)至vi)，例如輕鏈可變區(qū)的⑶R1XDR2和⑶R3序列和/或重鏈可變區(qū) 的⑶R4、⑶R5和⑶R6序列，包括含有多個單可變域的構(gòu)造，所述多個單可變域包含⑶R1、 ⑶R2和⑶R3序列的組合，或⑶R4、⑶R5和⑶R6序列的組合，或這些單可變域?qū)?，例如VH、 VHH或VH/VL域?qū)Α?br> [0054] 特定的實(shí)施方式涉及包含至少一個優(yōu)選至少兩個或至少三個A的⑶R序列，以及 至少一個B的⑶R序列的抗體形式。
[0055] 另一特定的實(shí)施方式涉及包含至少一個優(yōu)選至少兩個或至少三個B的⑶R序列， 以及至少一個A的⑶R序列的抗體形式。
[0056] 特定的實(shí)施方式涉及使用輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含A i)的 ⑶R1序列、A ii)的⑶R2序列以及A iii)的⑶R3序列，所述重鏈可變區(qū)包含A iv)或B iv)的⑶R4序列、A v)或B v)的⑶R5序列，以及A vi)或B vi)的⑶R6序列，其中⑶R4、 ⑶R5和⑶R6序列中的至少一個包含B的功能活性變體。
[0057] 特定的實(shí)施方式涉及使用重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含A iv) 的⑶R4序列、A v)序列的⑶R5以及A vi)的⑶R6序列，所述輕鏈可變區(qū)包含A i)或B i) 的⑶R1序列、A ii)或B ii)的⑶R2序列以及A iii)或B iii)的⑶R3序列，其中⑶Rl、 ⑶R2和⑶R3序列中的至少一個包含B的功能活性變體。
[0058] B的變體可選地包含列出的特定⑶R序列，其包含例如通過氨基酸殘基的插入、刪 除、取代或化學(xué)衍化而導(dǎo)致的一個、兩個或三個點(diǎn)突變。
[0059] 如果與⑶20 (特別是人⑶20,特別是具有高親和力例如Kd〈10_8M的⑶20)結(jié)合， CD20結(jié)合物的變體被視為功能活性變體。
[0060] 另一功能活性變體具有靶向激活的B細(xì)胞的功能活性，例如凋亡活性，如實(shí)施例 中描述的試驗中確定的。
[0061] 根據(jù)一個特定的實(shí)施方式，抗體形式包含VL域和/或VH域或它們的功能活性變 體，所述VL域包含SEQ ID 11的氨基酸序列或由SEQ ID 11的氨基酸序列構(gòu)成，所述VH域 包含SEQ ID 15的氨基酸序列或由SEQ ID 15的氨基酸序列構(gòu)成。
[0062] 特別地，該變體是包含VL域和/或VH域或它們的功能活性變體的人化變體，所述 VL域包含SEQ ID 19的氨基酸序列或由SEQ ID 19的氨基酸序列構(gòu)成，所述VH域包含SEQ ID20的氨基酸序列或由SEQ ID 20的氨基酸序列構(gòu)成。
[0063] 特別地，與⑶95結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)包含可變抗體域的六個互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1至 CDR6)，其中
[0064] A)
[0065] i)CDRl 包含氨基酸序列 RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID 2);
[0066] ii)CDR2 包含氨基酸序列 VASNVES(SEQ ID 3);
[0067] iii)CDR3 包含氨基酸序列 QQSTKVPWT(SEQ ID 4);
[0068] iv)CDR4 包含氨基酸序列 TNAMN(SEQ ID 6);
[0069] v)CDR5 包含氨基酸序列 RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7);以及
[0070] vi)CDR6 包含氨基酸序列 DGYY(SEQ ID 8);
[0071] 或者
[0072] B)其功能活性變體，其中至少一個
[0073] i) CDR1包含與氨基酸序列RASESVEYYGTSLMQ (SEQ ID 2)至少70 %，或至少80 %或 至少90%的序列一致性的氨基酸序列；
[0074] ii)CDR2包含與氨基酸序列VASNVES(SEQID3)至少70%，或至少80%或至少 90%的序列一致性的氨基酸序列；
[0075] i i i) CDR3包含與氨基酸序列QQSTKVPWT (SEQ ID 4)至少70 %，或至少80 %或至少 90%的序列一致性的氨基酸序列；
[0076] iv) CDR4包含與氨基酸序列TNAMN (SEQ ID 6)至少70 %，或至少80 %或至少90 % 的序列一致性的氨基酸序列；
[0077] v)CDR5 包含與氨基酸序列 RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7)至少 70%，或至少 80%或至少90%的序列一致性的氨基酸序列；和/或
[0078] vi) CDR6包含與氨基酸序列DGYY (SEQ ID 8)至少70 %，或至少80 %或至少90 % 的序列一致性的氨基酸序列。
[0079] 本發(fā)明特別地考慮使用包含⑶95結(jié)合位點(diǎn)的任何抗體形式，所述⑶95結(jié)合位點(diǎn) 獲自上面的序列A i)至vi)，例如輕鏈可變區(qū)的⑶R1XDR2和⑶R3序列和/或重鏈可變區(qū) 的⑶R4、⑶R5和⑶R6序列，包括含有多個單可變域的構(gòu)造，所述多個單可變域包含⑶R1、 ⑶R2和⑶R3序列的組合，或⑶R4、⑶R5和⑶R6序列的組合，或這些單可變域?qū)?，例如VH、 VHH或VH/VL域?qū)Α?br> [0080] 特定的實(shí)施方式涉及包含至少一個優(yōu)選至少兩個或至少三個A的⑶R序列，以及 至少一個B的⑶R序列的抗體形式。
[0081] 另一特定的實(shí)施方式涉及包含至少一個優(yōu)選至少兩個或至少三個B的⑶R序列， 以及至少一個A的⑶R序列的抗體形式。
[0082] 特定的實(shí)施方式涉及使用輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含A i)的 ⑶R1序列、A ii)的⑶R2序列以及A iii)的⑶R3序列，所述重鏈可變區(qū)包含A iv)或B iv)的⑶R4序列、A v)或B v)的⑶R5序列，以及A vi)或B vi)的⑶R6序列，其中⑶R4、 ⑶R5和⑶R6序列中的至少一個包含B的功能活性變體。
[0083] 另一特定的實(shí)施方式涉及使用重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含A iv)的⑶R4序列、A v)序列的⑶R5以及A vi)的⑶R6序列，所述輕鏈可變區(qū)包含A i)或 B i)的CDR1序列、A ii)或B ii)的CDR2序列以及A iii)或B iii)的CDR3序列，其中 ⑶R1、⑶R2和⑶R3序列中的至少一個包含B的功能活性變體。
[0084] B的變體可選地包含列出的特定⑶R序列，其包含例如通過氨基酸殘基的插入、刪 除、取代或化學(xué)衍化而導(dǎo)致的一個、兩個或三個點(diǎn)突變。
[0085] 如果與⑶95 (特別是人⑶95,特別是具有高親和力例如Kd〈10_8M的⑶95)結(jié)合， CD95結(jié)合物的變體被視為功能活性變體。
[0086] 另一功能活性變體具有靶向激活的B細(xì)胞的功能活性，例如凋亡活性，如實(shí)施例 中描述的試驗中確定的。
[0087] 根據(jù)一個特定的實(shí)施方式，抗體形式包含VL域和/或VH域或它們的功能活性變 體，所述VL域包含SEQ ID 1的氨基酸序列或由SEQ ID 1的氨基酸序列構(gòu)成，所述VH域包 含SEQ ID 5的氨基酸序列或由SEQ ID 5的氨基酸序列構(gòu)成。
[0088] 特別地，該變體是包含VL域和/或VH域或它們的功能活性變體的人化變體，所述 VL域包含SEQ ID 9的氨基酸序列或由SEQ ID 9的氨基酸序列構(gòu)成，所述VH域包含SEQ ID 10的氨基酸序列或由SEQ ID 10的氨基酸序列構(gòu)成。
[0089] 根據(jù)一個特定的實(shí)施方式，抗體形式包含一SEQ ID 21的輕鏈序列和一SEQ ID 22 的重鏈序列，或它們的功能活性變體，或由SEQ ID 21的輕鏈序列和SEQ ID 22的重鏈序列 或它們的功能活性變體構(gòu)成。
[0090] 特別地，該變體是包含VL域和/或VH域或它們的功能活性變體的人化變體，所述 VL域包含SEQ ID 24的氨基酸序列或由SEQ ID 24的氨基酸序列構(gòu)成，所述VH域包含SEQ ID25的氨基酸序列或由SEQ ID 25的氨基酸序列構(gòu)成。
[0091] 本發(fā)明雙特異性抗體形式特別地包含鼠科、嵌合、人化和/或人序列。
[0092] 優(yōu)選地，雙特異性抗體形式結(jié)合選自⑶19、⑶20和⑶40的抗原，優(yōu)選⑶20,其 Kd〈l(T8M 和 / 或結(jié)合 Kd〈l(T8M 的 CD95。
[0093] 一個示范性構(gòu)造是圖1B中示意描繪的具有⑶20X⑶95特異性的重組雙特異性 Fab-單鏈（bsFabXsc)。其被命名為 NA-C20。
[0094] 特別地，該形式?jīng)]有Fc部分，或包含經(jīng)改造以鈍化或減弱其Fc效應(yīng)功能的Fc部 分，優(yōu)選通過Fc部分中的一個或多個突變改造。減弱的Fc效應(yīng)功能的示例性突變位于抗 體Fc片段的Fcy受體結(jié)合區(qū)，優(yōu)選位于N末端CH2區(qū)。利用分子工程和/或化學(xué)工程進(jìn) 行突變是可行的。優(yōu)選的突變是氨基酸序列中的點(diǎn)突變，例如插入和/或刪除和/或取代。 另一優(yōu)選突變是氨基酸的化學(xué)衍化。
[0095] 鈍化或減弱的Fc效應(yīng)功能可通過用于確定抗體形式的ADCC和/或⑶C活性的合 適試驗確定。結(jié)果與相應(yīng)的野生型分子的活性進(jìn)行比較。
[0096] 特別地，該形式可獲自IgG類的抗體，特別是任何IgGl、IgG2或IgG4亞類，特別地 包括獲自人IgG抗體的序列。
[0097] 特別地，該形式可獲自人IgG抗體。
[0098] 根據(jù)一個特定的實(shí)施方式，雙特異性抗體形式被提供用于本發(fā)明與自身反應(yīng)性B 細(xì)胞紊亂的其它治療的組合療法中，優(yōu)選地與細(xì)胞因子治療組合，例如干擾素，特別是β 干擾素，或與其它抗體形式或試劑的治療的組合。
[0099] 特別地，用于本發(fā)明的雙特異性抗體形式以治療有效量給予需要其的主體，優(yōu)選 地以用于腸胃外的制劑提供，例如，靜脈內(nèi)或皮下制劑，特別是以藥物制品提供，所述藥物 制品包含該抗體形式和可選的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
[0100] 根據(jù)一個特定的方面，本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防自身反應(yīng)性Β細(xì)胞紊亂 的方法，包括給予需要的主體治療有效量的雙特異性抗體形式，所述雙特異性抗體形式無 活性Fc部分，包含用于死亡受體的單價結(jié)合位點(diǎn)和用于在Β細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的 至少一個結(jié)合位點(diǎn)。
[0101] 特別地，這種用于治療或預(yù)防自身反應(yīng)性B細(xì)胞紊亂的方法由本文描述的與醫(yī)學(xué) 用途相關(guān)的實(shí)施方式表征。
[0102] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于治療自身反應(yīng)性B細(xì)胞的方法，包括使 所述細(xì)胞與包含本發(fā)明雙特異性抗體形式的組合物相接觸。這種治療方法可以是體內(nèi)或離 體的。
[0103] 特別地，雙特異性抗體形式靶向死亡受體和由所述細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面抗原，從 而抑制所述細(xì)胞產(chǎn)生IgG，以及可選地使所述細(xì)胞凋亡。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0104] 圖1 :兩種示例性抗體形式的示意性描述：兩種不同形式的雙特異性CD20XCD95 抗體，用于在表達(dá)⑶20和⑶95兩者的正常、激活的或惡性B細(xì)胞表面上選擇性刺激死亡受 體 CD95。
[0105] 圖1A :化學(xué)雜交雙特異性（Fab'）2片段（此處也稱為bsFab2)。雙特異性Fab2片 段如Jung等人，Eur. J. Immunol. 21:2431，1991中所描述的進(jìn)行制備。用于化學(xué)雜交的親 本抗體是批準(zhǔn)用于治療衍生自B細(xì)胞的惡性淋巴瘤的抗CD20抗體利妥昔（Roche)，以及 從培養(yǎng)的淋巴瘤細(xì)胞的上清液純化的抗⑶95抗體Apo-1?；蛘?，Apo-1抗體可以純化形式 (BMS151)購自 eBioscience，San Diego, CA 92121。
[0106] 圖IB :重組雙特異性Fab單鏈（此處也稱為bsFab X sc或NA-C20)。NA-C20包含 一 Fab，其利用單體CH2域作為連接物連接至scFv。
[0107] 圖9E提供了這種單體形式的序列，包括⑶20 (2H7,鼠科和人化的）和⑶95 (鼠科 和人化的）抗體的那些序列。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼抗體的遺傳構(gòu)造穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到Sp2/0細(xì) 胞內(nèi)。使用購自 GE-Healthcare, Life Sciences, Freiburg, Germany 的 kappa-select，利用 親和層析從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液中純化蛋白質(zhì)。
[0108] 圖2 :用1 μ g/mL PWM激活的人B細(xì)胞上⑶95的表達(dá)。
[0109] 將利用密度梯度離心分離的正常健康捐獻(xiàn)者外周血單核細(xì)胞（PBMC)與美洲商陸 有絲分裂原（PWM, 1 P g/ml, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany)培養(yǎng) 6 天并洗漆。在指 定的時間點(diǎn)，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中移除，并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。為此，用耦合到太平洋 藍(lán)的CD19抗體或同型對照抗體、耦合到別藻藍(lán)蛋白（APC)和7-氨基-放線菌素 D(7-AAD) 染料的CD95抗體將細(xì)胞染色，以清楚地鑒別活細(xì)胞?；畹腃D19陽性細(xì)胞經(jīng)設(shè)門并進(jìn)行分 析?？贵w購自Biolegend，San Diego, CA92121。同型對照獲得明亮的輪廓-CD95抗體獲得 深色輪廓。
[0110] 結(jié)論：靜息B細(xì)胞上檢測不到⑶95,其表達(dá)在PWM刺激1天后升高，在第3天達(dá)到 其最大值，并維持高值直至第10天，盡管在第6天洗滌細(xì)胞。
[0111] 圖3 :PWM激活的B細(xì)胞引起的IgG產(chǎn)生動力學(xué)。
[0112] 用PWM(1 μ g/ml)刺激正常的PBMC。多次后，移除等份的培養(yǎng)上清液并通過ELISA 分析人IgG含量。用PWM刺激PBMC (實(shí)心圓）誘導(dǎo)產(chǎn)生人IgG。在第4天可檢測到抗體產(chǎn) 生，并持續(xù)升高至第10天。未刺激的PBMC的抗體產(chǎn)生的測量（空心圓）用作對照。
[0113] 結(jié)論：PWM刺激5天后可檢測到IgG產(chǎn)生，并持續(xù)升高到第10天。
[0114] 圖4 :來自未刺激的PBMC的⑶19+B細(xì)胞和⑶4/⑶8+T-輔助/殺傷細(xì)胞的耗竭
[0115] 未刺激的PBMC用指定的抗體（1 μ g/ml)培養(yǎng)4天、洗滌并利用耦合到太平洋 藍(lán)的CD19抗體、耦合到異硫氰酸熒光素（FITC)的CD4抗體、耦合到APC和活力染料 7-AAD(Biolegend，San Diego，CA92121)的CD8抗體通過流式細(xì)胞儀分析。NA-C20是描繪 于圖1B中的重組雙特異性抗體。
[0116] 結(jié)論：提到的抗體中沒有一個影響未刺激PBMC培養(yǎng)物中的T細(xì)胞或B細(xì)胞。
[0117] 圖5 :來自經(jīng)刺激的PBMC的⑶19+B細(xì)胞和⑶4/⑶8+T-輔助/殺傷細(xì)胞的耗竭。
[0118] PBMC用美洲商陸有絲分裂原（PWM, Sigma-Aldrich, 1 μ g/ml)刺激6天、洗漆并用 指定的抗體（1 μ g/ml)培養(yǎng)4天。在第10天如圖4所描述的通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。 NA-C20是描繪于圖1B中的bsFabXsc形式的重組雙特異性抗體。
[0119] 結(jié)論：兩種雙特異性⑶20X⑶95抗體引起PWM刺激的PBMC中B細(xì)胞耗竭。T細(xì) 胞不受影響。具有MycXCD95特異性的化學(xué)雜交對照抗體無效。
[0120] 圖6 :體外抗體生產(chǎn)的抑制：
[0121] 通過密度梯度分離將人外周血單核細(xì)胞（PBMC)從肝素化血液中分離出來，以 1 X 106細(xì)胞/ml接種于6孔平板中，并用凝集素美洲商陸有絲分裂原（PWM，1 μ g/ml，Sigma Aldrich)刺激。在第6天，洗漆細(xì)胞，并加入指定抗體。在第10天，通過ELISA測量上清液 中人IgG的量。NA-C20是圖1B描繪的bsFabXsc形式的重組雙特異性抗體。
[0122] 結(jié)論：兩種雙特異性⑶20X⑶95抗體抑制經(jīng)刺激的人PBMC產(chǎn)生IgG。具有 MycX⑶95特異性的化學(xué)雜交對照抗體則不會。
[0123] 圖7 :雙特異性抗體調(diào)節(jié)的PMW介導(dǎo)的體外IgG合成抑制。通過密度梯度離心將 三個不同的健康捐獻(xiàn)者的人外周血單核細(xì)胞（PBMC) (7A-7C)從肝素化血中分離出來，以 1 X 106細(xì)胞/ml接種于6孔平板中，并用凝集素美洲商陸有絲分裂原（PWM，1 μ g/ml，Sigma Aldrich)刺激。在第6天，洗漆細(xì)胞，加入雙特異性F(ab'）2抗體（即F(ab'） 2抗體形式）。 在第10天，通過ELISA測量上清液中人IgG的量。被測試的雙特異性抗體特異性地靶向 ⑶20 X⑶95 (實(shí)心圓）或⑶40 X⑶95 (三角形）。作為比較，平行測試帶有指向細(xì)胞內(nèi)myc 蛋白（mycXCD95)的不相關(guān)靶向特異性的雙特異性抗體（空心圓）（S卩，F(xiàn)(ab'）2抗體形 式）。
[0124] 結(jié)論：
[0125] 具有⑶20 X⑶95或⑶40 X⑶95特異性的雙特異性Fab2抗體抑制激活的人B細(xì) 胞在體外產(chǎn)生IgG，具有Myc X CD95特異性的抗體則不會。
[0126] 圖8 :破傷風(fēng)類毒素特異性IgG生產(chǎn)的抑制
[0127] 用破傷風(fēng)類毒素（25ng/ml, Calbiochem, Merck Darmstadt, Germany)刺激經(jīng)破傷 風(fēng)類毒素新鮮接種的捐獻(xiàn)者的PBMC4天，洗滌并用指定抗體（1 μ g/ml)培養(yǎng)8天。在第12 天，通過ELISA確定特異性抗破傷風(fēng)抗體的量。NA-C20是圖1B描繪的bsFabXsc形式的重 組雙特異性⑶20 X⑶95抗體。
[0128] 結(jié)論：重組雙特異性⑶20 X⑶95抗體NA-C20和單特異性抗⑶20抗體利妥昔抑制 體外特異性抗破傷風(fēng)類毒素抗體的產(chǎn)生。具有指向EGF受體的不相關(guān)靶向特異性的相應(yīng)抗 體（愛必妥）和黑色素瘤相關(guān)蛋白多糖（NA-CMel)分別無效。
[0129] 圖9 :實(shí)施例中提到的示例性抗體形式的序列。
[0130] 圖9A :具有指向⑶95、⑶R序列的結(jié)合位點(diǎn)的抗體形式的小鼠 VL和VH序列（分別 為 SEQ ID 1 和 5)加下劃線（VL 的 CDR1、CDR2、CDR3 :SEQ ID 2-4 ;VH 的 CDR1、CDR2、CDR3 : SEQ ID 6-8)。
[0131] 圖9B :具有指向CD95(人化）、CDR序列的結(jié)合位點(diǎn)的抗體形式的VL和VH序列 (分別為SEQ ID 9和10)加下劃線。
[0132] 圖9C :具有指向⑶20、⑶R序列的結(jié)合位點(diǎn)的抗體形式的VL和VH序列（分別為 SEQ ID 11 和 15)(鼠科，獲自抗體 2H7,如 Liu 等人，The Journal of Immunologyl39,35 21-3526 (1987)，NCBI Accession M17953 和 M17954 描述的）加下劃線（VL 的 CDR1、CDR2、 CDR3 :SEQ ID2-14 ;VH 的 CDR1、CDR2、CDR3 :SEQ ID 16-18)。
[0133] 圖9D :具有指向⑶20(人化、獲自抗體2H7)、⑶R序列的結(jié)合位點(diǎn)的抗體形式的VL 和VH序列（分別為SEQ ID 19和20)加下劃線。
[0134] 圖9E :示例性雙特異性抗體形式⑶95 X⑶20、嵌合和人化版本：SEQ ID 21 :嵌合 版本，輕鏈；SEQ ID 22:嵌合版本重鏈；SEQ ID 23:連接物序列；SEQ ID 24:人化版本輕 鏈；SEQ ID 25 :人化版本重鏈。

【具體實(shí)施方式】
[0135] 本文使用的術(shù)語"抗體形式"應(yīng)指由抗體域構(gòu)成或包含抗體域的多肽或蛋白質(zhì)，所 述抗體域被理解為免疫球蛋白的重鏈和/或輕鏈的恒定域和/或可變域。該定義特別地指 可變區(qū)和恒定區(qū)的重鏈和輕鏈的域（例如dAb、Fd、VL、Vk、VH、VHH)或完整抗體的各域例如 CH1、CH2、CH3、CH4、C1和Ck。Vk或VI理解為VL，輕鏈的可變域，Kappa或lambda ;類似地， C1或Ck理解為CL域，Kappa或lambda。清楚理解的是，引用如本文使用的抗體域理解為 指這種抗體域的任何類型或變體。因此，如本文使用的VH域的任何引用理解為包括VH域 的任何類型，包括VHH。
[0136] 抗體域可以是天然的結(jié)構(gòu)或通過突變或衍化進(jìn)行修飾，例如以改善抗原結(jié)合性質(zhì) 或任何其它性質(zhì)，例如穩(wěn)定性或功能性質(zhì)，例如與Fc受體FcRn和/或Fc γ受體的結(jié)合。多 肽序列被認(rèn)為是抗體域，如果包含β -桶結(jié)構(gòu)，所述β -桶結(jié)構(gòu)由抗體域結(jié)構(gòu)的至少兩條β 條帶通過環(huán)序列連接構(gòu)成。
[0137] 術(shù)語"抗體形式"特別地指多肽或蛋白質(zhì)，其顯示出單或雙或多特異性，或單、雙或 多價結(jié)合性質(zhì)，優(yōu)選至少兩個，更優(yōu)選至少三個特異性結(jié)合位點(diǎn)用于例如抗原的表位、效應(yīng) 分子或病原體起源或人結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，如自身抗原，包括細(xì)胞相關(guān)蛋白或血清蛋白。如本發(fā)明 使用的術(shù)語抗體形式包括全長抗體或抗體的功能性片段，例如Fab (此處理解為包括Fab、 F(ab)或 F(ab'））、（Fab'）2、scFv 或其它單鏈二聚體，例如 CHl/CL(kappa 或 lambda)域、Fv 的單鏈二聚體、二聚體如VH/VL、CH1/CL、CH2/CH2、CH3/CH3,或它們的其它衍生物或組合，例 如抗體域?qū)Φ膯捂溁蛲ㄟ^連接物或鉸鏈區(qū)相互連接的抗體域的鏈，特別是如圖1A或1B描 繪的抗體形式。
[0138] 經(jīng)木瓜蛋白酶消化的抗體得到三個片段：兩個Fab片段和一個Fc片段。術(shù)語 "卩&13"此處理解為包括？ &13、？(&13)或？(&13'），可包含或不包含鉸鏈區(qū)。？ &13或？(&13'）片段 是仍然與抗原結(jié)合但為單價且無 Fc部分的抗體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方式涉及包 含F(xiàn)ab片段的抗體形式，其包含VH/VL域?qū)Σ⑦M(jìn)一步包含兩個抗體恒定域，例如CL和CH1。
[0139] F (ab'）2片段抗體通過整個IgG抗體的胃蛋白酶消化產(chǎn)生，以除去大部分Fc區(qū)，同 時保留完整的某些鉸鏈區(qū)。？仏8'） 2片段具有兩個連接在一起的抗原結(jié)合F(ab'）部分，因 此是二價的。
[0140] 優(yōu)選本發(fā)明的抗體形式至少包含可變域以提供至少兩個特異性結(jié)合位點(diǎn)；以及至 少一個，優(yōu)選至少2個，或至少三個恒定域。
[0141] 術(shù)語"抗體形式"特別地包括分離的抗體形式，此處理解為基本無指向不同目標(biāo)抗 原，或包括抗體域的不同結(jié)構(gòu)排布的其它抗體形式。但是，如本發(fā)明使用的分離的抗體形式 可包含在組合制品中，所述制品包含分離的抗體形式例如與至少一種其它抗體形式（例如 單克隆抗體或具有不同特異性的抗體片段）的組合。
[0142] 本文使用的抗體形式可以是重組雙特異性抗體形式，該術(shù)語包括通過重組手段制 備的、表達(dá)的、產(chǎn)生的或分離的所有抗體形式，例如來自動物如哺乳動物包括人的抗體，其 包含來自不同來源的基因或序列，例如人化抗體或獲自雜交瘤的抗體。進(jìn)一步的實(shí)施例涉 及從宿主細(xì)胞分離的抗體形式，所述宿主細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)該抗體形式，或從抗體或抗體 域的重組的組合文庫中分離的抗體形式，或通過任何其它方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗 體形式，所述任何其它方法包含將抗體基因序列拼接到其它DNA序列。
[0143] 人們理解，術(shù)語"抗體形式"包括其衍生物。衍生物是一個或多個本發(fā)明抗體域或 抗體形式的任何組合和或融合蛋白，在所述融合蛋白中，本發(fā)明抗體形式的任何域可融合 在一種或多種其它蛋白的任何位置，所述其它蛋白例如其它抗體或抗體形式，例如包含CDR 環(huán)的結(jié)合結(jié)構(gòu)、受體多肽，還有配體、支架蛋白、酶、毒素等等。本發(fā)明組合式抗體的衍生物 還可通過利用多種化學(xué)技術(shù)例如共價耦合、靜電作用、二硫化結(jié)合等與其它物質(zhì)聯(lián)合或結(jié) 合來獲得。結(jié)合到免疫球蛋白的其它物質(zhì)可以是脂質(zhì)、碳水化合物、核酸、有機(jī)或無機(jī)分子 或它們的任何組合（例如PEG、前藥或藥物）。術(shù)語衍生物還包括抗體形式的片段、變體、類 似物或同系物，其具有功能性并可作為功能性等同物，例如結(jié)合到特定目標(biāo)并具有功能性 質(zhì)，例如IgG抑制活性或凋亡活性。優(yōu)選的衍生物仍然是對于抗原結(jié)合、凋亡活性和/或抑 制自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生IgG的活性具有功能性。
[0144] 本文使用的術(shù)語"活性Fc部分"指抗體的Fc片段（所述抗體包含至少兩個，優(yōu)選 至少四個恒定抗體域（例如CH2和CH3抗體域）），或修飾物、衍生物、組合物或仍然被Fc效 應(yīng)功能作用的恒定抗體域的部分。Fc效應(yīng)功能按以下方式理解。包含活性Fc部分的抗體 通常具有細(xì)胞毒活性。當(dāng)與抗原結(jié)合時，F(xiàn)c部分通過其對效應(yīng)物細(xì)胞的活性，激活細(xì)胞毒 性T細(xì)胞或調(diào)節(jié)ADCC或CDC的細(xì)胞，調(diào)節(jié)抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性（ADCC)和/或補(bǔ)體 依賴的細(xì)胞毒性（CDC)。功能活性Fc部分因此通過Fcy受體（FCGR)結(jié)合位點(diǎn)與效應(yīng)細(xì)胞 結(jié)合。
[0145] 本發(fā)明的抗體形式?jīng)]有活性Fc部分，因此，其由不具有FCGR結(jié)合位點(diǎn)的抗體域構(gòu) 成，特別地包括沒有CH2和CH3域的鏈的任何抗體形式，或本發(fā)明的抗體形式包含缺少Fc 效應(yīng)功能的Fc部分，例如通過修飾以減弱Fc效應(yīng)功能，特別地去掉或減弱ADCC和/或⑶C 活性。這種修飾可通過誘變引起，例如FCGR結(jié)合位點(diǎn)的突變，或通過衍生物或試劑引起，以 干擾抗體形式的ADCC和/或⑶C活性，從而達(dá)到減弱Fc效應(yīng)功能或缺失Fc效應(yīng)功能，這 通常理解為指通過ADCC和/或⑶C活性測量，F(xiàn)c效應(yīng)功能低于未經(jīng)修飾（野生型）形式 的10%，優(yōu)選低于5%。特定的實(shí)施例涉及包含F(xiàn)c區(qū)的抗體形式，其中作出了一種或多種 修改以改變抗體的功能性或藥代動力學(xué)性質(zhì)，例如通過取代位于Fc區(qū)負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)Fc效應(yīng)功 能的一個或多個氨基酸殘基，例如CH2域的N末端區(qū)中的突變。
[0146] 本文使用的術(shù)語"自身反應(yīng)性B細(xì)胞"和"自身反應(yīng)性B細(xì)胞紊亂"按照以下方式 理解。自身反應(yīng)性B細(xì)胞是初始B細(xì)胞庫的一部分，并且在自身免疫疾病的發(fā)病中是關(guān)鍵 的，不僅產(chǎn)生自身抗體，而且還分泌細(xì)胞因子并呈現(xiàn)自身抗原。自身反應(yīng)性B細(xì)胞紊亂是指 可通過給予包含本發(fā)明抗體形式的藥物組合物改善的疾病狀況。在與自身反應(yīng)性B細(xì)胞紊 亂相關(guān)的疾病中，如B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病，通常存在異常的消極的選擇以及自身反 應(yīng)性B細(xì)胞的激活。
[0147] 自身免疫疾病特別地理解為由指向患者自身組織或器官的反應(yīng)引起的紊亂，通常 是與自身抗原的抗體反應(yīng)。在多種臨床和實(shí)驗室指示自身免疫疾病的標(biāo)記中，有高Y球蛋 白血癥、高水平的自身抗體、貯存于組織中的抗原-抗體復(fù)合物、來自糖皮質(zhì)激素或免疫抑 制治療的臨床益處，以及受影響組織中的淋巴樣細(xì)胞聚集。
[0148] 本發(fā)明的抗體形式能夠調(diào)節(jié)B細(xì)胞庫以減少B細(xì)胞的自身反應(yīng)性。該調(diào)節(jié)比單特 異性抗體獲得的調(diào)節(jié)更具特異性，因為其僅影響表達(dá)CD95的激活的B細(xì)胞，而不影響靜息 B細(xì)胞?？梢员砻?，本發(fā)明的抗體形式誘導(dǎo)激活的B細(xì)胞的凋亡，并進(jìn)一步遏制活性誘導(dǎo)的 IgG產(chǎn)生，以及抑制激活的B細(xì)胞的IgG合成。因此，可有效地減少產(chǎn)生指向自身免疫目標(biāo) 例如自身抗原的IgG抗體的自身反應(yīng)性B細(xì)胞。
[0149] 通過本發(fā)明雙特異性抗體形式，特別是⑶20 X⑶95雙特異性，不僅是惡性B細(xì)胞， 而且表達(dá)CD95死亡受體的激活的正常（良性）B細(xì)胞可被靶向并被耗竭。相反，靜息B細(xì) 胞不會被靶向，這些正常B細(xì)胞不會受到影響。這表明，激活的B細(xì)胞是CD95敏感的，以在 與所描述種類的雙特異性⑶20X⑶95抗體培養(yǎng)后，經(jīng)受凋亡性細(xì)胞死亡。
[0150] 激活的B細(xì)胞的耗竭遏制了抗體產(chǎn)生。這是出人意料的，因為末端分化的抗體產(chǎn) 生細(xì)胞，即漿細(xì)胞，并不表達(dá)⑶20。遏制激活的前體B細(xì)胞顯然足以遏制抗體產(chǎn)生。
[0151] 通過本發(fā)明雙特異性抗體形式遏制抗體產(chǎn)生優(yōu)于使用已有的單特異性⑶20抗體 如利妥昔（Rituxai#),利妥昔使所有表達(dá)CD20的B細(xì)胞耗竭，而不會區(qū)分正常或靜息B細(xì) 胞和自身反應(yīng)性或激活的B細(xì)胞。
[0152] 本文關(guān)于本發(fā)明抗體或抗體形式使用的術(shù)語"結(jié)合位點(diǎn)"指能夠與抗原發(fā)生結(jié)合 相互作用的分子結(jié)構(gòu)。通常，結(jié)合位點(diǎn)位于抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)內(nèi)，此處也稱為"⑶R 結(jié)合位點(diǎn)"，其為具有不同結(jié)構(gòu)的特異性區(qū)域，賦予結(jié)合到各種抗原的功能。該不同的結(jié)構(gòu) 可獲自天然的抗體庫，例如鼠科或人庫，或可重組或合成產(chǎn)生，例如通過誘變以及特別地通 過隨機(jī)化技術(shù)產(chǎn)生。這些包括可變抗體域的誘變CDR區(qū)、環(huán)區(qū)，特別是抗體的CDR環(huán)，例如 任何VL和/或VH抗體域的⑶R1、⑶R2和⑶R3環(huán)。本發(fā)明使用的抗體形式通常包含一個 或多個CDR結(jié)合位點(diǎn)，每個結(jié)合位點(diǎn)對一抗原具有特異性。
[0153] 本文使用的術(shù)語"特異性"或"雙特異性"指一結(jié)合反應(yīng)，所述結(jié)合反應(yīng)對于異質(zhì) 分子群中的目標(biāo)同源配體具有決定性。因此，在特定條件下，例如免疫測定條件下，特異性 地結(jié)合其特定目標(biāo)的抗體形式并不以顯著的量結(jié)合到存在于樣品中的其它分子上。
[0154] 特異性結(jié)合位點(diǎn)通常并不與其它目標(biāo)交叉反應(yīng)。然而，特異性結(jié)合位點(diǎn)可特異性 地結(jié)合到目標(biāo)的一個或多個表位、亞型或變體，或與其它相關(guān)目標(biāo)抗原例如同系物或類似 物交叉反應(yīng)。
[0155] 特異性結(jié)合是指根據(jù)選擇的目標(biāo)識別度，高、中或低結(jié)合親和力或親合力進(jìn)行的 選擇性結(jié)合。如果結(jié)合常數(shù)或結(jié)合動力學(xué)相差至少10倍，通常可獲得選擇性結(jié)合，優(yōu)選差 異為至少100倍，以及更優(yōu)選至少1000倍。
[0156] 本發(fā)明雙特異性抗體形式特別地包含兩個或多個結(jié)合位點(diǎn)，可能具有特異性結(jié)合 性質(zhì)的3或4個結(jié)合位點(diǎn)，其中該抗體形式識別至少兩種不同的目標(biāo)抗原。因此，示例性 雙特異性抗體形式可包含兩個結(jié)合位點(diǎn)，其中每個結(jié)合位點(diǎn)能夠特異性地結(jié)合一不同的抗 原，例如死亡受體和B細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原。在雙特異性抗體形式包含多于兩個結(jié)合位點(diǎn) 的情況下，其可指向多于兩種不同的目標(biāo)抗原和/或包含多于一種效價以特異性地結(jié)合單 種或相同類型的目標(biāo)抗原。
[0157] 本文相對于抗體或抗體形式的結(jié)合位點(diǎn)使用的術(shù)語"單價"指僅包含一個指向目 標(biāo)抗原的結(jié)合位點(diǎn)的分子。術(shù)語"價"因此理解為指向相同目標(biāo)抗原的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，該 結(jié)合位點(diǎn)特異性地結(jié)合抗原的相同表位或結(jié)合抗原的不同表位。在本發(fā)明使用的抗體或抗 體形式包含兩個或多個結(jié)合位點(diǎn)的情況下，例如相對于相同目標(biāo)抗原的2、3或4個結(jié)合位 點(diǎn)，其特異性地指向抗原的相同或不同表位，這被稱為雙價或多價。
[0158] 本發(fā)明使用的抗體形式理解為包含特異性地結(jié)合死亡受體目標(biāo)的單價結(jié)合位點(diǎn)， 以及特異性的結(jié)合B細(xì)胞特別是自身反應(yīng)性B細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的至少一個另外的 結(jié)合位點(diǎn)。因此，相對于死亡受體結(jié)合為單價，相對于細(xì)胞表面抗原結(jié)合是單價、雙價或多 價。
[0159] 本文與術(shù)語"目標(biāo)"或"目標(biāo)抗原"互換使用的術(shù)語"抗原"指抗體結(jié)合位點(diǎn)識別的 整個目標(biāo)分子或這種分子的片段。特別地，抗原的亞結(jié)構(gòu)，例如多肽或糖結(jié)構(gòu)，一般稱為"表 位"，例如B細(xì)胞表位或T細(xì)胞表位，其為免疫相關(guān)，其可被這種結(jié)合位點(diǎn)識別。本文使用的 術(shù)語"表位"特別指一分子結(jié)構(gòu)，該分子結(jié)構(gòu)可完全構(gòu)成本發(fā)明抗體形式的結(jié)合位點(diǎn)的特異 性結(jié)合伴侶，或作為特異性結(jié)合伴侶的一部分。表位可由糖、肽結(jié)構(gòu)、脂肪酸、有機(jī)、生化或 無機(jī)物質(zhì)或它們的衍生物以及它們的任何組合構(gòu)成。如果表位包含在肽結(jié)構(gòu)中，例如肽、多 肽或蛋白質(zhì)，其通常包含至少3個氨基酸，優(yōu)選5-40個氨基酸，以及更優(yōu)選大約10-20個氨 基酸。表位可以是線性或構(gòu)象表位。線性表位由多肽或糖鏈的一級序列的單段構(gòu)成。線性 表位可以是連續(xù)的或重疊的。構(gòu)象表位由氨基酸或糖構(gòu)成，所述氨基酸或糖通過折疊多肽 聯(lián)系在一起以形成三級結(jié)構(gòu)，并且在線性序列中，氨基酸不必彼此相鄰。
[0160] 本文相對于B細(xì)胞使用的術(shù)語"細(xì)胞表面抗原"指B細(xì)胞表面表達(dá)的抗原，優(yōu)選成 熟的、激活的或自身反應(yīng)性B細(xì)胞，其可被與其結(jié)合的拮抗物靶向。示例性B細(xì)胞表面標(biāo)記 包括 CD19、CD20 和 CD40。
[0161] 特定目標(biāo)的B細(xì)胞表面抗原優(yōu)選在自身反應(yīng)性B細(xì)胞表面高度表達(dá)，優(yōu)選大于 10000個分子/細(xì)胞。
[0162] 特異性結(jié)合選自CD19、CD20和CD40的抗原的結(jié)合位點(diǎn)可獲自指向抗原的市售單 克隆抗體，例如指向CD20的利妥昔或奧瑞珠（ocrelizumab)。特別地，可使用圖9作為示例 的獲自任何抗CD20抗體形式的結(jié)合位點(diǎn)。
[0163] 術(shù)語"⑶19"包括人⑶19的任何變體、亞型和物種同源物，其由細(xì)胞自然地表達(dá)， 或表達(dá)在用⑶19基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上。
[0164] 術(shù)語"⑶20"包括人⑶20的任何變體、亞型和物種同源物，其由細(xì)胞自然地表達(dá)， 或表達(dá)在用⑶20基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上。
[0165] 術(shù)語"⑶40"包括人⑶40的任何變體、亞型和物種同源物，其由細(xì)胞自然地表達(dá)， 或表達(dá)在用⑶40基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上。
[0166] 本文相對于B細(xì)胞使用的術(shù)語"死亡受體"指獲自細(xì)胞表面上的受體的抗原，所述 細(xì)胞通過一種或多種凋亡途徑引致程序性細(xì)胞死亡。示例性死亡受體表達(dá)在激活的B細(xì)胞 上，并包括例如CD95、TRAIL受體（例如TRAIL-R1或TRAIL-R2)以及TNF受體。與激活的 B細(xì)胞相反，⑶95并不表達(dá)在正常靜息B細(xì)胞上。
[0167] ⑶95也稱為Fas或Apo-1，并且是腫瘤壞死因子受體超家族的成員。特異性地結(jié) 合⑶95的結(jié)合位點(diǎn)可獲自指向⑶95的抗體，例如Acris Antibodies, Herford, Germany提 供的克隆AP0-1或LT95和DX 2。特別地，可使用圖9作為示例的獲自任何抗⑶95抗體形 式的結(jié)合位點(diǎn)。
[0168] 術(shù)語"⑶95"包括人⑶95的任何變體、亞型和物種同源物，其由細(xì)胞自然地表達(dá)， 或表達(dá)在用⑶95基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上。
[0169] 術(shù)語"變體"指突變體，其例如通過定點(diǎn)突變獲得，以特別地刪除、交換、將插入物 引入特定抗體區(qū)或化學(xué)衍生氨基酸序列，以在恒定域中改造抗體效應(yīng)功能或半衰期，或在 可變域中改善抗原結(jié)合性質(zhì)，例如通過親和力成熟技術(shù)進(jìn)行?？刹捎萌魏我阎恼T變方法， 包括在所需位置處的點(diǎn)突變，例如通過隨機(jī)化技術(shù)獲得的點(diǎn)突變。在一些情況下，位置是隨 機(jī)挑選的，例如，可選擇任意可能的氨基酸或選擇優(yōu)選的氨基酸來隨機(jī)化抗體序列。術(shù)語 "變體"應(yīng)特別地包括功能活性變體。
[0170] 術(shù)語分子的"功能活性變體"，例如本文使用的抗體，是指通過插入、刪除或取代一 個或多個氨基酸，或化學(xué)衍生一個或多個氨基酸殘基或序列內(nèi)或位于序列遠(yuǎn)端的任一端或 兩端的核苷來修飾這個序列（親本序列）獲得的序列，并且，該修飾不影響（特別是削弱） 這個序列的活性。在結(jié)合位點(diǎn)對選定的目標(biāo)抗原具有特異性的情況下，分子的功能活性變 體將仍然具有預(yù)定的結(jié)合特異性，盡管這可被改變，例如以改變對特定表位的良好特異性、 親和力、親合力、Kon或Koff率等。
[0171] 功能活性變體可通過改變親本抗體形式的序列（例如圖9中的任何序列，如圖9E i)或ii)的NA-C20序列）來獲得，并且其特征在于具有類似于各序列表現(xiàn)的生物活性，包 括結(jié)合CD20和/或CD95的能力，或靶向激活的或自身反應(yīng)性B細(xì)胞的能力。
[0172] 抗體形式的功能活性變體優(yōu)選具有基本相同的生物活性（如通過特定結(jié)合試驗 或功能測試確定的），以靶向激活的或自身反應(yīng)性B細(xì)胞。本文使用的術(shù)語"基本相同的生 物活性"指由基本相同活性為親本抗體形式（例如圖9B的重組雙特異性抗體形式NA-C20) 測得活性的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或 甚至至少100%或至少110%，或至少120%，或至少130%，或至少140%，或至少150%，或 至少160%，或至少170%，或至少180%，或至少190%，例如高達(dá)200%表示的活性。
[0173] 在一個優(yōu)選實(shí)施例中，功能活性變體
[0174] a)為該分子的生物活性片段，該片段包含分子序列的至少50%，優(yōu)選至少70%， 更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %，甚至更優(yōu)選至少95 %，以及最優(yōu)選至少97 %、98 %或 99% ；
[0175] b)是來自至少進(jìn)行一個氨基酸取代、添加和/或刪除的分子，其中所述功能活性 變體與所述分子或者其一部分具有序列一致性，例如具有至少50%序列一致性的抗體，優(yōu) 選至少60 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %，甚至更優(yōu)選至少95 %, 以及最優(yōu)選至少97 %、98 %或者99 %的序列一致性；和/或
[0176] c)由該分子或其功能活性變體以及額外地與多肽或核苷酸序列異源的至少一 個氨基酸或核苷酸構(gòu)成，優(yōu)選其中功能活性變體獲自任何天然存在或重組的抗CD19、抗 ⑶20、抗⑶40和/或抗⑶95抗體。
[0177] 在本發(fā)明一個優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體的功能活性變體基本與上面描述的變 體相同，但其多肽或核苷酸序列分別不同，不同之處在于其獲自不同物種的同源序列。這些 都被稱為天然存在的變體。
[0178] 本發(fā)明特別地提供了嵌合、人化或人序列以及包含這類嵌合、人化或人序列的親 本抗體形式的功能活性變體。
[0179] 相對于本發(fā)明抗體形式使用的術(shù)語"嵌合"指那些抗體，其中每條重鏈和輕鏈的氨 基酸序列的一部分與獲自特定物種或?qū)儆谔囟悇e的抗體中的相應(yīng)序列同源，而該鏈的其 余段與另一物種或類的相應(yīng)序列同源。通常，輕鏈和重鏈兩者的可變區(qū)模擬獲自一種哺乳 動物的抗體的可變區(qū)，而恒定部分與獲自另一種的抗體的序列同源。例如，可變區(qū)可利用來 自非人宿主有機(jī)體的容易獲得的B細(xì)胞或雜交瘤以及獲自例如人細(xì)胞制品的恒定區(qū)從目 前已知的來源獲得。
[0180] 相對于本發(fā)明抗體形式使用的術(shù)語"人化"指具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，其基本上 從來自非人物種的免疫球蛋白獲得，其中該分子剩余的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基于人免疫球蛋白 的結(jié)構(gòu)和/或序列?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可包含融合到恒定域上的完整的可變域，或僅包含嫁接 到可變域中合適的框架區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)。抗原結(jié)合位點(diǎn)可以是野生型的或經(jīng)過修飾， 例如通過一個或多個氨基酸取代進(jìn)行的修飾，優(yōu)選經(jīng)修飾以與人免疫球蛋白更加類似。一 些人化抗體形式保持所有CDR序列（例如，包含來自小鼠抗體的所有六種CDR的人化小鼠 抗體）。其它形式具有相對于原抗體被改變的一個或多個CDR。
[0181] 相對于本發(fā)明抗體形式使用的術(shù)語"人"，理解為包括具有獲自人生殖系免疫球蛋 白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明人抗體形式可包括不被人生殖系免疫球蛋白序列 編碼的氨基酸殘基（例如，通過體外隨機(jī)或定點(diǎn)誘變引入的突變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引 入的突變），例如在CDR中。本發(fā)明的人抗體形式包括從人免疫球蛋白文庫或從轉(zhuǎn)基因用于 一種或多種人免疫球蛋白的動物中分離的抗體。
[0182] 術(shù)語"功能活性變體"還包括天然存在的等位基因變體，以及突變體或任何其它非 天然存在的變體。在現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的是，等位基因變體是一種（多）肽的替代形式， 其特征是具有一個或多個氨基酸的替換、刪除或添加，其本質(zhì)上不會改變多肽的生物功能。
[0183] 功能活性變體可通過多肽或核苷酸序列中的序列改變獲得，例如通過一個或多個 點(diǎn)突變，其中當(dāng)與本發(fā)明組合使用時，所述序列改變保留未改變多肽或核苷酸序列的功能。 這樣的序列改變可包括但不限于（保守）取代、添加、刪除、突變和插入。
[0184] CDR變體包括被至少一個氨基酸修飾的氨基酸序列，其中所述修飾可以是化學(xué)修 飾或氨基酸序列的部分改變，該修飾能使變體保留未修飾序列的生物學(xué)特征。例如，該變體 為與⑶19、⑶20、⑶40或⑶95結(jié)合的功能變體。⑶R氨基酸序列的部分改變可以是刪除或 取代一至數(shù)個氨基酸，例如1、2、3、4或5個氨基酸，或者是添加或插入一至數(shù)個氨基酸，例 如1、2、3、4或5個氨基酸，或者是化學(xué)衍化一至數(shù)個氨基酸，例如1、2、3、4或5個氨基酸， 或它們的組合。氨基酸殘基的取代可以是保守性取代，例如，將一個疏水性氨基酸取代為另 一疏水性氨基酸。
[0185] 保守取代是發(fā)生在與它們的側(cè)鏈和化學(xué)性質(zhì)相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)的那些。這些家 族的實(shí)例有具有堿性側(cè)鏈的氨基酸、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸、具有非極性脂肪族側(cè)鏈的氨 基酸、具有非極性芳香烴側(cè)鏈的氨基酸、具有不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸、具有小側(cè)鏈的氨基 酸及具有大側(cè)鏈的氨基酸等。
[0186] 點(diǎn)突變特別地理解為多核苷酸的改造，其導(dǎo)致不同于未經(jīng)改造的氨基酸序列的氨 基酸序列的表達(dá)，不同之處在于一個或多個單（非連續(xù)）或雙重氨基酸取代或交換、刪除或 插入不同的氨基酸。
[0187] 優(yōu)選的點(diǎn)突變是相同極性和/或電荷的氨基酸的交換。在這方面，氨基酸指由64 個三聯(lián)體密碼子編碼的20個天然存在的氨基酸。這20個氨基酸可分為：具有中性電荷、正 電荷和負(fù)電荷的氨基酸：
[0188] "中性"氨基酸在下面連同它們各自的三個字母和單個字母代碼和極性一起顯示：
[0189] 丙氨酸：(Ala，A)非極性，中性；
[0190] 天冬酰胺：(Asn，N)極性，中性；
[0191] 半胱氨酸：(Cys，C)非極性，中性；
[0192] 谷氨酰胺：(Gin, Q)極性，中性；
[0193] 甘氨酸：(Gly，G)非極性，中性；
[0194] 異亮氨酸：（lie, I)非極性，中性；
[0195] 亮氨酸：（Leu, L)非極性，中性；
[0196] 蛋氨酸：(Met, M)非極性，中性；
[0197] 苯丙氨酸：(Phe，F(xiàn))非極性，中性；
[0198] 脯氨酸：(Pro, P)非極性，中性；
[0199] 絲氨酸：（Ser，S)極性，中性；
[0200] 蘇氨酸：（Thr，T)極性，中性；
[0201] 色氨酸：（Trp，W)非極性，中性；
[0202] 酪氨酸：（Tyr，Y)極性，中性；
[0203] 纈氨酸：(Val，V)非極性，中性；以及
[0204] 組氨酸：（His, H)極性，正電荷（10% )中性（90% )
[0205] "正"電荷的氨基酸是：
[0206] 精氨酸：(Arg，R)極性，正電荷；以及
[0207] 賴氨酸：（Lys，K)極性，正電荷。
[0208] "魚"電荷的氨基酸是：
[0209] 天冬氨酸：(Asp, D)極性，負(fù)電荷；以及
[0210] 谷氨酸：(Glu，E)極性，負(fù)電荷。
[0211] 本文相對于多肽序列確定的"百分比（％)氨基酸序列一致性"定義為：在比對序 列和引入缺口（如果需要）以獲得最大百分比序列一致性后，以及不考慮將任何保守取代 作為序列一致性的一部分的情況下，候選序列中氨基酸殘基與特定多肽序列中氨基酸殘基 相同的百分比。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定測量比對的合適參數(shù)，包括在待比較的全長序列上 獲得最大比對所需的任何算法。
[0212] 本文使用的術(shù)語"主體"指溫血哺乳動物，特別是人類。需要預(yù)防或治療自身反應(yīng) 性B細(xì)胞紊亂的主體特別地可以是患有早期或晚期疾病的患者，或者傾向患這類疾?。ɡ?如，遺傳傾向性）的主體。
[0213] 因此，本發(fā)明的主題基于意想不到的發(fā)現(xiàn)，S卩，典型的雙特異性抗體構(gòu)造，特異性 地結(jié)合激活的B細(xì)胞表面上的⑶95和⑶19、⑶20或⑶40,特異性地遏制IgG產(chǎn)生并抑制 IgG合成，從而降低主體中IgG的產(chǎn)生水平并降低主體中的自身免疫反應(yīng)。對于本發(fā)明描述 以及圖1B描繪的重組雙特異性抗體NA-C20,證明了其不僅遏制多克隆激活的B細(xì)胞產(chǎn)生抗 體，而且遏制更特異性激活的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，所述更特異性激活的B細(xì)胞產(chǎn)生抗破傷風(fēng)類 毒素特異性抗體。
[0214] 之前描述過，對⑶20和死亡受體⑶95具有特異性的雙特異性抗體能夠誘導(dǎo)⑶20 陽性淋巴瘤細(xì)胞中⑶95介導(dǎo)的凋亡。意想不到地，結(jié)果是本發(fā)明的⑶20X⑶95雜交抗 體誘導(dǎo)表達(dá)CD95的美洲商陸有絲分裂原（PWM)激活的B細(xì)胞的調(diào)亡，而不會誘導(dǎo)缺乏其 的靜息細(xì)胞凋亡。PWM體外誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生被極度抑制。這些結(jié)果表明，本發(fā)明雙特異性 ⑶20 X⑶95抗體可用于治療抗體介導(dǎo)的自身免疫疾病。與單特異性⑶20抗體相比，這些試 劑為激活的而非靜息的B細(xì)胞提供了新的效應(yīng)原理和特異性。
[0215] 另外，確定了本發(fā)明雙特異性CD20XCD95抗體和特定抗體形式體外殺死激活的 人B細(xì)胞的能力并與抗CD20抗體利妥昔進(jìn)行比較。
[0216] 本發(fā)明典型的雙特異性抗體形式能夠靶向具有CD20和CD95的細(xì)胞，觸發(fā)CD95死 亡受體。⑶20/⑶95陽性激活的B細(xì)胞的存在的升高通常與紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的 耀斑相關(guān)。多發(fā)性硬化癥（MS)中包含激活的B細(xì)胞，這也越來越被接受，因為它們包含在 例如T細(xì)胞補(bǔ)充和激活、細(xì)胞因子釋放和抗體產(chǎn)生中。
[0217] 體外研究顯示，本發(fā)明典型的雙特異性抗體形式可下調(diào)激活的人B細(xì)胞產(chǎn)生免疫 球蛋白。我們發(fā)現(xiàn)其具有高度選擇性，從而通過減少非特異性反應(yīng)避免了副作用。
[0218] 本發(fā)明抗體形式對激活的B細(xì)胞產(chǎn)生IgG的遏制以及對IgG合成的抑制被理解為 "IgG抑制活性"。這種IgG抑制活性涉及激活的B細(xì)胞，特別是自身反應(yīng)性B細(xì)胞，并意圖 包括與相同細(xì)胞但不接觸本發(fā)明抗體形式的IgG產(chǎn)生相比，IgG水平的任何可測量下降，特 別是自身免疫抗體產(chǎn)生的減少，例如，在采用激活的B細(xì)胞的測試系統(tǒng)中，IgG降低至少大 約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。
[0219] 根據(jù)一個特定的實(shí)施方式，本發(fā)明的抗體形式具有凋亡活性，即獨(dú)立于免疫效應(yīng) 細(xì)胞例如NK細(xì)胞，對抗目標(biāo)B細(xì)胞的直接細(xì)胞毒活性。特別地，本發(fā)明的抗體形式具有凋 亡活性，如在標(biāo)準(zhǔn)凋亡試驗中測量的，例如如在標(biāo)準(zhǔn)DNA片段化試驗中測量的。
[0220] 凋亡活性優(yōu)選使用確定瀕死和/或死亡的細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法測定。為了測量凋亡， 可采用細(xì)胞毒性試驗。這些試驗可以是測量質(zhì)膜通透性提高的放射性和非放射性試驗，因 為瀕死細(xì)胞變得泄漏，或可以是測量線粒體代謝活性的比色試驗。死亡細(xì)胞中的線粒體不 能代謝染料，而活細(xì)胞中的線粒體可以。
[0221] 還可測量凋亡的早期指標(biāo)，例如導(dǎo)致細(xì)胞表面外側(cè)出現(xiàn)磷酯酰絲氨酸的膜不對稱 性的改變（基于膜聯(lián)蛋白V的試驗）?；蛘?，可在細(xì)胞群或獨(dú)立的細(xì)胞中測量凋亡后期例如 胱天蛋白酶的激活。此外，可確定細(xì)胞色素 C和AIF通過線粒體或染色體DNA片段釋放到 細(xì)胞質(zhì)中的測量。
[0222] 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL)是檢測由凋亡信號通路導(dǎo)致 的DNA片段的常見方法。該試驗依賴于可被末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶識別的DNA中缺口的存 在，所述末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化溴化dUTP的添加，其可用特定標(biāo)記的抗體二次檢測。
[0223] 優(yōu)選的本發(fā)明抗體形式的凋亡活性達(dá)細(xì)胞溶解的至少20%，優(yōu)選至少30%，更優(yōu) 選至少40%，甚至更優(yōu)選至少50%，如在各離體細(xì)胞殺死試驗中所測量的；例如，在培養(yǎng)后 用雙特異性抗體通過流式細(xì)胞儀測量B細(xì)胞的存活。
[0224] 由于缺少Fc效應(yīng)功能，本發(fā)明抗體形式特別地在免疫效應(yīng)細(xì)胞存在時不具有明 顯的細(xì)胞毒活性，如在標(biāo)準(zhǔn)ADCC或CDC試驗中所測量的，例如采用在細(xì)胞表面表達(dá)受體目 標(biāo)的細(xì)胞。
[0225] 如果相對于對照，細(xì)胞溶解百分比沒有顯著升高，本發(fā)明任何抗體形式可顯示低 細(xì)胞毒活性，如ADCC或⑶C試驗所確定的。如果通過ADCC和/或⑶C活性的絕對百分比 提高測量的細(xì)胞毒活性優(yōu)選低于10 %，優(yōu)選低于5 %，更優(yōu)選低于3 %，通?？纱_定Fc效應(yīng) 功能的缺失。
[0226] 優(yōu)選地，使用結(jié)合一種或兩種目標(biāo)抗原的抗體形式，所述目標(biāo)抗原具有高親和力， 特別是具有高的結(jié)合率和/或低脫除率，或高的結(jié)合親合力。抗體的結(jié)合親合力的特征常 在于抗體濃度方面，在該濃度下，半數(shù)抗原結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)，被稱為解離常數(shù)（Kd或KD)。通 常，Kd〈10_ 8M，優(yōu)選Kd〈10_9M，甚至更優(yōu)選KcKK^M的結(jié)合物被認(rèn)為是高親和力結(jié)合物。
[0227] 但是，在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，單獨(dú)的抗原結(jié)合親合力是中等親合力，例如Kd小 于1(Γ 6Μ以及高達(dá)1(Γ8Μ，例如當(dāng)結(jié)合至少兩種抗原時。
[0228] 本發(fā)明雙特異性單克隆抗體形式可通過多種技術(shù)產(chǎn)生，包括兩種Fab片段的化學(xué) 雜交（導(dǎo)致產(chǎn)生雙特異性Fab 2片段（(Fab'）2，bsFab2))，以及重組抗體技術(shù)，可選地采用雜 交瘤或人抗體序列文庫。實(shí)施例中提供的數(shù)據(jù)用bsFab 2片段（(Fab'）2)或圖1B中描繪的 重組bsFabXsc形式獲得。優(yōu)選重組抗體技術(shù)，因為其可以通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞和簡化的純化重 復(fù)生產(chǎn)。
[0229] 本發(fā)明抗體形式優(yōu)選用在藥物組合物中。其中配制有本發(fā)明抗體形式和一種或多 種治療活性劑的藥物組合物被考慮。將具有所需純度的抗體形式可選地與藥學(xué)上可接受 的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，制備本發(fā)明抗體形式的穩(wěn)定配方用于儲存，其形式為凍干制 齊U、水溶液或水包油乳液。
[0230] 通常，這樣的組合物包含藥學(xué)上可接受的已知的載體，所述載體為可接受的藥物 實(shí)踐所要求，見，例如Remingtons Pharmaceutical Sciences (《雷氏藥物科學(xué)》），16th edition(1980)Mack Publishing Co。這樣的載體的實(shí)施例包括經(jīng)滅菌的載體，例如鹽水， 林格氏液或葡萄糖溶液，可選地用合適的緩沖液緩沖至pH在5-8范圍內(nèi)。
[0231] 待用于體內(nèi)服用的配方需無菌。這通過無菌過濾膜或其它合適的方法容易地達(dá) 到。
[0232] 包含本發(fā)明抗體形式的藥物組合物可通過多種方法進(jìn)行給藥，包括全身性或腸 胃外給藥，優(yōu)選無菌水溶液的形式，例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑，還可以經(jīng)口、鼻內(nèi)、耳內(nèi) (intraotically)、透皮、黏膜、局部（例如凝膠、藥膏、洗液、乳膏等）、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)、 經(jīng)陰道、腸胃外、經(jīng)直腸或眼內(nèi)給藥。因此，本發(fā)明提供了適用于這些用途的相應(yīng)配方的抗 體形式。
[0233] 本發(fā)明包括用藥物制劑進(jìn)行治療，所述藥物制劑包含治療有效量的作為活性物質(zhì) 的本發(fā)明抗體形式。特別是，抗體形式的藥學(xué)上可接受制品與需要其的主體的治療兼容。
[0234] 此處使用的術(shù)語"治療有效量"可與本發(fā)明抗體形式的"有效量"或"足量"任一 術(shù)語互換，其為一量或活性，足以在對主體給藥時引起有益或所需效果，包括臨床效果，并 因此，有效量或其代名詞取決于其施用的背景。例如，在IgG產(chǎn)生或合成抑制的情況下，其 為足以抑制自身抗體升高的化合物的量，如通過將各IgG水平與沒有給予該化合物獲得的 反應(yīng)相比較確定的。在疾病的情況下，抗體形式的治療有效量用以治療、調(diào)節(jié)、減輕、逆轉(zhuǎn)或 影響得益于自身免疫反應(yīng)的疾病或狀況，例如，與自身反應(yīng)性B細(xì)胞紊亂相關(guān)的急性或慢 性炎癥性疾病。有效量意指足以治療、預(yù)防或抑制這些疾病或紊亂的化合物的量。相當(dāng)于 這一量的抗體形式的量根據(jù)不同因素而不同，例如給定的藥物或化合物、藥物制劑、給藥途 徑、疾病或紊亂的類型、主體或被治療宿主的特性，等等，但可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地確 定。
[0235] 提供給需要的人患者的抗體形式的治療有效量可特別地在0. 5_500mg，優(yōu)選 l-400mg，甚至更優(yōu)選高達(dá)300mg，高達(dá)200mg，高達(dá)lOOmg，或高達(dá)10mg的范圍內(nèi)，盡管可使 用較高的劑量例如用于治療急性疾病狀況。
[0236] 此外，用本發(fā)明治療有效量的抗體形式對主體進(jìn)行的治療或預(yù)防方法可由單次給 藥構(gòu)成，或包含一系列的施用。例如，抗體形式可至少每年一次、至少每半年一次或至少一 個月一次給藥。但是，在另一實(shí)施方式中，抗體形式可對給定治療進(jìn)行約每周一次至約每天 給藥。治療周期的長度依賴于多種因素，例如急性或慢性疾病的嚴(yán)重程度、患者年齡、抗體 形式的濃度和活性。也將理解，用于治療或預(yù)防的有效劑量可在特定治療或預(yù)防方法的過 程中提高或降低。通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)診斷試驗，劑量的改變可導(dǎo)致或變得明顯。在一 些情況下，可能需要慢性給藥。
[0237] 用于腸胃外給藥的示例性制劑包括適用于皮下、肌內(nèi)或靜脈注射的那些制劑，例 如，無菌溶液或懸液。
[0238] 本發(fā)明抗體形式通常用以減輕自身免疫反應(yīng)的癥狀，例如減少復(fù)發(fā)-緩解型 MS(RRMS)的每年復(fù)發(fā)率，例如減少至低于50%，優(yōu)選低于40%或低于30%。其它實(shí)施例是 特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP)情況下因子大于2的血小板計數(shù)升高，或自身免疫性溶血 性貧血情況下大于2mg/dl的血紅蛋白濃度升高。
[0239] 在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體形式是給予患者的唯一治療活性劑，例如作為疾 病改善單藥療法。
[0240] 或者，本發(fā)明抗體形式與一種或多種其它治療劑聯(lián)合給藥，包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)治 療，例如MS情況中的β干擾素或類固醇，或ITP情況中的高劑量免疫球蛋白。
[0241] 聯(lián)合療法特別地采用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如用于治療RRMS的標(biāo)準(zhǔn)方法。這可包括β干 擾素或類固醇。
[0242] 在聯(lián)合療法中，抗體形式可作為混合物給藥，或伴隨一種或多種其它治療方法例 如前面的任一方法同時或在伴隨的療法后給藥。
[0243] 本發(fā)明抗體形式的生物學(xué)性質(zhì)可在離體細(xì)胞、組織或整個生物體實(shí)驗中表征。如 本領(lǐng)域所知，常在動物體內(nèi)測試藥物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、貓、豬和猴子，以 測量藥物治療疾病或疾病模型的功效，或測量藥物的藥代動力學(xué)、藥效學(xué)性質(zhì)、毒性和其它 性質(zhì)。動物可被稱為疾病模型。療法常在小鼠中測試，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、異種 移植小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠（包括敲入和敲除）。這樣的實(shí)驗可提供有意義的數(shù)據(jù)用于確定抗 體形式用作具有合適半衰期、效應(yīng)功能、凋亡活性和IgG抑制活性的治療的潛力。任何生物 體優(yōu)選哺乳動物可用于測試。例如，由于與人具有遺傳相似性，靈長類動物、猴子是合適的 治療模型，因此可用以測試本發(fā)明抗體形式的功效、毒性、藥代動力學(xué)、藥效學(xué)性質(zhì)、半衰期 或其它性質(zhì)。最終需要物質(zhì)在人中的測試用于批準(zhǔn)作為藥物，而本文考慮了這些實(shí)驗。因 此，本發(fā)明抗體形式可在動物模型或人中測試以確定其治療功效、毒性、免疫原性、藥代動 力學(xué)性質(zhì)和/或臨床性質(zhì)。
[0244] 通過參考下述實(shí)例能夠更充分地理解上述說明。但是，這些實(shí)施例僅僅是代表實(shí) 施本發(fā)明一個或多個實(shí)施方式的方法，不應(yīng)解讀為對本發(fā)明范圍的限制。
[0245] 實(shí)施例
[0246] 實(shí)施例1A ：
[0247] 通討化學(xué)雜奪Fab片段產(chǎn)牛示例件抗體形式：
[0248] 制備圖1A中如上描述的雙特異性（Fab'）2抗體，且如Jung等人· Eur. J. Immunol. (《歐洲免疫學(xué)雜志》）.中描述。簡要地說，⑶20抗體利妥昔購自Roche Pharma AG (Germany)，⑶95抗體（Apo-1抗體）純化自雜交瘤培養(yǎng)物上清液。Apo-1抗體以純化形式 (BMS151)購自eBioscience，San Diego，CA 92121?？贵w使用蛋白A親和層析純化，myc抗體 獲自雜交瘤克隆克隆9E10(CRL-1729，ATCCManaSSa S，VA，USA)的上清液。兩種抗體都用胃 蛋白酶消化，經(jīng)修飾和雜交以獲得前面提到的文章中描述的雙特異性Fab 2片段（bsFab2)。 相應(yīng)地產(chǎn)生具有⑶40X⑶95和mycX⑶95特異性的雙特異性抗體。指向⑶40和myc蛋白 的親本抗體純化自雜交瘤細(xì)胞（ATCC Manassas，VA，USA)的培養(yǎng)上清液。
[0249] 以通用的方式，通過氧化單價（F(ab'））片段獲得（Fab'）2片段來制備雙特異性 (Fab，） 2 抗體。
[0250] 或者，雙特異性（Fab'）2抗體可通過融合兩種雜交瘤細(xì)胞系以給出四源雜交瘤 (quadroma)細(xì)胞來產(chǎn)生，或通過重組抗體技術(shù)產(chǎn)生。
[0251] 實(shí)施例1B :通討重纟目工稈產(chǎn)牛示例件抗體形式，重纟目雙特異件Fab單鏈（此處也 稱為 bsFab X sc 或 NA-C20):
[0252] 制備圖1B中如上描述的雙特異性NA-C20抗體并采用圖9種描述的序列。利用標(biāo) 準(zhǔn)技術(shù)將編碼抗體的遺傳構(gòu)造穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到Sp2/0細(xì)胞內(nèi)。使用帶有κ選擇的親和層析 (購自 GE-Healthcare, Life Sciences, Freiburg, Germany)從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中純化蛋白質(zhì)。
[0253] 實(shí)施例2 :CD95在用1 u g/mL PWM激活的人B細(xì)朐h.的表汰：
[0254] 將利用密度梯度離心分離的正常健康捐獻(xiàn)者外周血單核細(xì)胞（PBMC)與美洲商陸 有絲分裂原（PWM, 1 P g/ml, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany)培養(yǎng) 6 天并洗漆。在指 定的時間點(diǎn)，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中移除，并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。為此，用耦合到太平洋 藍(lán)的CD19抗體或同型對照抗體、耦合到別藻藍(lán)蛋白（APC)和7-氨基-放線菌素 D(7-AAD) 染料的CD95抗體將細(xì)胞染色，以清楚地鑒別活細(xì)胞?；畹腃D19陽性細(xì)胞經(jīng)設(shè)門并進(jìn)行分 析。抗體購自Bi 〇legend，SanDieg〇，CA92121。結(jié)果在圖2中提供。同型對照獲得明亮的 輪廓-CD95抗體獲得深色輪廓。
[0255] 結(jié)論：靜息B細(xì)胞上檢測不到⑶95,而其表達(dá)在PWM刺激1天后升高，在第3天達(dá) 到其最大值，并維持高值直至第10天，盡管在第6天洗滌細(xì)胞。
[0256] 實(shí)施例3 :通討PWM激活的B細(xì)朐產(chǎn)牛IgG的動力學(xué):
[0257] 用PWM(1 μ g/ml)刺激正常的PBMC。多次后，移除等份的培養(yǎng)上清液并通過ELISA 分析人IgG含量。結(jié)果在圖3中提供。用PWM刺激PBMC(實(shí)心圓）誘導(dǎo)產(chǎn)生人IgG。在第 4天可檢測到抗體產(chǎn)生，并持續(xù)升高至第10天。未刺激的PBMC的抗體產(chǎn)生的測量（空心 圓）用作對照。
[0258] 結(jié)論：PWM刺激5天后可檢測到IgG產(chǎn)生，并持續(xù)升高到第10天。
[0259] 實(shí)施例4 :來自未刺激的PBMC的⑶19+B細(xì)朐和⑶4/⑶8+T輔助/殺傷細(xì)朐的耗 竭：
[0260] 未刺激的PBMC用指定的抗體（1 μ g/ml)培養(yǎng)4天、洗滌并利用耦合到太平洋 藍(lán)的CD19抗體、耦合到異硫氰酸熒光素（FITC)的CD4抗體、耦合到APC和活力染料 7-AAD(Biolegend，San Diego，CA92121)的CD8抗體通過流式細(xì)胞儀分析。NA-C20是描繪 于圖1B中的重組雙特異性抗體。結(jié)果在圖4中提供。
[0261] 結(jié)論：提到的抗體中沒有一個影響未刺激PBMC培養(yǎng)物中的T細(xì)胞或B細(xì)胞。
[0262] 實(shí)施例5 :來自經(jīng)刺激的PBMC的⑶19+B細(xì)朐和⑶4/⑶8+T輔助/殺傷細(xì)朐的耗 竭：
[0263] PBMC用美洲商陸有絲分裂原（PWM, Sigma-Aldrich, 1 μ g/ml)刺激6天、洗漆并用 指定的抗體（1 μ g/ml)培養(yǎng)4天。在第10天如圖4所描述的通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。結(jié) 果在圖5中提供。NA-C20是描繪于圖1B中的bsFabXsc形式的重組雙特異性抗體。
[0264] 結(jié)論：兩種雙特異性⑶20X⑶95抗體引起PWM刺激的PBMC中的B細(xì)胞耗竭。T細(xì) 胞不受影響。具有MycXCD95特異性的化學(xué)雜交對照抗體無效。
[0265] 實(shí)施例6 :體外抗體牛產(chǎn)的抑制:
[0266] 通過密度梯度離心將人外周血單核細(xì)胞（PBMC)從肝素化血液中分離出來， 以lxlO 6細(xì)胞/ml接種于6孔平板中，并用凝集素商陸有絲分裂原（PWM, 1 μ g/ml, Sigma Aldrich)刺激。在第6天，洗漆細(xì)胞，并加入指定抗體。在第10天，通過ELISA測量上清液 中人IgG的量。NA-C20是描繪于圖1B中的bsFabXsc形式的重組雙特異性抗體。結(jié)果在圖 6中提供。
[0267] 結(jié)論：兩種雙特異性⑶20X⑶95抗體抑制經(jīng)刺激的人PBMC產(chǎn)生IgG。具有 MycX⑶95特異性的化學(xué)雜交對照抗體則不會。
[0268] 實(shí)施例7 :雙特異件抗體介導(dǎo)的體外PMW誘導(dǎo)的IgG合成抑制:
[0269] 通過密度梯度離心從肝素化血液中分離三個不同的健康捐獻(xiàn)者（圖7A-7C)人外 周血單核細(xì)胞（PBMC)，以lxlO 6細(xì)胞/ml接種于6孔平板中，并用凝集素美洲商陸有絲分裂 原（PWM，1 μ g/ml, Sigma Aldrich)刺激。在第6天，洗漆細(xì)胞，加入雙特異性F(ab'）2抗體 (即？(&13'） 2抗體形式）。在第10天，通過ELISA測量上清液中人IgG的量。被測試的雙 特異性抗體特異性地靶向⑶20 X⑶95 (實(shí)心圓）或⑶40 X⑶95 (三角形）。作為比較，平 行測試帶有指向細(xì)胞內(nèi)myc蛋白（mycXCD95)的不相關(guān)革巴向特異性的雙特異性抗體（空心 圓）（g卩，？( &13'）2抗體形式）。
[0270] 結(jié)論：
[0271] 具有⑶20 X⑶95或⑶40 X⑶95特異性的雙特異性Fab2抗體抑制激活的人B細(xì) 胞在體外產(chǎn)生IgG，具有Myc X CD95特異性的抗體則不會。
[0272] 實(shí)施例8 :破傷風(fēng)類毒素特異件IgG牛產(chǎn)的抑制
[0273] 用破傷風(fēng)類毒素（25ng/ml, Calbiochem, Merck Darmstadt, Germany)刺激經(jīng)破傷 風(fēng)類毒素新鮮接種的捐獻(xiàn)者的PBMC 4天，洗滌并用指定抗體（1 μ g/ml)培養(yǎng)8天。在第12 天，通過ELISA確定特異性抗破傷風(fēng)抗體的量。NA-C20是圖1B中描繪的bsFab X sc形式的 重組雙特異性⑶20X⑶95抗體。結(jié)果在圖8中提供。
[0274] 結(jié)論：重組雙特異性⑶20 X⑶95抗體NA-C20和單特異性抗⑶20抗體利妥昔抑 制體外特異性抗破傷風(fēng)類毒素抗體的產(chǎn)生。指向EGF受體（愛必妥）或CD95和黑色素瘤 相關(guān)的蛋白多糖（NA-CMel)的具有不相關(guān)目標(biāo)特異性的相應(yīng)單和雙特異性抗體各自無效。 NA-CMel是與NA-C20相同形式的重組雙特異性抗體。
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【權(quán)利要求】
1. 缺乏一活性Fc部分的雙特異性抗體形式，包含用于死亡受體的單價結(jié)合位點(diǎn)和用 于B細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的至少一個結(jié)合位點(diǎn)，用于治療或預(yù)防自身反應(yīng)性B細(xì)胞 紊亂。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1使用的雙特異性抗體形式，其中所述死亡受體選自：CD95、TRAIL受 體和TNF受體，優(yōu)選⑶95。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2使用的雙特異性抗體形式，其中所述細(xì)胞表面抗原選自：CD19、 CD20 和 CD40,優(yōu)選 CD20。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項使用的雙特異性抗體形式，其中所述形式包含特異性結(jié)合 ⑶95的單價結(jié)合位點(diǎn)和特異性結(jié)合⑶19、⑶20或⑶40的至少一個結(jié)合位點(diǎn)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項使用的雙特異性抗體形式，其中所述自身反應(yīng)性B細(xì)胞紊 亂由異常、過度或不希望出現(xiàn)的免疫反應(yīng)，優(yōu)選非癌癥導(dǎo)致。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項使用的雙特異性抗體形式，其中自身反應(yīng)性B細(xì)胞紊亂 是自身免疫紊亂，優(yōu)選選自：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Sjogren綜合癥、硬皮病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、幼 年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、移植體對抗宿主疾病、皮肌炎、I型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯氏 病、阿迪森氏病、脂泄病、克羅恩病、惡性貧血、尋常型天皰瘡、白癜風(fēng)、自身免疫性溶血性貧 血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、巨細(xì)胞性動脈炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥（MS)，優(yōu)選復(fù)發(fā) 緩解型MS(RRMS)、血管球性腎炎、古德帕斯丘綜合癥、大皰性類天皰瘡、潰瘍性結(jié)腸炎、格 林-巴利綜合癥、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、抗磷脂綜合癥、發(fā)作性睡病、結(jié)節(jié)病 以及韋格納氏肉芽腫。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項使用的雙特異性抗體形式，其中所述形式是包含至少2個 抗體域，優(yōu)選至少3、4、5、6、7或8個抗體域以及可選鉸鏈區(qū)的重組分子。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項使用的雙特異性抗體形式，其中所述抗體域是人源的或非 人哺乳動物的人化抗體域，優(yōu)選人化、鼠科或駱駝來源。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項使用的雙特異性抗體形式，其中所述形式包含由互補(bǔ)決定 區(qū)（CDR)形成的至少兩個結(jié)合位點(diǎn)，優(yōu)選的，CDR獲自抗體域，所述抗體域優(yōu)選選自VH和 VH/VL域?qū)?，?yōu)選至少一個或兩個VH和/或至少一個或兩個VH/VL域?qū)Α?br> 10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項使用的雙特異性抗體形式，其中所述形式包含VH/VL結(jié)合 位點(diǎn)和/或scFv結(jié)合位點(diǎn)的至少之一，以及可選地CHI、CL、CH2或CH3域至少之一。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項使用的雙特異性抗體形式，其中所述形式缺少Fc部分或 包含經(jīng)改造以滅活或減少其Fc效應(yīng)功能的Fc部分，所述改造優(yōu)選通過Fc部分中的一個或 多個突變實(shí)現(xiàn)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項使用的雙特異性抗體形式，其中所述形式選自：SCFv、 Fab與一個或多個抗體可變域的組合、F(ab'）2和它們的組合,優(yōu)選采用至少一個抗體恒定 域作為連接物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項使用的雙特異性抗體形式，其包含 -包含用于第一抗原的第一結(jié)合位點(diǎn)的Fab片段； -包含用于第二抗原的第二結(jié)合位點(diǎn)的scFv片段； -CH2域，其中Fab片段和scFv片段通過CH2域連接，其中 a)第一抗原是⑶95,第二抗原選自⑶19、⑶20和⑶40,優(yōu)選⑶20 ;或 b)第一抗原選自⑶19、⑶20和⑶40,優(yōu)選⑶20,第二抗原是⑶95。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項使用的雙特異性抗體形式，其中結(jié)合CD20的結(jié)合位點(diǎn)包 含抗體可變域的六個互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1至⑶R6)，其中 A) i) CDRl 包含氨基酸序列 RASSSVSYM(SEQ ID 12); ii) CDR2 包含氨基酸序列 APSNLAS(SEQ ID 13); iii) CDR3 包含氨基酸序列 QQWSFNPPT(SEQ ID 14); iv) CDR4 包含氨基酸序列 SYNMH(SEQ ID 16); v) CDR5 包含氨基酸序列 AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17);以及 vi) CDR6 包含氨基酸序列 VVYYSNSYWYFDV(SEQ ID 18); 或者 B) 其功能活性變體，其中至少一個 i) CDRl包含與氨基酸序列RASSSVSYM(SEQ ID 12)至少70%的序列一致性的氨基酸序 列； ii) ⑶R2包含與氨基酸序列APSNLAS(SEQ ID 13)至少70%的序列一致性的氨基酸序 列； iii) ⑶R3包含與氨基酸序列QQWSFNPPT(SEQ ID 14)至少70%的序列一致性的氨基酸 序列； iv) ⑶R4包含與氨基酸序列SYNMH(SEQ ID 16)至少70%的序列一致性的氨基酸序列； v) CDR5包含與氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQID17)至少70%的序列一致性的 氨基酸序列； 和/或 vi) ⑶R6包含與氨基酸序列VVYYSNSYWYFDV(SEQ ID 18)至少70%的序列一致性的氨 基酸序列。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項使用的雙特異性抗體形式，其包含VL域和/或VH域或 它們的功能活性變體，所述VL域包含SEQ ID 11的氨基酸序列，所述VH域包含SEQ ID 15 的氨基酸序列。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15使用的雙特異性抗體形式，其中所述變體為包含VL域和/或VH 域或它們的功能活性變體的人化變體，所述VL域包含SEQ ID 19的氨基酸序列，所述VH域 包含SEQ ID 20的氨基酸序列。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項使用的雙特異性抗體形式，其中結(jié)合CD95的結(jié)合位點(diǎn)包 含可變抗體域的六個互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R1至⑶R6)，其中 A) i) CDRl 包含氨基酸序列 RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID 2); ii) CDR2 包含氨基酸序列 VASNVES(SEQ ID 3); iii) CDR3 包含氨基酸序列 QQSTKVPWT(SEQ ID 4); iv) CDR4包含氨基酸序列TNAMN(SEQ ID 6); v) CDR5 包含氨基酸序列 RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7);以及 vi) CDR6包含氨基酸序列DGYY(SEQ ID 8); 或者 B)其功能活性變體，其中至少一個 i) CDRl包含與氨基酸序列RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID 2)至少70%的序列一致性的氨 基酸序列； ii) ⑶R2包含與氨基酸序列VASNVES(SEQ ID 3)至少70%的序列一致性的氨基酸序 列； iii) ⑶R3包含與氨基酸序列QQSTKVPWT(SEQ ID 4)至少70%的序列一致性的氨基酸 序列； iV)⑶R4包含與氨基酸序列TNAMN(SEQID6)至少70%的序列一致性的氨基酸序列； v)CDR5包含與氨基酸序列RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQID7)至少70%的序列一致性 的氨基酸序列； 和/或 Vi)⑶R6包含與氨基酸序列DGYY(SEQ ID 8)至少70%的序列一致性的氨基酸序列。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-17任一項使用的雙特異性抗體形式，其包含VL域和/或VH域或 它們的功能活性變體，所述VL域包含SEQ ID 1的氨基酸序列，所述VH域包含SEQ ID 5的 氨基酸序列。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18使用的雙特異性抗體形式，其中所述變體為包含VL域和/或VH 域或它們的功能活性變體的人化變體，所述VL域包含SEQ ID 9的氨基酸序列，所述VH域 包含SEQ ID 10的氨基酸序列。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項使用的雙特異性抗體形式，其包含SEQ ID 21的輕鏈序 列和SEQ ID 22的重鏈序列，或它們的功能活性變體。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20使用的雙特異性抗體形式，其中所述變體為包含VL域和/或VH 域或它們的功能活性變體的人化變體，所述VL域包含SEQ ID 24的氨基酸序列，所述VH域 包含SEQ ID 25的氨基酸序列。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1-21任一項使用的雙特異性抗體形式，其包含鼠科、嵌合和/或人化 序列。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1-22任一項使用的雙特異性抗體形式，其與CD20的Kd〈l(T8M和/或 與 CD95 結(jié)合的 Kd〈l(T8M。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1-23任一項使用的雙特異性抗體形式，其用在與自身反應(yīng)性B細(xì) 胞紊亂的其它治療的組合療法中，優(yōu)選與細(xì)胞因子治療或其它抗體形式或試劑的治療的組 合。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1-24任一項使用的雙特異性抗體形式，其中所述抗體形式以治療有 效量對需要其的主體給藥。
26. -種治療或防止自身反應(yīng)性B細(xì)胞紊亂的方法，包括對需要的主體給予治療有效 量的雙特異性抗體形式，該抗體形式缺少活性Fc部分，包含用于死亡受體的單價結(jié)合位點(diǎn) 以及用于在B細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的至少一個結(jié)合位點(diǎn)。
27. -種用于治療自身反應(yīng)性B細(xì)胞的方法，包括將所述細(xì)胞與包含權(quán)利要求1-23任 一項中限定的雙特異性抗體形式的組合物相接觸。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中死亡受體和所述細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面抗原被雙
【文檔編號】C07K16/28GK104105707SQ201280067246
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月17日
【發(fā)明者】G·容, L·格羅塞-霍韋斯特 申請人:G·容