專利名稱：人源化k33n單克隆抗體的生成、表達和表征的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的人源化抗體及其對與α 9整聯(lián)蛋白有關或牽涉α 9整聯(lián)蛋白的各種疾病或病癥(包括癌癥、炎性疾病、自身免疫性疾病、由α 9 整聯(lián)蛋白誘發(fā)的疾病狀況、等等)的治療和診斷用途。
2.
背景技術：
由一組稱作整聯(lián)蛋白的細胞表面受體介導，細胞粘附于胞外基質(zhì)(下文縮寫為 ECM)。整聯(lián)蛋白通過形成α和β鏈的1 1異二聚體來執(zhí)行其功能。迄今為止，已經(jīng)鑒定并確認至少18類α鏈、8類β鏈和對類α β異二聚體。已知每種整聯(lián)蛋白識別一種特定的配體。整聯(lián)蛋白根據(jù)其配體特異性或功能而分類入亞家族中，并分成膠原受體、層粘連蛋白受體、識別存在于纖連蛋白、玻連蛋白、等中的Arg-Gly-Asp (RGD)序列的RGD受體、和僅存在于白細胞中的白細胞特異性受體(Hynes, R. 0.，2002，Integrins bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110 :673-87 ；Miyasaka, Μ. ,2000, New edition of Adhesion Molecule Handbook，Shujunsya)。α 4和α 9整聯(lián)蛋白是不屬于任何這些類型并稱作α 4整聯(lián)蛋白亞家族的亞家族的成員(Elise L. Palmer, Curzio Rfiegg，Ronald Ferrando, Robert Pytela, Sheppard D.,1993, Sequence and Tissue Distribution of the Integrin α 9 Subunit, a Novel Partner of β 1 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle. The Journal of Cell Biology, 123 :1289-97)。同時，迄今為止， 過去認為ECM僅充當細胞間的粘合物質(zhì)?，F(xiàn)在已經(jīng)變得清楚的是，整聯(lián)蛋白介導的ECM-細胞相互作用顯著牽涉調(diào)節(jié)細胞的生長、粘附、運動、等，而且與疾病的發(fā)作(包括癌癥的進展、炎癥的惡化、等)有關。例如，作為ECM之一的骨橋蛋白(下文縮寫為0ΡΝ)是一種具有約41kDa分子量的分泌性、酸性磷酸化糖蛋白，而且是一種在母乳、尿液、腎小管、破骨細胞、成骨細胞、巨噬細胞、激活的T細胞、腫瘤組織、等等中廣泛觀察到其表達的分子。OPN具有粘附序列，即在其分子中央的GRGDS(SEQ IDNO :1)、在人OPN中的SWYGLR(SEQ ID NO 2)序列或小鼠OPN中的SLAYGLR(SEQ ID NO 3)序列，和與其極其接近的凝血酶切割位點，并經(jīng)由GRGDS (SEQ ID NO 1)序列結(jié)合RGD整聯(lián)蛋白或經(jīng)由SVVYGLR (SEQ IDNO 2)序列或SLAYGLR (SEQ ID NO 3)序列結(jié)合α4(α4β 1)禾口 α9(α9β 1)整聯(lián)蛋白。WO 02/081522披露了使用OPN敲除小鼠或針對OPN的中和性抗體通過抑制OPN功能實現(xiàn)的對類風濕性關節(jié)炎或肝炎的治療效果。此外，此公開文本披露了 SVVYGLR(SEQ ID NO 2)序列由于識別α9和α 4整聯(lián)蛋白而對于炎性疾病的發(fā)病機制是至關重要的，并且 OPN的受體在免疫活性細胞等等中表達且與炎性疾病有關。已經(jīng)找到了結(jié)合譜的差異，其在于α 4β 1既結(jié)合未經(jīng)凝血酶切割的0ΡΝ(未切割的0ΡΝ)又結(jié)合經(jīng)凝血酶切割的OPN (經(jīng)切割的0ΡΝ)的N端片段，而α 9 β 1僅結(jié)合經(jīng)切割的OPN(Y. Yokosaki等，(1999)The Journal of Biological Chemistry, 274 :36328-36334 ； P. Μ. Green 等，O001)raBS Letters, 503 :75-79 ；S. Τ. Barry 等，OOOO) Experimental CellResearch, 258 :342-351)。除了 OPN以外，α4和α9整聯(lián)蛋白共享許多共同配體。已知的配體有纖連蛋白的EDA域、前肽-von Willebrand因子(pp-vWF)、組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)、血液凝固因子XIII、血管細胞粘附分子-I(VCAM-I)等。另外，已知纖連蛋白的CS-I域、 MadCAM-I (α 4β 7)、等為受到α 4整聯(lián)蛋白特異性識別的配體。已知生腱蛋白-C、纖溶酶、 等為受到α9整聯(lián)蛋白特異性識別的配體。整聯(lián)蛋白亞基α 9、α 4和β 1的氨基酸序列是眾所周知的。例如，在GenBank，人 α 9 登記為 NM_002207，小鼠 α 9 為 NM_133721，人 α 4 為 NM_000885，小鼠 α 4 為 NM_010576， 人β 1為Χ07979，而小鼠β 1為ΝΜ_010578。還已知這些整聯(lián)蛋白在氨基酸序列方面在物種間具有高度相似性。3.發(fā)明概述雖然目前已知許多用于治療癌癥、炎性疾病和自身免疫性疾病的藥物，但是期望開發(fā)出對癌癥、炎性疾病和自身免疫性疾病具有更為改善的治療效果的預防和/或治療劑等。本發(fā)明部分基于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，即針對α9整聯(lián)蛋白的特異性抑制性抗體具有抑癌和消炎效果。先前，本發(fā)明人分離出免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白并由雜交瘤克隆Κ33Ν(保藏登錄號FERM ΒΡ-10830)生成的小鼠單克隆抗體。在本文中，該雜交瘤克隆名稱與由該克隆生成的單克隆抗體的名稱可互換使用。小鼠抗人α 9整聯(lián)蛋白抗體是IgGl同種型的。該單克隆抗體抑制人和/或小鼠α 9整聯(lián)蛋白與α 9整聯(lián)蛋白的配體，諸如骨橋蛋白之間的結(jié)合。如此，該抗α 9整聯(lián)蛋白抗體抑制α 9整聯(lián)蛋白的功能，而且對癌癥，例如癌細胞的生長或轉(zhuǎn)移，和對炎性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維化、糖尿病、動脈硬化、多發(fā)性硬化、肉芽腫、炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩(Crohn)氏病)、自身免疫性疾病、由α 9整聯(lián)蛋白誘發(fā)的疾病狀況、等等展現(xiàn)出治療效果。此外，本發(fā)明的抗α 9整聯(lián)蛋白抗體可以作為體內(nèi)診斷劑用于檢測受試者中的 α 9整聯(lián)蛋白表達的存在和水平，由此診斷牽涉α 9整聯(lián)蛋白的病癥或疾病。然而，因為該單克隆抗體是小鼠起源的，其在人中的免疫原性所致的可能的不利影響已經(jīng)阻礙了其直接應用于人的診斷或治療用途。為了降低免疫原性，本發(fā)明人已經(jīng)制備了人源化抗體，其具有與衍生所述人源化抗體的初始小鼠抗α 9整聯(lián)蛋白抗體展現(xiàn)的生物學活性對應的生物學活性。因而，本發(fā)明提供了免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體包含部分自非人起源衍生和部分自人起源衍生的抗原結(jié)合區(qū)。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含自非人來源(供體)，諸如Κ33Ν 單克隆抗體衍生的互補決定區(qū)(CDR)和自人來源(接受體)衍生的框架區(qū)(FR)。在一個實施方案中，所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段抑制人α9整聯(lián)蛋白與人α9整聯(lián)蛋白的配體之間的結(jié)合。在一個具體的實施方案中，所述免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的人源化抗體或其抗體結(jié)合片段包含(i)重鏈(H鏈)，其包含至少一種自人H鏈的可變區(qū)(V區(qū))衍生的 H鏈FR(FRH)和至少一種自免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的非人抗體K33N的至少一種 ⑶RH衍生的H鏈互補決定區(qū)(⑶RH)；或(ii)輕鏈(L鏈)，其包含至少一種自人L鏈的V區(qū)衍生的L鏈FR(FRL)和至少一種自免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的非人抗體K33N的至少一種⑶RL衍生的L鏈互補決定區(qū)(⑶RL)；或上文的(i)和(ii)兩者。例如，所述非人抗體(其衍生本發(fā)明的人源化抗體的至少一種CDRH和/或至少一種CDRL)是由登錄號 FERMBP-10830的雜交瘤生成的單克隆抗體。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含(i) 至少一種自人FRH衍生的FRH和至少一種包含選自氨基酸序列SEQID NO :4、5和6的氨基酸序列的CDRH ；或(ii)至少一種自人FRL衍生的FRL和至少一種包含選自氨基酸序列SEQ ID N0:ll、12和13的氨基酸序列的CDRL ；或(iii)上文的⑴和(ii)兩者。本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，它們分別包含氨基酸序列SEQ IDN0:4、5和6。在備選中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含⑶RL1、 ⑶RL2和⑶RL3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID NO :11、12和13。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1、⑶RL2和 CDRL3，它們分別包含氨基酸序列SEQ ID NO :4、5、6、11、12和13。在另一個備選中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含自由GenBank登錄號DA980102 (SEQ ID NO 18) 編碼的人H鏈的可變區(qū)衍生的FRH，或自由GenBank登錄號X7M41 (SEQ ID NO 23)編碼的人κ-L鏈的可變區(qū)衍生的FRL。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的人源化抗體的FRH包含至少一種選自氨基酸序列SEQID NO 19、20、21和22 (分別由DA980102的相應部分編碼的FRH1、FRH2、FRH3和FRH4)的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的人源化抗體的FRL包含至少一種選自氨基酸序列SEQ ID NO :M、25J6和27 (分別由X7M41的相應部分編碼的FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的氨基酸序列。在一個更優(yōu)選的實施方案中， 本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含(i) H鏈可變區(qū)(VH區(qū))，其包含氨基酸序列 SEQ ID N0:29;或(ii)L鏈可變區(qū)(VL區(qū))，其包含氨基酸序列SEQ ID NO 31 ；或(iii)上文的(i)和(ii)兩者。在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含(i) Y-IH鏈，其包含氨基酸序列SEQ ID NO 37 ；或(ii) κ L鏈，其包含氨基酸序列 SEQID NO 39 ；或(iii)上文的⑴和(ii)兩者。本發(fā)明進一步提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的核苷酸序列。具體地，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼包含至少一種選自SEQID NO :4、5和6的氨基酸序列的人源化 H鏈，或包含至少一種選自SEQ IDNO 11、12和13的氨基酸序列的人源化L鏈，或所述人源化H鏈和所述人源化L鏈兩者的核苷酸序列。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，此類分離的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO :28(其編碼VH區(qū))或編碼氨基酸序列SEQ IDNO 29 的核苷酸序列。在另一個優(yōu)選的具體實施方案中，此類分離的核酸分子包含核苷酸SEQ ID NO 30 (其編碼VL區(qū))或編碼氨基酸序列SEQ ID NO 31的核苷酸序列。在又一個優(yōu)選的具體實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO 和30兩者。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，此類分離的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO :36(其編碼 Y-IH鏈)或編碼氨基酸序列SEQ ID NO :37的核苷酸序列。在另一個優(yōu)選的具體實施方案中，此類分離的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO :38(其編碼kL鏈)或編碼氨基酸序列SEQ ID NO :39的核苷酸序列。在又一個優(yōu)選的具體實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID N0:36和38兩者。在又一個優(yōu)選的具體實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子進一步包含編碼供體起源(諸如分別為氨基酸序列SEQ ID N0:10和17) 或異源起源的信號肽的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供了一種載體，例如表達載體，其包含編碼免疫特異性識別人α 9 整聯(lián)蛋白的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的H鏈或L鏈或二者的核苷酸序列。在此類載體中，本發(fā)明的核苷酸序列可以與一種或多種調(diào)節(jié)元件可操作連接。本發(fā)明的核苷酸序列可以包括編碼對于衍生CDR的非人供體抗體而言天然的信號肽或異源起源的信號肽的核苷酸序列。此外，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，其包含本發(fā)明的核酸分子，包括包含本發(fā)明的核酸分子的載體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的宿主細胞，其包含編碼本發(fā)明的人源化H鏈的第一核酸分子和編碼本發(fā)明的人源化L鏈的第二核酸分子，所述第一和第二核酸分子各自以使得本發(fā)明的生物學功能性人源化抗體或其抗原結(jié)合片段表達的方式與調(diào)節(jié)元件可操作連接。因而，本發(fā)明進一步提供了一種用于制備本發(fā)明的人源化抗體的方法，包括在使得該人源化抗體表達的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞；并收集所生成的人源化抗體。本發(fā)明進一步提供了包含至少一種本發(fā)明的人源化抗體的組合物。另外，本發(fā)明提供了一種用于預防或治療與α9整聯(lián)蛋白有關的病癥或疾病的藥物組合物，其包含至少一種本發(fā)明的人源化抗體和藥學可接受載體。任一種所述組合物可以進一步包含另一種活性化合物，其能附加地或協(xié)同地改善該病癥或疾病。此類活性化合物包括(但不作為限制) 消炎化合物、化學治療化合物、等等，以及抗體或其抗原結(jié)合片段，諸如能免疫特異性結(jié)合人α 4整聯(lián)蛋白的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于預防或治療與α 9整聯(lián)蛋白有關或牽涉α 9 整聯(lián)蛋白的病癥或疾病的方法，所述方法包括對有此需要的受試者施用預防或治療有效量的至少一種本發(fā)明的人源化抗體。對于此類用途，本發(fā)明的人源化抗體可以與增強該人源化抗體的生物學效果的治療模塊綴合。此類治療模塊的例子包括另一種抗體，諸如抗α 4 抗體(例如以形成雙特異性抗體)、抑制細胞性或殺細胞性細胞毒素、放射性元素、和/或其它治療劑，包括消炎劑、抗生素、等等。在又一發(fā)面，本發(fā)明提供了一種用于在受試者中診斷與α 9整聯(lián)蛋白有關或牽涉 α 9整聯(lián)蛋白的病癥或疾病的方法，所述方法包括對要檢查的受試者施用診斷有效量的本發(fā)明的人源化抗體。對于此類診斷用途，可以用可檢測標志物，諸如放射性元素標記本發(fā)明的人源化抗體。3. 1 定義如本文中所使用的，術語“抗體”指能夠免疫特異性結(jié)合期望的抗原，諸如α 9整聯(lián)蛋白的抗體分子，而且涵蓋完整的抗體分子或其片段，包括抗原結(jié)合片段。本文中所使用的術語“免疫特異性識別”指抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合靶多肽或蛋白質(zhì)，特別是人α 9整聯(lián)蛋白的能力。此類抗體并不非特異性結(jié)合其它多肽或蛋白質(zhì)。然而，免疫特異性結(jié)合靶多肽或蛋白質(zhì)(例如人α9整聯(lián)蛋白)的抗體或其抗原結(jié)合片段可以與其它抗原起交叉反應。例如，免疫特異性識別人α9整聯(lián)蛋白的本發(fā)明的人源化抗體或抗原結(jié)合片段可以與例如其它物種的α9整聯(lián)蛋白起交叉反應。優(yōu)選地，免疫特異性結(jié)合人α 9整聯(lián)蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段不與其它抗原起交叉反應。
本文中所使用的術語“抗原結(jié)合片段”指保留免疫特異性結(jié)合靶多肽或蛋白質(zhì)，特別是人α 9整聯(lián)蛋白和/或非人α9整聯(lián)蛋白的能力的任何抗體片段，而且包括單鏈抗體、 Fab片段、F(ab' )2片段、二硫化物連接的Fv、和含有特異性結(jié)合靶多肽或蛋白質(zhì)的輕鏈可變區(qū)(VL)和/或重鏈可變區(qū)(VH)或甚至互補決定區(qū)(CDR)的片段。如此，人源化抗體的此類抗原結(jié)合片段可以包含或不包含部分或全長人恒定區(qū)。用于獲得上文所描述的抗體片段的各種方法是本領域中公知的。本文中所使用的術語“自人來源衍生的”或“自非人來源衍生的”指自人抗體或非人抗體的相應部分衍生其氨基酸序列的抗體部分。本文中所使用的術語“接受體序列”指充當來自供體抗體(其通常是非人抗體)的 CDR的接受體的，來自人抗體VH或VL區(qū)的框架區(qū)的核苷酸序列或氨基酸序列。4.附圖簡述

圖1顯示了實驗結(jié)果，其中用人α-9整聯(lián)蛋白表達細胞(人黑素瘤細胞G361)和 OPNa-9整聯(lián)蛋白結(jié)合位點肽(SVVYGLR)測量抗人α _9整聯(lián)蛋白抗體(即本發(fā)明的兩種克隆(即Κ33Ν和Μ35Α)、五種其它克隆(1K11、21C5、24I11、25B6、和28S1)、和Υ9Α2)的細胞粘附抑制活性。使用針對人骨橋蛋白的單克隆抗體(5A1)作為陰性對照。圖2顯示了實驗結(jié)果，其中用人α-9整聯(lián)蛋白表達細胞(人黑素瘤細胞G361)和生腱蛋白C片段的α-9整聯(lián)蛋白結(jié)合位點肽測量抗人α-9整聯(lián)蛋白抗體(即本發(fā)明的兩種克隆(即Κ33Ν和Μ35Α)、五種其它克隆(1K11、21C5、24I11、25B6、和28S1)、和Υ9Α2)的細胞粘附抑制活性。使用針對人骨橋蛋白的單克隆抗體(5A1)作為陰性對照。圖3顯示了小鼠K33N VH cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 7)及推導的氨基酸序列(SEQ ID NO :8)。氨基酸殘基以單字母代碼顯示。信號肽序列(SEQID NO=IO)為斜體。 成熟VH的N端氨基酸殘基(Q)加雙下劃線。依照Kabat等(kquences of Proteins of Immunological Interests,第五版,NIH出版No. 91-3242,U. S. Department of Health and Human Services, 1991)定義的⑶R序列加下劃線。圖4顯示了小鼠K33N VL cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 14)及推導的氨基酸序列(SEQ ID N0:15)。氨基酸殘基以單字母代碼顯示。信號肽序列(SEQ ID N0 17)為斜體。成熟VL的N端氨基酸殘基⑶加雙下劃線。依照Kabat等(1991)定義的CDR序列加下劃線。圖5顯示了側(cè)翼有SpeI和HindIII位點(加下劃線)的設計K33N VH(ChK33N VH) 基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 32)及推導的氨基酸序列(SEQID NO 8)。氨基酸殘基以單字母代碼顯示。信號肽序列(SEQ ID N0 10)為斜體。成熟VH的N端氨基酸殘基(Q)加雙下劃線。依照Kabat等(1991)定義的CDR序列加下劃線。內(nèi)含子序列為斜體。圖6顯示了側(cè)翼有NheI和EcoRI位點(加下劃線)的設計K33N VL(ChK33N VL) 基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 33)及推導的氨基酸序列(SEQID Ν0:Μ)。氨基酸殘基以單字母代碼顯示。信號肽序列(SEQ ID N0 17)為斜體。成熟VL的N端氨基酸殘基(D)加雙下劃線。依照Kabat等(1991)定義的CDR序列加下劃線。內(nèi)含子序列為斜體。圖7顯示了 pChK33N和pHuK33N(集體為表達載體)的示意結(jié)構(gòu)。從頂部的Mil 位點順時針方向前進，該質(zhì)粒含有重鏈轉(zhuǎn)錄單元，其始自人巨細胞病毒(CMV)主要立即早期啟動子和增強子(CMV啟動子)以啟動抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄。CMV啟動子后面有VH外顯子、含有人Y-I重鏈恒定區(qū)(包括CH1、鉸鏈、CH2和CH3外顯子及居間內(nèi)含子)的基因組序列、和CH3后面供mRNA加工用的Y-I基因多聚腺苷酸化位點。重鏈基因序列后面，輕鏈轉(zhuǎn)錄單元始自CMV啟動子，后面有VL外顯子和含有人κ鏈恒定區(qū)外顯子(CL)及其前面的內(nèi)含子一部分的基因組序列、和κ基因的polyA信號。然后，輕鏈基因后面有SV40早期啟動子(SV40啟動子)、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)、和含有SV40多聚腺苷酸化位點的區(qū)段(SV40 poly(A)位點)。最后，該質(zhì)粒含有質(zhì)粒pUC19—部分，其包含細菌復制起點(PUC ori)和β -內(nèi)酰胺酶基因(β -內(nèi)酰胺酶)。圖 8 顯示了 Κ33Ν VH(SEQ ID NO 9)、人源化 K33N(HuK33N) VH(SEQID NO :29)和自由GenBank登錄號DA980102的核苷酸序列編碼的氨基酸序列衍生的人接受體序列的 FRHl(SEQ ID NO 19)、FRH2(SEQ ID NO :20)、FRH3(SEQ ID NO :21)禾口FRH4(SEQ ID NO :22) 的氨基酸序列的比對。氨基酸殘基以單字母代碼顯示。序列上方的數(shù)字標示依照Kabat等 (1991)的位置。由Kabat等(1991)限定的CDR序列加下劃線。加雙下劃線的殘基預測為與⑶R接觸，而且小鼠殘基在人源化形式中的這些位置處得到保留。將DA980102中的第82 位處的Met (加下劃線)(其在人VH序列中的此位置處是非典型的)用典型的殘基Leu替換以降低潛在的免疫原性。圖中省略DA980102中的⑶R殘基。圖 9 顯示了 K33N VL(SEQ ID NO :16)、人源化 K33N(HuK33N)VL(SEQID NO :31) 和自由GenBank登錄號X7M41的核苷酸序列編碼的氨基酸序列衍生的人接受體序列的 FRLl (SEQ ID NO :24)、FRL2 (SEQ ID NO :25)、FRL3 (SEQ ID NO :26)和 FRL4 (SEQ ID NO :27) 的氨基酸序列的比對。氨基酸殘基以單字母代碼顯示。序列上方的數(shù)字標示依照Kabat等 (1991)的位置。由Kabat等(1991)限定的CDR序列加下劃線。加雙下劃線的殘基預測為與⑶R接觸，而且小鼠殘基在人源化形式中的這些位置處得到保留。圖中省略X7M41中的 CDR殘基。圖10顯示了用于構(gòu)建HuK33N VH基因的寡核苷酸。圖11顯示了用于構(gòu)建HuK33N VL基因的寡核苷酸。圖12顯示了用于構(gòu)建HuK33N VH基因的寡核苷酸。箭表示每種寡核苷酸的位置和取向(5’至3’)。VH區(qū)(SEQ ID NO 29)的氨基酸殘基以單字母代碼顯示。圖13顯示了用于構(gòu)建HuK33N VL基因的寡核苷酸。箭表示每種寡核苷酸的位置和取向(5’至3’)。VL區(qū)(SEQ ID NO 31)的氨基酸殘基以單字母代碼顯示。圖14顯示了側(cè)翼有SpeI和HindIII位點(加下劃線)的HuK33N VH基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 34)及信號肽(SEQ ID NO 58 ；以斜體顯示)和VH區(qū)(SEQ ID NO 29) 的推導的氨基酸序列。氨基酸殘基以單字母代碼顯示。信號肽序列為斜體。成熟VH的N 端氨基酸殘基(Q)加雙下劃線。依照Kabat等(1991)定義的CDR序列加下劃線。內(nèi)含子序列為斜體。圖15顯示了側(cè)翼有NheI和EcoRI位點(加下劃線)的HuK33N VL基因的核苷酸序歹丨J (SEQ ID NO 35)及信號肽(SEQ ID NO 59 ；以斜體顯示)和VL區(qū)(SEQ ID NO 31)的推導的氨基酸序列。氨基酸殘基以單字母代碼顯示。信號肽序列為斜體。成熟VL的N端氨基酸殘基(D)加雙下劃線。依照Kabat等(1991)定義的CDR序列加下劃線。內(nèi)含子序列為斜體。圖16顯示了嵌合的與人源化的K33N抗體對人α 9整聯(lián)蛋白的親和力的比較。通過細胞ELISA檢查1和0. 5 μ g/ml嵌合的和人源化的K33N對CHO/ α 9細胞的結(jié)合。一式三份實施實驗。圖中顯示了均值吸光度值及SEM。圖17顯示了用于HuK33N重鏈和輕鏈cDNA的PCR擴增和測序的寡核苷酸的序列 (SEQ ID NO 44-50)。圖18顯示了 pHuK33N中的HuK33N γ _1重鏈編碼區(qū)的核苷酸序列(SEQID NO 36) 及推導的氨基酸序列(SEQ ID Ν0:37)。氨基酸殘基以單字母代碼顯示。終止密碼子以“·” 表不。圖19顯示了 pHuK33N中的HuK33Nk輕鏈編碼區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 38)及推導的氨基酸序列(SEQ ID N0:39)。氨基酸殘基以單字母代碼顯示。終止密碼子以“ ·，， 表不。圖20顯示了對純化的抗體的SDS-PAGE分析的結(jié)果。依照Sambrook等(Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)在還原條件下在存在SDS的情況中在10%聚丙烯酰胺凝膠上運行6 μ g嵌合的和人源化的IgGl/ κ抗體(分別為ChK33N和HuK33N)。使用寬范圍蛋白質(zhì)標志物(MW;New England Biolabs, Ipswich, ΜΑ)作為大小標志物。右側(cè)顯示的數(shù)字表示按千道爾頓(kDa)計的標志物大小。圖21顯示了對小鼠K33N抗體對人α 9整聯(lián)蛋白的結(jié)合的FACS分析的結(jié)果。在多個濃度(以1. 67 μ g/ml開始且連續(xù)3倍稀釋)對小鼠K33N抗體測試對CH0/hu α 9細胞的結(jié)合。在圖中在測試的每個抗體濃度(X軸)為幾何平均通道熒光數(shù)值(MCF;Y軸)繪圖。 使用 GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego, CA)來計算 EC50I^o圖22顯示了對嵌合的和人源化的K33N抗體對人α 9整聯(lián)蛋白的結(jié)合的FACS分析的結(jié)果。在多個濃度(以5 μ g/ml開始且連續(xù)3倍稀釋)對每種抗體測試對CHO/hu α 9 細胞的結(jié)合。在圖中在測試的每個抗體濃度(X軸)為幾何平均通道熒光數(shù)值(MCF;Y軸) 繪圖。使用 GraphPad Pr ism (GraphPad Software, San Diego, CA)來計算 EC5tl 值。圖23顯示了針對人α 9整聯(lián)蛋白的小鼠的、嵌合的和人源化的Κ33Ν抗體和小鼠抗人α 9整聯(lián)蛋白抗體Υ9Α2的劑量響應細胞粘附抑制率。在5、1、0. 2、0. 04、0. 008和 0. 0016 μ g/mL的濃度對每種抗體測試對人α 9整聯(lián)蛋白表達細胞系G-361的細胞粘附。一式四份實施實驗。圖中顯示了均值抑制率值。5.發(fā)明詳述5.1.針對人α 9整聯(lián)蛋白的抗體的制備可通過本領域中已知的任何合適的方法來生成免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白或其任何表位的抗體。在本發(fā)明中作為抗原使用的α 9整聯(lián)蛋白可以是⑴自表達α 9整聯(lián)蛋白的所有來自人的細胞，或其中存在這些細胞的所有組織衍生的蛋白質(zhì)，( 重組蛋白，其中將編碼 α 9整聯(lián)蛋白的基因DNA，優(yōu)選地cDNA轉(zhuǎn)染入細菌、酵母、細胞系(包括動物細胞)、等中，并表達，或⑶合成的蛋白質(zhì)。α 9整聯(lián)蛋白包括包含與人α 9整聯(lián)蛋白的氨基酸序列(SEQ ID Ν0:55，其中殘基 1-29是信號肽)基本上相同的氨基酸序列的多肽。在本文中，術語“包含基本上相同的氨基酸序列的多肽”指包含如下氨基酸序列的變體多肽，其中多個氨基酸，優(yōu)選地1至10個氨基酸且更優(yōu)選地1至幾個(例如1至5個) 氨基酸被替代、刪除和/或修飾，只要這些變體多肽與天然存在的人α 9整聯(lián)蛋白具有基本上等同的生物學特性；和包含如下氨基酸序列的變體多肽，其中多個氨基酸，優(yōu)選地1至10 個氨基酸且更優(yōu)選地1至幾個(例如1至5個)氨基酸被添加至天然存在的人α 9整聯(lián)蛋白的氨基酸序列。此外，變體多肽可以是那些具有這些氨基酸替代、刪除、修飾和添加中多處的。在基因重組技術外，可以通過本領域中公知的方法，諸如化學合成法、細胞培養(yǎng)法、等，或其修改方案來生成在本發(fā)明中作為抗原的人α 9整聯(lián)蛋白。用于生成變體多肽的方法的例子包括合成寡核苷酸定點誘變(缺口雙鏈體法)、 牽涉通過用亞硝酸鹽或亞硫酸鹽處理來隨機引入點突變的點誘變法、牽涉用Bal31酶或其它酶制備缺失突變體的方法、盒式誘變、接頭掃描法、誤摻入法(miss incorporation method)、錯配引物法、DNA區(qū)段合成法、等等。要在本發(fā)明中作為抗原使用的人α 9整聯(lián)蛋白還包括所述α 9整聯(lián)蛋白一“部分”。如本文中所使用的，“部分”指包含結(jié)合0 9整聯(lián)蛋白配體，例如0 1￥0六11-1、生腱蛋白 C、等所需要的區(qū)域的部分；具體地，成熟人α 9整聯(lián)蛋白(SEQ ID NO 55的第30-第1035 氨基酸殘基)中包含第14-第980氨基酸殘基的部分，和包含第11-第981氨基酸殘基的部分。所述α 9整聯(lián)蛋白一“部分”可以依照下文所描述的本領域中已知的方法或其修改方案通過基因重組或化學合成來生成，或者可以通過用蛋白水解酶等等適當消化通過細胞培養(yǎng)法分離的人α9整聯(lián)蛋白來生成。在細胞膜上過表達α 9整聯(lián)蛋白的細胞本身或其膜級分也可以作為抗原使用?？梢酝ㄟ^本領域中公知的重組DNA技術來制備過表達人α 9整聯(lián)蛋白的細胞。使用如上文所描述的那樣制備的合適的抗原，可以通過本領域中公知的多種方法來制備對人α9整聯(lián)蛋白或其任何表位特異性的抗體。針對人α9整聯(lián)蛋白的多克隆抗體可以通過本領域中公知的多種規(guī)程來生成。例如，可以對多種宿主動物(包括但不限于家兔、小鼠、大鼠、等)施用感興趣的抗原，以誘導含有對抗原特異性的多克隆抗體的抗血清生成。根據(jù)宿主物種，可以使用各種佐劑來提高免疫學應答，并且包括但不限于弗 (Freund)氏(完全和不完全)佐劑、礦物凝膠諸如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)諸如溶血卵磷月旨、Pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔i威血藍蛋白、二硝基苯酚、和對人潛在有用的佐劑諸如BCG (卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。此類佐劑也是本領域中公知的?？梢允褂帽绢I域中已知的極其多種技術(包括使用雜交瘤、重組體、和噬菌體展示技術，或其組合)來制備單克隆抗體。例如，可以使用雜交瘤技術來生成單克隆抗體，所述雜交瘤技術包括那些在本領域中已知的和在例如Harlow等，Antibodies =A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版 1988) ；Hammerling 等，于 Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,第 563 頁-第 681 頁(Elsevier,N. Y., 1981)(通過提及而完整收錄這兩者)中教導的。如本文中所使用的，術語“單克隆抗體”不限于經(jīng)由雜交瘤技術生成的抗體。術語“單克隆抗體”指自單克隆，包括任何真核、原核、或噬菌體克隆衍生的抗體，而非生成其的方法。使用雜交瘤技術來生成和篩選特異性抗體的方法是本領域中公知的且常規(guī)的。在一個非限制性例子中，可以用感興趣的抗原或表達此類抗原的細胞來免疫小鼠。一旦檢測出免疫應答，例如在小鼠血清中檢測出對抗原特異性的抗體，收獲小鼠脾，并分離脾細胞。然后，通過公知的技術將脾細胞與任何合適的骨髓瘤細胞(例如P3Ul、P3X63-Ag8、 P3X63-Ag8-UU P3NS1-Ag4, SP2/0_Agl4、P3X63-Ag8-653 等)融合。選擇雜交瘤，并通過有限稀釋將其克隆。然后，通過本領域中已知的方法對雜交瘤克隆測定分泌能夠結(jié)合抗原的抗體的細胞?？梢酝ㄟ^給小鼠腹膜內(nèi)接種陽性雜交瘤克隆來生成腹水，其一般含有高水平的抗體?？梢酝ㄟ^已知的技術來生成識別特定表位的抗體片段。例如，可以通過使用諸如木瓜蛋白酶(以生成Fab片段)或胃蛋白酶(以生成F(ab’)2片段)等酶來蛋白水解切割免疫球蛋白分子，從而生成Fab和F(ab’)2片段。F(ab’)2片段含有完整的輕鏈和重鏈的可變區(qū)、CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段也可以通過本領域中已知的用于合成抗體的任何方法，特別是通過化學合成或者優(yōu)選地，通過重組表達技術來生成。編碼抗體的核苷酸序列可以自本領域技術人員可得的任何信息(即自Genbank、 文獻、或者通過常規(guī)的克隆和序列分析)獲得。若不可獲得含有編碼特定抗體或其表位結(jié)合片段的核酸的克隆，但是抗體分子或其表位結(jié)合片段的序列是已知的，則編碼免疫球蛋白的核酸可以化學合成或者使用與序列的3’和5’端可雜交的合成引物通過PCR擴增或者使用對特定基因序列特異性的寡核苷酸探針以鑒定例如來自cDNA文庫的編碼抗體的cDNA 克隆通過克隆自合適的來源(例如抗體cDNA文庫、或自表達抗體的任何組織或細胞諸如選擇為表達抗體的雜交瘤細胞生成的cDNA文庫、或自表達抗體的任何組織或細胞分離的核酸，優(yōu)選地polyA+RNA)獲得。然后，可以使用本領域中公知的任何方法來將通過PCR生成的擴增核酸克隆入可復制克隆載體中。5. 2.重組抗體的制備—旦確定抗體的核苷酸序列，便可以使用本領域中公知的用于操作核苷酸序列的方法，例如重組DNA技術、定點誘變、PCR、等(參見例如Sambrook等，見上文；及Ausubel等 IS, 1998,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，NY 巾Micii^白勺技術，通過提及而將這兩篇文獻完整收入本文)來操作抗體的核苷酸序列，以通過例如將氨基酸替代、刪除、和/或插入引入抗體的表位結(jié)合域區(qū)或抗體中可以提高或降低抗體的生物學活性的任何部分中來生成具有不同氨基酸序列的抗體?？贵w的重組表達需要構(gòu)建含有編碼抗體的核苷酸序列的表達載體。一旦獲得了編碼抗體分子或抗體的重鏈或輕鏈或其部分的核苷酸序列，便可以使用本領域中公知的技術通過重組DNA技術來生成供生成抗體分子用的載體，如先前的小節(jié)中所討論的?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的方法來構(gòu)建含有抗體編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術、合成技術、和體內(nèi)遺傳重組?？梢詫⒕幋a抗體的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、重鏈和輕鏈可變區(qū)兩者、重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的表位結(jié)合片段、或一個或多個互補決定區(qū)(CDR)的核苷酸序列克隆入此類載體中進行表達?？梢詫⒋祟愋蛄信c編碼對于初始抗體而言天然的信號肽或異源信號肽的多核苷酸融合。然后，可以將如此制備的表達載體導入合適的宿主細胞中以表達抗體。因而，本發(fā)明包括含有編碼免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸的宿主細胞。
可以用本發(fā)明的兩種表達載體(第一種載體編碼重鏈衍生的多肽，而第二種載體編碼輕鏈衍生的多肽)共轉(zhuǎn)染宿主細胞。兩種載體可以含有相同的選擇標志(其使重鏈和輕鏈多肽能夠相等表達)或不同的選擇標志以確保維持這兩種質(zhì)粒?；蛘?，可以使用單一載體，其編碼并能夠表達重鏈和輕鏈多肽兩者。重鏈和輕鏈的編碼序列可以包含cDNA或基因組DNA。在另一個實施方案中，也可以使用本領域中已知的多種噬菌體展示法來生成抗體。在噬菌體展示法中，功能性抗體域在攜帶編碼它們的多核苷酸序列的噬菌體顆粒表面上展示。在一個特別的實施方案中，可以利用此類噬菌體來展示自全集或組合抗體文庫(例如人的或鼠的)表達的抗原結(jié)合域，諸如Fab和Fv或二硫鍵穩(wěn)定化的Fv?？梢杂每乖缡褂媒?jīng)標記的抗原或被固體表面或珠結(jié)合或捕獲的抗原來選擇或鑒定表達結(jié)合感興趣抗原的抗原結(jié)合域的噬菌體。這些方法中使用的噬菌體通常是絲狀噬菌體， 包括fd和M13?？乖Y(jié)合域作為與噬菌體基因III或基因VIII蛋白的重組融合蛋白表達?？梢杂糜谏杀景l(fā)明的免疫球蛋白或其片段的噬菌體展示法的例子包括那些披露于 Brinkman 等，J. Immunol. Methods, 182 :41-50,1995 ；Ames 等，J. Immunol. Methods, 184 177-186,1995 ；Kettleborough 等，Eur. J. Immunol. ,24 :952-958,1994 ；Persic 等，Gene, 187 :9-18,1997 ；Burton等，Advances in Immunology, 57 :191-280，1994 ；PCT 申請No. PCT/ GB91/01134 ;PCT 公開文本 WO 90/02809 ；WO 91/10737 ；WO 92/01047 ；WO 92/18619 ；WO 93/11236 ；W095/15982 ；WO 95/20401 ；及美國專利 No. 5，698，426 ；5，223，409 ；5，403，484 ； 5，580，717 ；5，427，908 ；5，750，753 ；5，821，047 ；5，571，698 ；5，427，908 ；5，516，637 ； 5，780，225 ；5, 658，727 ；5, 733，743和5，969，108的；通過提及而將每篇完整收入本文。如上述參考文獻中所記載的，噬菌體選擇后，可以分離來自噬菌體的抗體編碼區(qū)， 并使用其來生成完整抗體，包括人抗體，或任何其它期望的片段，并在任何期望的宿主(包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母、和細菌)中表達，例如如下文更為詳細地描述的。例如，也可以采用用于重組生成Fab、Fab'和F(ab’)2片段的技術，其使用本領域中已知的方法，諸如那些披露于PCT公開文本W(wǎng)O 92/22324 ；MulIinax等，BioTechniques, 12(6) :864-869,1992 ；及 Sawai 等，AJRI，34 :26-34,1995 ；及 Better 等，Science, 240 1041-1043，1988(通過提及而完整收錄每篇)的方法進行?？梢杂糜谏蓡捂淔v和抗體的技術的例子包括那些記載于美國專利No. 4，946，778和5，258，498 ；Huston等，Methods in Enzymology,203 :46-88,1991 ；Shu 等，PNAS，90 :7995-7999,1993 ；及 Skerra 等，Science, 240 :1038-1040,1988 的。—旦通過上文所描述的任何方法生成了本發(fā)明的抗體分子，然后便可以通過本領域中已知的用于純化免疫球蛋白分子的任何方法，例如通過層析(例如離子交換、親和、特別是在蛋白A或蛋白G純化后通過對特定抗原的親和、和篩分柱層析)、離心、差別溶解度、 或者通過任何其它用于純化蛋白質(zhì)的標準技術來將其純化。此外，可以將本發(fā)明的抗體或其片段與本文中所描述的或者在其它情況中在本領域中已知的異源多肽序列融合以便于純化。對于一些用途(包括抗體在人中的體內(nèi)用途和體外檢測測定法)，可以優(yōu)選使用嵌合的、人源化的、或人的抗體。在下文5. 3 一節(jié)中詳細討論了嵌合抗體和人源化抗體。與其它化合物或異源多肽融合或綴合的抗體可以在體外免疫測定法中、在純化法(例如親和層析)中、及在體內(nèi)治療或診斷用途中使用。參見例如PCT公開文本 No. WO 93/21232 ；EP 439，095 ;Naramura 等，Immunol. Lett.，39 :91_99，1994 ；美國專利 5，474，981 ；Gillies 等，PNAS，89 :1428-1432,1992 ；及 Fell 等，J. Immunol.，146 M46-2452，1991，通過提及而將它們完整收入本文。例如，可以使用已知的方法或商品化試劑盒(例如生物素標記、FITC標記、APC標記)以多種方式來標記抗體。作為另一個例子， 可以將抗體與提高抗體的體內(nèi)生物學效果的治療模塊綴合。此類治療模塊的例子包括另一種抗體、抑制細胞性或殺細胞性細胞毒素、放射性元素、和/或其它治療劑，包括消炎劑、抗生素、等等。在本發(fā)明中，可以將人源化抗人α 9整聯(lián)蛋白與另一種抗體，諸如抗α4抗體綴合(例如以形成雙特異性抗體)。作為另一個例子，對于體內(nèi)診斷用途，可以用可檢測標志物，諸如放射性元素標記本發(fā)明的人源化抗體。5. 3.嵌合的和人源化的抗體嵌合抗體是一種自不同動物物種衍生抗體的不同部分的分子，諸如具有自鼠單克隆抗體衍生的可變區(qū)和自人免疫球蛋白衍生的恒定區(qū)的抗體。用于生成嵌合抗體的方法是本領域中已知的。參見例如 Morrison，kience，229 :1202,1985 ；Oi 等，BioiTechniques, 4 214，1986 ；Gillies 等，J. Immunol. Methods, 125 :191-202,1989 ；美國專利 No. 5，807，715 ； 4，816，567 ’及4，816，397，通過提及而將它們完整收入本文。人源化抗體是一種結(jié)合期望的抗原且包含含有一種或多種自非人物種衍生的互補決定區(qū)(CDR)和一種或多種自人免疫球蛋白分子衍生的框架區(qū)的可變區(qū)的分子。用于使非人抗體人源化的典型方法已經(jīng)記載于多份參考文獻，諸如如下那些Queen等，1989， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :10029-10033 和美國專利 No. 5，585，089 和 5，693，762 ； Riechmann 等，Nature，332 :323，1988 ；及 Tsurushita 等，Methods 36 :69-83, 2005，通過提及而將它們都完整收入本文。例如，Tsurushita等Q005，見上文；下文稱為“"Tsurushita”) 的參考文獻提供了一種用于使小鼠單克隆抗體人源化的實用且指導性的方案，其基于最初由Queen等(1989，見上文)開發(fā)的抗體人源化方法。下文簡要匯總了 Tsurushita中所披露的通用方案。5. 3. 1.用于制備人源化抗體的通用方案小鼠V基因的克隆和測序有多種方法可用于克隆編碼目標小鼠單克隆抗體的VH和VL區(qū)的cDNA。例如， 通常使用5，RACE (cDNA末端快速擴增)法，其使用SMART RACE cDNA擴增試劑盒(BD Biosciences,CA)或Genefcicer試劑盒(Invitrogen，CA)進行。可以基于目標單克隆抗體的H鏈和L鏈的同種型來制備用于5’ RACE的基因特異性引物，從而它可以剛好在H鏈和 L鏈之每種的可變區(qū)下游結(jié)合。如此，5’ RACE引物可以設計為對小鼠中的每種亞型，諸如 YU Y 2a, γ 2b或Y 3特異的?；蛘撸梢曰趤喰烷g共有的或高度同源的區(qū)域來設計所有亞型的共同引物。在Tsurushita中，下列5’ RACE引物作為例子被披露(i)5' -GCCAGTGGATAGACTGATGG-(SEQ ID NO :56)(用于克隆小鼠 y U Y 2a, y 2b 和Y3H鏈)(ii) 5' -GATGGATACAGTTGGTGCAGC- (SEQ ID NO :57)(用于克隆小鼠 κ 輕鏈)?？梢岳缡褂胟ro Blunt T0P0 PCR克隆試劑盒(Invitrogen)來將PCR擴增的V 基因片段直接克隆入質(zhì)粒載體中，并測定其DNA序列。獲得的序列應當通過例如比較其編碼氨基酸序列與使用例如241型蛋白質(zhì)測序儀(Hewlett-Packard，CA)通過N端氨基酸測序測定的目標單克隆抗體的氨基酸序列來確認。通常，通過例如埃德曼(Edman)降解測定在目標抗體N端的至少15-20個氨基酸殘基足以確認克隆DNA序列的真實性。Tsurushita 告誡，在谷氨酰胺(其是小鼠中兩種最常見的N端氨基酸之一)是N端氨基酸時，其可能已經(jīng)轉(zhuǎn)變成焦谷氨酰胺并封閉N端的測序。在該情況中，有必要使N端去封閉以獲得序列。V區(qū)的三維津樽基于VH和VL區(qū)的序列，首先通過例如由R.Levy等，1989，Biochemistry 28: 7168-7175 ；及 B. Zilber 等，1990，Biochemistry 29 :10032-10041 記載的方法來鑒定靴抗體中對于維持⑶R的構(gòu)象結(jié)構(gòu)潛在重要的框架殘基。通常，將VH和VL區(qū)之每種分成 14個結(jié)構(gòu)上有意義的區(qū)段，其是構(gòu)成免疫球蛋白超家族域結(jié)構(gòu)的β鏈和環(huán)樣結(jié)構(gòu)。將來自目標抗體的每個區(qū)段的氨基酸序列與PDB數(shù)據(jù)庫(參見H. Μ. Berman等，2000，Nucleic Acids Res. 28 :235-342)中的已知結(jié)構(gòu)的抗體的相應區(qū)段比對。通過多序列比對，選擇與每個靶區(qū)段具有最高序列同源性的相應區(qū)段，并構(gòu)建V區(qū)的三維模型。為了優(yōu)化結(jié)構(gòu)，將模型進行多輪共軛梯度能量最小化(例如使用ENCAD，或者如由Press等，1990，于 "Numerical Recipes，，，Cambridge University Press, Cambridge 中所記載的；Weiner 等， 1981，J. Comp. Chem. 2 :287-303 的 AMBER ；由英國癌癥研究中心(Cancer Research UK)運行的BioMolecularModelling或“B匪”網(wǎng)站上可獲得的3D-JIG-SAW ；或在由瑞士生物信息學研究所(Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva)運行的 ExPASy 蛋白質(zhì)組學服務器網(wǎng)站上可獲得的SWISS-MODEL進行)。人框架的選擇與對V區(qū)結(jié)構(gòu)建模并行，將自小鼠VH和VL區(qū)的cDNA克隆推導的氨基酸序列分別與數(shù)據(jù)庫，例如 Kabat 數(shù)據(jù)庫(參見 Johnson 等，2000，Nucleic Acids Res. 28 :214-218.)、 GenBank、等等中的人V區(qū)序列比較?？梢允褂美鏢mith-Waterman算法(Gusfield，1997， 于“Algorithms on Strings, Trees, and Sequences，，，Cambridge University Press, Cambridge)、或 BLAST (Karlin 等，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268)、等等來搜索與小鼠序列具有至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、 至少約90%、或至少95%同一性的總體序列同一性的人框架區(qū)。這些人序列可以根據(jù)基于cDNA的和蛋白質(zhì)衍生的序列；然而，種系的使用常常是優(yōu)選的，因為它可以用于消除與基于cDNA的、蛋白質(zhì)衍生的序列中的體細胞高度突變有關的潛在免疫原性。在備選中，如 Queen等(1989，見上文)中所記載的，共有框架序列的使用也可以在自基于cDNA的或蛋白質(zhì)衍生的序列獲得的框架中鑒定并清除此類高度突變殘基。在使用種系VH區(qū)段作為接受體框架的情況中，應當使用染色體14，而非15和16上編碼的VH區(qū)段，因為只有染色體14 上的那些生成功能性VH區(qū)。人源化V區(qū)的設計依照Queen等(1989，見上文)，有必要鑒定距⑶R約4_6埃內(nèi)的框架氨基酸，因為認為這些殘基是支持正確CDR結(jié)構(gòu)的潛在的關鍵框架殘基。此類方法可以使用計算機程序，諸如由國家科學基金會(National Science Foundation, NSF)支持的分子可視化免費軟件(Molecular Visualization Freeware)網(wǎng)站上可獲得的RASMOL(其通過原子坐標或者經(jīng)由計算機模型的手工檢查來計算原子間距離)來實現(xiàn)。若關鍵框架位置處的氨基酸在小鼠供體和人接受體序列之間不同，則通常用小鼠供體的那些替換人殘基。然后，若此類殘基對支持CDR結(jié)構(gòu)具有最小的貢獻，則通常使用相應的人殘基。還有，若選定的人接受體含有“非典型的”氨基酸(其在小于約10-20%的V區(qū)序列中發(fā)生)，則它們可以是親和力成熟過程中體細胞高度突變的結(jié)果，而且應當用供體殘基替換以避免在人中的潛在免疫原性。另外，在設計人源化V區(qū)時需要仔細考慮其它因素，諸如潛在的N連接的糖基化信號的殘基(關于詳情，參見Tsurushita)。根據(jù)治療用途需要的或要消除的效應器功能，人源化抗體可以含有來自人抗體的人κ或λ輕鏈、和/或γ 1、γ 2、γ 3、γ 4、μ、α 1、α 2、δ、或ε重鏈、或其變體的人恒定區(qū)或其部分。例如，可以將含有突變的恒定區(qū)的Fc部分與本發(fā)明的嵌合的或人源化的抗體的可變區(qū)融合，從而降低抗體對Fc受體的結(jié)合和/或降低其固定補體的能力(參見例如 Winter 等，GB 2，209，757B ;Morrison 等，WO 89/07142 ;Morgan 等，WO 94/29351)?？梢酝ㄟ^重組DNA技術來實施對抗體分子的此類操作，如5. 2 一節(jié)中所描述的。優(yōu)選地，所得的嵌合或人源化抗體具有與非人供體抗體相同的特異性和與非人供體抗體的親和力相似或非人供體抗體的親和力的至少約1/3、至少約1/2、或至少約2/3 的親和力。在另一方面，所得的嵌合或人源化抗體具有至少約lxlOl1、優(yōu)選地至少約 lxlOl1、且最優(yōu)選地至少約ΙχΚΛΓ1的親和常數(shù)。在上文所描述的通用方案外，可以使用本領域中已知的多種技術來使抗體人源化，所述技術包括例如⑶R嫁接(EP 239,400 ;PCT公開文本W(wǎng)091/09967 ；美國專利 No. 5，225, 539 ；5，530，101 和 5，585，089)、鑲飾(veneering)或重修表面(resurfacing) (EP 592, 106 ；EP 519, 596 ；Padlan, Molecular Immunology,28(4/5) :489-498,1991 ； Studnicka 等，Protein Engineering, 7 (6) :805-814,1994 ;Roguska 等，Proc Natl. Acad. Sci. USA, 91 =969-973,1994)、和鏈改組(美國專利No. 5，565，332)，在此通過提及而將它們都完整收錄。5. 3. 2.將人源化抗體制備為藥物的其它考慮因素為了作為藥物來供應人源化抗體，需要制備有效且一致的其生產(chǎn)系統(tǒng)。例如，通過插入H和L鏈序列來制備適合于人源化抗體的表達載體，并可以獲得經(jīng)表達載體轉(zhuǎn)染的高生產(chǎn)率細胞系作為主細胞庫(MCB)的種子細胞，其充當工作細胞庫(WCB)的穩(wěn)定且半永久來源。然后，可以通過培養(yǎng)來自WCB的工作細胞，并收集培養(yǎng)液來制備人源化抗體。可以使用具有合適調(diào)節(jié)基因的多種表達載體來制備此類生產(chǎn)細胞系。作為宿主細胞，可以使用通常用于表達哺乳動物蛋白質(zhì)的宿主細胞來表達人源化抗體。此類宿主細胞的例子包括但不限于中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、SP2/0-Agl4. 19細胞、NSO細胞、等等?？梢酝ㄟ^選擇表達載體和宿主細胞的最好組合來使人源化抗體的生產(chǎn)率最大化。此外，應當探索培養(yǎng)基的組成以從多種無血清培養(yǎng)基和補充物選擇合適的培養(yǎng)基，從而可以優(yōu)化宿主細胞的人源化抗體表達。基于效率和最終的產(chǎn)率，可以使用本領域中公知的多種方法來自培養(yǎng)物上清液純化由宿主細胞生成的人源化抗體，所述方法包括親和層析、離子交換層析、疏水相互作用層析、等等。 5. 4.藥物組合物和治療用途 本發(fā)明提供了一種包含免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的上述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物。包含本發(fā)明的人源化抗體作為活性成分的藥物組合物可以作為藥劑用于預防和/或治療與α 9整聯(lián)蛋白有關的病癥或疾病，包括但不限于癌癥，例如癌細胞的生長或轉(zhuǎn)移，和炎性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維化、糖尿病、動脈硬化、多發(fā)性硬化、肉芽腫、炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病)、自身免疫性疾病、等等。也可以使用包含本發(fā)明的人源化抗體的藥物組合物來治療器官移植后慢性排斥反應、和自身免疫性疾病諸如系統(tǒng)性自身免疫性疾病、全身性紅斑狼瘡(erythematosus)、 葡萄膜炎、貝切特(Behcet)氏病、多肌炎、腎小球增殖性腎炎(glomerular proliferative nephritis)、結(jié)節(jié)病、由α 9整聯(lián)蛋白誘發(fā)的疾病狀況、等等。用于預防或治療上文所描述的病癥或疾病的預防和/或治療劑(其包含本發(fā)明的人源化抗體)具有低毒性，而且可以作為通過在合適的溶劑中混合得到的液體制劑，或者作為合適劑量形式的藥物組合物直接給人口服或胃腸外施用。用于上文所描述的施用的藥物組合物含有上述抗體或其鹽和藥學可接受載體、稀釋劑或賦形劑。此類組合物以適合于口服或胃腸外施用的劑量形式提供。劑量可以隨要施用的受試者的年齡和體型、目標疾病、狀況、施用路徑、等等而所有變化。在使用抗體來預防和/或治療例如成年患者中的類風濕性關節(jié)炎時，有利的是，通常以約0. 01至約20mg/kg體重、優(yōu)選地約0. 1至約10mg/kg體重、且更優(yōu)選地約0. 1至約 5mg/kg體重的單劑每天約1至5次、優(yōu)選地每天約1至3次靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的抗體。在其它胃腸外施用和口服施用中，可以以與上文給定的劑量對應的劑量施用抗體。在狀況特別嚴重時，可以根據(jù)狀況增加劑量。多種投遞系統(tǒng)是已知的，并且可以用于施用本發(fā)明的藥物組合物，例如脂質(zhì)體中的包囊、微粒、微囊劑、能夠表達突變體病毒的重組細胞、受體介導的胞吞(參見例如mi和 Wu, 1987，J. Biol. Chem. 262 =4429-4432)。導入的方法包括但不限于皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、 靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外、和口服路徑?；衔锟梢酝ㄟ^任何方便的路徑，例如通過輸注或推注，通過經(jīng)由上皮或粘膜皮膚襯里(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜、等)的吸收來施用， 而且可以與其它生物學活性劑一起施用。施用可以是全身的或局部的。還可采用肺部施用， 例如通過使用吸入器或噴霧器和含霧化劑的配制劑來實現(xiàn)。在一個具體的實施方案中，可期望對需要治療的區(qū)域局部施用本發(fā)明的藥物組合物；這可以通過例如(而不作為限制)手術過程中的局部輸注、表面應用(例如與手術后的傷口敷料一起)、通過注射、依靠導管、依靠栓劑、依靠鼻噴霧、或者依靠植入物來進行，所述植入物是多孔的、非多孔的、或凝膠狀的材料，包括膜，諸如硅橡膠膜、或纖維。在一個實施方案中，可以通過在受感染組織部位(或以前的部位)直接注射進行施用。在另一個實施方案中，藥物組合物可以在囊泡，特別是脂質(zhì)體中投遞(參見 Langer,1990, Science 249 :1527-1533 ；Treat 等， 于 Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein 禾口 Fidler (編)，Liss, New York,第 353頁-第365頁(1989) ；Lopez-Berestein,同上，第317頁-第327頁；通常參見如上)。在又一個實施方案中，藥物組合物可以在受控釋放系統(tǒng)中投遞。在一個實施方案中，可使用泵(參見 Langer，見上文 Jefton，1987，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 201 ；Buchwald 等，1980，Surgery 88 :507 ；及 Saudek 等，1989，N. Engl. J. Med. 321 :574)。在另一個實施方案中，可使用聚合材料(參見Medical Applications of Controlled Release, Langer 禾口 Wise (編)，CRC Pres. , Boca Raton, Florida (1974) ；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance，Smolen 禾口 Ball (編)，ffiley， New York (1984) ；Ranger 禾口 P印pas，J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23 61 (1983)； 還可參見 Levy 等，1985，Science 228 :190 ；During 等，1989，Ann. Neurol. 25 :351 ；Howard 等，1989，J. Neurosurg. 71 :105)。在又一個實施方案中，受控釋放系統(tǒng)可以放置在組合物的靶物附近，如此僅需要系統(tǒng)劑量的一部分(參見例如Goodson，于Medical Applications of Controlled Release，見上文，第 2 卷，第 115 頁-第 138 頁(1984))。Langer (Science 249 :1527-1533(1990))的綜述中討論了其它受控釋放系統(tǒng)。供口服施用的組合物的例子包括固體或液體劑量形式，具體有片劑(包括糖衣片和薄膜衣片劑)、丸劑、顆粒劑、粉狀制劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿劑、乳劑、懸浮液、等。此類組合物通過眾所周知的方法來制造備，而且含有藥用制劑領域中常規(guī)使用的媒介、稀釋劑或賦形劑。供片劑用的媒介或賦形劑的例子有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂、等等?？勺⑸渲苿┛梢园ㄓ糜陟o脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和肌肉內(nèi)注射、點滴輸注、等的劑量形式。這些可注射制劑可以通過眾所周知的方法來制備?？梢岳缤ㄟ^在常規(guī)用于注射的無菌水性介質(zhì)或油性介質(zhì)中溶解、懸浮或乳化上文所描述的抗體或其鹽來制備可注射制劑。作為供注射用的水性介質(zhì)，有例如生理鹽水、含有葡萄糖和其它輔助劑的等張溶液、等， 其可以與合適的增溶劑諸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子型表面活性劑[例如聚山梨酯80、HC0-50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]、等組合使用。作為油性介質(zhì)，有采用例如芝麻油、大豆油、等，其可以與增溶劑諸如苯甲酸芐酯、苯甲醇、等組合使用。優(yōu)選地，在合適的安瓿中裝滿如此制備的注射劑?？梢酝ㄟ^將上述抗體或其鹽與供栓劑用的常規(guī)基質(zhì)混合來制備用于直腸施用的栓劑。有利地，將上文所描述的供口服或胃腸外使用的藥物組合物制備成單位劑量的劑量形式，其適合于配合活性組分的劑量。此類單位劑量的劑量形式包括例如片劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑、等。所含有的上述抗體量一般是每單位劑量的劑量形式約5至 500mg ；尤其在注射劑形式中，優(yōu)選的是以約5至IOOmg包含上述抗體，而對于其它劑量形式以約10至250mg包含上述抗體。上文所描述的每種組合物可以進一步含有其它活性成分，除非配制劑引起與上文所描述的抗體的任何不利的相互作用。本發(fā)明還涉及用于細胞和/或組織重塑的抑制劑和/或促進劑，其包含α 9整聯(lián)蛋白結(jié)合性功能分子(例如0 1￥0六11-1、生腱蛋白-(、纖連蛋白、？ 11 、《6、等)作為活性組分；和用于抑制和/或促進細胞和/或組織重塑的方法，其包括使表達α9整聯(lián)蛋白的細胞和/或組織(例如腫瘤細胞、嗜中性粒細胞、平滑肌、等)與α 9整聯(lián)蛋白結(jié)合性功能分子接觸?？梢酝ㄟ^參照包含本發(fā)明人源化抗體的藥物的前述描述適當?shù)卮_定此類治療劑中的活性組分的劑量、施用方法、藥用制劑、等。如上文所描述的，本發(fā)明進一步提供了一種用于預防或治療與α 9整聯(lián)蛋白有關或牽涉α 9整聯(lián)蛋白的病癥或疾病的方法，所述方法包括對有此需要的受試者施用有效量的至少一種本發(fā)明的人源化抗體。5. 5.診斷用途
包含本發(fā)明的人源化抗體的藥物組合物可以作為癌癥(例如癌細胞的生長或轉(zhuǎn)移)，和炎性疾病(例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維化、糖尿病、 癌癥轉(zhuǎn)移、動脈硬化、多發(fā)性硬化、肉芽腫、等)的診斷劑，或者作為器官移植后慢性排斥反應、自身免疫性疾病諸如系統(tǒng)性自身免疫性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、葡萄膜炎、貝切特氏病、多肌炎、腎小球增殖性腎炎、結(jié)節(jié)病、由α 9整聯(lián)蛋白誘發(fā)的疾病狀況、等等的診斷劑使用。本發(fā)明的人源化抗體能夠特異性識別α 9整聯(lián)蛋白，因此可以用于量化測試流體中的 α 9整聯(lián)蛋白，尤其是用于通過三明治式免疫測定法、競爭性測定法、免疫測量法、腎測量法 (nephrometry)、等、免疫染色、等等進行的量化。在將這些免疫學方法應用于本發(fā)明的測定方法時，不需要列出任何特定的條件、規(guī)程、等。通過向常規(guī)的條件和規(guī)程添加本領域中普通的技術考慮因素足以構(gòu)建測定系統(tǒng)。關于這些通用技術手段的詳情，可以參照綜述、教科
4 絕絕節(jié)、寸寸°如上文所描述的，可以通過使用本發(fā)明的抗體以高靈敏度量化α 9整聯(lián)蛋白。本發(fā)明的人源化抗體特別可用于診斷與α 9整聯(lián)蛋白有關的各種疾病，其通過應用用于在體內(nèi)量化α 9整聯(lián)蛋白的方法來實現(xiàn)。例如，在檢測出α 9整聯(lián)蛋白表達水平升高或降低的情況中，可以診斷很有可能現(xiàn)在患有與α 9整聯(lián)蛋白有關的疾病，例如癌癥或炎性疾病，或者很有可能將來會患有這些疾病。如此，本發(fā)明還提供了一種用于在受試者中診斷與α9 整聯(lián)蛋白有關或牽涉α 9整聯(lián)蛋白的病癥或疾病的方法，所述方法包括對有此需要的受試者施用有效量的至少一種本發(fā)明的人源化抗體或兩者。此類體內(nèi)診斷需要的劑量可以小于治療用途所需要的，而且可以由本領域技術人員依照常規(guī)規(guī)程確定。還可以使用本發(fā)明的人源化抗體來特異性檢測測試流體諸如體液、組織、等中存在的α9整聯(lián)蛋白。還可以使用人源化抗體來制備用于純化α9整聯(lián)蛋白的抗體柱，檢測純化時每個級分中含有的α9整聯(lián)蛋白或分析α9整聯(lián)蛋白在要測試的細胞中的行為。
6.實施例以下實施例例示了免疫特異性識別人和/或小鼠α 9整聯(lián)蛋白的單克隆抗體的制備、單克隆抗體的可變區(qū)的測序和抗體的其它表征及此類抗體的嵌合化和人源化，以及所得的嵌合和人源化抗體的表征。這些實施例不應解釋為限制性的。6. 1.針對人α 9整聯(lián)蛋白的小鼠抗體的制備依照扣除免疫法(WilliamsC. V.等，1992，Biotechniques 12 :842-847)來制備針對人α 9整聯(lián)蛋白的小鼠單克隆抗體。簡言之，以每只小鼠3xl06個給3只Balb/c小鼠腹膜內(nèi)注射表達人^9整聯(lián)蛋白的肌!1-313細胞(人α9/ΝΙΗ-3Τ3細胞)。在注射后1和2周時，給小鼠腹膜內(nèi)注射3χ106個細胞/小鼠的人α 9/ΝΙΗ-3Τ3細胞，接著是一周后，以2χ106 個細胞/小鼠再次靜脈內(nèi)注射相同細胞。通過本領域中公知的方法制備雜交瘤(參見例如 Harlow等，Antibodies :A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988) ；Hammerling等，于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,第563 頁-第681頁(Elsevier,N. Y. , 1981)) 建立生成與表達人α 9整聯(lián)蛋白的人α 9/CH0-K1 細胞和內(nèi)源表達人α 9整聯(lián)蛋白的人黑素瘤細胞而非表達人α 4整聯(lián)蛋白的CHO Kl細胞有免疫特異性反應的單克隆抗體的雜交瘤克隆，并分離生成免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的單克隆抗體的雜交瘤克隆(即Κ33Ν)。
6. 2.對抗人α 9整聯(lián)蛋白抗體的⑶R分析通過逆轉(zhuǎn)錄自相應的雜交瘤提取的mRNA以制備cDNA來測定單克隆抗體(即 K33N)的CDR的氨基酸序列。使用cDNA作為模板，使用kFv克隆引物(輕鏈引物混合物和重鏈引物混合物；Amersham Biosciences Corp.，IL)通過PCR來延伸并擴增H鏈和L鏈的可變區(qū)。將PCR產(chǎn)物克隆入pCRII TOPO載體中，測序，并確定氨基酸序列。將此過程重復三次。表1中顯示了結(jié)果。表1
CDR氨基酸序列SEQ ID NO CDRHlSYYMN4CDRH2WIFPGSGNTKYNEKFKG5CDRH3SWVSYERGYYFDY6CDRLlRASENIYYSLA11CDRL2NANSLED12CDRL3KQAYDVPYT136. 3.細胞粘附抑制活件(1)因為已知細胞粘附牽涉α 9整聯(lián)蛋白與其配體，即各種ECM(包括0ΡΝ、纖連蛋白、生腱蛋白-C、VCAM-1、等等)的結(jié)合，通過使用表達人α 9整聯(lián)蛋白的細胞(人黑素瘤 G361細胞)與配體的結(jié)合來對分離的抗人α 9整聯(lián)蛋白抗體檢查其細胞粘附抑制活性。簡言之，以牛血清清蛋白(BSA)-融合SVVYGLR(SEQ ID NO 2)肽來制備OPN肽。 通過在大腸桿菌宿主細胞中表達，以人生腱蛋白C中的纖連蛋白III型重復的第三區(qū)制備 TN-C fn3 (RAA)，其中已經(jīng)用RAA序列替換該肽的GRD序列。以Syg/mL將OPN肽和生腱蛋白C片段(TN-C fn3 (RAA))添加至96孔板，并于 37°C溫育1小時以包被平板，然后用封閉溶液(0. 5%BSA/PBS)封閉平板。將人黑素瘤G361 細胞在0. 25% BSA/DMEM中懸浮(IxlO5個細胞/mL)，并將每個濃度的抗人α 9整聯(lián)蛋白抗體添加至細胞懸浮液。將0. 25% BSA/DMEM中的人黑素瘤G361細胞(IxlO5個細胞/mL)和抗體的混合物以200 μ L/孔添加至96孔板，并于37°C在5% CO2下溫育1小時。用PBS洗去非粘附細胞，將粘附細胞固定，并用0.5%結(jié)晶紫(WAKO，Osaka, Japan)/20%甲醇染色。 用蒸餾水將經(jīng)染色的細胞清洗三次，然后向其添加20%乙酸溶液以實現(xiàn)溶解。通過測量 590nm波長的OD來量化粘附活性。使用抗人OPN單克隆抗體(5A1)作為陰性對照和先前制備的抗人α 9整聯(lián)蛋白抗體(1K11、21C5、MI11、25B6和28S1)作為陽性對照。圖1中顯示了抗人α 9整聯(lián)蛋白抗體對G361細胞結(jié)合OPN肽的影響，而圖2中顯示了抗人α 9整聯(lián)蛋白抗體對G361細胞結(jié)合生腱蛋白C片段的影響。如圖1中所顯示的， 牽涉OPN的細胞粘附受與陽性對照21C5和24111相比低濃度的和與Υ9Α2相同濃度的Κ33Ν 抑制。牽涉生腱蛋白C的細胞粘附受低濃度的和與Υ9Α2相同濃度的Κ33Ν抑制，抑制效果顯著強于陽性對照21C5和24111。6. 4.非人抗體的人源化6. 4. 1.小鼠K33N V基因的克隆和測序?qū)⑿∈驥33N雜交瘤細胞在含有10%胎牛血清(FBS ；HyClone, Logan, UT)的TIL 培養(yǎng)基 I (Immuno-Biological Laboratories,Gunma, Japan)中于 37°C在 7. 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)依照供應商的方案自約IO7個雜交瘤細胞提取總RNA。使用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)遵循供應商的方案來合成寡聚dT引發(fā)的cDNA。使用分別與小鼠Y-I和κ鏈恒定區(qū)退火的3，引物和GeneRacer試劑盒中提供的 GeneRacer 5’ 引物(5，-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3，)(SEQ ID NO 51)用 Phusion DNA 聚合酶(New England Biolabs, Beverly, ΜΑ)通過聚合酶鏈式反應(PCR)來擴增Κ33Ν重鏈和輕鏈的可變區(qū)cDNA。為了重鏈可變區(qū)(VH)的PCR擴增，3’引物具有序列 5，-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3，(SEQ ID NO :52)。為了輕鏈可變區(qū)(VL)的 PCR 擴增，3， 引物具有序列 5，-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3，(SEQ ID NO :53)。將擴增的 VH 和 VL cDNA 亞克隆入pCR4Blunt-T0P0載體(Invitrogen)中以進行序列測定。可變區(qū)的DNA測序在 Tocore (Menlo Park, CA)實施。對數(shù)個重鏈和輕鏈克隆測序，并鑒定與典型的小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)同源的獨特序列。圖3和圖4中分別顯示了 K33N VH和VL的共有cDNA序列及推導的氨基酸序列。6. 4. 2.嵌合 K33N IgGl/ κ 抗體的構(gòu)建使用Κ33Ν VH cDNA 作為模板、5' -GGGACTAGTACCACCATGGGATG GAGCTGGATCTTTCTC-3，(SpeI 位點加下劃線)(SEQ ID NO 40)作為 5，引物、和 5，-GGGAAG CTTGTTTTAAGGACTCACCTGAGGAGACTCTGAGACTG GTGCC-3，(SEQ ID NO 41) (HindIII 位點加下劃線)作為3’引物通過PCR以包含剪接供體信號和合適的側(cè)翼限制酶位點的外顯子生成編碼K33N VH的基因(圖5)。類似地，使用K33N VL cDNA作為模板、5’-GGGGCTAGCACCA CCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTG-3，(SEQ ID NO :42) (NheI 位點加下劃線)作為 5，引物、和 5‘-GGGGAATTCTGAGAAGAC TACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-3，(SEQ ID NO 43) (EcoRI 位點加下劃線)作為3’引物通過PCR以包含剪接供體信號和合適的側(cè)翼限制酶位點的外顯子生成編碼K33N VL的基因(圖6)。K33N VH和VL外顯子的剪接供體信號分別衍生自小鼠種系JH4和J κ 2序列。使用QIAquick凝膠提取試劑盒Oliagen，Valencia, CA)將PCR 擴增的片段進行凝膠純化，用SpeI和HindIII (對于VH)或NheI和EcoRI (對于VL)將其消化，并克隆入攜帶人Y-I和κ恒定區(qū)的哺乳動物表達載體中以生成嵌合K33N IgGl/κ 抗體。圖7中顯示了所得的表達載體pChK33N的示意結(jié)構(gòu)。6. 4. 3.人源化K33N V基因的生成如由Queen 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :10029-10033,1989)所概述的那樣實施K33N可變區(qū)的人源化。首先，借助于計算機程序來構(gòu)建K33N可變區(qū)的分子模型。接著，基于針對人可變區(qū)序列的同源性搜索，選擇自DA980102 (GenBank登錄號)衍生的人氨基酸序列(其與K33N VH具有高度同源性)作為接受體以為人源化K33N VH提供框架。 小鼠K33N與DA980102 VH區(qū)之間的框架氨基酸同一性是74. 7% (65/87)。類似地，選擇 X7M41 (GenBank登錄號)的人氨基酸序列作為接受體以使K33N VL人源化。小鼠K33N和 X72441VL區(qū)之間的框架氨基酸同一性是76. 3% (61/80)。
在計算機模型提示了與互補決定區(qū)(OTR)的顯著接觸的框架位置處，用來自K33N 可變區(qū)的氨基酸替換人框架氨基酸。這在第28位、第48位、第66位、第67位和第71位進行以生成人源化K33N(HuK33N)VH(圖8)。另外，發(fā)現(xiàn)人DA980102接受體的第82位處的 Met在人VH序列的相同亞組中是非典型的，因此用最常見的氨基酸殘基(Leu)替換以降低潛在的免疫原性。對于輕鏈，在殘基70和71處進行替換以生成HuK33N VL(圖9)。圖8中對VH和圖9中對VL顯示了 K33N(稱作HuK33N)與人接受體氨基酸序列的比對。將編碼HuK33N VH和VL之每種的基因設計為包含信號肽、剪接供體信號、和合適的限制酶位點(用于隨后將其克隆入哺乳動物表達載體中)的外顯子。HuK33N VH和VL外顯子的剪接供體信號分別衍生自人種系JH4和J κ 1序列。通過SIG-Pred信號肽預測軟件 (http://bmbpcu36. leeds. ac.uk/prot_analysis/Signal.html)指明小鼠 K33N VH 基因的信號肽序列對于精確切割是亞最佳的。因此，在HuK33N VH基因中使用小鼠抗人α 9整聯(lián)蛋白單克隆抗體Mill (Gene Techno Scienee)的VH基因的信號肽序列，其通過SIG-Pred 軟件預測為被有效且精確切割。人源化K33N VL外顯子中的信號肽序列衍生自相應的小鼠 K33N VL序列。SIG-Pred軟件指明HuK33N VL基因的信號肽被有效且精確切割。使用ThermalAce DNA聚合酶(Invitrogen)通過數(shù)種交疊的合成寡核苷酸引物的延伸和PCR擴增來構(gòu)建HuK33N VH和 VL基因，如由 He等(J. Immunol. 160 :1029-1035,1998) 所概述的。圖10和圖11中分別列出了用于構(gòu)建HuK33NVH和VL基因的寡核苷酸。圖12 和圖13中分別顯示了寡核苷酸在HuK33N VH和VL基因中的位置。使用QIAquick凝膠提取試劑盒Oiiagen)來將PCR擴增的片段進行凝膠純化，并將其克隆入pCR4Blimt-T0P0載體中以進行序列測定。用SpeI和HindIII (對于VH)或NheI和EcoRI (對于VL)消化后， 將HuK33NVH和VL基因亞克隆入哺乳動物表達載體中的相應位點中以便以人IgGl/ κ形式生成。圖7中顯示了所得的表達載體pHuK33N的示意結(jié)構(gòu)。圖14和圖15中分別顯示了所獲得的HuK33N VH和VL基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列。6. 4. 4.嵌合的和人源化的K33N IgGl/ κ的瞬時表達依照Durocher等(Nuc 1. Acids Res. 30 :e9，2002)使用聚乙烯亞胺來分別將 pChK33N和pHuK33N質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至HEK293細胞，從而瞬時表達嵌合的和人源化的K33N IgGl/ κ抗體。將經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293細胞在含有10% FBS的DMEM中于37°C在7. 5% CO2 培養(yǎng)箱中維持4天。通過三明治式ELISA來測量培養(yǎng)物上清液中ChK33N和HuK33N IgGl/ κ抗體之每種的表達水平。用100 μ 1/孔PBS中1/2，000稀釋的山羊抗人IgG Fc γ鏈特異性多克隆抗體(SouthernBiotech，Birmingham，AL)于4°C包被ELISA板過夜，用清洗緩沖液(含有0. 05% Tween 20的PBS)清洗，并用300ul/孔的封閉緩沖液(含有2%脫脂奶和 0. 05% Tween 20的PBS)于室溫封閉1小時。用清洗緩沖液清洗后，將100 μ 1/孔在ELISA 緩沖液(含有脫脂奶和0.025% Tween 20的PBS)中適當稀釋的樣品應用于ELISA板。 使用自人骨髓瘤血清純化的人IgGl/κ抗體(SouthernBiotech)作為標準品。于室溫將 ELISA板溫育2小時并用清洗緩沖液清洗后，使用100 μ 1/孔的1/2，000稀釋的偶聯(lián)有HRP 的山羊抗人κ鏈多克隆抗體(SouthernBiotech)來檢測所結(jié)合的抗體。于室溫溫育1小時并用清洗緩沖液清洗后，通過添加100 μ 1/孔的ABTS底物(bio WORLD, Dublin, 0H)來進行顯色。通過添加100 μ 1/孔的2%草酸來停止顯色。以405nm讀取吸光度。通過細胞ELISA來檢查瞬時表達的ChK33N和HuK33N抗體對人α 9整聯(lián)蛋白的結(jié)合。將在表面上表達重組人α 9整聯(lián)蛋白的CHO-Kl穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子(CHO/hu α 9 ；由Gene Techno Science 提供)以 2xl05 個細胞 / 孔在 50 μ 1 含有 10% FBS 的 F12/DMEM(HyClone)中在 96 孔組織培養(yǎng)板中接種，并于37°C在7. 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。為了測試對人α 9整聯(lián)蛋白的結(jié)合，將50 μ 1含有10 % FBS的F12/DMEM中的ChK33N、HuK33N或無關的人IgGl/ κ骨髓瘤抗體(SouthernBiotech)添加至每孔。于4°C溫育1小時并用冰冷的PBS將細胞清洗兩次后，將100 μ 1 1/1，000稀釋的偶聯(lián)有HRP的山羊抗人IgG多克隆抗體(SouthernBiotech) 添加至每孔。于4°C溫育1小時后，用冰冷的PBS將細胞清洗三次。為了顯色，添加100 μ 1 ABTS底物。通過添加100 μ 1 2%草酸來停止顯色。以405nm讀取吸光度。結(jié)果顯示了在 0. 5和1 μ 1/ml兩者，ChK33N抗體對人α 9整聯(lián)蛋白的結(jié)合幾乎與HuK33N抗體對人α 9整聯(lián)蛋白的結(jié)合相同(圖16)。6. 4. 5.生成ChK33N和HuK33N IgGl/ κ抗體之每種的NSO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的生成為了獲得穩(wěn)定生成ChK33N和HuK33N IgGl/κ抗體的細胞系，分別將表達載體 pChK33N和pHuK33N導入小鼠骨髓瘤細胞系NSO (歐洲動物細胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures), Salisbury, Wiltshire, UK)的染色體中。將 NSO 細胞在含有10% FBS的DME培養(yǎng)基中于37°C在7. 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過電穿孔來實施進入 NSO 中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，如 Bebbington 等(Bio/Technology 10 169-175，1992)中所記載的。轉(zhuǎn)染前，使用FspI來使表達載體線性化。用IOyg線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染約IO7個細胞，將其在含有10% FBS的DME培養(yǎng)基中懸浮，并分配入數(shù)塊96孔板中。M小時后，應用選擇培養(yǎng)基(含有 10% FBS, HT 培養(yǎng)基補充物(Sigma，St. Louis, MO)、0· 25mg/ml 黃嘌呤和 1 μ g/ ml霉酚酸的DME培養(yǎng)基)。啟動選擇后約10天，對培養(yǎng)物上清液測定抗體生成。通過三明治式ELISA本質(zhì)上依照6. 4. 3 一節(jié)中所描述的規(guī)程來測量ChK33N和 HuK33N IgGl/κ抗體的表達。使用雜交瘤SFM(Invitrogen)來使生成高水平ChK33N抗體的NSO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子(NS0-ChK33N 3D11)適應于在無血清培養(yǎng)基中的生長。通過有限稀釋將生成高水平HuK33N抗體的NSO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子在96孔板中進一步亞克隆。使亞克隆之一 (NS0-HuK33N 8G8-11)適應于在雜交瘤SFM中生長。用PCR枝原體檢測組(Takara Bio USA, Madison, WI)進行的測試指明，NS0_ChK33N 3D11 和 NS0_HuK33N 8G8-11 兩者在枝原體存在方面呈陰性。通過cDNA測序來確認NS0-HUK33N 6D5-11中生成的HuK33N重鏈和輕鏈的真實性。使用TRIzol試劑(Invitrogen)自NS0_HuK33N 6D5-11細胞提取總RNA,并使用 GeneRacer試劑盒(Invitrogen)遵循制造商的方案來合成寡聚dT引發(fā)的cDNA。使用CMV2 和JNT098作為引物(圖17)和Phusion聚合酶(New England Biolabs)通過PCR擴增γ-1 重鏈的編碼區(qū)。將PCR片段進行凝膠純化，并用CMV2、JNT082、JNT097和JNT098作為引物 (圖17)進行測序。類似地，使用CMV2和JNT026 (圖17)來擴增κ輕鏈的編碼區(qū)。用CMV2、 JNT026、JNT080和JNT084作為引物(圖17)對凝膠純化的DNA片段進行測序。HuK33N重鏈和輕鏈之每種的編碼區(qū)獲得的核苷酸序列與pHuK33N載體中的相應序列完全匹配(分別為圖18和圖19)。6. 4. 6. ChK33N 和 HuK33N 抗體的純化將NS0-ChK33N 3D11和NS0_HuK33N 8G8-11細胞在滾瓶中在雜交瘤SFM中培養(yǎng)至耗盡。離心并過濾后，將培養(yǎng)物上清液加載至蛋白A kpharose柱(GE Healthcare,Piscataway, NJ)上。用PBS清洗柱，之后用0. IM甘氨酸-HCl (pH 3.0)洗脫抗體。用IM Tris-HCKpH 8)中和后，通過透析將洗脫抗體的緩沖液更換成PBS。通過測量^Onm的吸光度來測定抗體濃度(lmg/ml = 1. 4個0D)。NS0-ChK33N 3D11細胞的抗體表達水平是50 μ g/ ml，而NS0-HuK33N8G8-ll細胞的抗體表達水平是12μ g/ml。通過SDS-PAGE依照標準的規(guī)程來表征純化的ChK33N和HuK33N抗體。還原條件下的分析指明ChK33N和HuK33N抗體之每種由具有約50kDa分子量的重鏈和具有約25kDa 分子量的輕鏈構(gòu)成(圖20)。每種抗體的純度表現(xiàn)為超過95%。6. 4. 7. ChK33N 和 HuK33N 抗體的表征在用CHO/hua 9細胞進行的FACS結(jié)合測定法中檢查小鼠的、嵌合的和人源化的 K33N抗體對人α 9整聯(lián)蛋白的結(jié)合。用FACS結(jié)合緩沖液(含有0. 5% BSA和0. 05% NaN3 的PBS)清洗約切105個CHO/hu α 9細胞/測試，并在200 μ 1含有多個量的測試抗體的FACS 結(jié)合緩沖液中懸浮。在冰上30分鐘后，用FACS結(jié)合緩沖液清洗細胞。然后，將用小鼠Κ33Ν 染色的細胞在100 μ 1 FACS結(jié)合緩沖液中1/200稀釋的經(jīng)FITC標記的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體(SouthernBiotech)中懸浮。將用嵌合或人源化Κ33Ν染色的細胞在100 μ 1 FACS 結(jié)合緩沖液中1/200稀釋的經(jīng)FITC標記的山羊抗人IgG多克隆抗體(SouthernBiotech) 中懸浮。在冰上30分鐘后，將細胞用FACS結(jié)合緩沖液清洗，在200 μ 1 FACS結(jié)合緩沖液中懸浮，并使用FACScan流式細胞儀(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)來分析。小鼠 K33N抗體結(jié)合CHO/hu α 9細胞的EC50值是104ng/ml (圖21)。在ChK33N和HuK33N抗體之間，結(jié)合樣式彼此非常相似(圖22)。另外，ChK33N和HuK33N抗體的EC5tl值彼此幾乎相同(ChK33N抗體為143ng/ml，而HuK33N抗體為151ng/ml)。此結(jié)果指明小鼠K33N抗體在不損失抗原結(jié)合親和力的情況中成功人源化。6.4.8.細胞粘附測定法用50 μ L 5 μ g/mL hTNC (AEIDGIEL)-BSA 溶液于 37°C在 CO2 培養(yǎng)箱中將 96 孔平底微量滴定板(Nunc)包被1小時。用50 μ L 5 μ g/mL BSA溶液包被對照孔。包被反應后，用 200 μ L 0. 5w/v% BSA(封閉)溶液更換孔中的溶液，并于室溫溫育1小時。封閉反應后， 用PBS清洗孔。將150 μ L含有0. 25w/v% BSA的TIL培養(yǎng)基中懸浮的2. 5x10s個細胞/mL G-361細胞和50 μ L測試抗體溶液(0. 25w/v% BSA/TIL)在孔中分配，并于37°C在(X)2培養(yǎng)箱中溫育1小時。溫育后，用PBS溶液將每孔小心清洗三次以除去非粘附細胞。添加50 μ L 0. 5w/V%結(jié)晶紫溶液以將粘附細胞固定并染色。30分鐘后，通過用一盆水清洗三次來除去過量的染料，并用50yL 20v/v%乙酸溶解孔中的染料。使用吸收分光光度計來測量每孔在595nm的吸光度。通過下式計算細胞粘附抑制率；(1_ (A-B) / (C-B)) xlOO (%)。A 在存在抗體的情況中用hTNC-BSA包被的孔的吸光度，B 在沒有任何測試抗體的情況中用BSA包被的孔的吸光度，C 在存在正常人IgG (陰性對照)的情況中用hTNC-BSA包被的孔的吸光度(圖23)。結(jié)果Y9A2 的 IC50 是 0. 053 μ g/ml (95 % CI :0. 032-0. 089)。K33N、ChK33N 禾口 HuK33N 的 IC50 分另Ij 是 0. 075μ Μ(0· 053-0. 106)、0· 090 μ g/ml (0. 063-0. 1 )、0· 084μ g/ ml (0. 055-0. 129)，指明測試抗體的IC50值與Y9A2的IC50值在相同水平上。7.保藏
本文中稱為K33N的生成小鼠抗人α 9整聯(lián)蛋白單克隆抗體的雜交瘤依照微生物保藏布達佩斯條約于2007年5月四日保藏于位于中心6，l-l-lHigashi，Tsukuba, Ibaraki (郵政編碼305-8566)的國際專利生物體保藏中心(International Patent Organisms D印ository)，國家先進工業(yè)科學技術研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and iTechnology)，并記錄為登錄號 FERM BP-10830，通過提及而將其完整收入本文。8.工業(yè)實用性本發(fā)明的人源化單克隆抗體抑制α 9整聯(lián)蛋白的功能以對癌癥，例如癌細胞的生長或轉(zhuǎn)移，和炎性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維化、糖尿病、癌癥轉(zhuǎn)移、動脈硬化、多發(fā)性硬化、肉芽腫、炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病)、自身免疫性疾病、等等展現(xiàn)出治療效果。9.序列表下文匯總了貫穿整個說明書所提及的序列。
權(quán)利要求
1.一種免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含(i)H鏈，該H鏈包含至少一種自人抗體的VH區(qū)衍生的FRH和至少一種自免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的非人抗體的至少一種⑶RH衍生的⑶RH ；或(ii)L鏈，該L鏈包含至少一種自人抗體的VL區(qū)衍生的FRL和至少一種自免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的非人抗體的至少一種⑶RL衍生的⑶RL ；或(iii)上文的⑴和( )兩者。
2.權(quán)利要求1的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述非人抗體是由保藏登錄號 FERM BP-10830的雜交瘤生成的小鼠單克隆抗體。
3.權(quán)利要求1的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述人源化抗體的至少一種CDRH 包含選自氨基酸序列SEQ ID NO :4、5和6的氨基酸序列，且所述人源化抗體的至少一種 ⑶RL包含選自氨基酸序列SEQ IDNO 11、12和13的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求2或3的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述人抗體的VH區(qū)包含自由 GenBank登錄號DA980102的核苷酸序列(SEQ ID NO 18)編碼的氨基酸序列衍生的氨基酸序列，且所述人抗體的VL區(qū)包含自由GenBank登錄號X7M41的核苷酸序列(SEQ ID NO 23)編碼的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
5.一種免疫特異性識別人α 9整聯(lián)蛋白的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含H鏈和L鏈，該H鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :60，且該L鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :61。
6.一種分離的核酸分子，其包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO 60的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求6的核酸分子，其中所述核苷酸序列具有核苷酸序列SEQIDNO :62。
8.權(quán)利要求6的核酸分子，其進一步包含編碼信號肽的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求8的核酸分子，其中所述信號肽包含氨基酸序列SEQID Ν0:58。
10.一種分離的核酸分子，其包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO :61的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求10的核酸分子，其中所述核苷酸序列具有核苷酸序列SEQIDNO :63。
12.權(quán)利要求10的核酸分子，其進一步包含編碼信號肽的核苷酸序列。
13.權(quán)利要求12的核酸分子，其中所述信號肽包含氨基酸序列SEQIDNO 590
14.一種載體，其包含權(quán)利要求6或10或二者的核酸分子，其中所述核酸分子與一種或多種調(diào)節(jié)元件可操作連接。
15.一種分離的宿主細胞，其包含權(quán)利要求14的載體。
16.一種用于制備人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，包括在使得該人源化抗體或其抗原結(jié)合片段表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求15的宿主細胞，并收集所表達的人源化抗體。
17.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1、2或5中任一項的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段和藥學可接受載體。
18.一種用于預防或治療與α 9整聯(lián)蛋白有關的病癥或疾病的方法，所述方法包括對有此需要的受試者施用有效量的權(quán)利要求5的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。
19.一種用于體內(nèi)診斷與α 9整聯(lián)蛋白有關的病癥或疾病的方法，所述方法包括對要檢查的受試者施用有效量的權(quán)利要求1或2的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了免疫特異性識別人9整聯(lián)蛋白的人源化抗體。這些抗體中的一些抑制9整聯(lián)蛋白的生物學功能，由此對與9整聯(lián)蛋白有關的各種病癥或疾病(包括癌癥，例如癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，和炎性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維化、糖尿病、動脈硬化、多發(fā)性硬化、肉芽腫、炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病)、自身免疫性疾病、等等)展現(xiàn)出治療效果。
文檔編號C07K16/28GK102333791SQ201080009550
公開日2012年1月25日 申請日期2010年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月10日
發(fā)明者S.庫馬, 原田達弘, 曹仲欣, 鶴下直也 申請人:株式會社遺傳科技, 科研制藥株式會社