一種皂苷異構(gòu)體分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種皂苷異構(gòu)體分離純化方法。采用親水作用色譜在醇水洗脫體系下實現(xiàn)皂苷異構(gòu)體的高效分離。流動相組成為甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇或水，無緩沖鹽添加，便于樣品制備后處理。采用線性梯度、臺階梯度或等度洗脫方式。選取三七葉水提物反相色譜制備分離所得4個餾分，通過親水色譜制備獲得4組皂苷異構(gòu)體，共12個皂苷，其中包括1個新皂苷和2個首次從三七葉中分得的皂苷。該方法可以實現(xiàn)皂苷異構(gòu)體的高效制備，特別是對含有呋喃型阿拉伯糖基、吡喃型阿拉伯糖基或吡喃型木糖基的皂苷異構(gòu)體，該方法表現(xiàn)出優(yōu)異的分離效果。從而可以不斷豐富皂苷庫，為皂苷類化合物的活性研究和單一成分的新藥開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
【專利說明】一種皂苷異構(gòu)體分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及皂苷類化合物的分離純化，具體地說是一種利用親水作用色譜在醇水洗脫體系中高效分離皂苷異構(gòu)體的方法。該方法對包含呋喃型阿拉伯糖基、吡喃型阿拉伯糖基或吡喃型木糖基的皂苷異構(gòu)體表現(xiàn)出較優(yōu)的分離效果。
【背景技術(shù)】
[0002]阜苷(Saponins)是苷元(Sapogenins)為三職(Triterpenoids)或螺旋留燒類(Spirostane)化合物的一類糖苷。在阜苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，由于苷元具有不同程度的親脂性，糖鏈具有較強的親水性，使皂苷成為一種表面活性劑，用力振搖其水溶液可產(chǎn)生持久性泡沫。
[0003]皂苷類化合物除具有表面活性、溶血、毒魚等特性外，還具有多種生理功能，是許多中藥的主要活性成分。皂苷的生物活性除與苷元有關(guān)外，與糖鏈的結(jié)構(gòu)也關(guān)系密切。S.G.Sparg、王楠、張云峰和張存莉等分別對皂苷類化合物具有的生物活性進(jìn)行了綜述，這些活性主要包括防治心血管系統(tǒng)疾病、抗癌、降血糖、降血脂、保肝、抗炎、抗過敏、抗微生物、抗衰老、抗生育等(S.G.Sparg, Μ.E.Light, J.van Staden, Biological activities anddistribution of plant saponins, Journal of Ethnopharmaco1gy 94 (2004)219-243 ；王楠.皂苷生物活性的研究進(jìn)展，醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2007，20(2):211-214;張云峰，魏東，鄧雁如，等.三萜皂苷的生物活性研究新進(jìn)展，中成藥，2006，28 (9):1349-1353 ;張存莉，吳戰(zhàn)庫，馬惠玲 ，等.留體皂苷的生物活性研究進(jìn)展，西北林學(xué)院學(xué)報，2003，18(2):95-100.)。
[0004]皂苷的苷元和糖鏈的結(jié)構(gòu)多樣性是皂苷眾多生理活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但這種多樣性也給皂苷的結(jié)構(gòu)解析帶來了很大困難，特別是皂苷異構(gòu)體。因為常規(guī)的核磁表征方法需要毫克級的高純度皂苷單體。反相色譜是目前皂苷分離中應(yīng)用最廣泛的色譜技術(shù)，但對于僅端基糖存在差異的皂苷異構(gòu)體反相色譜的分離能力常常是不足的。例如，3種常見的人參皂苷Ginsenosides Re，Rb2和Rb3，它們的差別僅存在于端基五碳糖上。采用反相色譜進(jìn)行分離時，即使采用乙腈、甲醇和水三元流動相體系也很難將其有效分離(X.Qiao etal.J.Sep.Sc1.2011，34，169-175)。這是因為反相色譜柱對皂苷的親水選擇性不足。而親水作用色譜卻恰恰是利用皂苷的親水性差異對其進(jìn)行分離，其有望成為反相色譜的替代色譜模式來分離該類皂苷異構(gòu)體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明涉及一種皂苷異構(gòu)體的分離純化方法。采用親水作用色譜在醇水流動相體系下高效分離皂苷異構(gòu)體。流動相組成為甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇或水，無緩沖鹽添加，便于樣品制備后處理。采用線性梯度、臺階梯度或等度洗脫方式。
[0006]其中所述親水色譜柱為兩性離子柱(Click X1n，北京華譜新創(chuàng)科技有限公司)。色譜操作參數(shù)如下:色譜柱內(nèi)徑為4.6-100mm ;樣品濃度為lmg/mL-lg/mL ;進(jìn)樣量為I μ L-40mL ;流速為0.5_480mL/min ;柱溫為4_60°C。所述流動相組成為甲醇-水、乙醇-水、異丙醇-水、異丙醇-甲醇-水或正丁醇-甲醇-水。
[0007]采用以醇水為洗脫劑的親水作用色譜從三七葉提取物中制備獲得4組皂苷異構(gòu)體，包括I個新皂苷、2個首次從三七葉中分得的皂苷，共12個高純度皂苷。所述化合物的
結(jié)構(gòu)信息如下:
[0008]
【權(quán)利要求】
1.一種皂苷異構(gòu)體分離純化方法，其特征在于:采用親水作用色譜從皂苷提取物中高效分離純化高純度皂苷異構(gòu)體；流動相組成為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇中的一種或兩種與水，無緩沖鹽添加，便于樣品制備后處理；采用線性梯度、臺階梯度或等度洗脫方式。
2.按照權(quán)利要求1所述皂苷分離純化方法，其特征在于:親水作用色譜柱為兩性離子柱(Click X1n)。
3.按照權(quán)利要求1所述皂苷分離純化方法，其特征在于:色譜操作參數(shù)如下:色譜柱內(nèi)徑為 4.6-100mm ;樣品濃度為 lmg/mL-lg/mL ;進(jìn)樣量為 I μ L_40mL ;流速為 0.5-480mL/min ；柱溫為4_60 C。
4.按照權(quán)利要求1所述皂苷分離純化方法，其特征在于:所述流動相組成為甲醇-水、乙醇-水、異丙醇-水、異丙醇-甲醇-水或正丁醇-甲醇-水。
5.按照權(quán)利要求1所述皂苷分離純化方法，其特征在于:所述皂苷提取物為三七葉水提物。
6.一種權(quán)利要求1所述皂苷類化合物的制備方法，其特征在于: 1)三七葉水提物先經(jīng)制備型RPLC分離，色譜條件:色譜柱為C18TDE柱；水(々)和乙腈(B)流動相體系；洗脫梯度為0-5min，體積濃度20%— 32% B;5-45min,體積濃度32%—68% B;45-50min,體積濃度 68%— 100% B; 50-55min, 100% B ;流速為 300mL/min ;檢測波長為203nm ;樣品溶液濃度為300mg/mL，其采用體積濃度20% ACN-80% H2O溶解；進(jìn)樣體積為IOmL ;l_55min，每分鐘收集一份，共計54個組分，每個組分濃縮至干后備用；針對4個富含皂苷異構(gòu)體的組分(F r.10，F(xiàn) r.12，F(xiàn)r.17和Fr.26)采用親水作用色譜進(jìn)行制備，色譜柱為Click X1n柱；采用甲醇 水流動相體系，根據(jù)各個組分的色譜保留特性，流動相中甲醇的體積濃度控制在80% -100% ;采用等度洗脫方式制備皂苷異構(gòu)體； 2)選取Fraction10采用親水色譜模式進(jìn)行制備型HPLC分離，色譜條件:色譜柱為兩性離子柱(Click X1n, 150X 10mm, 1.d.，10 μ m) jjC(A)和甲醇(B)流動相體系；體積濃度92% B等度洗脫；流速為2mL/min ;檢測波長為203nm ;進(jìn)樣量為50 μ L ;收集各個色譜峰，分別回收溶劑，經(jīng)核磁實驗確定，獲得1，2，3三個化合物； 選取Fraction 12采用親水色譜模式進(jìn)行制備型HPLC分離，色譜條件:色譜柱為兩性離子柱(Click X1n, 150X 10mm, 1.d.，10 μ m);水(八)和甲醇(B)流動相體系；體積濃度95% B等度洗脫；流速為2mL/min ;檢測波長為203nm ;進(jìn)樣量為50 μ L ;收集各個色譜峰，分別回收溶劑，經(jīng)核磁實驗確定，獲得4，5，6三個化合物； 選取Fraction 17采用親水色譜模式進(jìn)行制備型HPLC分離，色譜條件:色譜柱為兩性離子柱(Click X1n, 150X 10mm, 1.d., 10 μ m) ；100 % 甲醇等度洗脫；流速為 2mL/min ;檢測波長為203nm ;進(jìn)樣量為50 μ L ;收集各個色譜峰，分別回收溶劑，經(jīng)核磁實驗確定，獲得7，8，9三個化合物； 選取Fraction 26采用親水色譜模式進(jìn)行制備型HPLC分離，色譜條件:色譜柱為兩性離子柱(Click X1n, 150X 10mm, 1.d., 10 μ m) ；100 % 甲醇等度洗脫；流速為 lmL/min ;檢測波長為203nm ;進(jìn)樣量為50 μ L ;收集各個色譜峰，分別回收溶劑，經(jīng)核磁實驗確定，獲得10，11，12三個化合物。
7.按照權(quán)利要求6所述皂苷異構(gòu)體的制備方法，通過親水色譜制備獲得4組高純度皂苷異構(gòu)體，包括I個新皂苷和2個首次從三七葉中分得的皂苷，共12個皂苷；所述化合物的結(jié)構(gòu)信息如下:
【文檔編號】C07J17/00GK103772467SQ201210405911
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月22日
【發(fā)明者】梁鑫淼, 郭秀潔, 張秀莉, 郭志謀, 肖遠(yuǎn)勝, 薛興亞 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所