專利名稱：一種抗肌鈣蛋白i單克隆抗體及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗肌鈣蛋白I單克隆抗體及其用途，屬于生物技術領域。
技術背景
心肌肌鈣蛋白I(cTnl)是心肌中所特有的蛋白標志物，分子量為22. 5kD。在心臟 內(nèi)，TnI與TnC和TnT—起組成肌鈣蛋白復合物，當心肌收縮與舒張時，該復合物在細胞間 鈣信號的傳播中起樞紐作用。早期心肌損傷的生化指標主要限于肌紅蛋白和CK-MB。然而 不僅CK-MB血中存在的時間較短(1 4天)，而且CK-MB在骨骼肌及大腦中也存有，當骨骼 肌及大腦損傷，CK-MB都會有顯著升高。90年代以來，對肌鈣蛋白的大量臨床研究表明，肌 鈣蛋白具有心肌損傷的高度的特異性和敏感性。美國臨床化學學會(NACB)及國際檢測醫(yī) 學聯(lián)合會(TFCC)建議心肌肌鈣蛋白是檢測心肌損傷的新的標志物；中國檢驗學會推薦由 心肌肌鈣蛋白逐步取代CK-MB成為檢出心肌損傷的新標準。
心肌肌鈣蛋白I檢測的臨床應用
(1)心肌梗死(MI)是冠狀動脈閉塞，血流中斷，部分心肌因嚴重的持續(xù)性缺血而 發(fā)生局部壞死。cTnl的心臟特異性，及其在心臟受損后的快速及長時期的升高反應，決定 了 cTnl是一種診斷心肌損傷性疾病，特別是診斷心肌梗死的最佳指標。( 不穩(wěn)定型心絞 痛(UA)是一組介于穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死之間的急性冠狀動脈缺血綜合征。粥樣 化硬塊破裂誘發(fā)非閉塞性血栓形成，由于血栓性物質造成冠狀動脈小分支的栓塞，就可能 引起心肌細胞的缺血性損傷，cTnl血液濃度的監(jiān)測能為微小心肌損傷提供最敏感和最特異 的診斷。( 急性心衰患者血液中的cTnl可有不同程度的升高，提示cTnl可作為急性心衰 患者心肌損害的敏感的生化指標。(4)心臟壓力增大導致的心內(nèi)膜下?lián)p傷，如充血性心衰高 血壓所至的左心室肥大或者代償性心動過速時血液動力學改變(如休克病人)及肺栓塞引 起的右心室損傷均可在血液中檢測到cTnl的升高。(5)心肌炎的診斷與CK-MB活性相比， 患心肌炎時，因cTnl相對較高的血清檢測值和較長的升高時間，使cTnl具有較高的檢測敏 感性。短暫性心肌炎癥也可引起心肌損傷。(6)手術損傷評估術后心肌梗死是術后常見 的死亡原因，病死率高達36% 70%，然而診斷卻很困難，因為手術病人常處于麻醉和鎮(zhèn) 靜狀態(tài)，不能主動提示心肌梗死癥狀。Adams等人利用cTnl判斷血管和脊柱外科手術中的 心肌梗死，認為手術病人，心臟標志物cTnl的升高預示著心肌損傷的存在。標志物水平越 高，損傷程度越大。(7)窒息新生兒心肌損傷判斷新生兒窒息是新生兒死亡的主要原因之 一，因窒息缺氧導致心肌損傷已日益受到重視。1997年美國Hirsch等通過檢測兒童血清 cTnl，證實了兒童心肌損傷時應用cTnl檢測的價值。
采用膠體金標記技術的免疫層析法具有方便、快捷、試劑易于保存等優(yōu)點，已被廣 泛應用于免疫的各個領域，但膠體金免疫層析法的使用關鍵要解決其特異性、靈敏度及準 確性的問題，這都需要選用具有高度特異性和高親和力的單克隆抗體。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高度特異性的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體及其在膠體金 免疫層析法制備的肌鈣蛋白I檢測試劑盒中的應用，以實現(xiàn)利用膠體金免疫層析法能快 速、準確、高靈敏度檢測肌鈣蛋白I的目的。
本發(fā)明所提供的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，其特征在于其輕鏈的氨基酸殘基序 列如SEQ ID No. 1所示，其重鏈的氨基酸殘基序列如SEQ ID No. 2所示。
所述的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，是由保藏號為CCTCC NO. C201059的雜交瘤細 胞株5G9A10E3分泌產(chǎn)生。
所述的雜交瘤細胞株是以肌鈣蛋白I為免疫源，小鼠為免疫對象，通過免疫注射 小鼠，取免疫小鼠脾臟制備懸液，并使之與骨髓瘤細胞進行細胞融合獲得。
所述的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，屬于IgG亞型。
所述的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的腹水效價為1 106。
本發(fā)明的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體不僅可以與肌鈣蛋白I高度特異性結合，而且 靈敏度高、穩(wěn)定性好，可通過本領域技術人員所公知的的方法，制備成肌鈣蛋白I的各種檢 測試劑盒。尤其是，應用本發(fā)明的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體和膠體金免疫層析法制備的肌 鈣蛋白I的檢測試劑盒，不僅可以快速、簡捷檢測人血清、血漿或全血標本中的肌鈣蛋白I， 使檢測靈敏度達到97. 74%，檢測特異度達到94. 74%，檢測準確度達到96. 72%，而且能使 Kappa檢驗值達到0. 927，遠大于0. 75，與臨床診斷具有較高的診斷一致性，可用于臨床上 對急性心肌梗塞疾病的輔助診斷。


圖1為5RACE產(chǎn)物電泳圖，其中1號為輕鏈結果，2號為重鏈結果，M為DNA Marker。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件、實驗室手冊中所 述的條件或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的制備
一、動物免疫
取雌性6 8周齡的BALB/c小鼠，首次免疫用濃度為5mg/ml的肌鈣蛋白I純品， 經(jīng)腹腔和四肢腋下注射，總量Iml ；每隔2周以同樣的方法加強免疫1次，共免疫3次，末次 免疫后的第4天，從經(jīng)三次免疫后小鼠眼球采血，離心分離血清，用ELISA法選出效價高的 小鼠準備融合。
二、雜交瘤細胞系的制備
將完成免疫過程的小鼠準備取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，在融合前一 天制備飼養(yǎng)細胞；融合時無菌下取小鼠脾細胞，與SP2/0細胞以10 1混合，以50% PEG介導融合，離心后重懸于HAT選擇性培養(yǎng)基中，接種于含有飼養(yǎng)細胞的96孔微孔板中，置 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，融合后第3d、第5d、第7d用HAT培養(yǎng)液半量換液，兩周后換用HT 培養(yǎng)液。
觀察雜交瘤細胞的生長情況，等克隆長至孔底面積的1/3 1/2，取培養(yǎng)上清液， 用ELISA法進行抗體檢測，篩選陽性克隆。以有限稀釋法對陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆 化培養(yǎng)，直到克隆化細胞抗體陽性率為100%，選出高分泌特異性細胞株(即ELISA效價在 1 IO6以上的陽性克隆)，此時可將陽性克隆細胞進一步擴大培養(yǎng)。將雜交瘤細胞經(jīng)體外 連續(xù)傳代3個月以上和反復凍存、復蘇，定期收集上清，用篩選抗體的方法測定上清中的抗 體，直至細胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。
三、單克隆抗體的制備和純化
選用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0. 5ml液體石蠟，1 2周后收集生長狀態(tài)良好的 單克隆雜交瘤細胞株5G9A10E該細胞株已在設置于中國武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保 藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期為2010年7月1日，保藏號為CCTCC NO. C201059，每只 腹腔注射1ml。接種2周左右的小鼠腹部可見明顯膨大，以頸椎脫白法處死后打開腹腔，取 出腹水。離心后吸取上清，用硫酸銨沉淀后，再用DEAE離子交換柱純化，用PH5. 6、20mM的 醋酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液。再用親和層析純化法(蛋白A-S印har0Se4B柱)繼續(xù)純 化，上樣條件樣品和蛋白A-kphar0Se4B柱用PH8. 2,1. OM的Tris緩沖液平衡后再上樣。 洗脫條件用PH3. 0、50mM的甘氨酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，制得特異的單克隆抗體。
四、單克隆抗體的腹水效價及鑒定
取小鼠腹水抗體，用篩選抗體的方法測定效價為1 106，亞型鑒定為IgG型。 劉世國等通過常規(guī)單抗雜交瘤細胞技術也獲得了抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，其效價為 1 32000;楊能運用此技術獲得的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的效價為1 16000，本發(fā)明 的單克隆抗體的效價遠高于現(xiàn)有技術。
實施例2 單克隆抗體的特異性鑒定
材料肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白T、肌紅蛋白、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶 (CK-MB)。
方法采用ELISA法檢測，以肌鈣蛋白I為陽性對照。
結果顯示肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白T、肌紅蛋白、肌酸激酶MB(CKMB)均為陰性。
說明本發(fā)明的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體對肌鈣蛋白I有高度特異性。
實施例3 單克隆抗體的可變區(qū)序列的克隆與測序
采用5，RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends，快速擴增 cDNA 末端)技術， 從分泌抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的雜交瘤細胞株5G9A10E3中克隆功能性抗體的可變區(qū)序 列。其步驟可簡述為由一個反義的基因特異性引物(GSPl)來合成cDNA第一鏈，cDNA第 一鏈純化后，利用末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminaldeoxynucleotidy transferase, TdT) 在cDNA的3’末端加上一個合成的同聚核苷酸錨定序列。利用第二個巢式基因特異性引物 (GSP2)和一個與同聚核苷酸尾巴可以退火的錨定引物來擴增cDNA。具體實驗過程如下
材料
-由雜交瘤細胞株5G9A10E3分泌產(chǎn)生的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體
-大腸桿菌jToplO菌株
-pGEM-T Easy 克隆載體
引物設計
根據(jù)免疫球蛋白基因的特點，設計兩套分別對應Ig和Kappa恒定區(qū)的基因特異性 引物GSP1、GSP2，引物序列如下
pRace-H-GSPl GTCCACCKYGGTSYTGCTGGCYGGGTG
pRace-H-GSP2 GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC
pRace-K-GSPl :ACTTGACATTGATGTCTTTG
pRace-K-GSP2 CACGACTGAGGCACCTCCAGATG
克隆過程
A、第一鏈合成
以總RNA為模板，以GSPl為引物，在反轉錄酶的作用下合成cDNA第一鏈。具體步 驟如下
1)在一個0. 5ml的微量離心管中加入以下組分
GSPl 2. 5ml
總 RNA 1 5 μ g
補充經(jīng)DEPC處理的水至總體積為15. 5 μ 1，混勻。
2) 70°C變性lOmin，冰浴lmin，短暫離心后依次加入以下組分
10*PCR buffer 2. 5 μ 1
25mM MgCl22. 5 μ 1
IOmMdNTPmix Ι.ΟμΙ
0. IM DTT2·5μ1。
3)混勻，短暫離心后置42°C lmin。
4)在反應體系中加入1 μ 1 SuperScriptTMII RT (Invitrogen公司)，輕輕混勻后 置 42°C 反應 50min。
5)反轉錄結束后置70°C、15min以終止反應。
6)離心10 20秒后置于37°C。
7)加入1 μ 1 RNase mix，輕輕混勻后置于37°C反應30min。
8)將反應管取出置冰上備用。
B、DNA 純化
使用QIAGEN公司QIAquick PCR純化試劑盒。
1)加5倍體積于反轉錄體系的PB緩沖液于反轉錄反應管中，混勻。
2)將QIAquick離心柱置于2ml收集管中，把樣品加入離心柱，13000rpm離心60秒。
3)棄去液體，將離心柱放回原來的收集管中，加入0.75ml PE緩沖液于QIAquick 離心柱，13000rpm離心60秒。
4)棄去液體，將QIAquick離心柱放回原來的收集管，13000rpm離心60秒。
5)將QIAquick離心柱置于一干凈的1. 5ml離心管，在QIAquick膜中央加入30 μ 1 EB緩沖液，靜置Imin后，13000rpm離心60秒。
C、cDNA 加尾
1)在一個0．5ml的微量離心管中一次加入以下組分
DEPC處理的水6．5 ix l
5*tailing buffer5．0 u l
2mM dCTP2．5 lX l
純化的cDNA10．0 u l，混勻。
2)將反應管置94℃維持3min后，冰浴lmin，短暫離心后置冰上。
3)加入l u l TdT，混勻后置37℃反應10min。
4)將反應管置于65℃中作用30min終止反應，離心后置于冰上備用。
D1PCR
在一個0．2ml的PCR薄壁管中加入以下組分
滅菌水31．5 u l
IO*PCR Buffer5．0 u l
25mlVI MgCl，3．0 u l
lOmM dNTP mix1．o u l
GSP2(10pm01／u 1)2．0 u l
AAP(10pm01／u 1)2．0 u l
dC—tailed CDNA5．o u l
Tag酶0．5 u l
合計50．0 u l
混勻后置PCR儀中進行反應。
E1PCR產(chǎn)物電泳純化
PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖l所示其中l(wèi)號為輕鏈結果，在約440bp處有一特異性條帶；2號為重鏈結果，在約470bp處有一特異性條帶。
F1使用Promega公司的pGEM—T Easy試劑盒，將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM—TEasy載體，轉化大腸桿菌Topl0(Invitrogen公司)具體過程為
1)輕鏈和重鏈PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收440bp和470bp的條帶，最終定容于20 u l體積的滅菌水中；
2)在一個0．5ml的微量離心管中，加入以下組分
2*連接緩沖液 5 u l
pGEM—T Easy50ng(1 u 1)
PCR產(chǎn)物25ng(3 u 1)
／4連接酶l u l
混勻后室溫連接2小時或者4℃連接16小時以上。
3)轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐青霉素和IP／G1X—GAL的LB平板上，37℃培養(yǎng)12小時左右。[Oloo] G1測定所克隆的PCR產(chǎn)物的堿基序列
各選取至少5個質粒測定其所含的PCR產(chǎn)物的堿基序列。
H1根據(jù)堿基序列與氨基酸編碼序列的相應關系，分析PCR產(chǎn)物的閱讀框架，確定相應可變區(qū)的氨基酸序列，其輕鏈和重鏈的序列分別如SEQ工D N。．1和SEQ工D N。．2所示。根據(jù)免疫球蛋白基因的特點驗證其為抗體序列。
實施例4 本發(fā)明的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的應用
采用本領域技術人員所公知的膠體金免疫層析法，制作肌鈣蛋白I快速檢測試劑 盒，在體外定性檢測人血清、血漿或全血標本中的肌鈣蛋白I，用于臨床上輔助診斷急性心 肌梗塞(AMI)疾病。
一、檢測原理
采用膠體金標記的免疫層析技術，標本中的cTnl與檢測區(qū)包被的抗cTnl抗體結 合，當cTnl濃度超過檢測限時，在檢測區(qū)會形成一條色帶，無cTnl的標本在檢測區(qū)不會形 成色帶。而質控區(qū)則始終會出現(xiàn)紅色色帶，以提示檢測結果正確有效。
二、檢測方法
A、標本收集及準備
1)采用標準實驗室程序收集血清、血漿或全血標本。
2)避免熱滅活標本，以防止出現(xiàn)溶血或蛋白變性。
3)全血標本采集使用肝素或EDTA為抗凝劑，收集血液標本，由于肌鈣蛋白I在 全血或血清標本中很不穩(wěn)定，全血或血清標本應在采集后4小時內(nèi)用于檢測。
4)血漿/血清標本采集將全血標本離心以獲得血清或血漿標本，如果標本不能 馬上用于檢測，置2 8°C保存M小時，如果不能在M小時內(nèi)進行檢測，需置-20°C或更低 溫度下保存。注意標本在檢測前需平衡至室溫。
B、操作步驟
1)實驗前將所需物質及標本平衡至室溫。然后撕開鋁箔袋，從中取出檢測板，放在 水平的表面上。
2)用移液器加80μ1標本(或用吸管滴加2滴標本)于樣品孔中。
3) 15分鐘內(nèi)觀察結果。注意若為肌鈣蛋白I含量低的標本，顯色時間可能會超 過15分鐘。
三、結果判定
1)陽性15分鐘內(nèi)出現(xiàn)兩條色帶時，結果判為陽性。
2)陰性如果檢測區(qū)不出現(xiàn)色帶，而在質控區(qū)出現(xiàn)一條色帶，結果判為陰性。
3)無效如果質控區(qū)不出現(xiàn)色帶，結果判為無效，必須使用新檢測板重新檢測標 本。
四、臨床應用結果
為評價本發(fā)明的肌鈣蛋白I快速檢測試劑盒在臨床上應用于對急性心肌梗塞 (AMI)疾病進行輔助診斷的適用性與準確性，在浙江大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院從臨床中選 出335例樣本作為研究對象。入選對象以表現(xiàn)出急性心肌梗塞癥狀的患者為主，也包括少 部分無明顯急性心肌梗塞癥狀的就診患者。采用美國貝克曼庫爾特公司的肌鈣蛋白I檢測 試劑盒對入選樣本進行檢測，依據(jù)檢測結果將樣本分為病例組和對照組。同時用本發(fā)明的 試劑盒對這些樣本進行檢測，比較檢測結果，并進行統(tǒng)計分析，實驗結果見表1所示。
表1應用本發(fā)明的檢測試劑盒的臨床對比研究結果
權利要求
1.一種抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，其特征在于其輕鏈的氨基酸殘基序列如SEQ ID No. 1所示，其重鏈的氨基酸殘基序列如SEQ ID No. 2所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，其特征在于所述的抗肌鈣蛋白I 單克隆抗體是由保藏號為CCTCC NO. C201059的雜交瘤細胞株5G9A10E3分泌產(chǎn)生。
3.根據(jù)權利要求2所述的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，其特征在于所述的雜交瘤細胞 株是以肌鈣蛋白I為免疫源，小鼠為免疫對象，通過免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾臟制備懸 液，并使之與骨髓瘤細胞進行細胞融合獲得。
4.根據(jù)權利要求1所述的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，其特征在于所述的抗肌鈣蛋白I 單克隆抗體屬于IgG亞型。
5.根據(jù)權利要求1所述的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，其特征在于所述的抗肌鈣蛋白 I單克隆抗體的腹水效價為1 106。
6.一種權利要求1所述的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的應用，其特征在于用于肌鈣蛋 白I的檢測試劑盒的制備。
7.根據(jù)權利要求6所述的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的應用，其特征在于用于膠體金 免疫層析法制備的肌鈣蛋白I檢測試劑盒。
8.根據(jù)權利要求7所述的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體的應用，其特征在于用于臨床上 對急性心肌梗塞疾病的輔助診斷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗肌鈣蛋白I單克隆抗體，所述抗體的輕鏈的氨基酸殘基序列如SEQ ID No.1所示，其重鏈的氨基酸殘基序列如SEQ ID No.2所示。所述的抗體是由保藏號為CCTCC NO.C201059的雜交瘤細胞株5G9A10E3分泌產(chǎn)生。本發(fā)明的抗肌鈣蛋白I單克隆抗體可應用于肌鈣蛋白I的各種檢測試劑盒的制備中。使用本發(fā)明的單克隆抗體和膠體金免疫層析法制備的檢測試劑盒，不僅使檢測靈敏度達到97.74％，檢測特異度達到94.74％，檢測準確度達到96.72％，而且使Kappa檢驗值達到0.927，遠大于0.75，與臨床診斷具有較高的診斷一致性，可用于臨床上對急性心肌梗塞疾病的輔助診斷。
文檔編號C07K16/18GK102030825SQ201010516899
公開日2011年4月27日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權日2010年10月22日
發(fā)明者周季余, 黃桂民, 黃波 申請人:上海貝西生物科技有限公司