專利名稱：感染抑制劑的制作方法
感染抑制劑本發(fā)明涉及白斑綜合征(White Spot Syndrome)病毒蛋白和編碼所述蛋白的白斑 綜合征病毒核酸分子。本發(fā)明還涉及包含所述蛋白的組合物、其在疫苗中的用途、包含所述 蛋白的疫苗和用于檢測白斑綜合征病毒特異性DNA或抗原性物質(zhì)的診斷測試。最后本發(fā)明 涉及抗所述蛋白的抗體。白斑綜合征病毒(WSSV)是養(yǎng)殖的對(duì)蝦(penaeid Shrimp)中涉及主要經(jīng)濟(jì)重要性 的病原體。該病毒不僅存在于蝦中而且還存在于其他淡水和海洋甲殼類動(dòng)物(包括蟹和鰲 蝦)中。在養(yǎng)殖的蝦中，WSSV感染可在3-10天內(nèi)達(dá)到直至100%的累積死亡率，從而可對(duì) 蝦養(yǎng)殖工業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病毒特別地在90年代初發(fā)現(xiàn)于中國，并從中國很快地 傳播至東南亞的其他蝦養(yǎng)殖區(qū)。在其于1995年11月在Texas和South-Carolina被發(fā)現(xiàn) 之前，WSSV最初顯示局限于亞洲。在1999年初，中部和南部美洲也報(bào)導(dǎo)了 WSSV并且現(xiàn)已 在歐洲檢測到WSSV。密集的蝦養(yǎng)殖、不充分的衛(wèi)生設(shè)施和世界貿(mào)易已增加甲殼類動(dòng)物的發(fā) 病率和增強(qiáng)了疾病傳播。因此，WSS已成為動(dòng)物流行病并且不僅是對(duì)蝦養(yǎng)殖的主要威脅而 且還是對(duì)海洋生態(tài)的主要威脅。該疾病是必須向0.1. E.申報(bào)的。WSSV是大的DNA病毒。WSSV病毒體廣泛地在感染的蝦的血淋巴中循環(huán)。電子顯 微術(shù)研究顯示W(wǎng)SSV病毒體是長度為大約275nm和寬度為大約120nm的桿狀至卵形形狀的 包膜顆粒。最顯著的特征是懸浮時(shí)在病毒體的一個(gè)末端上的尾樣附屬物。病毒顆粒包含至少6種主要病毒體蛋白(其中3種(VP664、VP26、VP24和VP15) 存在于桿狀核殼體中，且2種(VP^和VP19)存在于包膜中)和大約40種次要蛋白。已測定了 WSSV 的全基因組序列(Van Hulten 等人，Virology 286 ；7-22 (2001), Yang 等人，J. Virol. 75 ； 11811-1182(^2001)，Chen 等人，Virology 293 ；44-53 (2002) )。DNA 具有大約3001Λρ的大小。其包含大約180個(gè)開放閱讀框架。大部分基因編碼與任何已知 的蛋白或基序不具有相似性的蛋白(Van Hulten等人，Virology 286 ;7_22 (2001)，Yang等 人，J. Virol. 75 ； 11811-11820 (2001)) 迄今為止，特異性地保護(hù)蝦免受WSSV感染的唯一可能性是接種疫苗。大多數(shù) 實(shí)驗(yàn)疫苗基于 WSSV 包膜蛋白 VP^ (Witteveldt 等人，于 Fish Shellfish Immunol 16: 571-579(2004)中，Witteveldt 等人，于 J. Virol. 78 :2057-2061 (2004)中)。疫苗的不利方面通常是接種疫苗是為了抵抗可能發(fā)生或可能不發(fā)生的感染的預(yù) 防性行為。因此，如果感染壓力較低，那么解決感染問題的治療性方法更方便(可按需要獲 得)且更便宜。然而，對(duì)于治療目的，疫苗不是合適的選擇，因?yàn)榻㈩A(yù)防性應(yīng)答需要時(shí)間。本發(fā)明的目的是提供用于保護(hù)蝦免受WSSV感染，更具體地免受口腔感染(oral infection)的改進(jìn)的或可選擇的方法。令人驚訝地，在WSSV中發(fā)現(xiàn)編碼新型蛋白的新基因，所述蛋白經(jīng)顯示在病毒至蝦 (或更一般地；甲殼類動(dòng)物)的上皮細(xì)胞的初步附著(primary attachment)中起著至關(guān)重 要的作用。因此，該基因經(jīng)證實(shí)編碼口腔感染過程中的主要起始因子。這將在下面進(jìn)一步 闡釋。該基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO. :1中。顯然，由于在許多密碼子的第二個(gè)和第三個(gè)堿基中存在擺動(dòng)性，因此，在個(gè)體病毒之間的核苷酸序列中可存在一些變異。因此，與SEQID NO. :1中所示的核苷酸序列具有至 少90%的核苷酸序列同一性的核酸分子也被認(rèn)為代表根據(jù)本發(fā)明的新基因。核酸分子的核苷酸序列與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的核苷酸序列的“百分比核苷酸 序列同一性”可通過與SEQ ID NO 1的核苷酸序列的全部或相關(guān)部分進(jìn)行核苷酸序列比對(duì) 來測定。核酸分子與具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的核酸分子之間的同一性的百分比可 通過選擇子程序“BlastN"而用計(jì)算機(jī)程序“BLAST2SEQUENCES”進(jìn)行測定(T. htusova & T. Madden, 1999，F(xiàn)EMSMicrobiol. Letters,第 174 卷，第 247-250 頁)，所述程序可見于 互聯(lián)網(wǎng)地址www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bl2. html。使用的參數(shù)是缺省參數(shù) 匹配加分(rewa rd) :+1 ；錯(cuò)配罰分_2 ；開放缺口罰分5 ；延伸缺口罰分2 ；以及缺口 χ-dropoff :50οBlastN程序不列出相似性，只列出同一性將相同的核苷酸的百分比表示為“同一性，，。在使用計(jì)算機(jī)算法測定核酸與根據(jù)本發(fā)明的核酸之間的同一性/錯(cuò)配的水平之 后，還可使用實(shí)驗(yàn)技術(shù)。特別合適的是在受控制的嚴(yán)格性條件下進(jìn)行的雜交。作為兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性的函數(shù)，嚴(yán)格雜交條件的定義遵從Meinkoth 和Wahl的解鏈溫度Tm的公式(1984，Anal. Biochem.，第138卷，第洸7_284頁)Tm= [81. 5°C +16. 6 (log Μ)+0· 41 (% GC)_0. 61 甲酰胺)-500/L]_l°C/1%錯(cuò) 配在該公式中M是單價(jià)陽離子的摩爾濃度；％ GC是DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸 的百分比；L是堿基對(duì)形式的雜交體的長度；以及“錯(cuò)配”是同一性匹配的不存在。還可使雜交后的清洗條件更嚴(yán)格或較不嚴(yán)格，從而分別選擇更高或更低的同一性 百分比。一般地，通過降低鹽濃度和增加溫育溫度來獲得更高的嚴(yán)格性。選擇匹配通過計(jì) 算機(jī)分析確定的某一同一性百分比水平的雜交條件完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。為了本專利的目的，“嚴(yán)格條件”是在該條件下如果核酸分子具有10 %或更少的錯(cuò) 配(即如果核酸分子與SEQ ID NO :1中所述的核苷酸序列至少90%同一)則核酸分子可 雜交的條件。因此，如果核酸分子在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO 1中所述的核苷酸序列雜交，即如 果核酸分子與SEQ ID NO :1中所述的核苷酸序列至少90%同一，則其被認(rèn)為是根據(jù)本發(fā)明 的核酸分子。因此，本發(fā)明的第一實(shí)施方案涉及具有根據(jù)SEQ ID NO. :1的核苷酸序列的白斑綜 合征病毒(WSSV)核酸分子，或在嚴(yán)格條件下能與具有根據(jù)SEQ ID N0. 1的核苷酸序列的 所述核酸分子雜交的核酸分子。因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的核酸分子特異于白斑綜合征病毒，因此基于該核酸分子的診斷 測試非常適合于診斷WSSV在水中，更具體地在蝦場水池(shrimp farm basin)的水中的存 在或不存在。這樣的測試可以是上述雜交測試。其還可以是標(biāo)準(zhǔn)PCR測試。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于檢測白斑綜合征病毒特異性DNA的診斷測試，其特征在于測試包括根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或基于該核酸分子的PCR引物。標(biāo)準(zhǔn)PCR 教科書給出了確定用于使用根據(jù)本發(fā)明的WSSV DNA的選擇性PCR反應(yīng)的引物的長度的方 法。通常使用具有至少12個(gè)核苷酸的核苷酸序列的引物片段，但多于15個(gè)，更優(yōu)選18個(gè) 核苷酸的引物稍微更具選擇性。特別地具有至少20個(gè)，優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸的長度的 引物是可廣泛應(yīng)用的。PCR技術(shù)詳盡地描述于Dieffenbach & Dreksler ;PCR primers, a laboratory manual. ISBN 0-87969-447-5(1995)中。僅作為例子；此類引物可以例如包含 具有根據(jù)SEQ ID NO. :1的核苷酸序列的核酸分子的前20個(gè)和最后20個(gè)核苷酸。由具有根據(jù)SEQ ID NO. :1的核苷酸序列的核酸分子編碼的蛋白具有SEQ ID No. 2中描述的氨基酸序列。由所述基因編碼的蛋白具有大約IlOkD的分子量。蛋白的進(jìn)一步分析顯示其令 人驚訝地在WSSV中實(shí)現(xiàn)了與P74蛋白在桿狀病毒中的作用相似的作用，雖然P74蛋白要小 得多(大約74kD)。就其本身而言，這些蛋白相異如此之大的事實(shí)毫無疑問是因?yàn)闂U狀病毒 和WSSV屬于完全不同的病毒科并且具有完全不同的宿主范圍。出于下面給出的理由，根據(jù)本發(fā)明的新型蛋白也被稱為WSSV PAP，或簡稱PAP (初 /VPii^s& (Primary Attachment Protein))。WSSV PAP與類似的桿狀病毒蛋白P74在麗上的巨大差異明確地從表1得出。

圖1顯示根據(jù)本發(fā)明的WSSV PAP與桿狀病毒P74的進(jìn)化距離。WSSV PAP和桿狀 病毒P74不共有任何顯著的序列同源性。
權(quán)利要求
1.具有根據(jù)SEQID NO. 1的核苷酸序列的白斑綜合征病毒(WSSV)核酸分子或能夠 在嚴(yán)格條件下與具有根據(jù)SEQ ID NO. :1的核苷酸序列的所述核酸分子雜交的核酸分子。
2.能夠抑制WSSV與甲殼類動(dòng)物宿主細(xì)胞之間的結(jié)合的白斑綜合征病毒蛋白或所述蛋 白的片段，其特征在于所述蛋白或其片段由根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子編碼。
3.權(quán)利要求2的白斑綜合征病毒蛋白，其特征在于其具有根據(jù)SEQID NO. :2的氨基 酸序列或能夠抑制WSSV與甲殼類動(dòng)物宿主細(xì)胞之間的結(jié)合的所述蛋白的片段。
4.藥物組合物，其包含權(quán)利要求2或3的白斑綜合征病毒蛋白或所述蛋白的片段以及 藥學(xué)可接受的載體。
5.權(quán)利要求2或3的白斑綜合征病毒蛋白或其片段，其用于疫苗。
6.權(quán)利要求2或3的白斑綜合征病毒蛋白或其片段用于制造疫苗的用途，所述疫苗用 于抵抗白斑綜合征病毒感染。
7.用于抵抗白斑綜合征病毒感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含根據(jù)權(quán)利要求2或 3的白斑綜合征病毒蛋白或其片段以及藥學(xué)可接受的載體。
8.權(quán)利要求7的用于抵抗白斑綜合征病毒感染的組合疫苗，其特征在于其額外地包含 白斑綜合征病毒蛋白VP^。
9.權(quán)利要求7的用于抵抗白斑綜合征病毒感染的組合疫苗，其特征在于其額外地包含 白斑綜合征病毒蛋白VP110。
10.權(quán)利要求7的用于抵抗白斑綜合征病毒感染的組合疫苗，其特征在于其額外地包 含白斑綜合征病毒蛋白VP187。
11.用于檢測白斑綜合征病毒特異性DNA的診斷測試，其特征在于所述測試包括權(quán)利 要求1的核酸分子或基于所述核酸分子的PCR引物。
12.用于檢測白斑綜合征病毒的抗原性物質(zhì)的診斷測試，其特征在于所述測試包括抗 權(quán)利要求2或3的白斑綜合征病毒蛋白或其片段的抗體。
13.能夠結(jié)合白斑綜合征病毒蛋白或所述蛋白的片段的抗體，其特征在于所述蛋白或 其片段由權(quán)利要求1的核酸分子編碼。
14.能夠結(jié)合權(quán)利要求2或3的白斑綜合征病毒蛋白或其片段的抗體，所述抗體至少能 夠結(jié)合參與抑制WSSV與甲殼類動(dòng)物宿主細(xì)胞之間的結(jié)合的所述蛋白的片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及白斑綜合征病毒蛋白和編碼所述蛋白的白斑綜合征病毒核酸分子。本發(fā)明還涉及包含所述蛋白的組合物、其在疫苗中的用途、包含所述蛋白的疫苗和用于檢測白斑綜合征病毒特異性DNA或抗原性物質(zhì)的診斷測試。最后本發(fā)明涉及抗所述蛋白的抗體。
文檔編號(hào)C07K16/08GK102046650SQ200980119665
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者J·M·拉克 申請(qǐng)人:瓦赫寧恩大學(xué)