專利名稱：一種固相制備布舍瑞林的方法
一種固相制備布舍瑞林的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽的合成方法，尤其涉及布舍瑞林固相合成的方法。背景技術(shù)：
過去10年來，多肽類藥品已成為國際藥學(xué)界研究的熱門課題，并已成為許多廠商 競相開發(fā)的目標(biāo)。據(jù)一家著名國際醫(yī)藥技術(shù)咨詢公司透露目前全球多肽類藥物的原料藥 總產(chǎn)值估計(jì)為4億美元左右。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國際市場上現(xiàn)有多肽類藥物約35種，其中暢銷產(chǎn)品 包括布舍瑞林、亮丙瑞林、戈瑞林、促黃體激素拮抗劑以及羅氏多肽類新藥Fuzeon等。還 有幾種抗SARS病毒、HIV病毒的活性肽類新藥即將被美國FDA批準(zhǔn)上市。不僅美國公司在 開發(fā)多肽類新藥，一些傳統(tǒng)歐洲制藥強(qiáng)國如瑞士、瑞典、荷蘭、法國、德國和英國均在大力開 發(fā)活性肽類新藥。其中布舍瑞林(Buserelin)、亮丙瑞林(Leuprorelin)、戈舍瑞林(Goserelin)、 曲普瑞林(Triptorelin)、阿拉瑞林(Alarelin)、戈那瑞林(Gonadorelin)、舍莫瑞林 (Sermorelin)、那法瑞林(Nafarelin)和組胺瑞林(Histrelin)屬于促黃體生成素釋放激 素(LHRH)類似物，該類研究較為成熟。LHRH是由下丘腦分泌的十肽激素，能促進(jìn)垂體合成并釋放黃體生成素(LH)和卵 泡刺激素(FSH)，激發(fā)青春期發(fā)育和調(diào)節(jié)生殖、生育及性激素產(chǎn)生。當(dāng)外源性LHRH或其類似 物以生理脈沖頻率(每90分鐘一次)短期、小劑量給藥時(shí)，對垂體性腺系統(tǒng)起促進(jìn)作用，用 于治療性功能低下、不排卵、青春期延緩；而以非生理脈沖頻率長期、大劑量給藥時(shí)，可抑制 垂體分泌LH和FSH，導(dǎo)致性腺分泌激素能力下降，性器官萎縮，用于治療一些激素依賴性疾 病，如前列腺癌、子宮肌瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位癥及青春期性早熟。所以說布舍瑞林(Buserelin)及其類似物具有很高的藥用價(jià)值和廣闊的市場前 景，但現(xiàn)有的制備方法主要是液相合成工藝，操作復(fù)雜，不利于工業(yè)生產(chǎn)、應(yīng)用價(jià)值不高，于 是要求有更優(yōu)異的生產(chǎn)工藝。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種高收率、低成本、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、有利于實(shí) 現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的布舍瑞林固相合成方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種制備布舍瑞林的方法，包括以下 步驟1)用固相合成方法由Fmoc-Pro-OH和取代度為0. 2mmol/g至0. 9mmol/g的 HMPB-MBHA 樹脂出發(fā)，得到取代度為 0. 15mmol/g 至 0. 80mmol/g 的 Fmoc-Pro-HMPB-MBHA 樹 脂；2)將Fmoc-Pro-HMPB-MBHA樹脂依肽序逐步偶聯(lián)剩余的保護(hù)氨基酸得到布舍瑞 林-HMPB-MBHA 樹脂；3)將布舍瑞林-HMPB-MBHA樹脂進(jìn)行裂解，得到全保護(hù)肽；
4)得到的全保護(hù)肽經(jīng)過經(jīng)過乙胺化、脫保護(hù)、純化，得到布舍瑞林。進(jìn)一步地，上述的布舍瑞林的固相合成工藝，其中，步驟1)優(yōu)選生成取代度為 0. 60mmol/g的Fmoc-Pro-HMPB-MBHA樹脂。固相合成方法特指多肽的固相合成法。發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)，采用HMPB-MBHA樹脂可以在弱酸條件就能把肽切割下來，可 以使全保護(hù)肽不被破壞，能滿足做全保護(hù)肽的需要。發(fā)明人經(jīng)過多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)樹脂取代度大于0.9mmol/g時(shí)，難以偶聯(lián)完 全；當(dāng)樹脂取代度小于0. 2mmol/g時(shí)，會造成樹脂浪費(fèi)，并發(fā)現(xiàn)取代度為0. 60mmol/g時(shí)，產(chǎn) 品收率最高，純度最好。故本發(fā)明采用的HMPB-MBHA樹脂取代度為0. 2mmol/g至0. 9mmol/ g，優(yōu)選取代度為0. 60mmol/go更進(jìn)一步地，上述的布舍瑞林的固相合成工藝，其中，步驟2)中氨基酸的偶聯(lián)劑 體系為 DIC+A 或 B+A 或 B+A+C 或 C，其中 A 為 HOBt 或 HOAt，B 為 HBTU、HATU、TBTU 或 PyBOP， C為DIPEA或TMP。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的多種偶聯(lián)劑體系，能夠顯著提高反應(yīng)效率。本 發(fā)明偶聯(lián)體系能提高反應(yīng)速度，讓反應(yīng)進(jìn)行得更徹底，避免了二次偶聯(lián)。依肽序逐步偶聯(lián)采用的有機(jī)堿包括TMP或DIPEA，采用DIPEA或TMP替代，這樣能 防止消旋?！氨Ｗo(hù)氨基酸”是指N端采用Fmoc保護(hù)的氨基酸，各種氨基酸分別以Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Arg(HCl)-OH、Fmoc-Leu-OH Fmoc-D-Ser(tBu) _0H、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser (Trt)_0H、 Fmoc-Trp-0H、Fmoc-His (Trt)-OH和pGlu的形式應(yīng)用。在接氨基酸過程中每一步都經(jīng)過 Kaiser Test 檢測。再進(jìn)一步地，上述的布舍瑞林的固相合成工藝，其中，步驟3)裂解試劑是三氟乙 酸的二氯甲烷溶液。布舍瑞林-HMPB-MBHA樹脂進(jìn)行裂解后，可以用冰乙醚進(jìn)行沉淀。全保 護(hù)肽是指 pGlu-His (Trt) -Trp-Ser (Trt) -Tyr-D-Ser (tBu) -Leu-Arg (HCl) -Pro-OH 粗肽，所 述“粗肽”的HPLC純度> 90 %。Fmoc保護(hù)基通過哌啶處理來除去。步驟3)裂解試劑是三氟乙酸的二氯甲烷溶液。步驟4)所述“純化”是指全保護(hù)肽經(jīng)過液相甲酯化、氨解、再脫保護(hù)，高效液相純 化。脫保護(hù)所使用的裂解試劑是三氟乙酸的二氯甲烷溶液。本發(fā)明合成方法總收率達(dá)到35%，反應(yīng)操作簡單、后處理容易、原料投入少，低成 本的固相合成工藝，且與原有的純液相合成工藝比較，具有中間步驟不用純化、操作簡單、 反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明總的工藝流程如下HMPB-MBHA Resin + Fmoc-Pro-OH - Fmoc-Pro-HMPB-MBHA Resin
20%哌啶/DMF偶聯(lián)__
-H-Pro-HMPB-MBHA Resin+ Fmoc-Arg(HCl)-OH DIC+A or B+A+C~
20%哌啶/DMF 偶聯(lián) Fmoc-Arg(HCl)-Pro-HMPB-MBHA Resin -- -^ *
3-9貧基酸
pGIu-HisUr^-Trp-SerCTrO-Tyr-D-SeittBiO-Leu-ArgiHCD-Pro-HMPB-MBHA Resin 麵 ，pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-OH ~ pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-OMe -
pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHC2H5__
CrudeBuserelin 純化--Buserelin上述流程中3-9氨基酸是指第三到第九個(gè)氨基酸。
具體實(shí)施方式
下面給出實(shí)施例以對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用 于對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人 員根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。說明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫的含義列于下表中
Fmoc9_芴甲氧羰基HBTU0-苯并三唑-N，N, N, N-四甲基脲鐺六氟磷酸鹽HATU0-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N，N, N, N-四甲基脲鐺六氟磷酸鹽TBTU0-(苯并三唑-1-氧)-N, N, N, N-四甲基脲鐺六氟硼酸鹽PyBOP(苯并三唑-ι-氧)三吡咯烷子基磷鐺六氟磷酸鹽DIC二異丙基碳二亞胺HOBt1-羥基苯并三唑
權(quán)利要求
一種固相制備布舍瑞林的方法，包括以下步驟1)用固相合成方法由Fmoc Pro OH和取代度為0.2mmol/g至0.9mmol/g的HMPB MBHA樹脂出發(fā)，得到取代度為0.15mmol/g至0.80mmol/g的Fmoc Pro HMPB MBHA樹脂；2)將Fmoc Pro HMPB MBHA樹脂依肽序逐步偶聯(lián)剩余的保護(hù)氨基酸得到布舍瑞林 HMPB MBHA樹脂；3)將布舍瑞林 HMPB MBHA樹脂進(jìn)行裂解，得到全保護(hù)肽；4)得到的全保護(hù)肽經(jīng)過乙胺化、脫保護(hù)、純化，得到布舍瑞林。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟1)的Fmoc-Pro-OH與HMPB-MBHA樹脂 在DIPEA的作用下生成Fmoc-Pro-HMPB-MBHA樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟1)得到取代度為0.60mmol/g的 Fmoc-Pro-HMPB-MBHA 樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于步驟1)得到取代度為0.60mmol/g的 Fmoc-Pro-HMPB-MBHA 樹脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于步驟2)中采用的偶聯(lián)劑包括 DIC/HOBt、DIC/HOAt、PyB0P/H0Bt、TBTU/HOBt、HBTU/HOBt 或 HATU/HOAt。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于步驟2)中偶聯(lián)采用的有機(jī)堿 包括TMP或DIPEA。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于步驟2)中偶聯(lián)采用的有機(jī)堿包括TMP或 DIPEA0
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟3)的裂解采用的是三氟乙醇的二氯甲 烷溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于=Fmoc保護(hù)基通過哌啶處理來除去。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種固相制備布舍瑞林的方法，包括以下步驟1)用固相合成方法由Fmoc-Pro-OH和取代度為0.2mmol/g至0.9mmol/g的HMPB-MBHA樹脂出發(fā)，得到取代度為0.15mmol/g至0.80mmol/g的Fmoc-Pro-HMPB-MBHA樹脂；2)將Fmoc-Pro-HMPB-MBHA樹脂依肽序逐步偶聯(lián)剩余的保護(hù)氨基酸得到布舍瑞林-HMPB-MBHA樹脂；3)將布舍瑞林-HMPB-MBHA樹脂進(jìn)行裂解，得到全保護(hù)肽；4)得到的全保護(hù)肽經(jīng)過乙胺化、脫保護(hù)、純化，得到布舍瑞林。本發(fā)明的目的是提供一種高收率、低成本、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的布舍瑞林固相合成方法。
文檔編號C07K1/14GK101935339SQ20101025605
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者李紅玲, 袁建成, 陳大來, 馬亞平 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司