固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種固相萃取?液質(zhì)串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法，旨在提供一靈敏度高，檢測時間短的固相萃取?液質(zhì)串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法；該方法依次包括下述步驟：1)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液；2)取脂必妥片0.5g粉碎，置10ml錐形瓶中，加3ml 1％甲酸?甲醇溶液，50℃，310W超聲波提取20min，冷卻，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過濾，以1ml/min流速通過分別以3ml乙醇和3ml水活化的C18固相萃取小柱，用5ml水淋洗，棄去，再用5ml乙醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40℃下氮吹至近干，精密加入1ml乙醇溶解，用0.22μm有機濾膜過濾，即得待測樣品，將待測樣品上Agilent1295?6550C三重四級桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測；屬于化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【專利說明】
固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明提供一種桔霉素的檢測方法，具體的說是一種固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測必 妥片中桔霉素的方法;屬于化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 桔霉素(citrinin)是1931年首次從青霉菌Penicillium citrinum中分離得到。其 分子式為C13H14O5，分子量為250.25。桔霉素有一定的腎毒性和肝毒性，能致畸、引發(fā)腫瘤及 誘發(fā)突變。而紅曲是中國傳統(tǒng)藥材，是用特有的紅曲霉菌在大米中培養(yǎng)發(fā)酵而成。因某些紅 曲霉菌株能產(chǎn)生具有抑制膽固醇生物合成的他汀類物質(zhì)，因而中藥紅曲被開發(fā)為降血脂的 國脂必妥片和保健食品。在1995年法國學(xué)者Blanc等首次發(fā)現(xiàn)了紅曲產(chǎn)品中含有桔霉素后， 國外已將桔霉素作為食品污染的嚴(yán)格控制指標(biāo)。而在中國，中國藥典尚未將桔霉素作為含 紅曲中成藥的控制指標(biāo)。
[0003] 對于國脂必妥片一一脂必妥片有文獻記載用RP-HPLC法測定其桔霉素含量，而在 食品、保健食品中也有桔霉素的檢測方法:薄層層析法、熒光分光光度法、高效液相色譜法 等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高，分析時間短的固相萃取-液質(zhì) 串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法桔霉素的方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
[0006] -種固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法，所述的檢測方法包括下述 步驟：1)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液;2)取脂必妥片0.5g粉碎，置10ml錐形瓶中，加3ml 1 %甲酸-甲醇溶 液，50°C，310W超聲波提取20min，冷卻，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度， 搖勻后過濾，以lml/min流速通過分別以3ml乙醇和3ml水活化的C18固相萃取小柱，用5ml水 淋洗，棄去，再用5ml乙醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮吹至近干，精密加入lml乙醇 溶解，用〇. 22_有機濾膜過濾，即得待測樣品，將待測樣品上Agi 1 ent 1295-6550C三重四級 桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。
[0007] 進一步的，上述的一種固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法，所述的制 備標(biāo)準(zhǔn)溶液包括下述步驟：
[0008] 1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
[0009] 標(biāo)準(zhǔn)儲備液:精密稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5mg，置5ml容量瓶中，加乙醇溶解并至刻度，使成 濃度為lmg/ml;
[0010] 標(biāo)準(zhǔn)稀釋液:精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液〇.2ml，置50ml的容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，使 成濃度為2μg/mll;
[0011] 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：取標(biāo)準(zhǔn)稀釋液液適量加乙醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、5、 20ng/ml標(biāo)準(zhǔn)工作液。
[0012]進一步的，上述的固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法，所述的液相色 譜與質(zhì)譜條件色譜柱:Agilent poroshell 120EC-C18,3.0X50mm 2.7micron，1.8iim;流動 相A為0.2%磷酸，流動相B為甲醇，采用梯度洗脫程序如下:0-3min，A、75-5 %，B、25-95 % ; 3-5.5min，A、5%，B、95%;5.5.-5.6min，A、75%，B、25% ;流速0.2ml/min;柱溫40°C;進樣量 2yl;電噴霧源ESI，正離子方式，選擇多反應(yīng)監(jiān)測MRM，載氣溫度：150°C，載氣流量：15L/ min，霧化器壓力40psi，鞘氣溫度300°C，鞘氣流量：12L/min，毛細(xì)管電壓3500V，定性定量離 子:母離子m/z = 251.2，子離子m/z233.2和m/z 205.2，碰撞能量分別為5V和20V。
[0013]本文建立了含紅曲國脂必妥片的桔霉素液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，本方法在6min 內(nèi)完成了對該物質(zhì)的分析測定，在保證定性定量準(zhǔn)確的情況下，實現(xiàn)了高靈敏的分析，并在 提取過程中減少了甲苯等有毒試劑的使用，具有高效、環(huán)保等特點，可為國脂必妥片中的桔 霉素監(jiān)測提供技術(shù)支撐。
【附圖說明】
[0014]圖1是2μg/ml桔霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測圖。
[0015] 圖2是空白樣品的多反應(yīng)監(jiān)測圖。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對 本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的 權(quán)利要求保護范圍之內(nèi)。
[0017] 實施例i [0018] 1 材料
[0019] 1.1儀器
[0020] Agi lent 1295-6550C三重四級桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent )、HLB-SPE柱 (60mg/3ml，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus(2.1X50mm，1.8 Mi;美國Agi 1 ent)、XA20OTU電子天平(德國梅特勒托利多公司）、超聲波清洗器。
[0021] 1.2國脂必妥片與試劑
[0022]國脂必妥片4批，均來源于市場銷售樣品。
[0023] 桔霉素（批號：518-75-2-150403,標(biāo)準(zhǔn)品購于Pribolab，純度>98%)，乙醇和甲醇 均為色譜純，其它試劑均為分析純，實驗用水為經(jīng)ELGA PURELAB ClassicUVF凈化系統(tǒng)過濾 的去離子水。
[0024] 本發(fā)明所涉及到的百分濃度，沒有特別說明的，液體均為體積濃度，溶質(zhì)為固體的 指質(zhì)量濃度。
[0025] 2方法與結(jié)果 [0026] 2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
[0027] 2.1.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液:精密稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5mg，置5ml容量瓶中，加乙醇溶解并至刻度， 使成濃度為lmg/ml。
[0028] 2.1.2標(biāo)準(zhǔn)稀釋液:精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2ml，置50ml的容量瓶中，加乙醇稀釋至刻 度，使成濃度為2μg/ml，檢測結(jié)果見見圖1。
[0029] 2.1.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：取標(biāo)準(zhǔn)稀釋液液適量加乙醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、 5、20ng/ml標(biāo)準(zhǔn)工作液。
[0030] 2.2樣品前處理
[0031] 2)取脂必妥片0.5g粉碎，置10ml錐形瓶中，加3ml 1 %甲酸-甲醇溶液，50°C，310W 超聲波提取20min，冷卻，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過濾，待 測。
[0032] 2.3樣品凈化
[0033]將上述樣品前處理液，以約lml/min流速通過C18固相萃取小柱(使用前分別以3ml 乙醇和3ml水活化），用5ml水淋洗，棄去，再用5ml乙醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮 吹至近干，精密加入lml乙醇溶解，用0.22mi有機濾膜過濾，即得待測樣品。
[0034] 2.4液相色譜與質(zhì)譜條件
[0035]色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱（2 ? 1 X 50mm，1 ? 8_);流動相A為0 ? 2% 磷酸，流動相B為甲醇，采用梯度洗脫程序，見表1。流速0.2ml/min;柱溫40 °C ;進樣量2yl;電 噴霧源(ESI)，正離子方式，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，載氣溫度：150°C，載氣流量：15L/min，霧 化器壓力40psi，鞘氣溫度300°C，鞘氣流量：12L/min，毛細(xì)管電壓3500V，定性定量離子:母 離子m/z = 251.2(M+1)，子離子m/z233.2和m/z 205.2，碰撞能量分別為5V和20V，F(xiàn)rag均為 380V〇
[0036]表1梯度洗脫程序
[0037] Tab 1 Gradient elution program
[0039] 2.5實際樣品的測定
[0040]在本試驗中，以定量離子峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)系列的回歸方程計算，結(jié)果國脂必妥片4 批，均未檢出桔霉素。
[0041 ] 2.4方法的準(zhǔn)確度
[0042]在經(jīng)測定不含有桔霉素的二種基質(zhì)的空白樣品中進行加標(biāo)回收率試驗，加標(biāo)濃度 為5ng/ml。平行測定6次，得到的平均加標(biāo)回收率液體制劑范圍為95%~50%，參見圖2。 [0043]本發(fā)明提供的技術(shù)方案用水(含0.2 %磷酸)+甲醇=75+25作流動相，流速0.3ml/ min，桔霉素的色譜峰對稱，采用串聯(lián)質(zhì)譜檢測器進行檢測，由于串聯(lián)質(zhì)譜具有在分離、高分 辨能力和靈敏度高的特性，配合多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)及母離子和兩個相應(yīng)的子離子進行 監(jiān)測，達到了準(zhǔn)確的定性和定量的目的，簡化了對流動相選擇的步驟，所以本方法選用了上 述流動相及其比例。
[0044]為了解本方法采用C18固相萃取小柱對樣品中的桔霉素進行凈化后，在測定時對 質(zhì)譜檢測的基質(zhì)干擾情況，選擇一個未檢出桔霉素的樣品按方法進行萃取作基質(zhì)液，并加 入標(biāo)準(zhǔn)系列，同時對外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)系列進行質(zhì)譜測定，根據(jù)保留時間對應(yīng)的定量離子峰面積與 其濃度進行回歸分析，得基質(zhì)液加標(biāo)準(zhǔn)系列的回歸方程為Y = 3298.522531X+4528.423351， r = 0.9994,與外標(biāo)回歸方程 Y = 3329.186799X+4586.551631 (r = 0.9994)進行比較，兩者無 實質(zhì)性差異，表明C18固相萃取小柱對樣品基質(zhì)有明顯凈化作用。
[0045]本文建立了含紅曲國脂必妥片的桔霉素液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，本方法在6min 內(nèi)完成了對該物質(zhì)的分析測定，在保證定性定量準(zhǔn)確的情況下，實現(xiàn)了高靈敏的分析，并在 提取過程中減少了甲苯等有毒試劑的使用，具有高效、環(huán)保等特點，可為國脂必妥片中的桔 霉素監(jiān)測提供技術(shù)支撐。
【主權(quán)項】
1. 一種固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法，其特征在于，所述的檢測方法 包括下述步驟：1)制備標(biāo)準(zhǔn)溶液；2)取脂必妥片O . 5g粉碎，置IOml錐形瓶中，加3ml 1 %甲 酸-甲醇溶液，50°C，3IOW超聲波提取20min，冷卻，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用水定 容至刻度，搖勻后過濾，以lml/min流速通過分別以3ml乙醇和3ml水活化的C18固相萃取小 柱，用5ml水淋洗，棄去，再用5ml乙醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮吹至近干，精密加 入Iml乙醇溶解，用0.22μπι有機濾膜過濾，即得待測樣品，將待測樣品上Agilentl295-6550C 三重四級桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法，其特征在 于，所述的制備標(biāo)準(zhǔn)溶液包括下述步驟： 1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 標(biāo)準(zhǔn)儲備液:精密稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5mg，置5ml容量瓶中，加乙醇溶解并至刻度，使成濃度 為lmg/ml; 標(biāo)準(zhǔn)稀釋液:精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液〇. 2ml，置50ml的容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，使成濃 度為 2μg/mll; 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：取標(biāo)準(zhǔn)稀釋液液適量加乙醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、5、20ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)工作液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法，其特征在 于，所述的液相色譜與質(zhì)譜條件色譜柱：Agilent poroshell 120EC-C18,3.0X50mm 2.7micron，1.8μηι;流動相A為0.2 %磷酸，流動相B為甲醇，采用梯度洗脫程序如下:0-3min， A、75-5%，B、25-95% ;3-5.5min，A、5%，B、95% ;5.5.-5.6min，A、75%，B、25%;流速0.2ml/ min;柱溫40°C ;進樣量2μ1;電噴霧源ESI，正離子方式，選擇多反應(yīng)監(jiān)測MRM，載氣溫度：150 。(：，載氣流量：15L/min，霧化器壓力40psi，鞘氣溫度300 °C，鞘氣流量：12L/min，毛細(xì)管電壓 3500V，定性定量離子:母離子m/z = 251.2，子離子m/z233.2和m/z 205.2，碰撞能量分別為 5V和20V。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測必妥片中桔霉素的方法桔，其特征在 于，所述的C18固相萃取小柱使用前分別以3ml乙醇和3ml水活化。
【文檔編號】G01N30/02GK105929037SQ201610234683
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】陳學(xué)松, 羅達龍, 王 華
【申請人】廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗所