專利名稱：?jiǎn)纬坛瑸V提取卵黃免疫球蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分離工程與技術(shù)領(lǐng)域，具體是應(yīng)用單程超濾技術(shù)從雞卵黃中快速 提取卵黃免疫球蛋白的方法，產(chǎn)品純度可達(dá)85%。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白是機(jī)體受抗原(如病原體)刺激后產(chǎn)生的，其主要作用是與抗原起免 疫反應(yīng)，生成抗原_抗體復(fù)合物，從而阻斷病原體對(duì)機(jī)體的危害，使病原體失去致病作用。卵黃免疫球蛋白(IgY)是指雞卵黃中存在的主要免疫球蛋白，是母雞在接受免疫 后的7 10天，S卩卵黃成熟期，由母雞血液中的免疫球蛋白IgG選擇性的轉(zhuǎn)移到卵黃中而 形成的。所以，IgY相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的IgG。同時(shí)，與IgG相比，卵黃免疫球蛋白(IgY)具有 諸多優(yōu)點(diǎn)(1) IgY不與血清中的類風(fēng)濕因子結(jié)合，不激活哺乳動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)，也不與Fc受 體結(jié)合，有利于提高免疫診斷檢測(cè)的特異性和敏感性；(2) IgY的性質(zhì)穩(wěn)定，活性保持良好， 在75oC以下，IgY活性基本不受影響，在pH3 12之間，活性保持不變；(3)無(wú)需采血，符合 國(guó)際動(dòng)物保護(hù)條例；(4)價(jià)廉易得，一枚雞蛋中含有的IgY的量相當(dāng)于從200mL血液中提取 的量；(5)由于種系發(fā)生距離相差很大，禽類IgY與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白之間不會(huì)發(fā)生交叉 血清學(xué)反應(yīng)。因此，近年來(lái)，許多學(xué)者及生物制品公司都在著手于IgY的分離、純化研究。目前，從卵黃中分離IgY的主要方法有鹽析法、聚乙二醇沉淀法、氯仿抽提法、中 鏈脂肪酸法、表面活性劑法等。然而這些技術(shù)均存在一定的局限性，其中，鹽析法和聚乙二 醇沉淀法容易引起蛋白質(zhì)的失活和變性；氯仿抽提法、中鏈脂肪酸法、表面活性劑法的處理 周期較長(zhǎng)，存在殘留問(wèn)題，不利于IgY的藥用。膜分離法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動(dòng)力， 對(duì)雙組份或多組分的混合物進(jìn)行分離、提純和富集的方法。膜分離技術(shù)是20世紀(jì)50年代 發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高效分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比，具有分離效率高、能耗低、可連續(xù) 操作、易于放大、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。超濾膜是指膜孔徑在1 IOOnm之間，具有不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜。由于其孔徑尺寸 與生物大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質(zhì)等的分離與純化。超濾分離 是分子級(jí)的，即可截留溶液中的大分子溶質(zhì)，同時(shí)使小分子溶質(zhì)透過(guò)；有時(shí)也可以通過(guò)調(diào)節(jié) 溶液中微環(huán)境，使預(yù)分離的蛋白質(zhì)分子和膜表面帶有不同性質(zhì)的電荷，再通過(guò)蛋白質(zhì)分子 之間、蛋白質(zhì)與膜表面之間的靜電作用，達(dá)到分離的目的。目前，在生物加工領(lǐng)域，超濾技術(shù) 常用于蛋白質(zhì)的純化與濃縮，在工業(yè)上已有較多應(yīng)用，但由于自然體系中蛋白質(zhì)種類復(fù)雜， 且存在較多的同工酶，使用超濾法直接分離得到高純度的功能蛋白質(zhì)的成功實(shí)例極少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速提取卵黃免疫球蛋白的方法。本發(fā)明采取的技術(shù)路線是1.將雞蛋的蛋殼、蛋清和卵黃膜除去，取蛋黃液；
2.使用去離子水或離子強(qiáng)度小于500mM、pH4. 0-10. 0的緩沖溶液將卵黃液稀釋至 6-15倍，最佳為7-10倍，充分?jǐn)嚢?0分鐘以上，于-20°C或更低溫度下冷凍8小時(shí)以上，解 凍、離心，取上清液；3.利用截留分子量為100-150kDa的超濾膜對(duì)步驟2得到的上清液進(jìn)行超濾分離， 分離條件為溶液PH值4-10，離子強(qiáng)度0-1M，截留液即為高純度的卵黃免疫球蛋白溶液；4.將所得到的卵黃免疫球蛋白(IgY)溶液凍干，即獲卵黃免疫球蛋白(IgY)干粉。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1，從黃皮雞蛋中提取卵黃免疫球蛋白(IgY)的方法，步驟1.取四個(gè)新鮮的黃皮雞蛋，用自來(lái)水洗凈蛋殼，再用紙擦干，去除蛋殼和蛋清后， 用注射器針頭輕輕將蛋黃膜刺破，收集蛋黃液，約50mL ；2.使用去離子水將上述步驟獲得的50mL卵黃液稀釋至350mL，充分?jǐn)嚢?0分鐘 后，置于_20°C冷凍8小時(shí)，解凍，解凍液在4°C下、用3000rpm離心，取上清液，約300mL ；3.利用截留分子量為IOOkDa的聚砜膜對(duì)步驟2得到的上清液進(jìn)行超濾分離，分離 條件為4°C、pH6.0，截留液即為卵黃免疫球蛋白(IgY)溶液(約160!1^)，純度82.5% ；4.將得到的IgY溶液置于_60°C冷阱中凍干8小時(shí)，獲得IgY干粉約541mg。實(shí)施例2，從白皮雞蛋中提取卵黃免疫球蛋白(IgY)的方法，步驟1.取三個(gè)新鮮的白皮雞蛋，用自來(lái)水洗凈蛋殼，再用紙擦干，去除蛋殼和蛋清后， 用注射器針頭輕輕將蛋黃膜刺破，收集蛋黃液，約38mL ；2.使用pH4. OUOOmM的磷酸鹽緩沖溶液將上述步驟獲得的卵黃液稀釋至380mL， 充分?jǐn)嚢?0分鐘后，置于_20°C冷凍12小時(shí)，解凍，將解凍液在4°C下、用6000rpm離心，取 上清液，約320mL ；3.利用截留分子量為IOOkDa的再生纖維素膜對(duì)步驟2得到的上清液進(jìn)行超濾 分離，分離條件為4°C、pH8.0，取截留即為卵黃免疫球蛋白(IgY)溶液液(約170mL)，純度 84% ；4.將得到的IgY溶液置于_60°C冷阱中凍干12小時(shí)，獲得IgY干粉約415mg。實(shí)施例3，從雞蛋中提取卵黃免疫球蛋白(IgY)的方法，步驟1.取五個(gè)新鮮的雞蛋，用自來(lái)水洗凈蛋殼，再用紙擦干，去除蛋殼和蛋清后，用注 射器針頭輕輕將蛋黃膜刺破，收集蛋黃液，約60mL ；2.使用pH10. 0、400mM的磷酸鹽緩沖溶液將上述步驟獲得的卵黃液稀釋至420mL， 充分?jǐn)嚢?5分鐘后，置于-20°C冷凍10小時(shí)，解凍，將解凍液在4°C下用5000rpm離心，取 上清液，約360mL ；3.利用截留分子量為150kDa的聚醚砜膜對(duì)步驟2得到的上清液進(jìn)行超濾分離，分 離條件為4°C、pH7. 0，取截留液即為卵黃免疫球蛋白(IgY)溶液液(約200mL)，純度80% ；4.將得到的IgY溶液置于_60°C冷阱中凍干11小時(shí)，獲得IgY干粉約642mg。
權(quán)利要求
一種快速提取卵黃免疫球蛋白的方法，是以截留分子量為100 150kDa的超濾膜超濾處理卵黃免疫球蛋白的粗酶液，最終獲得較高純度的黃免疫球蛋白；所述黃免疫球蛋白的粗酶液是將蛋黃液經(jīng)稀釋、凍融、離心后得到的上清液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取黃免疫球蛋白的方法，其特征在于所述用截留分子量 為100-150kDa的超濾膜處理時(shí)，溶液pH值4_10，離子強(qiáng)度0-1M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取黃免疫球蛋白的方法，其特征在于所述用截留分 子量為100-150kDa的超濾膜的組件形式為中空纖維素膜、平板膜或卷式膜。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、快速提取卵黃免疫球蛋白的方法，屬于生物分離工程技術(shù)領(lǐng)域，主要是應(yīng)用超濾分離技術(shù)，經(jīng)過(guò)稀釋、凍融、離心和單程超濾四個(gè)步驟，即可從卵黃中提取卵黃免疫球蛋白，在提取過(guò)程中，未使用有機(jī)溶劑，有效避免了有機(jī)溶劑引起的蛋白變性，杜絕了溶劑殘留造成的產(chǎn)品安全隱患。
文檔編號(hào)C07K1/34GK101955529SQ20101050445
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者劉建國(guó), 呂建仁, 崔占峰 申請(qǐng)人:中國(guó)石油大學(xué)(華東)