專利名稱：用于治療病毒感染的疊氮基嘌呤核苷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用核苷類似物來治療或預(yù)防病毒感染的化合物、方法和組合物。更具體地說，本發(fā)明描述了3’-疊氮基3’-脫氧嘌呤和改良的嘌呤核苷類似物、其藥用鹽類、藥物前體或其他衍生物，以及其在治療病毒感染，并且特別是人類免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)或乙型肝炎病毒(HBV)感染中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
核苷類似物作為一類藥物，具有廣受認(rèn)可的監(jiān)管史，其中多于10種現(xiàn)在已經(jīng)被美國食品藥品管理局(US FDA)批準(zhǔn)用于治療人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)。開發(fā)抗病毒療法的挑戰(zhàn)在于抑制病毒復(fù)制而不損傷宿主細(xì)胞。在HIV中，藥物開發(fā)的關(guān)鍵目標(biāo)是逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV-RT)，一種獨(dú)特的病毒聚合酶。該酶在病毒復(fù)制周期的早期具有活性，并將病毒的遺傳信息從RNA轉(zhuǎn)化入DNA內(nèi)，這是持續(xù)病毒復(fù)制必需的一個(gè)過程。核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)模擬天然核苷。在三磷酸形式中，每一個(gè)NRTI均與四種天然存在的2’-脫氧核苷-5’-三磷酸(dNTP)，即dCTP、TTP、dATP或dGTP之一競爭結(jié)合以及HIV-1RT活性位置附近的DNA鏈延伸。
逆轉(zhuǎn)錄是HIV-1復(fù)制周期中的一個(gè)必要事件，并且是開發(fā)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的一個(gè)主要目標(biāo)(參見Parniak MA，Sluis-Cremer N.Inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase.Adv.Pharmacol.2000，49，67-109；Painter GR，Almond MR，Mao S，Liotta DC.Biochemical andmechanistic basis for the activity of nucleoside analogue inhibitors ofHIV reverse transcriptase.Curr.Top.Med.Chem.2004，4，1035-44；Sharma PL，Nurpeisov V，Hernandez-Santiago B，Beltran T，SchinaziRF.Nucleoside inhibitors of human immunodeficiency virus type 1reverse transcriptase.Curr.Top.Med.Chem.2004，4 895-919)?，F(xiàn)在已經(jīng)鑒定了兩組不同的化合物，其能抑制HIV-1RT。它們是核苷或核苷酸RT抑制劑(NRTI)和非核苷RT抑制劑(NNRTI)。
NRTI是脫氧核糖核苷的類似物，其核糖上缺乏3’-OH基團(tuán)。它們是最早用來治療HIV-1感染的藥物，并且它們保持幾乎所有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒方案(rigimen)的完整組成。
1985年，報(bào)道了，合成的核苷3’-疊氮基-3’-脫氧胸苷(齊多夫定，AZT，一種代表性的NRTI)抑制HIV的復(fù)制。自那時(shí)起，已證實(shí)幾種其他NRTI，包括但不限于2’，3’-雙脫氧肌苷(地達(dá)諾新，ddI)，2’，3’-雙脫氧胞苷(扎西他濱，ddC)，2’，3’-雙脫氧-2’，3’-雙脫氫胸苷(司他夫定，d4T)，(-)-2’，3’-雙脫氧-3’-硫代胞苷(拉米夫定，3TC)，(-)-2’，3’-雙脫氧-5-氟代-3’-硫代胞苷(恩曲他濱，F(xiàn)TC)，(1S，4R)-4-[2-氨基-6-(環(huán)丙基-氨基)-9H-嘌呤-9-基]-2-環(huán)戊烯-1-甲醇琥珀酸鹽(阿巴卡韋，ABC)，(R)-9-(2-膦酰甲氧丙基)腺嘌呤(PMPA，富馬酸替諾福韋二吡呋酯)(TDF)和(-)-碳環(huán)2’，3’-雙脫氫-2’，3’-雙脫氧鳥苷(卡波佛)及其藥物前體阿巴卡韋可有效抗HIV。通過細(xì)胞激酶磷酸化為5’-三磷酸酯(或鹽)后，這些NRTI整合入正形成的病毒DNA鏈中而引起鏈終止，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈?’-羥基基團(tuán)。某些三磷酸酯形式的核苷還抑制病毒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。
通常，為了表現(xiàn)出抗病毒活性，NRTI必須通過宿主細(xì)胞激酶代謝轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的三磷酸酯形式(NRTI-TP)。該NRTI-TP通過作為DNA合成的鏈終止劑而抑制HIV-1RT DNA合成(參見GoodyRS，Muller B，Restle T.Factors contributing to the inhibition of HIVreverse transcriptase by chain terminating nucleotides in vitro and invivo.FEBS Lett.1991，291，1-5)。盡管包含一種或多種NRTI的組合療法已經(jīng)廣泛降低了與AIDS相關(guān)的發(fā)病率和死亡率，但已批準(zhǔn)的NRTI可能還具有明顯的局限性。它們包括急性和慢性毒性、與其他抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的藥動(dòng)學(xué)相互作用以及選擇對(duì)其他NRTI表現(xiàn)出交叉耐藥性的HIV-1的耐藥變體。
個(gè)體的HIV-1耐藥性來自于該病毒群體的遺傳變異性以及治療對(duì)耐藥變體的選擇(參見Chen R，Quinones-Mateu ME，Mansky LM.Drug resistance，virus fitness and HIV-1 mutagenesis.Curr.Pharm.Des.2004，10，4065-70)。HIV-1遺傳變異性是由于復(fù)制過程中HIV-1RT無法校正核苷酸序列引起的。該變異性隨著高速HIV-1復(fù)制、HIV-1感染過程中前病毒變體的累積以及不同序列病毒感染同一細(xì)胞時(shí)的遺傳重組而增加。結(jié)果，初次感染后幾年內(nèi)個(gè)體體內(nèi)會(huì)發(fā)展無數(shù)種遺傳不同的變體(稱為準(zhǔn)種)。耐藥性的發(fā)展依賴于藥物治療過程中病毒復(fù)制持續(xù)的程度、獲得特定突變(或一組突變)的容易性以及耐藥性突變對(duì)藥物易感性和病毒適合度的影響。通常，對(duì)于具有RT突變的病毒選擇NRTI療法。取決于所選擇的NRTI耐藥性突變，該突變病毒通常表現(xiàn)出對(duì)某些或者在某些情況下對(duì)所有NRTI的易感性降低。從臨床角度，耐藥性HIV-1的發(fā)展通過有效地減少可采用的保留了針對(duì)耐藥性病毒的效力的藥物數(shù)量而限制了未來的治療選擇。這經(jīng)常需要更復(fù)雜的藥物方案，其涉及強(qiáng)化劑量方案并且由于藥物毒性引起的嚴(yán)重副作用的風(fēng)險(xiǎn)增大。這些因素經(jīng)常造成對(duì)藥物方案的不完全依從性。因此，具有優(yōu)異的活性和安全性以及與目前可用的藥物具有有限或無交叉耐藥性的新型NRTI的開發(fā)對(duì)于HIV-1感染的有效治療是非常關(guān)鍵的。
對(duì)耐藥性HIV-1具有活性的核苷類似物的開發(fā)需要詳細(xì)了解對(duì)該類化合物耐藥所涉及的分子機(jī)制。因此，我們提供了HIV-1對(duì)NRTI耐藥的突變和分子機(jī)制的簡單總結(jié)?，F(xiàn)在已經(jīng)提出了HIV-1對(duì)NRTI的耐藥性的兩種動(dòng)力學(xué)不同的分子機(jī)制(參見Sluis-CremerN，Arion D，Parniak MA.Molecular mechanisms of HIV-1 resistance tonucleoside reverse transcriptase inhibitors(NRTIs).Cell Mol.Life Sci.2000；57，1408-22)。一種機(jī)制涉及病毒DNA合成過程中NRTI-TP對(duì)正常dNTP摻入的選擇性減少。這種耐藥機(jī)制已命名為辨別。第二種機(jī)制涉及從過早終止的DNA鏈上選擇性去除鏈終止性NRTI單磷酸酯(NRTI-MP)(參見Arion D，Kaushik N，McCormick S，Borkow G，Parniak MA.Phenotypic mechanism of HIV-1 resistance to3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)increased polymerizationprocessivity and enhanced sensitivity to pyrophosphate of the mutantviral reverse transcriptase.Biochemistry.1998，37，15908-17；MeyerPR，Matsuura SE，Mian AM，So AG，Scott WA.A mechanism of AZTresistancean increase in nucleotide-dependent primer unblocking bymutant HIV-1 reverse transcriptase.Mol.Cell.1999，4，35-43)。該機(jī)制已經(jīng)命名為切除(或切割)。
所述辨別機(jī)制涉及在RT中獲得一個(gè)或多個(gè)耐藥性突變，從而提高了該酶在天然dNTP底物與NRTI-TP之間辨別的能力。在這點(diǎn)上，耐藥性通常與NRTI-TP摻入的降低的催化效率相關(guān)。NRTI-TP(和dNTP)催化效率受兩個(gè)動(dòng)力學(xué)參數(shù)驅(qū)動(dòng)，(i)核苷酸與RT聚合酶活性位點(diǎn)的親和性(Kd)和(ii)核苷酸摻入的最大速率(kpol)，兩個(gè)參數(shù)均可利用前穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析來確定(參見Kati WM，Johnson KA，Jerva LF，Anderson KS.Mechanism and fidelity of HIVreverse transcriptase.J.Biol.Chem.1992，26，25988-97)。通常，NRTI-TP辨別通過僅影響這些動(dòng)力學(xué)參數(shù)之一的耐藥性突變而實(shí)現(xiàn)，如下文所述。
a)K65RHIV-1RT中的K65R突變降低了對(duì)除AZT之外所有FDA批準(zhǔn)的NRTI的易感性(參見Parikh UM，Koontz DL，ChuCK，Schinazi RF，Mellors J W.In vitro activity of structurally diversenucleoside analogs against human immunodeficiency virus type 1withthe K65R mutation in reverse transcriptase.Antimicrob.AgentsChemother.2005，49，1139-44)。該突變還顯著降低了對(duì)目前正開發(fā)的幾乎所有NRTI的易感性。殘基K65位于HIV-1RT的66kDa亞單位的“手指”亞區(qū)的β3-β4環(huán)內(nèi)，并且位于三元HIV-1RT-模板/引物(T/P)-dNTP復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)內(nèi)，K65的ε氨基與所結(jié)合的dNTP底物的γ-磷酸鹽/酯相互作用(參見Huang H，Chopra R，Verdine GL，Harrison SC.Structure of a covalently trapped catalyticcomplex of HIV-1reverse transcriptaseimplications for drug resistance.Science.1998，282，1669-75)。前穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析已經(jīng)證實(shí)K65R在不影響Kd的情況下通過選擇性降低kpol而賦予了對(duì)ddATP(ddI的活性代謝產(chǎn)物)、3TCTP、卡巴韋-三磷酸(CBVTP，ABC的活性代謝產(chǎn)物)和二磷酸泰諾福韋(泰諾福韋-DP)的耐藥性(參見SelmiB，Boretto J，Sarfati SR，Guerreiro C，Canard B.Mechanism-basedsuppression of dideoxynucleotide resistance by K65R humanimmunodeficiency virus reverse transcriptase using analpha-boranophosphate nucleoside analogue.J.Biol.Chem.2001，276，48466-72；Deval J，White KL，Miller MD，Parkin NT，CourcambeckJ，Halfon P，Selmi B，Boretto J，Canard B.Mechanistic basis forreduced viral and enzymatic fitness of HIV-1 reverse transcriptasecontaining both K65R and M184V mutations.J.Biol.Chem.2004，279，509-16)。然而，對(duì)于ddCTP和DXGTP(DAPD的活性代謝產(chǎn)物)，耐藥機(jī)制同時(shí)涉及kpol的降低和Kd的增加(參見Selmi B，Boretto J，Sarfati SR，Guerreiro C，Canard B.Mechanism-basedsuppression of dideoxynucleotide resistance by K65R humanimmunodeficiency virus reverse transcriptase using analpha-boranophosphate nucleoside analogue.J.Biol.Chem.2001，276，48466-72；Furman PA，Jeffrey J，Kiefer LL，F(xiàn)eng JY，Anderson KS，Borroto-Esoda K，Hill E，Copeland WC，Chu CK，Sommadossi JP，Liberman I，Schinazi RF，Painter GR.Mechanism of action of1-beta-D-2，6-diaminopurine dioxolane，a prodrug of the humanimmunodeficiency virus type 1 inhibitor 1-beta-D-dioxolane guanosine.Antimicrob.Agents Chemother.2001，45，158-65)。結(jié)構(gòu)研究表明，HIV-1RT中的K65R突變改變了NRTI-TP在活性部位的最佳定位，從而引起摻入的催化效率下降(參見Selmi B，Boretto J，Sarfati SR，Guerreiro C，Canard B.Mechanism-based suppression ofdideoxynucleotide resistance by K65R human immunodeficiency virusreverse transcriptase using an alpha-boranophosphate nucleosideanalogue.J.Biol.Chem.2001，276，48466-72；Sluis-Cremer N，ArionD，Kaushik N，Lim H，Parniak MA.Mutational analysis of Lys65 ofHIV-1 reverse transcriptase.Biochem.J.2000，348，77-82)。
b)K70EK70E突變最初是在體外用阿德福韋篩選出來的(參見Cherrington JM，Mulato AS，F(xiàn)uller MD，Chen MS.Novel mutation(K70E)in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptaseconfers decreased susceptibility to 9-[2-(phosphonomethoxy)ethyl]adenine in vitro.Antimicrob.Agents Chemother.1996，40，2212-6)，但最近還在利用D-d4FC(Reverset)的篩選實(shí)驗(yàn)中觀察到(參見Hammond JL，Parikh UM，Koontz DL，Schlueter-Wirtz S，Chu CK，Bazmi HZ，Schinazi RF，Mellors JW.In vitro selection andanalysis of human immunodeficiency virus type 1 resistant toderivatives of beta-2′，3′-didehydro-2′，3′-dideoxy-5-fluorocytidine.Antimicrob.Agents Chemother.2005，49，3930-2)。有趣的是，由于引入了替諾福韋，K70E突變?cè)谂R床樣品中變得更加普遍，并且最近在10％的接受替諾福韋、ABC和3TC的三聯(lián)NRTI組合的天然抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的受治療者中報(bào)道了該突變(參見Ross L，GerondelisP，Liao Q，Wine B，Lim M，Shaefer M，Rodriguez A，Limoli K，Huang W，Parkin NT，Gallant J，Lanier R.Selection of the HIV-1reverse transcriptase mutation K70E in antiretroviral-

subjectstreated with tenofovir/abacavir/lamivudine therapy.Antiviral Ther.2005；10，S102)。我們已證實(shí)K70E通過辨別機(jī)制而賦予對(duì)替諾福韋-DP、CBVTP和3TCTP的耐藥性，其中涉及kpol的降低且對(duì)Kd的影響極小(參見Sluis-Cremer N，Argoti Tores P，Grzybowski J，Parikh U，Mellors，JW.Molecular Mechanism of Tenofovir，Abacavirand Lamivudine Resistance by the K70E Mutation in HIV-1 ReverseTranscriptase，13th Conference on Retroviruses and OpportunisticInfections，F(xiàn)ebruary 5-9 2006，Denver，CO，Abstract 152)。
c)L74VL74V突變最初鑒定為能引起ddI耐藥性(參見Winters MA，Shafer RW，Jellinger RA，Mamtora G，Gingeras T，Merigan TC.Human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase genotype and drug susceptibility changes in infectedindividuals receiving dideoxyinosine monotherapy for 1 to 2 years.Antimicrob.Agents Chemother.1997，41，757-62)，但還與ABC、ddC和DXG/DAPD(Amdoxovir)耐藥性相關(guān)(參見Hammond JL，Parikh UM，Koontz DL，Schlueter-Wirtz S，Chu CK，Bazmi HZ，Schinazi RF，Mellors JW.In vitro selection and analysis of humanimmunodeficiency virus type 1 resistant to derivatives ofbeta-2′，3′-didehydro-2′，3′-dideoxy-5-fluorocytidine.Antimicrob.AgentsChemother.2005，49，3930-2；Winters MA，Shafer RW，Jellinger RA，Mamtora G，Gingeras T，Merigan TC.Human immunodeficiency virustype 1 reverse transcriptase genotype and drug susceptibility changes ininfected individuals receiving dideoxyinosine monotherapy for 1 to 2years.Antimicrob.Agents Chemother.1997，41，757-62；Miller V，Ait-Khaled M，Stone C，Griffin P，Mesogiti D，Cutrell A，HarriganR，Staszewski S，Katlama C，Pearce G，Tisdale M.HIV-1 reversetranscriptase(RT)genotype and susceptibility to RT inhibitors duringabacavir monotherapy and combination therapy.AIDS.2000，14，163-71；Bazmi HZ，Hammond JL，Cavalcanti SC，Chu CK，SchinaziRF，Mellors JW.In vitro selection of mutations in the humanimmunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase that decreasesusceptibility to (-)-beta-D-dioxolane-guanosine and suppressresistance to 3′-azido-3′-deoxythymidine.Antimicrob.AgentsChemother.2000，44，1783-8)。前穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)L74V突變通過降低kpol而不影響Kd來賦予對(duì)ddATP的耐藥性。分子模型表明該L74V突變導(dǎo)致所引入核苷酸(incoming nucleotide)的核苷酸堿基與Leu-74的側(cè)鏈之間穩(wěn)定性相互作用的喪失。這可引起堿基的轉(zhuǎn)動(dòng)(與dATP相比，ddATP轉(zhuǎn)動(dòng)7°)，從而間接影響磷酸鹽(或酯)的定位(參見DevalJ，Navarro JM，Selmi B，Courcambeck J，Boretto J，Halfon P，Garrido-Urbani S，Sire J，Canard B.A loss of viralreplicative capacity correlates with altered DNA polymerizationkinetics by the human immunodeficiency virus reverse transcriptasebearing the K65R and L74V dideoxynucleoside resistance substitutions.J.Biol.Chem.2004，279，25489-96)。
d)Q151M復(fù)合物Q151M復(fù)合物由HIV-1RT中的一組(一串)突變組成，該一組突變包括Q151M突變加上四種另外的突變A62V、V75I、F77L和F116Y。所述Q151M突變通常在獲得其他突變之前發(fā)生(參見Ueno T，Shirasaka T，Mitsuya H.Enzymaticcharacterization of human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase resistant to multiple 2′，3′-dideoxynucleoside5′-triphosphates.J.Biol.Chem.1995，270，23605-11；Matsumi S，Kosalaraksa P，Tsang H，Kavlick MF，Harada S，Mitsuya H.Pathwaysfor the emergence of multi-dideoxynucleoside-resistant HIV-1 variants.AIDS.2003，17，1127-37)。盡管罕見(占耐藥性數(shù)據(jù)庫的～1％)，但該Q151M復(fù)合物最經(jīng)常被包含d4T和ddI的方案選擇(參見Balotta C，Violin M，Monno L，Bagnarelli P，Riva C，F(xiàn)acchi G，Berlusconi A，Lippi M，Rusconi S，Clementi M，Galli M，AngaranoG，Moroni M.Prevalence of multiple dideoxynucleoside analogueresistance(MddNR)in a multicenter cohort of HIV-1-infected Italianpatients with virologic failure.J.Acquir.Immune Defic.Syndr.2000，24，232-40)。由Q151M和該Q151M復(fù)合物介導(dǎo)的耐藥性機(jī)制涉及用于NRTI-TP摻入的催化速率常數(shù)(kpol)的選擇性降低(參見Deval J，Selmi B，Boretto J，Egloff MP，Guerreiro C，Sarfati S，Canard B.The molecular mechanism of multidrug resistance by theQ151M human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptaseand its suppression using alpha-boranophosphate nucleotide analogues.J.Biol.Chem.2002，277，42097-104)。
e)M184I/VHIV-1RT中的M184I/V突變引起高水平(＞100倍)的對(duì)3TC的耐藥性以及FTC耐藥性(參見Schinazi RF，LloydRM Jr，Nguyen MH，Cannon DL，McMillan A，Ilksoy N，Chu CK，Liotta DC，Bazmi HZ，Mellors JW.Characterization of humanimmunodeficiency viruses resistant to oxathiolane-cytosine nucleosides.Antimicrob.Agents Chemother.1993，37，875-81；Faraj A，AgrofoglioLA，Wakefield JK，McPherson S，Morrow CD，Gosselin G，MatheC，Imbach JL，Schinazi RF，Sommadossi JP.Inhibition of humanimmunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase by the5′-triphosphate beta enantiomers of cytidine analogs.Antimicrob.Agents Chemother.1994，38，2300-5)。然而，該突變還賦予了對(duì)ABC、ddC、ddI、(-)dOTC和L-d4FC的耐藥性(參見Hammond JL，Parikh UM，Koontz DL，Schlueter-Wirtz S，Chu CK，Bazmi HZ，Schinazi RF，Mellors JW.In vitro selection and analysis of humanimmunodeficiency virus type 1 resistant to derivatives of beta-2′，3′-didehydro-2′，3′-dideoxy-5-fluorocytidine.Antimicrob.AgentsChemother.2005，49，3930-2；Winters MA，Shafer RW，Jellinger RA，Mamtora G，Gingeras T，Merigan TC.Human immunodeficiency virustype 1 reverse transcriptase genotype and drug susceptibility changes ininfected individuals receiving dideoxyinosine monotherapy for 1 to 2years.Antimicrob.Agents Chemother.1997，41，757-62；Miller V，Ait-Khaled M，Stone C，Griffin P，Mesogiti D，Cutrell A，HarriganR，Staszewski S，Katlama C，Pearce G，Tisdale M.HIV-1 reversetranscriptase(RT)genotype and susceptibility to RT inhibitors duringabacavir monotherapy and combination therapy.AIDS.2000，14，163-71)。前穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析已經(jīng)證實(shí)M184V對(duì)3TCTP的Kd發(fā)揮深遠(yuǎn)作用，而不影響kpol(參見Deval J，White KL，Miller MD，Parkin NT，Courcambeck J，Halfon P，Selmi B，Boretto J，Canard B.Mechanistic basis for reduced viral and enzymatic fitness of HIV-1reverse transcriptase containing both K65R and M184V mutations.J.Biol.Chem.2004，279，509-16；Feng JY，Anderson KS.Mechanisticstudies examining the efficiency and fidelity of DNA synthesis by the3TC-resistant mutant(184V)of HIV-1 reverse transcriptase.Biochemistry.1999，38，9440-8)。M184構(gòu)成了高度保守的YMDD基序的一部分，并且在存在或者不存在核酸底物的情況下獲得的3TC耐藥性M184I RT的晶體結(jié)構(gòu)均表明，3TCTP的草酰硫酸環(huán)(草酰硫代坊環(huán)，oxathiolane ring)與β分支氨基酸(Val或Ile)的側(cè)鏈(在第184位)之間的空間位阻減少了抑制劑結(jié)合，從而增加了Kd(參見Gao HQ，Boyer PL，Sarafianos SG，Arnold E，Hughes SH.The role of steric hindrance in 3TC resistance of humanimmunodeficiency virus type-1 reverse transcriptase.J.Mol.Biol.2000，300，403-18)。
對(duì)于NRTI耐藥性的切除機(jī)制，該突變HIV-1RT不能在核苷酸摻入步驟辨別天然dNTP底物與NRTI-TP(參見Kerr SG，AndersonKS.Pre-steady-state kinetic characterization of wild type and3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)resistant human immunodeficiencyvirus type 1 reverse transcriptaseimplication of RNA directed DNApolymerization in the mechanism of AZT resistance.Biochemistry.1997，36，14064-70)。相反，包含“切除”突變的RT在存在生理濃度的ATP(通常在0.8-4mM的范圍內(nèi))或焦磷酸鹽(或酯)(PPi)的情況下，表現(xiàn)出增強(qiáng)的開啟NRTI-MP終止的引物的能力(參見Arion D，Kaushik N，McCormick S，Borkow G，Parniak MA.Phenotypic mechanism of HIV-1 resistance to3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)increased polymerizationprocessivity and enhanced sensitivity to pyrophosphate of the mutantviral reverse transcriptase.Biochemistry.1998，37，15908-17；MeyerPR，Matsuura SE，Mian AM，So AG，Scott WA.A mechanism of AZTresistancean increase in nucleotide-dependent primer unblocking bymutant HIV-1 reverse transcriptase.Mol.Cell.1999，4，35-43)。與切除機(jī)制相關(guān)的NRTI耐藥性突變包括胸苷類似物突變(TAMS)和T69S插入性突變，這些中的每一種均在下文中描述。
a)TAMSAZT耐藥性與RT中的多種突變相關(guān)，包括M41L、D67N、K70R、L210W、T215F/Y和K219E/Q(Kerr SG，AndersonKS.Pre-steady-state kinetic characterization of wild type and3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)resistant human immunodeficiencyvirus type 1 reverse transcriptaseimplication of RNA directed DNApolymerization in the mechanism of AZT resistance.Biochemistry.1997，36，14064-70；Larder BA，Kemp SD.Multiple mutations inHIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine(AZT).Science.1989，246，1155-8；Kellam P，Boucher CA，LarderBA.Fifth mutation in human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase contributes to the development of high-level resistance tozidovudine.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1992，89，1934-8；HarriganPR，Kinghorn I，Bloor S，Kemp SD，Najera I，Kohli A，Larder BA.Significance of amino acid variation at human immunodeficiency virustype 1 reverse transcriptase residue 210 for zidovudine susceptibility.J.Virol.1996，70，5930-4)。因?yàn)檫@些突變中的每一種也已經(jīng)由D4T治療失敗而被篩選出(參見Hooker DJ，Tachedjian G，Solomon AE，Gurusinghe AD，Land S，Birch C，Anderson JL，Roy BM，Arnold E，Deacon NJ An in vivo mutation from leucine to tryptophan at position210 in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptasecontributes to high-level resistance to 3′-azido-3′-deoxythymidine.J.Virol.1996，70，8010-8)，它們已經(jīng)被命名為胸苷類似物突變或TAMS。通常，需要3種或更多種TAMS，以表現(xiàn)出對(duì)AZT的高水平耐藥性以及對(duì)其他NRTI的交叉耐藥性?？色@得的生物化學(xué)數(shù)據(jù)表明AZTMP和d4TMP是通過包含TAMS的HIV-1RT所執(zhí)行的切割反應(yīng)的最好底物(參見Meyer PR，Matsuura SE，Schinazi RF，So AG，Scott WA.Differential removal of thymidine nucleotideanalogues from blocked DNA chains by human immunodeficiencyvirus reverse transcriptase in the presence of physiologicalconcentrations of 2′-deoxynucleoside triphosphates.Antimicrob.AgentsChemother.2000，44，3465-72；Naeger LK，Margot NA，Miller MD.ATP-dependent removal of nucleoside reverse transcriptase inhibitorsby human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase.Antimicrob.Agents Chemother.2002，46，2179-84)。然而，ddAMP也可被切割，盡管效率比AZTMP低。相反，報(bào)道了胞苷類似物和CBVTP是切割反應(yīng)的較差底物(參見Naeger LK，Margot NA，MillerMD.ATP-dependent removal of nucleoside reverse transcriptaseinhibitors by human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase.Antimicrob.Agents Chemother.2002；46，2179-84)。為了使HIV-1RT能夠從引物的3’末端有效切割A(yù)ZT，鏈終止AZT-MP必須定位于RT活性位置的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(N-位點(diǎn))(Naeger LK，Margot NA，Miller MD.ATP-dependent removal of nucleoside reversetranscriptase inhibitors by human immunodeficiency virus type 1reverse transcriptase.Antimicrob.Agents Chemother.2002，46，2179-84)。在生理?xiàng)l件下，隨后校正的dNTP(the hext-correct dNTP)的結(jié)合可驅(qū)動(dòng)終止核苷酸進(jìn)入引物結(jié)合位點(diǎn)(P-位點(diǎn))，從而形成死端式(dead-end)復(fù)合物。該復(fù)合物的形成能防止切割反應(yīng)的發(fā)生。許多研究已表明，通過包含TAMS的HIV-1RT切割A(yù)ZT-MP對(duì)隨后校正的dNTP抑制的敏感性比其他缺乏3’-疊氮基的NRTI類似物低得多(＞50倍)(參見Meyer PR，Matsuura SE，Schinazi RF，So AG，Scott WA.Differential removal of thymidine nucleotide analogues fromblocked DNA chains by human immunodeficiency virus reversetranscriptase in the presence of physiological concentrations of2′-deoxynucleoside triphosphates.Antimicrob.Agents Chemother.2000，44，3465-72；Boyer PL，Sarafianos SG，Arnold E，Hughes SH.Selective excision of AZTMP by drug-resistant humanimmunodeficiency virus reverse transcriptase.J.Virol.2001，75，4832-42)。這些數(shù)據(jù)有助于解釋為什么TAMS可賦予對(duì)AZT的耐藥性比對(duì)d4T高。盡管已經(jīng)表明AZT-MP-終止的引物的3’疊氮基是該切割表型的主要結(jié)構(gòu)決定簇(或決定子)(參見Boyer PL，Sarafianos SG，Arnold E，Hughes SH.Selective excision of AZTMP bydrug-resistant human immunodeficiency virus reverse transcriptase.J.Virol.2001，75，4832-42；Sarafianos SG，Clark AD Jr，Das K，TuskeS，Birktoft JJ，Ilankumaran P，Ramesha AR，Sayer JM，Jerina DM，Boyer PL，Hughes SH，Arnold E.Structures of HIV-1 reversetranscriptase with pre-and post-translocation AZTMP-terminated DNA.EMBO J.2002，21，6614-24)，但我們證實(shí)了3’-疊氮基-2’，3’-ddA和3’-疊氮基-2’，3’-ddG保留了它們的抗AZT耐藥性病毒的效力(參見Sluis-Cremer N，Arion D，Parikh U，Koontz D，Schinazi RF，Mellors JW，Parniak MA.The 3′-azido group is not the primarydeterminant of 3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)responsible for theexcision phenotype of AZT-resistant HIV-1.J.Biol.Chem.2005，280，29047-52)。這表明該核苷堿基對(duì)TAMS引起的切割效率具有重要的影響。
b)T69S插入密碼子69與70之間包含二肽插入(通常為Ser-Ser、Ser-Gly或Ser-Ala)以及氨基酸取代T69S、T215Y和其他TAMS的HIV-1RT已在經(jīng)歷嚴(yán)重NRTI的患者中得到鑒定，雖然比率較低(0.5-2.7％)(參見Winters MA，Merigan TC.Insertions in thehuman immunodeficiency virus type 1 protease and reversetranscriptase genesclinical impact and molecular mechanisms.Antimicrob.Agents Chemother.2005，49，2575-82)。在表型分析中，包含RT中的插入突變的病毒分離物證實(shí)對(duì)AZT的高水平耐藥性以及對(duì)其他NRTI如d4T、ddC、ddI、ABC和替諾福韋的中等水平耐藥性。在與TAMS(特別是T215Y)結(jié)合方面，HIV-1RT中的二肽插入賦予了增強(qiáng)的ATP依賴性磷酸解活性，其有利于去除終止性AZTMP、d4TMP、ddAMP或替諾福韋，甚至當(dāng)在反應(yīng)中存在相對(duì)高水平的dNTP時(shí)(參見Meyer PR，Lennerstrand J，Matsuura SE，Larder BA，Scott WA.Effects of dipeptide insertions between codons69 and 70 of human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase on primer unblocking，deoxynucleoside triphosphateinhibition，and DNA chain elongation.J.Virol.2003，77，3871-7；Boyer PL，Sarafianos SG，Arnold E，Hughes SH.Nucleoside analogresistance caused by insertions in the fingers of humanimmunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase involvesATP-mediated excision.J.Virol.2002，76，9143-51；Mas A，Parera M，Briones C，Soriano V，Martinez MA，Domingo E，Menendez-Arias L.Role of a dipeptide insertion between codons 69 and 70 of HIV-1reverse transcriptase in the mechanism of AZT resistance.EMBO J.2000，19，5752-61)。
基于上面描述的結(jié)構(gòu)-活性結(jié)果，某些3’-疊氮基嘌呤核苷(APN)成為一類主要的核苷類似物，其表現(xiàn)出良好的抗HIV-1AZT2和HIV-1K65R活性。為了進(jìn)一步表征這些核苷的活性，針對(duì)一組突變病毒評(píng)價(jià)了3’-疊氮基-ddA和3’-疊氮基-2’，3’-ddG。該組突變病毒包括含有K65R(HIV-1K65R)、L74V(HIV-1L74V)、M184V(HIV-1M184V)、TAMS的不同組合(例如，M41L/L210W/T215Y(HIV-1AZT3)，M41L/D67N/K70R/T215F/K219Q(HIV-1AZT7)，或M41L/D67N/K70R/L210W/T215Y/K219Q(HIV-1AZT9)，以及多NRTI耐藥復(fù)合物(例如，A62V/V75I/F77L/F116Y/Q151M(HIV-1Q151M)或M41L/69SS/L210W/T215Y(HIV-169插入))的重組病毒。結(jié)果表明，3’-疊氮基-ddA和3’-疊氮基-ddG對(duì)含有K65R、L74V或M184V突變的病毒均有活性。與AZT相比，這兩種化合物也均對(duì)所有含TAM的病毒有顯著活性。例如，HIV-1AZT7對(duì)AZT的耐藥性大于500倍，然而可注意到對(duì)于該病毒對(duì)3’-疊氮基-ddA和3’-疊氮基-ddG的耐藥性低于3.5倍。然而，3’-疊氮基-ddA和3’-疊氮基-ddG對(duì)HIV-1Q151M的活性均較低，并且3’-疊氮基-ddG還喪失了抗HIV-169插入的活性。
另一種引起嚴(yán)重人類健康問題的病毒是乙型肝炎病毒(HBV)。HBV是僅次于煙草的人類癌癥起因。HBV誘發(fā)癌癥的機(jī)制尚不清楚。推測其可能直接觸發(fā)腫瘤形成或者通過慢性炎癥、肝硬化以及與感染相關(guān)的細(xì)胞再生而間接觸發(fā)腫瘤。
在2-6個(gè)月潛伏期(其間宿主通常未意識(shí)到感染)后，HBV感染可導(dǎo)致急性肝炎和肝損傷，引起腹痛、黃疸以及某些酶的血液水平升高。HBV可引起暴發(fā)性肝炎，一種進(jìn)展迅速、經(jīng)常致死的疾病形式，其中大部分肝受損。
患者通常可從HBV感染的急性期恢復(fù)。然而，在某些患者中，病毒持續(xù)復(fù)制延長的期間或無限期，引起慢性感染。慢性感染可導(dǎo)致慢性遷延性肝炎。感染了慢性遷延性HBV的患者在發(fā)展中國家最普遍。截至1991年中期，僅亞洲已有約2.25億名慢性HBV攜帶者，并且世界范圍有幾乎3億名攜帶者。慢性遷延性肝炎可引起疲勞、肝硬化以及肝細(xì)胞癌(一種原發(fā)性肝癌)。
在工業(yè)化國家，HBV感染的高危人群包括那些接觸HBV攜帶者或它們的血液樣品的人。HBV的流行病學(xué)與HIV/AIDS非常類似，這就是HBV感染在感染HIV或患有AIDS的患者中非常普遍的原因。然而，HBV比HIV是更有傳染性的。
3TC(拉米夫定)、干擾素α-2b、聚乙二醇化干擾素(peginterferon)α-2a、賀維力(hepsera)(阿德福韋二匹伏酯(adefovirdipivoxil))、博路定(baraclude)(恩替卡韋(entecavir))和Tyzeka(替比夫定(Telbivudine))是目前FDA批準(zhǔn)的用于治療HBV感染的藥物。然而，這些藥物中的一些具有嚴(yán)重的副作用，并且用這些藥物治療的患者迅速形成病毒耐藥性。
HIV和HBV治療的一個(gè)主要問題是耐藥性的選擇。短期服用抗病毒藥物后，病毒突變被篩選，這使得該藥物成為效力低很多的病毒生成抑制劑。即使目前的聯(lián)合治療也不能避免耐藥性。
鑒于獲得性免疫缺陷綜合癥、AIDS相關(guān)綜合癥狀以及乙型肝炎病毒均已達(dá)到世界流行水平，并且對(duì)已感染的患者具有嚴(yán)重影響，因此，仍然急需提供新型有效的藥物試劑(pharmaceuticalagents)來治療這些疾病，其中該試劑對(duì)宿主具有較低的毒性。
提供新型的抗病毒劑、包含這些試劑的組合物以及利用這些試劑的治療方法，特別是治療耐藥性突變病毒將是有利的。本發(fā)明提供了這樣的試劑、組合物和方法。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防宿主體內(nèi)的HIV-1、HIV-2、HBV或黃病毒科感染(flaviviridae infection)如HCV感染的化合物、方法和組合物。該方法涉及給予如本文所述的治療或預(yù)防有效量的至少一種化合物以治療或預(yù)防HIV-1、HIV-2、HBV或HCV感染或者給予足以降低HIV-1、HIV-2、HBV或HCV生物學(xué)活性的量。本文中還公開了藥物組合物，該藥物組合物包括一種或多種本文描述的化合物以及藥用載體或賦形劑，用于治療感染HIV-1、HIV-2、HBV或HCV的宿主。該制劑可以進(jìn)一步包括至少一種另外的治療劑(治療試劑)。此外，本發(fā)明包括用于制備這樣的化合物的方法。
本文描述的化合物包括β-D和β-L-3’-疊氮基-2’，3’-二脫氧嘌呤核苷和其膦酸(衍生物)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該活性化合物具有化學(xué)式(I)-(IV)
或者其藥用鹽或藥物前體，其中 i)X是O、CH2、S、SO2、NH、P＝O(OH)、C＝CH2、C＝CHF或C＝CF2； ii)Y是O或S； iii)Z是-CH2、-CH2CH2、-CH2O、-CH2S或CH2NH(均為碳原子連接至磷原子)； iv)R1是氫、烷基、鹵代烷基(包括但不限于CH2F、CF3)、鹵素、疊氮基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯基、炔基、鹵代鏈烯基(包括但不限于Br-乙烯基)、烷氧基、鏈烯氧基、烷硫基(alkylthio)、酰氧基、烷氧?；?烷氧基?；琣lkyloxyacyl)、烷基羰基、酰基硫基(acylthio)或酰氨基； v)R2是H、磷酸酯(phosphate)(包括但不限于單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或穩(wěn)定化的磷酸酯藥物前體)、磷硫酰(phosphothioate，硫代磷酸酯)、用烷基(包括但不限于C1-C6)、鏈烯基(包括但不限于C2-C6)、炔基(包括但不限于C2-C6)、芳基(包括但不限于C6-C10)或其他藥用離去基團(tuán)取代的羰基，當(dāng)體內(nèi)給予時(shí)其能夠提供一種這樣的化合物，其中R2是H或磷酸酯、磺酸酯(包括但不限于烷基或芳基烷基磺?；缂谆酋；?、芐基(其中苯基基團(tuán)可選地被如在上文給出的芳基定義中描述的一種或多種取代基所取代)、脂質(zhì)(包括但不限于磷脂)、氨基酸、肽或膽固醇； vi)R3和R4獨(dú)立地是氫、磷酸酯、二磷酸酯或一種在肝細(xì)胞中優(yōu)先去除以生成相應(yīng)的H基團(tuán)的基團(tuán)，如本文中使用的術(shù)語“在肝細(xì)胞中優(yōu)先去除”是指該基團(tuán)的至少部分在肝細(xì)胞中以高于同一基團(tuán)在非肝細(xì)胞(例如，成纖維細(xì)胞或淋巴細(xì)胞)中去除的速率的速率被去除。因此，可以設(shè)想，該可去除基團(tuán)(除去基團(tuán))包括所有可通過還原酶、酯酶、細(xì)胞色素P450或任何其他特異性肝酶而被去除的藥用基團(tuán)。可替換地，設(shè)想的基團(tuán)還可包括那些無需在肝細(xì)胞中優(yōu)先被去除但實(shí)現(xiàn)至少一些積累和/或特異性遞送至肝細(xì)胞(例如，含所選氨基酸，包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或聚精氨酸或聚天冬氨酸的酯類)的基團(tuán)；以及 vii)堿基是具有通式(III)-(IV)的嘌呤或修飾的嘌呤
其中 W、W1、W2和W3均獨(dú)立地為N、CCF3、CC(O)NH2、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)2、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR5； W4獨(dú)立地是O、S、NH或NR’； R5和R6均獨(dú)立地選自H、鹵素(F、Cl、Br、I)、CN、N3、NO2、OH、NH2、SH、OR’、NHR’、N(R’)2，SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH2OH，CH2CN、CH2N3、COOH、COOR’、CONH2、CONHR、CON(R’)2、CH2COOH、CH2COOR’、CH2CONH2、CH2CONHR’、CH2CON(R’)2、烷基(包括但不限于C1-C6)、鏈烯基(包括但不限于C2-C6)和炔基(包括但不限于C2-C6)、環(huán)烷基((包括但不限于C3-C8)、芳基(包括但不限于C6-C10)、雜芳基(包括但不限于C6-C10)、?；?包括但不限于C2-C6)、芳烷基和烷芳基； 其中，對(duì)于其中堿基是式(III)的式(I)，R5不能是Cl、Br、I、C1-6烷氧基、C3-6環(huán)烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、被一種或兩種取代基取代的氨基，所述取代基獨(dú)立地選自C1-6烷基和C3-6環(huán)烷基、或含有至少一個(gè)氮原子的四至六元雜環(huán)，該環(huán)通過氮原子鍵合于嘌呤堿；如果R1和R2是H，則W是CH，W1、W2和W3是N，并且R6是NH2或NHR7，其中R7是酰基； 其中，對(duì)于其中堿基是式(III)的式(I)，當(dāng)R5是OH時(shí)，R6不能是NH2，并且當(dāng)R5是NH2時(shí)，R6不能是H，如果R1和R2是H，則W是CH，W1、W2和W3是N；并且 每一個(gè)R’均獨(dú)立地是低級(jí)烷基(C1-C6烷基)、低級(jí)鏈烯基、低級(jí)炔基、低級(jí)環(huán)烷基(C3-C6環(huán)烷基)芳基、烷芳基或者芳烷基，其中所述基團(tuán)可以被如上文所定義的一種或多種取代基取代，例如羥烷基、氨基烷基和烷氧基烷基。
在一個(gè)方面，W是CH，而W1-W3是N。在另一個(gè)方面，與W2相鄰的R5是鹵素基團(tuán)、羥基基團(tuán)、烷氧基基團(tuán)或胺基基團(tuán)，其中所述胺基基團(tuán)可選地被烷基基團(tuán)、羥烷基基團(tuán)、氨基烷基基團(tuán)、環(huán)烷基基團(tuán)、鏈烯基基團(tuán)或炔基基團(tuán)取代。在又一方面，R6是H或NH2。
在另一方面，所述化合物是3’-疊氮基-ddA和/或3’-疊氮基-ddG，與針對(duì)TAM突變選擇的藥物和/或針對(duì)M184V突變選擇的藥物組合。本文描述的化合物可以為分離的β-L-或β-D-構(gòu)型的形式或者其混合物，包括但不限于外消旋混合物。
此外，本文所描述的化合物是HBV和/或HCV的抑制劑。因此，這些化合物還可用來治療共同感染HIV-1或HIV-2與HBV和/或HCV的患者。



圖1是xxLAI病毒的基因型的圖示。
圖2A-2B是3’-疊氮基-2’，3’-ddA和3’-疊氮基-2’，3’-ddG對(duì)一組耐藥性HIV-1的抗HIV活性的圖示。
圖4A-4B是通過腺苷脫氨酶進(jìn)行的脫氨作用的圖示。
圖5是示出了一種抗3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧鳥苷(3’-疊氮基-ddG，本文中也稱為化合物56)的病毒隨時(shí)間(周)的發(fā)展的圖表。
圖6是用3’-疊氮基-ddG進(jìn)行處理以及隨時(shí)間選擇的突變的總結(jié)。

具體實(shí)施例方式 本文描述的3’-疊氮基-2’，3’-二脫氧嘌呤核苷表現(xiàn)出改善的對(duì)HIV、HBV及黃病毒科病毒(包括那些含有突變的RT酶的病毒)的抑制活性。因此，該化合物可用來治療或預(yù)防宿主體內(nèi)的病毒感染，或者降低該病毒的生物學(xué)活性。宿主可以為哺乳動(dòng)物，特別是人類，其感染了HIV-1、HIV-2、HBV和/或黃病毒科病毒如HCV。該方法涉及給予有效量的本文描述的一種或多種3’-疊氮基-2’，3’-二脫氧嘌呤核苷。
還披露了一種藥物制劑，其包括本文描述的一種或多種化合物以及藥用載體或賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，該制劑包括本文描述的至少一種化合物以及至少一種另外的治療劑。
參照下面的定義將更好的理解本發(fā)明 I.定義 術(shù)語“獨(dú)立地”在本文中用來表示作為獨(dú)立采用的該變量隨應(yīng)用不同而獨(dú)立地變化。因此，在化合物如R”XYR”中，其中R”獨(dú)立地是“碳或氮”，兩個(gè)R”均可為碳，兩個(gè)R”均可為氮，或者一個(gè)R”為碳而另一個(gè)R”為氮。
如本文中使用的，術(shù)語“光學(xué)異構(gòu)純(enantiomerically pure)”是指一種核苷組合物，其至少包括約95％，優(yōu)選約97％，98％，99％或100％的所述核苷的單一對(duì)映體。
如本文中使用的，術(shù)語“基本上無”或者“基本上缺乏”是指一種這樣的核苷組合物，其至少包括按重量計(jì)85-90％，優(yōu)選按重量計(jì)95％-98％，并且甚至更優(yōu)選按重量計(jì)99％-100％的所述核苷的指定對(duì)映體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文所描述的化合物基本上無對(duì)映體。
類似地，術(shù)語“分離的”是指一種這樣的核苷組合物，其至少包括按重量計(jì)85-90％，優(yōu)選按重量計(jì)95％-98％，并且甚至更優(yōu)選按重量計(jì)99％-100％的所述核苷，其余部分包含其他化學(xué)物質(zhì)或?qū)τ丑w。
如本文中使用的，除非另有說明，否則術(shù)語“烷基”是指飽和的直鏈、支鏈或環(huán)狀的伯、仲或叔烴，包括取代的或未取代的烷基基團(tuán)。所述烷基基團(tuán)可以可選地被任何不以其他方式干擾反應(yīng)或能夠在該方法中提供改善的部分(moiety)所取代，該部分包括但不限于鹵素、鹵代烷基、羥基、羧基、?；?、芳基、酰氧基、氨基、胺基(amido)、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫羥、亞胺、磺?；?、硫烷基(sulfanyl)、亞磺?；?、磺胺基(sulfamonyl)、酯、羧酸、酰胺、膦酰(phosphonyl)、氧膦基、磷?；㈧?、硫酯、硫醚、酸性鹵化物、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、磷酸、磷酸鹽(或酯)，未保護(hù)或者有必要加以保護(hù)的，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的，例如，如在Greene、et al.，Protective Groups in Organic Synthesis、John Wileyand Sons、Second Edition、1991中所教導(dǎo)的，結(jié)合于本文作為參考。特別包括CF3和CH2CF3。
在上下文中，無論何時(shí)使用術(shù)語C(烷基范圍)，該術(shù)語獨(dú)立地包括該類的每一種成員，如同具體并單獨(dú)列出的一樣。術(shù)語“烷基”包括C1-22烷基部分，并且術(shù)語“低級(jí)烷基”包括C1-6烷基部分。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，相關(guān)烷基通過用后綴“-基”代替后綴“-烷”來命名。
術(shù)語“鏈烯基”是指線性或支鏈的不飽和烴基團(tuán)，因?yàn)槠浒粋€(gè)或多個(gè)雙鍵。本文中披露的鏈烯基可以可選地用任何不會(huì)負(fù)面影響該反應(yīng)過程的部分所取代，所述部分包括但不限于針對(duì)烷基部分上的取代基所描述的那些取代基。鏈烯基基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括乙烯基、甲基亞乙基(methylethylene)、異亞丙基、1，2-乙烷-二基、1，1-乙烷-二基、1，3-丙烷-二基、1，2-丙烷-二基、1，3-丁烷-二基以及1，4-丁烷-二基。
術(shù)語“炔基”是指線性或支鏈的不飽和無環(huán)烴基團(tuán)，因?yàn)槠浒粋€(gè)或多個(gè)三鍵。所述炔基基團(tuán)可以可選地用任何不會(huì)負(fù)面影響該反應(yīng)過程的部分所取代，所述部分包括但不限于上面針對(duì)烷基部分描述的那些取代基。合適的炔基基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括乙炔基、丙炔基、羥丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、戊炔-2-基、4-甲氧基戊炔-2-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-1-基、己炔-2-基和己炔-3-基、3，3-二甲基丁炔-1-基基團(tuán)。
術(shù)語“烷基氨基”或“芳基氨基”分別指具有一個(gè)或兩個(gè)烷基或芳基取代基的氨基基團(tuán)。
如本文中使用的，并且除非另有定義，否則術(shù)語“受保護(hù)的”是指添加了氧、氮或磷原子以防止其進(jìn)一步反應(yīng)或用于其他目的的基團(tuán)。大量氧和氮保護(hù)基團(tuán)對(duì)于有機(jī)合成領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說是已知的，并且例如描述在上文的Greene et al.，Protective Groups inOrganic Synthesis中。
術(shù)語“芳基”單獨(dú)或一起表示一種包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)環(huán)的碳環(huán)芳香族體系(carbocyclic aromatic system)，其中這樣的環(huán)可以懸掛方式(pendent manner)連接在一起或者可稠合在一起。芳基的非限制性實(shí)例包括苯基、聯(lián)苯基或萘基或者在從芳環(huán)去除一個(gè)氫后剩余的其他芳族基團(tuán)。術(shù)語芳基包括取代的或未取代的部分。所述芳基基團(tuán)可以可選地用任何不會(huì)負(fù)面影響該過程的部分所取代，所述部分包括但不限于上述針對(duì)烷基部分所描述的基團(tuán)。取代的芳基的非限制性實(shí)例包括雜芳基氨基、N-芳基-N-烷基氨基、N-雜芳基氨基-N-烷基氨基、雜芳氧基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳硫基、單芳基胺基磺?；?、芳基磺酰胺基、二芳基胺基磺?；?、單芳基氨基磺酰基、芳基亞磺?；⒎蓟酋；㈦s芳硫基、雜芳亞磺?；?、雜芳磺?；⒎减；?、雜芳?；?、芳烷?；?aralkanoyl)、雜芳烷?；?heteroaralkanoyl)、羥基芳烷基、羥基雜芳烷基、、鹵代烷氧基烷基、芳基、芳烷基、芳氧基、芳烷氧基、芳氧基烷基、飽和雜環(huán)、部分飽和的雜環(huán)、雜芳基、雜芳氧基、雜芳氧基烷基、芳烷基、雜芳烷基、芳基鏈烯基和雜芳基鏈烯基、碳芳烷氧基(carboaralkoxy)。
術(shù)語“烷芳基”是指用含芳基取代基的烷基基團(tuán)。術(shù)語“芳烷基”是指含烷基取代基的芳基基團(tuán)。
如本文中使用的，術(shù)語“鹵素”包括氯、溴、碘和氟。
術(shù)語“?；笔侵隔人狨?，其中該酯基團(tuán)的非羰基部分選自直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或低級(jí)烷基、烷氧基烷基(包括但不限于甲氧基烷基)、芳烷基(包括但不限于芐基)、芳氧基烷基如苯氧基甲基、芳基(包括但不限于可選地用鹵素(F、Cl、Br、I)取代的苯基)、烷基(包括但不限于C1、C2、C3和C4)或烷氧基(包括但不限于C1、C2、C3和C4)、磺酸酯如烷基或芳烷基磺?；?包括但不限于甲基磺?；?、單、二或三磷酸酯、三苯甲基或單甲氧基三苯甲基、取代的芐基、三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲硅烷基。酯中的芳基基團(tuán)最優(yōu)地包括苯基基團(tuán)。術(shù)語“低級(jí)酰基”是指其中非羰基部分是低級(jí)烷基的?；鶊F(tuán)。
術(shù)語“烷氧基”和“烷氧基烷基”包括具有烷基部分的線性或支鏈的含氧基團(tuán)，如甲氧基基團(tuán)。術(shù)語“烷氧基烷基”還包括具有一個(gè)或多個(gè)連接于烷基基團(tuán)的烷氧基基團(tuán)的烷基基團(tuán)，即用于形成單烷氧基烷基和雙烷氧基烷基基團(tuán)。術(shù)語“烷氧基”基團(tuán)可進(jìn)一步用一個(gè)或多個(gè)鹵素原子如氟、氯或溴取代以提供“鹵代烷氧基”基團(tuán)。這樣的基團(tuán)的實(shí)例包括氟代甲氧基、氯代甲氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟乙氧基、氯代乙氧基、四氟乙氧基、五氟乙氧基和氟代丙氧基。
術(shù)語“烷基氨基”表示“單烷基氨基”和“二烷基氨基”，其分別包含一個(gè)或兩個(gè)連接于氨基基團(tuán)的烷基基團(tuán)。術(shù)語芳基氨基表示“單芳基氨基”和“二芳基氨基”，其分別包含一個(gè)或兩個(gè)連接于氨基基團(tuán)的芳基基團(tuán)。術(shù)語“芳烷基氨基”包括連接于氨基基團(tuán)的芳烷基基團(tuán)。術(shù)語芳烷基氨基表示“單芳烷基氨基”和“二芳烷基氨基”，其分別包含一個(gè)或兩個(gè)連接于氨基基團(tuán)的芳烷基基團(tuán)。術(shù)語芳烷基氨基進(jìn)一步表示“單芳烷基單烷基氨基”，其包含一個(gè)芳烷基基團(tuán)和一個(gè)烷基基團(tuán)，其連接于氨基基團(tuán)。
如本文中使用的，術(shù)語“雜原子”是指氧、硫、氮和磷。
如本文中使用的，術(shù)語“雜芳基”或“芳香雜環(huán)”是指在芳環(huán)中包括至少一個(gè)硫、氧、氮或磷的芳香烴(芳香族化合物)。
術(shù)語“雜環(huán)”是指非芳香族環(huán)狀基團(tuán)，其中在環(huán)中存在至少一種雜原子如氧、硫、氮或磷。
雜芳基和雜環(huán)基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括呋喃基、呋喃(furanyl)、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、異噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、異喹啉基、苯并噻吩基、異苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、異吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、噁唑基、噻唑基、異噻唑基、1，2，4-噻二唑基、異噁唑基、吡咯基、喹唑啉基、噌嗪、酞嗪基、黃嘌呤基(xanthinyl)、次黃嘌呤基(hypoxanthinyl)、噻吩、呋喃、吡咯、異吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噁唑、異噁唑、噻唑、異噻唑、嘧啶或噠嗪、和喋啶基、氮丙啶、噻唑、異噻唑、1，2，3-噁二唑、噻嗪、吡啶、吡嗪、哌嗪、吡咯烷、oxaziranes、吩嗪、吩噻嗪、嗎啉基、吡唑基、噠嗪基、吡嗪基、喹喔啉基、黃嘌呤基(xanthinyl)、次黃嘌呤基(hypoxanthinyl)、喋啶基、5-氮雜胞苷基、5-氮雜尿苷基、三唑吡啶基、咪唑吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、腺嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-芐基嘌呤、N6-鹵代嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-乙炔基嘌呤、N6-?；堰?、N6-羥烷基嘌呤、N6-硫烷基嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、6-氮雜嘧啶、2-巰基嘧啶、尿嘧啶、N5-烷基嘧啶、N5-芐基嘧啶、N5-鹵代嘧啶、N5-乙烯基嘧啶、N5-乙炔基嘧啶、N5-?；奏?、N5-羥烷基嘌呤和N6-硫烷基嘌呤以及異噁唑基。所述雜芳基基團(tuán)可以可選地用如上面針對(duì)芳基描述的基團(tuán)取代。雜環(huán)或雜芳基基團(tuán)可以可選地用一種或多種選自鹵素、鹵代烷基、烷基、烷氧基、羥基、羧基衍生物、胺基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基的取代基取代。如果需要，芳香雜環(huán)(heteroaromatic)可部分或全部氫化。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，代替吡啶，可以使用二氫吡啶。如有必要或需要，可對(duì)雜環(huán)或雜芳基基團(tuán)上的官能性氧或氮基加以保護(hù)。合適的保護(hù)基團(tuán)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的，并且包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基或取代的三苯甲基、烷基基團(tuán)、?；鶊F(tuán)如乙?；捅；?，甲基磺?；蛯?duì)甲苯基磺?；?。所述雜環(huán)或芳香雜環(huán)基團(tuán)可以用任何不會(huì)負(fù)面影響反應(yīng)的基團(tuán)所取代，包括但不限于上述那些針對(duì)芳基描述的基團(tuán)。
如本文中使用的，術(shù)語“宿主”是指其中病毒可以復(fù)制的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物，包括但不限于細(xì)胞系和動(dòng)物，以及優(yōu)選地，人類。可替換地，宿主可以攜帶該病毒基因組的一部分，其復(fù)制或功能可被本發(fā)明的化合物改變。術(shù)語宿主具體是指受感染的細(xì)胞、轉(zhuǎn)染有全部或部分該病毒基因組的細(xì)胞以及動(dòng)物，特別是靈長類(包括但不限于黑猩猩)和人類。在本發(fā)明的大多數(shù)動(dòng)物應(yīng)用中，宿主是人類患者。然而，在某些適應(yīng)癥中，很明顯獸醫(yī)應(yīng)用是本發(fā)明預(yù)期的(例如用于治療黑猩猩)。
術(shù)語“藥用鹽或藥物前體”在整個(gè)說明書中均用來描述核苷化合物的任何藥用形式(例如酯、磷酸酯、酯或相關(guān)基團(tuán)的鹽)，一旦給予患者，將提供該核苷化合物。藥用鹽包括那些來自藥用無機(jī)或有機(jī)堿和酸的鹽類。合適的鹽類包括那些來自堿金屬如鉀和鈉、堿土金屬如鈣和鎂以及制藥領(lǐng)域中熟知的多種其他酸的鹽。藥用藥物前體是指一種這樣的化合物，其在宿主體內(nèi)代謝如水解或氧化以形成本發(fā)明的化合物。藥物前體的典型實(shí)例包括在活性化合物的官能部分上具有生物學(xué)不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)的化合物。藥物前體包括可以被氧化、還原、胺化、脫氨、羥基化、脫羥、水解、脫水、烷基化、去烷基化、酰化、去?；⒘姿峄?、去磷酸化以生成活性化合物的化合物。本發(fā)明的化合物的藥物前體形式可具有抗病毒活性，可被代謝以形成表現(xiàn)出這樣的活性的化合物或者既具有抗病毒活性又可被代謝形成表現(xiàn)出這樣的活性的化合物。
藥物前體還包括所披露的核苷的氨基酸的酯類(參見，例如歐洲專利說明書第99493號(hào)，其正文結(jié)合于此作為參考，其描述了阿昔洛韋(acyclovir)的氨基酸酯類，特別是甘氨酸和丙氨酸酯，與阿昔洛韋本身相比，其表現(xiàn)出改善的水溶性；以及美國專利第4,957,924號(hào)(Beauchamp)，其披露了阿昔洛韋的纈氨酸酯，其特征在于α碳原子相鄰的側(cè)鏈分支，與丙氨酸和甘氨酸酯相比，其在口服后表現(xiàn)出改善的生物利用度。)。美國專利第4,957,924號(hào)(Beauchamp)中披露了一種用于制備這樣的氨基酸酯的方法，該專利正文結(jié)合于此作為參考。作為使用纈氨酸本身的替代品，可以使用氨基酸的功能等價(jià)物(例如，酸性鹵化物如酸性氯化物或酸酐)。在這樣的情況下，為了避免不期望的副反應(yīng)，使用氨基保護(hù)的衍生物可能是有利的。
II.活性化合物 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該活性化合物具有化學(xué)式(I)-(IV)
或者其藥用鹽或藥物前體，其中 i)X是O、CH2、S、SO2、NH、P＝O(OH)、C＝CH2、C＝CHF或C＝CF2； ii)Y是O或S； iii)Z是-CH2、-CH2CH2、-CH2O、-CH2S或CH2NH(均為碳原子連接至磷原子)； iv)R1是氫、烷基、鹵代烷基(包括但不限于CH2F和CF3)、鹵素、疊氮基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯基、炔基、鹵代鏈烯基(包括但不限于Br-乙烯基)、烷氧基、鏈烯氧基、烷硫基(alkylthio)、酰氧基、烷氧基?；?烷氧?；琣lkyloxyacyl)、烷基羰基、?；蚧?acylthio)或酰氨基； v)R2是H、磷酸酯(phosphate)(包括但不限于單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或穩(wěn)定化的磷酸酯藥物前體)、磷硫酰(phosphothioate)、用烷基(包括但不限于C1-C6)、鏈烯基(包括但不限于C2-C6)、炔基(包括但不限于C2-C6)、芳基(包括但不限于C6-C10)或其他藥用離去基團(tuán)取代的羰基，當(dāng)體內(nèi)給予時(shí)其能夠提供一種這樣的化合物，其中R2是H或磷酸酯、磺酸酯(包括但不限于烷基或芳烷基磺酰基，例如甲基磺?；?methanesulfonyl))、芐基(其中苯基基團(tuán)可選地被如在上文給出的芳基定義中描述的一種或多種取代基所取代)、脂質(zhì)(包括但不限于磷脂)、氨基酸、肽或膽固醇； vi)R3和R4獨(dú)立地是氫、磷酸酯、二磷酸酯或一種在肝細(xì)胞中優(yōu)先去除以生成相應(yīng)的H基團(tuán)的基團(tuán)，如本文中使用的術(shù)語“在肝細(xì)胞中優(yōu)先去除”是指該基團(tuán)的至少部分在肝細(xì)胞中以高于同一基團(tuán)在非肝細(xì)胞(例如，成纖維細(xì)胞或淋巴細(xì)胞)中去除的速率的速率被去除。因此，可以設(shè)想，該可去除基團(tuán)(除去基團(tuán))包括所有藥用基團(tuán)，其可通過還原酶、酯酶、細(xì)胞色素P450或任何其他特異性肝酶而被去除。可替換地，設(shè)想的基團(tuán)還可包括那些無需在肝細(xì)胞中優(yōu)先被去除但實(shí)現(xiàn)至少一些積累和/或特異性遞送至肝細(xì)胞(例如，含所選氨基酸，包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或聚精氨酸或聚天冬氨酸的酯類)的基團(tuán)；以及 vii)堿基是具有通式(III)-(IV)的嘌呤或修飾的嘌呤
其中 W、W1、W2和W3均獨(dú)立地為N、CCF3、CC(O)NH2、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)2、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR5； W4獨(dú)立地是O、S、NH或NR’； R5和R6均獨(dú)立地選自H、鹵素(F、Cl、Br、I)、CN、N3、NO2、OH、NH2、SH、OR’、NHR’、N(R’)2，SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH2OH，CH2CN、CH2N3、COOH、COOR’、CONH2、CONHR、CON(R’)2、CH2COOH、CH2COOR’、CH2CONH2、CH2CONHR’、CH2CON(R’)2、烷基(包括但不限于C1-C6)、鏈烯基(包括但不限于C2-C6)和炔基(包括但不限于C2-C6)、環(huán)烷基((包括但不限于C3-C8)、芳基(包括但不限于C6-C10)、雜芳基(包括但不限于C6-C10)、酰基(包括但不限于C2-C6)、芳烷基和烷芳基； 其中，對(duì)于其中堿基是化學(xué)式(III)的化學(xué)式(I)，R5不能是Cl、Br、I、C1-6烷氧基、C3-6環(huán)烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、被一種或兩種取代基取代的氨基，所述取代基獨(dú)立地選自C1-6烷基和C3-6環(huán)烷基、或含有至少一個(gè)氮原子的四至六元雜環(huán)，該環(huán)通過氮原子鍵合于嘌呤堿；如果R1和R2是H，則W是CH，W1、W2和W3是N，并且R6是NH2或NHR7，其中R7是?；?； 其中，對(duì)于其中堿基是化學(xué)式(III)的化學(xué)式(I)，當(dāng)R5是OH時(shí)，R6不能是NH2，并且當(dāng)R5是NH2時(shí)，R6不能是H，如果R1和R2是H，則W是CH，W1、W2和W3是N；并且 每一個(gè)R’均獨(dú)立地是低級(jí)烷基(C1-C6烷基)、低級(jí)鏈烯基、低級(jí)炔基、低級(jí)環(huán)烷基(C3-C6環(huán)烷基)芳基、烷芳基或者芳烷基，其中所述基團(tuán)可以被如上文所定義的一種或多種取代基取代，例如羥烷基、氨基烷基和烷氧基烷基。
在一個(gè)方面，W是CH，而W1-W3是N。在另一個(gè)方面，與W2相鄰的R5是鹵素基團(tuán)、羥基基團(tuán)、烷氧基基團(tuán)或胺基基團(tuán)，其中所述胺基基團(tuán)可選地被烷基基團(tuán)、羥烷基基團(tuán)、氨基烷基基團(tuán)、環(huán)烷基基團(tuán)、鏈烯基基團(tuán)或炔基基團(tuán)取代。在又一方面，R6是H或NH2。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物是3’-疊氮基-ddA或3’-疊氮基-ddG，單獨(dú)或一起，每一種或兩種均與一種或多種針對(duì)TAM突變和/或M184V突變選擇的抗病毒化合物聯(lián)用。
本文描述的化合物可以為β-L-或β-D構(gòu)型的形式或者其混合物，包括但不限于外消旋混合物。
III.立體異構(gòu)現(xiàn)象和多態(tài)性 本文描述的化合物可以具有不對(duì)稱中心，并且作為外消旋化合物、外消旋混合物、單個(gè)非對(duì)映體或?qū)τ丑w存在，其中所有的異構(gòu)體形式均包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的具有手性中心的化合物可以以旋光和外消旋形式存在和分離。某些化合物可表現(xiàn)出多態(tài)性。本發(fā)明涵蓋本發(fā)明的化合物的外消旋、旋光、多態(tài)或立體異構(gòu)形式或其混合物，其均具有本文描述的有用特性。所述旋光形式可通過例如重結(jié)晶技術(shù)進(jìn)行的該消旋形式的拆分、通過從旋光原料合成、通過手性合成或通過利用手性靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)行層析分離或通過酶性拆分來制備。
所述化合物的旋光形式可利用本領(lǐng)域已知的任何方法來制備，包括但不限于通過例如重結(jié)晶技術(shù)進(jìn)行外消旋形式的拆分、通過從旋光原料合成、通過手性合成或通過利用手性靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)行層析分離。
獲得旋光材料的方法的實(shí)例至少包括如下方法。
i)結(jié)晶(晶體)的物理分離借助該技術(shù)，可手工分離單個(gè)對(duì)映體的肉眼結(jié)晶。如果存在獨(dú)立對(duì)映體的結(jié)晶，即該材料聚集且肉眼可區(qū)別該結(jié)晶，則可以使用該技術(shù)。
ii)同時(shí)結(jié)晶作用借助該技術(shù)，單個(gè)對(duì)映體從外消旋化合物的溶液中獨(dú)立結(jié)晶，可能只要后者(外消旋化合物)在固態(tài)是聚集物。
iii)酶法拆分借助該技術(shù)，可根據(jù)對(duì)映體的不同反應(yīng)速率用酶將消旋體部分或完全分離。
iv)酶促不對(duì)稱合成一種合成技術(shù)，借此該合成的至少一個(gè)步驟利用酶促反應(yīng)來獲得期望的對(duì)映體的對(duì)映純化或富集合成的前體。
v)化學(xué)不對(duì)稱合成一種合成技術(shù)，借此期望的對(duì)映體在可使產(chǎn)物中產(chǎn)生不對(duì)稱性(即手性)的條件下由手性前體合成，其可利用手性催化劑或手性助劑而實(shí)現(xiàn)； vi)非對(duì)映體分離借助該技術(shù)，外消旋化合物與對(duì)映體純?cè)噭?手性助劑)反應(yīng)，該試劑將單個(gè)對(duì)映體轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)映體。然后借助于其目前更加明顯的結(jié)構(gòu)差異通過層析或結(jié)晶來分離所得的非對(duì)映體，隨后去除手性助劑，從而得到期望的對(duì)映體； vii)一級(jí)和二級(jí)不對(duì)稱性轉(zhuǎn)化借助該技術(shù)，來自外消旋化合物平衡體系的非對(duì)映體產(chǎn)生了該非對(duì)映體從期望的對(duì)映體溶解的優(yōu)勢或者該非對(duì)映體從期望的對(duì)映體的優(yōu)先結(jié)晶干擾了平衡，使得最終理論上所有物質(zhì)均從期望的對(duì)映體轉(zhuǎn)化為結(jié)晶非對(duì)映體。隨后期望的對(duì)映體從非對(duì)映體中釋放； viii)動(dòng)力學(xué)拆分該技術(shù)是指借助于在動(dòng)力學(xué)條件下，對(duì)映體與手性非消旋試劑或催化劑的不同的反應(yīng)速率來實(shí)現(xiàn)外消旋化合物的部分或全部拆分(或者進(jìn)一步拆分已部分拆分的化合物)。
ix)從非消旋前體進(jìn)行對(duì)映體特異性合成借助該合成技術(shù)從非手性原料獲得期望的對(duì)映體，并且其中在合成過程中沒有或僅最小程度地?fù)p壞了立體化學(xué)完整性； x)手性液相色譜法借助該技術(shù)，在液態(tài)流動(dòng)相中通過其與固定相不同的相互作用來分離外消旋化合物的對(duì)映體(包括但不限于通過手性HPLC)。所述固定相可由手性材料制成或者所述流動(dòng)相可包含另外的手性材料以激發(fā)不同的相互作用； xi)手性氣相色譜法借助該技術(shù)，外消旋化合物被揮發(fā)，并且對(duì)映體通過其在氣態(tài)流動(dòng)相中與柱(包含固定的非消旋手性吸收劑相)不同的相互作用而分離； xii)利用手性溶劑提取借助該技術(shù)，對(duì)映體通過將一種對(duì)映體優(yōu)先溶解到特定的手性溶劑中而分離； xiii)跨手性膜轉(zhuǎn)運(yùn)借助該技術(shù)，使外消旋化合物與薄隔膜接觸。該隔膜通常分離兩種互溶流體，一種包含該外消旋化合物，并且諸如濃度或壓力差的驅(qū)動(dòng)力引起跨隔膜的優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)。由于該膜的非消旋手性性質(zhì)僅允許外消旋化合物的一種對(duì)映體通過從而實(shí)現(xiàn)分離。
在一個(gè)實(shí)施方式中使用手性色譜，包括但不限于模擬移動(dòng)床色譜。各種手性固定相是商業(yè)上可獲得的。
IV.核苷酸鹽或藥物前體制劑 在化合物足夠堿性或酸性以形成穩(wěn)定的非毒性酸或堿鹽的情況下，該化合物作為藥用鹽給予可能是適當(dāng)?shù)?。藥用鹽的實(shí)例是與形成生理可接受陰離子的酸形成的有機(jī)酸加成鹽，如甲苯磺酸鹽、甲烷磺酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽(tartarate)、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽和α-甘油磷酸鹽。還可形成合適的無機(jī)鹽，包括但不限于硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽和碳酸鹽。
藥用鹽可利用本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)步驟而獲得，例如通過使足夠堿性的化合物如胺與合適的酸(提供生理可接受的陰離子)反應(yīng)。還可制備堿性金屬(如鈉、鉀或鋰)或堿土金屬(如鈣)的羧酸鹽。
本文描述的任何一種核苷均可作為核苷酸藥物前體而給予，以增加該核苷的活性、生物利用度、穩(wěn)定性或以其他方式改變其特性。已知大量的核苷藥物前體的配體。通常，該核苷的單、二或三磷酸酯的烷基化、?；蚱渌H脂性修飾將增加該核苷酸的穩(wěn)定性?？扇〈姿狨ゲ糠稚系囊粋€(gè)或多個(gè)氫的取代基的實(shí)例為烷基、芳基、類固醇、碳水化合物，包括但不限于糖類、1，2-甘油二酯和醇類。許多描述在R.Jones&N.Bischofberger，Antiviral Research，1995，27，1-17中。這些中的任何一種均可與所披露的核苷聯(lián)用以達(dá)到期望的效果。
活性核苷還可作為5’-磷醚脂質(zhì)(phosphoether lipid)或5’-醚脂質(zhì)而提供，如在下面的文獻(xiàn)(均結(jié)合于此作為參考)中所披露的Kucera，L.S.，N.Iyer，E.Leake，A.Raben，Modest E.K.，D.L.W.，and C.Piantadosi，“Novel membrane-interactive ether lipid analogs thatinhibit infectious HIV-1 production and induce defective virusformation，”AIDS Res.Hum.Retroviruses，1990，6，491-501；Piantadosi，C.，J.Marasco C.J.，S.L.Morris-Natschke，K.L.Meyer，F(xiàn).Gumus，J.R.Surles，K.S.Ishaq，L.S.Kucera，N.Iyer，C.A.Wallen，S.Piantadosi，and E.J.Modest，“Synthesis and evaluation of novel etherlipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity，”J.Med.Chem.，1991，34，1408-14；Hosteller，K.Y.，D.D.Richman，D.A.Carson，L.M.Stuhmiller，G.M.T.van Wijk，and H.van den Bosch，“Greatlyenhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1replication in CEM and HT4-6C cells by 3’-deoxythymidinediphosphate dimyristoylglycerol，a lipid prodrug of3，-deoxythymidine，”Antimicrob.Agents Chemother.，1992，36，2025-29；Hostetler，K.Y.，L.M.Stuhmiller，H.B.Lenting，H.van denBosch，and D.D.Richman，“Synthesis and antiretroviral activity ofphospholipid analogs of azidothymidine and other antiviralnucleosides.”J.Biol.Chem.，1990，265，61127。
披露合適的親脂性取代基(其可共價(jià)摻入核苷中，優(yōu)選在該核苷或親脂性制劑的5’-OH位置)的美國專利的非限制性實(shí)例包括美國專利第5,149,794號(hào)(Yatvin et al.)；5,194,654(Hostetler et al.)、5,223,263(Hostetler et al.)；5,256,641(Yatvin et al.)；5,411,947(Hostetler et al.)；5,463,092(Hostetler et al.)；5,543,389(Yatvin etal.)；5,543,390(Yatvin et al.)；5,543,391(Yatvin et al.)和5,554,728(Basava et al.)，將全部結(jié)合于此作為參考。披露可連接于本發(fā)明的核苷或親脂性制劑的親脂性取代基的外國專利申請(qǐng)包括WO89/02733、WO 90/00555、WO 91/16920、WO 91/18914、WO93/00910、WO 94/26273、WO 96/15132、EP 0350287、EP 93917054.4和WO 91/19721。
V.聯(lián)合或交替治療 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物可與至少一種其他抗病毒劑聯(lián)合應(yīng)用，該抗病毒劑選自侵入抑制劑(entry inhibitors)、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和基于免疫的治療劑。
例如，當(dāng)用來治療或預(yù)防HIV或HBV感染時(shí)，該活性化合物或其藥物前體或藥用鹽可與另一種抗病毒劑聯(lián)合或交替給予，例如抗HIV、抗HBV或抗HCV試劑，包括但不限于具有上面的化學(xué)式的那些試劑。通常，在聯(lián)合治療中，將有效劑量的兩種或多種試劑一起給予，而在交替治療過程中，順次給予有效劑量的每一種試劑。該劑量將依賴于該藥物的吸收、滅活和清除速率以及本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的其他因素。應(yīng)注意，劑量值還將隨著待緩解病癥的嚴(yán)重程度而變化。還應(yīng)理解，對(duì)于任何特定個(gè)體，特定劑量方案以及時(shí)間表均應(yīng)根據(jù)個(gè)體需要以及給藥或監(jiān)督組合物的給藥人員的專業(yè)判斷而隨時(shí)間加以調(diào)整。
可與本文披露的化合物組合使用的抗病毒劑的非限制性實(shí)例包括下表中的那些抗病毒劑。
乙型肝炎治療

HIV治療蛋白酶抑制劑(PIs)

HIV治療核苷/核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)

HIV治療非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)
HIV治療其他種類的藥物 細(xì)胞抑制劑

侵入抑制劑(entry inhibitor)(包括融合抑制劑)
HIV治療基于免疫的療法
在一個(gè)實(shí)施方式中，本文描述的化合物可與至少一種其他抗病毒劑一起應(yīng)用，所述抗病毒劑選自逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、融合抑制劑、侵入抑制劑(entry inhibitor)和聚合酶抑制劑。
此外，根據(jù)本發(fā)明的化合物可與一種或多種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒、抗HBV、抗HCV或抗皰疹試劑或干擾素、抗癌或抗細(xì)菌試劑(包括但不限于本發(fā)明的其他化合物)聯(lián)合或交替給予。本文所描述的某些化合物可通過降低其他化合物的代謝、分解代射或滅活來有效的增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的某些試劑的生物學(xué)活性，并且像這樣被共同給予用于該期望的效應(yīng)。
VI.藥物組合物 感染了人免疫缺陷病毒、乙型或丙型肝炎病毒或者其基因片段的宿主(包括但不限于人類)可通過在藥用載體(或稱藥學(xué)上可接受的載體)或稀釋劑存在的條件下給予患者有效量的活性化合物或者其藥用藥物前體或鹽來加以治療。該活性物質(zhì)可通過任何適當(dāng)?shù)耐緩?，例如口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或局部以液體或固體形式加以給予。
用于HIV、HBV或HCV感染的化合物的優(yōu)選劑量將在約1-50mg/kg體重/天，優(yōu)選1-20mg/kg體重/天的范圍內(nèi)，更通常地為0.1至約100mg/kg受者體重/天。藥用鹽和藥物前體的有效劑量范圍可基于待遞送的親本核苷的重量來計(jì)算。如果該鹽或藥物前體本身表現(xiàn)出活性，則有效劑量可以如上利用該鹽或藥物前體的重量而估計(jì)或通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其他方式來估計(jì)。
該化合物可以任何合適的單位劑型方便地給予，包括但不限于包含7-3000mg，優(yōu)選70-1400mg活性成分/單位劑型。50-1000mg的口服劑量通常是適宜的。
理論上，應(yīng)該給予該活性成分以達(dá)到約0.2-70μM，優(yōu)選約1.0-15μM的該活性化合物的峰值血漿濃度。這可以例如通過靜脈注射0.1-5％的活性成分溶液(可選地，在鹽水中)而實(shí)現(xiàn)，或者以該活性成分的大藥丸而給予。
藥物組合物中活性化合物的濃度將依賴于該藥物的吸收、滅活和排泄速率以及本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的其他因素。應(yīng)該注意，劑量值還將隨著待緩解病癥的嚴(yán)重程度而變化。應(yīng)進(jìn)一步理解，對(duì)于任何特定個(gè)體，具體劑量方案應(yīng)根據(jù)個(gè)體需要以及負(fù)責(zé)或監(jiān)督該組合物給藥的醫(yī)師的專業(yè)判斷而隨時(shí)間加以調(diào)整，并且本文中闡述的濃度范圍僅是示例性的，并且不用于限制所要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵺`?；钚猿煞挚梢淮谓o予或者可分為多個(gè)較小劑量以不同的時(shí)間間隔給予。
該活性化合物的給藥的優(yōu)選模式是口服。口服組合物通常將包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可以包封在明膠膠囊中或壓縮成片劑。為了用于口服治療性給藥，該活性化合物可與賦形劑結(jié)合并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用?？梢园帉W(xué)上相容的粘合劑和/或佐劑材料作為該組合物的一部分。
片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可包含下列成分中的任何一種或者類似性質(zhì)的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲酯或柑橘調(diào)味劑。當(dāng)單位劑型是膠囊時(shí)，除了上述類型的物質(zhì)以外，其還可包含液體載體如脂肪油。此外，單位劑型可包含各種能改良該劑量單位的物理形式的其他物質(zhì)，例如糖包衣、蟲膠或其他腸溶性試劑。
該化合物可作為酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、口香糖等的組成部分加以給予。除了該活性化合物以外，糖漿劑還可包含蔗糖作為甜味劑以及某些防腐劑、染料以及著色劑和調(diào)味劑。
該化合物或者其藥用藥物前體或鹽還可與其他并不減弱期望的作用的活性物質(zhì)或者與增補(bǔ)期望作用的物質(zhì)相混合，例如抗生素、抗真菌藥、抗炎藥或其他抗病毒藥(包括但不限于其他核苷化合物)。用于胃腸外、皮內(nèi)、皮下或局部施加的溶液或混懸劑可包括下列組分無菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于張力調(diào)節(jié)的試劑如氯化鈉或葡萄糖。胃腸外制劑可封入安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的倍劑量瓶中。
如果靜脈內(nèi)給藥，則優(yōu)選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該活性化合物與將保護(hù)該化合物免于從機(jī)體快速清除的載體一起制備，例如控釋制劑包括但不限于植入物和微囊遞送系統(tǒng)。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、多原酸酯和聚乳酸。例如，腸溶衣化合物可用來保護(hù)其免受胃酸分裂。用于制備這樣的制劑的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。合適的材料還可以商購獲得。
脂質(zhì)體混懸液(包括但不限于用針對(duì)病毒抗原的單克隆抗體靶向于感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也優(yōu)選作為藥用載體。這些混懸液可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法而制備，如在美國專利第4,522,811號(hào)(結(jié)合于此供參考)中所描述的。例如，脂質(zhì)體制劑可通過將適當(dāng)?shù)闹|(zhì)(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰膽堿、花生四烯酰(arachadoyl)磷脂酰膽堿和膽固醇)溶解在無機(jī)溶劑(其隨后蒸發(fā))中，在容器的表面上留下一薄層干燥的脂質(zhì)來制備。隨后將該活性化合物或其單磷酸、二磷酸和/或三磷酸衍生物的水溶液引入到該容器中。然后手動(dòng)渦旋該容器以從該容器的側(cè)面上釋放脂質(zhì)物質(zhì)并使脂質(zhì)聚集體分散，從而形成脂質(zhì)體混懸液。
在描述本發(fā)明時(shí)使用的術(shù)語是通用的，并且對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的。如本文中使用的，下列縮略詞具有指定含義 AIBN 2，2’-偶氮二異丁腈 BuLi 正丁基鋰 DMF N，N-二甲基甲酰胺 DMSO 二甲亞砜 EtOAc 醋酸乙酯 h 小時(shí) M 摩爾 MeCN 乙腈 MeOH 甲醇 min 分鐘 NaOMe 甲醇鈉 Py 吡啶 rt或RT 室溫 TBAF 四-N-丁基氟化銨 TBAT 四丁基銨三苯基二氟硅酸鹽 TBDMSCl 叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物 THF 四氫呋喃 TMSBr 三甲基甲硅烷基溴化物 TMSOTf 三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯 TsCl 對(duì)甲基苯磺酰氯 VII.用于制備活性化合物的總體方案 還提供了用于容易的制備3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷和3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷膦酸(phosphonate，膦酸鹽/酯)的方法。3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷和其膦酸(衍生物)可以如下文詳細(xì)描述的或通過本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的其他方法加以制備。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，這些方案決不是限制性的，并且在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行變動(dòng)。
各種反應(yīng)方案總結(jié)如下 方案1是合成本發(fā)明的活性化合物，并且特別是從9-(2-脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)嘌呤合成3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷I的一個(gè)非限制性實(shí)例。
方案2是合成本發(fā)明的活性化合物，并且特別是從核糖或核糖核苷合成9-(2-脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)嘌呤的一個(gè)非限制性實(shí)例。
方案3是合成本發(fā)明的活性化合物，并且特別是從木糖合成9-(2-脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)嘌呤的一個(gè)非限制性實(shí)例。
方案4是合成本發(fā)明的活性化合物，并且特別是從脫氧核糖合成9-(2-脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)嘌呤的一個(gè)非限制性實(shí)例。
方案5是合成本發(fā)明的活性化合物，并且特別是合成碳環(huán)嘌呤核苷的一個(gè)非限制性實(shí)例。
方案6是合成本發(fā)明的活性化合物，并且特別是通過處理3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷的2或6位而合成3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷的一個(gè)非限制性實(shí)例。
方案7是合成本發(fā)明的活性化合物，并且特別是合成3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷膦酸(phosphonate)的一個(gè)非限制性實(shí)例。
方案8是合成本發(fā)明的活性化合物，并且特別是合成碳環(huán)3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷膦酸(衍生物)的一個(gè)非限制性實(shí)例。
方案9是合成本發(fā)明的活性化合物，并且特別是合成3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷膦酸(衍生物)的一個(gè)非限制性實(shí)例。
方案10是合成本發(fā)明的活性化合物，并且特別是合成3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧鳥苷的一個(gè)非限制性實(shí)例。
方案11是合成本發(fā)明的活性化合物，并且特別是合成3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧鳥苷類似物(62-65)的一個(gè)非限制性實(shí)例。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括9-(2-脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)嘌呤I的疊氮基取代，在Mitsunobu條件下直接取代(參見Marchand et al.，Nucleosides Nucleotides&Nucleic Acids，2000，19，205-17)或者通過磺酸酯中間體用疊氮化鋰、疊氮化鈉或疊氮化銨，隨后脫保護(hù)，如方案1中所述。該磺酸酯可為甲烷磺酸酯、甲苯磺酸酯、三甲基硅酯(triflate)或其他合適的離去基團(tuán)，并且去保護(hù)條件可隨5’-O-保護(hù)而變化。5’位置的保護(hù)基團(tuán)可以為酯(如Bz，Ac)、醚(如三苯甲基或MOM)、甲硅烷基(如TBDMS或TBDPS)或其他保護(hù)基團(tuán)。通常，甲醇銨用于去除酯保護(hù)，并且酸性條件如HOAc或HCl可用于去除三苯甲基保護(hù)。為了去保護(hù)甲硅烷基基團(tuán)，可以使用TBAF或NH4F。

方案1.從9-(2-脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)嘌呤合成3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷I。
化合物1可以通過各種途徑來制備。方案2中所示的第一種途徑基于Robins’過程，其通過脫氧作用以及同時(shí)以一鍋方式翻轉(zhuǎn)3’-羥基而將2’-O-甲苯磺?；塑?轉(zhuǎn)化為2’-脫氧-3’-向上核苷6(參見Hansske et al.，J.Am.Chem.Soc.1983，105，6736)。該甲苯磺酸鹽5可通過Wagner-Moffatt過程(參見Wagner et al.，J.Org.Chem.1974，39，24)由嘌呤核苷4而制備，而嘌呤核苷4則可從核糖3(X＝O，S)與嘌呤(或修飾嘌呤)堿基縮合而制備或者可以由商購來源獲得。5’-羥基保護(hù)后，獲得了3’-羥基-向上核苷1a。

方案2.從核糖或核糖核苷合成9-(2-脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)嘌呤1a。X＝O、S、CH2；B＝保護(hù)或未保護(hù)的嘌呤堿；試劑和條件；(a)當(dāng)X＝O或S時(shí)i)TMSOTf，甲苯，保護(hù)或硅烷化的嘌呤；ii)NH3，MeOH；(b)i)Bu2SnO，MeOH；ii)TsCl，Et3N；(c)LiEt3BH，THF，DMSO；(d)TBDMSCl，咪唑，DMF。
第二種途徑利用木糖7與硅烷化或保護(hù)的嘌呤或修飾的嘌呤堿的縮合。所得到的木糖核苷8可被選擇性脫酰并被脫氧以得到化合物10。去保護(hù)和硅烷化后，化合物10可以被轉(zhuǎn)化為1a(方案3)。

方案3.從木糖合成9-(2-脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)嘌呤1a。X＝O或S；B＝保護(hù)或未保護(hù)的嘌呤堿；試劑和條件(a)TMSOTf，甲苯；(b)H2NNH2.H2O，AcOH，Py；(c)i)PhOCSCl，DMAP，MeCN；ii)(Me3Si)3SiH，AIBN，二氧雜環(huán)己烷；(d)NH3，MeOH；(e)TBDMSCl，咪唑，DMF。
用于制備化合物1的第三種途徑涉及2-脫氧-糖12與硅烷化或保護(hù)的嘌呤堿或修飾的嘌呤堿的縮合。獲得的苯甲酰化的2’-脫氧嘌呤核苷13可通過去保護(hù)和選擇性苯甲?；D(zhuǎn)化為3’-未保護(hù)的化合物14。利用Herdewijn的過程翻轉(zhuǎn)3’-羥基，將14轉(zhuǎn)化為1b(方案4)。

方案4.從脫氧核糖合成9-(2-脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)嘌呤1b。X＝O或S；B＝保護(hù)或未保護(hù)的嘌呤堿；試劑和條件(a)MeCN；(b)i)NH3，MeOH；ii)BzCl，Py；(c)i)(CF3SO2)2O，Py，CH2Cl2，H2O；ii)MeOH，NaHCO3。
為了合成碳環(huán)核苷4，可采用Jung’s法。該方法涉及將Vince內(nèi)酰胺15轉(zhuǎn)化為戊烯基氨基磺酸酯16以及隨后的Trost加成(參見Jung et al.，J.Org.Chem.1994，59，4719-20)。所得到的不飽和碳環(huán)核苷17可以被氧化成18，并且后者化合物可去保護(hù)成碳環(huán)核苷4(方案5)。按照方案1和2中描述的步驟，可從化合物4制備碳環(huán)類似物I。

方案5.合成碳環(huán)嘌呤核苷4。B＝保護(hù)或未保護(hù)的嘌呤堿；試劑和條件(a)參照J(rèn)ung et al.，J.Org.Chem.1994，59，4719-4720；(b)i)Pd(OAc)2，P(OiPr)3，THF，n-BuLi；ii)NaH，DMSO，嘌呤堿；(c)OsO4；(d)NH3，MeOH。
為了合成4’-取代的3’-疊氮基嘌呤核苷，在嘌呤堿基偶聯(lián)之前或之后，可以使用多種方法學(xué)。例如，可以使用4’-5’-不飽和糖從而通過環(huán)氧化物(參見Haraguchi et al.，J.Org.Chem.2006，71，4433-38)或碘/親核基團(tuán)組合(參見Connolly et al.，2005，WO2005/000864A1)在4’位置引入各種取代基。在另一個(gè)實(shí)例中，該4’-C-羥甲基可由甲醛或其等價(jià)物制備，并被轉(zhuǎn)化為4’-位置的多種取代基(參見Kohgo，et al.，Nucleosides&Nucleotides 2004，23，671-90；Siddiqui，et al.，J.Med.Chem.2004，47，5041-8)。
為了合成2-和/或6-修飾的3’-疊氮基嘌呤核苷，可采用功能性處理的方法學(xué)(方案6)。例如，Robins’重氮化法可用來合成2-或6-取代的嘌呤核苷，其中氨基基團(tuán)通過重氮中間體轉(zhuǎn)化為鹵素或氫。6-氟代核苷可通過三甲基銨鹽中間體從6-氯代化合物23而合成(參見ref.Gurvich et al.，Nucleosides&Nucleotides 1999，18，2327-33；Kim et al.，J.Med.Chem.1999，42，324-8)。從6-氯代化合物23，還可制備其他6-烷基氨基取代的核苷。方案6中描述了這些制備過程。在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，其他功能性轉(zhuǎn)化還可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他反應(yīng)來進(jìn)行。

方案6.通過處理3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷的2或6位來合成3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷。X＝O、S、CH2；試劑和條件(a)ref.Francom et al.，J.Org.Chem.2002，67，6788-96；Francomet al.，J.Org.Chem.2003，68，666-669；(b)NH3，MeOH，0℃；(c)i)NMe3，二甲氧基乙烷；ii)TBAT，DMF；(d)i)NMe3，DMF，THF；ii)KF，DMF；(e)NH3或烷基胺。
3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷膦酸II(R3和R4＝H，X＝O，S)可通過采用Kim’s法而合成(參見Kim et al.，J.Org.Chem.1991，56，2642)。關(guān)鍵中間體呋喃烯糖27可利用Horwitz法(參見Zemlickaet al.，J.Am.Chem.Soc.1972，94，3213-8)從2’-脫氧核苷25而制備。從烯糖27，通過氯化苯硒加成以及隨后在高氯酸銀存在下用二甲基(羥甲基)膦酸酯取代或者直接在N-(苯硒)酞酰亞胺或溴化碘的輔助下引入(二甲基膦?；?甲氧基功能性。苯硒或碘基的清除導(dǎo)致形成雙鍵產(chǎn)物29，其一旦氧化即產(chǎn)生核糖核苷30。該核糖核苷30可通過采用Robins’過程(參見Hansske et al.，J.Am.Chem.Soc.1983，105，6736)以及隨后的甲磺?；D(zhuǎn)變?yōu)榧谆撬猁}33，與方案2中所述類似的合成。用疊氮化物取代隨后去保護(hù)，將33轉(zhuǎn)化為3’-疊氮基-2’，3’-二脫氧嘌呤核苷膦酸II，如方案7中所描述的。

方案7.3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷膦酸II的合成。X＝O或S；B＝保護(hù)或未保護(hù)的嘌呤堿；試劑和條件(a)Pt，pH 9或CrO3，Py或KMnO4；(b)DMF，二甲基甲酰胺二新戊基乙縮醛，80-90℃；(c)i)PhSeCl，-70℃；ii)AgClO4，(MeO)2P(＝O)CH2OH；或N-(苯硒)酞酰亞胺，(MeO)2P(＝O)CH2OH；(d)NaIO4；(e)OsO4；(f)i)Bu2SnO，MeOH；ii)TsCl，Et3N；(g)LiEt3BH，THF，DMSO；(h)MsCl，Py；(i)LiN3，DMF；(j)TMSBr。
由于4’-羥基碳環(huán)核苷的穩(wěn)定性，因此該碳環(huán)核苷36可直接通過Trost反應(yīng)從環(huán)戊烯醇酯35而制備。36的保護(hù)和氧化產(chǎn)生了碳環(huán)核苷37，其可以與方案2中所描述的類似的方式轉(zhuǎn)化為甲磺酸鹽40。用疊氮化物取代甲磺酸鹽40隨后去保護(hù)可得到3’-疊氮化合物42，其可與(EtO)(OH)P(＝O)CH2Ots縮合以得到磷酸酯43。通過去保護(hù)反應(yīng)，可獲得碳環(huán)3’-疊氮基核苷膦酸II(R3和R4＝H，X＝CH2)(方案8)。

方案8.碳環(huán)3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷膦酸II的合成。B＝保護(hù)或未保護(hù)的嘌呤堿；試劑和條件(a)Pd(PPh3)4，PPh3，NaH，Base；(b)i)CH2(OMe)2，CH2Cl2，TfOH；ii)OsO4；(c)i)Bu2SnO，MeOH；ii)TsCl，Et3N；(d)LiEt3BH，THF，DMSO；(e)MsCl，Py；(f)LiN3，DMF；(g)CF3COOH，CH2Cl2；(h)(EtO)(HO)P(＝O)CH2OTs，NaH；(i)TMSBr。
5’-脫氧核苷膦酸II(Z＝CH2)可從5’-碘代化合物46合成，46可通過甲苯磺?；偷饣瘡暮塑?4而制備。用磷酸三乙酯取代碘代化合物46隨后去保護(hù)，可獲得3’-疊氮基嘌呤核苷膦酸II(方案9)。該方法已廣泛用于合成5’-脫氧核苷膦酸(參見Holy，et al.，Tetrahedron Lett.1967，881-884)。
5’-亞甲基膦酸II(Z＝CH2CH2)也可通過與二異丙基鋰代甲烷膦酸酯縮合隨后去保護(hù)而從5’-碘代化合物46來合成，這是Wolff-Kugel和Halazy使用的一種方法(參見Wolff-Kungel，Halazy，Tetrahedron Lett.1991，32，6341-4)。方案9中描述了該過程。

方案9.3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷膦酸II的合成。X＝O，S，CH2；B＝保護(hù)或未保護(hù)的嘌呤堿；試劑和條件(a)TsCl，Py；(b)NaI，EtCOMe；(c)(EtO)3P；(d)TMSBr；(e)LiCH2P(＝O)(iPrO)2。
通式(IV)的修飾嘌呤可通過多種方法來制備，包括但不限于1)糖與雜芳基溴化鎂鹽的C-雜芳基化(參見Cornia，M.et al.，J.Org.Chem.1991，40，19-34)；2)吲哚-2-硫酮(或嘌呤-8-硫酮)與呋喃核糖衍生物之間的Knoevenagel型縮合(參見Chen，JJ et al.，Nucleosides Nucleotides&Nucleic Acids，2005，24，1417-37)；或由SnCl4/AgOTfa促進(jìn)的苯并噻吩與1-O-Me-脫氧核糖的Friedel-Crafts型糖基化，(參見Hainke，S.et al.，Org.Biomol.Chem.2005，23，2233-8)；和4)一種用于芳基C-糖基化的通用方法，涉及有機(jī)鎘化合物或諾爾芒銅酸鹽(Normantcuprates)與受保護(hù)的呋喃核糖基氯的偶聯(lián)(參見Ren，RXF，et al.，J.Am.Chem.Soc.1996，118，7671-78)。
除了上面描述的方法以外，其他方法如轉(zhuǎn)糖基作用(參見Robins et al.，J.Med.Chem.1989，32，1763-8；Freeman et al.，Bioorg.Med.Chem.1995，3，447-58)，3’-疊氮基糖-堿基縮合(參見Fleet etal.，Tetrahedron 1988，44，625-36)以及那些在最近一篇綜述性文章中闡述的方法(參見Pathak，Chem.Rev.2002，102，1623-67)，也可用來合成3’-疊氮基嘌呤核苷和其膦酸(衍生物)。
本發(fā)明將在下列實(shí)施例中得到進(jìn)一步闡釋。方案10-11和實(shí)施例1-13示出了用于合成3’-疊氮基嘌呤的制備方法，而實(shí)施例14-26示出了3’-疊氮基嘌呤核苷類似物的生物學(xué)評(píng)價(jià)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能夠理解，這些實(shí)施例決不是限制性的，并且在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行改變。
具體的實(shí)施例 代表本發(fā)明的特定化合物按照下列實(shí)施例和反應(yīng)順序而制備；描述反應(yīng)順序的實(shí)施例和圖通過舉例說明的方式給出，以幫助理解本發(fā)明，并且不應(yīng)解釋為以任何方式限制其后將在權(quán)利要求中闡述的本發(fā)明。本發(fā)明的化合物還可在隨后的實(shí)施例中用作中間體以產(chǎn)生本發(fā)明的另外的化合物。無需嘗試優(yōu)化在任何反應(yīng)中獲得的產(chǎn)量。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將清楚如何通過反應(yīng)時(shí)間、溫度、溶劑和/或試劑的常改變來增加這樣的產(chǎn)量。
無水溶劑購自Aldrich Chemical Company，Inc.(Milwaukee)。試劑由商業(yè)來源購買。除非另有指出，否則實(shí)施例中使用的物質(zhì)易于從供應(yīng)商處獲得或者通過化學(xué)合成領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來合成。熔點(diǎn)(mp)在電熱數(shù)字熔點(diǎn)裝置上測定，并且未經(jīng)校正。1H和13C NMR光譜在室溫下在Varian Unity Plus 400光譜儀上采集并以距內(nèi)在四甲基硅烷的ppm報(bào)告。進(jìn)行氘交換，去偶實(shí)驗(yàn)或2D-COSY以確認(rèn)質(zhì)子分配。信號(hào)多樣性由s(單一)、d(二重)、dd(雙組雙重)、t(三重)、q(四重)、br(寬)、bs(寬單一)、m(多重)來表示。所有J-值以Hz為單位。質(zhì)譜在Micromass PlatformLC光譜儀上利用電噴射技術(shù)來確定。元素分析由Atlantic MicrolabInc.(Norcross，GA)實(shí)施。分析型TLC在Whatman LK6F硅膠板上實(shí)施，而制備型TLC在Whatman PK5F硅膠板上實(shí)施。柱層析在硅膠上或通過逆向高效液相色譜法而實(shí)施。

方案10.3’-疊氮基-2’，3’-二脫氧鳥苷(56)的合成。
實(shí)施例1 N2-異丁?；?2’-脫氧鳥苷(50) 將2’-脫氧鳥苷(49)(5g，18.72mmol)與吡啶(100mL)共蒸發(fā)3次，并懸浮在干吡啶(100mL)中。加入三甲基氯硅烷(11.88mL，93.63mmol)，并在室溫下攪拌所得溶液2h。加入異丁酸酐(15.54mL，93.65mmol)，并在氬氣氛下在室溫下攪拌混合物4h。在冰浴中冷卻反應(yīng)，然后加入水(30mL)。15分鐘后，加入29％氨水(30mL)，并攪拌該反應(yīng)15分鐘。然后使溶液蒸發(fā)至僅干燥，并將殘留物溶解在水(300mL)中。用二氯甲烷(150mL)沖洗含水層，并且在水中迅速出現(xiàn)結(jié)晶。過濾該化合物，隨后在真空下過夜干燥，以獲得標(biāo)題化合物50(4.75g，75％)作為白色固體。1H NMR(DMSO-d6)δ1.01-1.10(m，6H，2xCH3)，2.20-2.26(m，1H，H-2’)，2.46-2.57(m，1H，H-)，2.71-2.76(m，1H，H-)，3.43-3.55(m，2H，H-5’，H-5”)，3.77-3.81(m，1H，H-4’)，4.31-4.35(m，1H，H-)，4.93(br s，OH)，5.29(br s，OH)，6.17(t，1H，J＝6.0Hz，H-1’)，8.20(s，1H，H-8)，10.97(br s，2x NH)。
實(shí)施例2 5’-O-苯甲酰-N2-異丁?；?2’-脫氧鳥苷(51) 向在無水DMF(44mL)中的N2-異丁酰基-2’-脫氧鳥苷(50)(1g，2.96mmol)的溶液中加入Et3N(1.5mL)和4-二甲基氨基吡啶(15mg，0.12mmol)。在攪拌的情況下，將在無水DMF(10mL)中的苯甲酸酐(740mg，3.27mmol)的溶液在2h的時(shí)間內(nèi)逐滴加入到該溶液中。該反應(yīng)在室溫下攪拌過夜。蒸發(fā)溶劑，并將該混合物通過柱層析在硅膠柱上純化，并用CH2Cl2-MeOH(9∶1)洗脫，以給出標(biāo)題化合物51(0.6g，46％)作為白色固體。1H NMR(DMSO-d6)δ1.03-1.09(m，6H，2xCH3)，2.32-2.39(m，1H，H-2’)，2.47-2.73(m，2H，H-2”，異丁?；鵆H)，4.08-4.12(m，1H，H-)，4.35-4.40(m，1H，H-5’)，4.44-4.48(m，1H，H-5”)，4.51-4.55(m，1H，H-)，5.52(br s，1H，5’-OH)，6.22(t，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，7.47-7.51(m，2H苯甲酰)，7.60-7.64(m，1H苯甲酰)，7.86-7.91(m，2H苯甲酰)，8.15(s，1H，H-8)，11.61(br s，NH)，12.04(br s，NH)。
實(shí)施例3 N2-異丁酰基-9-(5-O-苯甲酰-2-脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)-鳥嘌呤(52) 在0℃下向在無水二氯甲烷(200mL)和無水吡啶(30mL)中的51(5g，11.33mmol)的混懸液中逐滴加入三氯甲烷磺酸酐(5.8mL，33.99mmol)。移走冷卻浴后，在室溫下攪動(dòng)反應(yīng)30分鐘，直至反應(yīng)混合物澄清。隨后加入水(20mL)，并在室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3h。使有機(jī)層分離并蒸發(fā)。然后將殘留的油通過柱層析在硅膠上純化，并用CH2Cl2-MeOH(95∶5)洗脫，得到標(biāo)題化合物52(0.5g，10％)以及N2-異丁?；?9-(3-O-苯甲酰-2-脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)-鳥嘌呤(53)(1.93g，39％)和N2-異丁酰基-9-(5-O-苯甲酰-2，3-雙脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)-(N3→3’)-環(huán)鳥苷(54)(0.89g，18％)。
52的數(shù)據(jù)1H NMR(DMSO-d6)β1.06-1.08(m，6H，2xCH3)，2.27-2.31(m，1H，H-2’)，2.67-2.77(m，2H，H-2”，異丁?；鵆H)，4.26-4.42(m，1H)，4.44-4.47(m，2H)，4.54-4.59(m，1H)，5.65(d，1H，J＝4.0Hz，3’-OH)，6.15(d，1H，J＝6.4Hz，H-1’)，7.46-7.51(m，2H苯甲酰)，7.59-7.62(m，1H苯甲酰)，7.90-7.92(m，2H苯甲酰)，8.20(s，1H，H-8)，11.68(br s，NH)，12.04(br s，NH)。
53的數(shù)據(jù)1H NMR(DMSO-d6)δ1.05-1.08(m，6H，2xCH3)，2.68-2.76(m，2H，H-2’，異丁?；鵆H)，2.91-2.99(m，1H，H-2”)，3.68-3.76(m，2H，H-5’，H-5”)，4.25-4.29(m，1H，H-4’)，4.93(t，1H，J＝5.6Hz，5’-OH)，5.63-5.65(m，1H，H-3’)，5.18-5.23(m，1H，H-1’)，7.45-7.49(m，2H苯甲酰)，7.61-7.65(m，1H苯甲酰)，7.79-7.82(m，2H苯甲酰)，8.11(s，1H，H-8)，11.68(br s，NH)，11.99(br s，NH)。
54的數(shù)據(jù)1H NMR(DMSO-d6)δ0.94-0.96(m，3H，CH3)，1.00-1.02(m，3H，CH3)，2.26-2.34(m，1H)，2.55-2.58(m，1H)，2.73-2.78(m，1H)，4.20(dd，1H，J＝4.5Hz，J＝9.0Hz，H-5’)，4.41(dd，1H，J＝4.5Hz，J＝9.0Hz，H-5”)，4.73-4.78(m，1H，H-4’)，5.61-5.64(m，1H，H3’)，6.44(d，1H，J＝3.0Hz，H-1’)，7.40-7.44(m，2H苯甲酰)，7.58-7.62(m，1H苯甲酰)，7.69-7.72(m，2H苯甲酰)，8.00(s，1H，H-8)，12.69(br s，NH)。
實(shí)施例4 53部分異構(gòu)化為52 將在MeOH(30mL)中的53(3.05g，6.91mmol)和NaHCO3(488mg，5.8mmol)的溶液在室溫下攪拌3h。溶劑蒸發(fā)后，殘留物通過層析在硅膠上純化，并用CH2Cl2-MeOH(95∶5)洗脫，以給出52(1.3g，43％)和53(1.7g，56％)。
實(shí)施例5 N2-異丁?；?9-(3-疊氮基-5-O-苯甲酰-2，3-雙脫氧-β-D-蘇型-呋喃戊糖基)-鳥嘌呤(55) 向在二氯甲烷(30mL)中的52(290mg 0.65mmol)的混合物中加入4-二甲基氨基吡啶(12mg，0.065mmol)和Et3N(0.45mL)，隨后在0℃下逐滴加入甲磺酰氯(0.121mL，1.30mmol)。所得的混合物在0℃下在氬氣中攪拌40min，然后用水(20mL)進(jìn)行水解。使有機(jī)層分離并蒸發(fā)。將殘留的油稀釋在無水DMF(20mL)中。向該溶液中加入疊氮化鈉(410mg，6.5mmol)，并將該混合物在120℃下在氬氣下加熱2h。將反應(yīng)冷卻至室溫，用AcOEt稀釋并用水沖洗。使有機(jī)層蒸發(fā)，然后將殘留物通過柱層析在硅膠柱上純化，并用CH2Cl2-MeOH(9∶1)洗脫，以給出55(200mg，65％)作為白色固體。IR 2104cm-1(N3)；1H NMR(DMSO-d6)δ1.08-1.12(m，6H，2xCH3)，2.50-2.79(m，2H，H-2’，異丁?；鵆H)，2.91-3.01(m，1H，H-2’)，4.18-4.23(m，1H，H-4’)，4.42-4.56(m，2H，H-5’，H-5”)，4.83-4.89(m，1H，H-3’)，6.21(t，1H，J＝5.4Hz，H-1’)，7.45-7.50(m，2H苯甲酰)，7.62-7.66(m，1H苯甲酰)，7.85-7.88(m，2H苯甲酰)，8.20(s，1H，H-8)，11.53(br s，NH)，11.91(br s，NH)。
實(shí)施例6 3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧鳥苷(56)(也稱為3’-疊氮基-ddG) 向在CH2Cl2(180mL)中的55(1.4g，3.00mmol)的溶液中加入NaOMe(在MeOH中的0.5M溶液，2mL)。在45℃下攪拌該反應(yīng)溶液4h，隨后蒸發(fā)至干燥。將殘留物通過柱層析在硅膠柱上純化，并用AcOEt/MeOH/H2O(75∶20∶5)洗脫，以給出標(biāo)題化合物56(500mg，57％)作為白色固體。IR 2104cm-1(N3)；1H NMR(DMSO-d6)δ2.35-2.50(m，1H，H-2’)，2.71-2.78(m，1H，H-2”)，3.51-3.57(m，2H，H-5’，H-5”)，3.83-3.86(m，1H，H-4’)，4.51-4.58(m，1H，H-3’)，5.08-5.14(m，1H，5’-OH)，6.05(t，1H，J＝6.3Hz，H-1’)，6.53(br s，2H，NH2)，7.91(s，1H，H-8)，1068(br s，1H，NH)。

方案11.3′-疊氮基-2′，3′-雙脫氧鳥苷類似物(62-65)的合成。
實(shí)施例7 2-異丁基氨基-9-(5-O-苯甲酰-3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-(2，4，6-三異丙基磺酰基)-9H-嘌呤(57) 向在CH2Cl2(10mL)中的化合物55(0.08g，0.17mmol)的溶液中加入三乙胺(0.04mL，0.42mmol)，雙脫氧氨基吡啶(0.004g，0.03mmol)和三異丙基苯磺酰氯(0.07g，0.24mmol)，并在室溫下攪拌6-10h。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干燥，并通過柱層析EtOAc∶己烷(3∶2)來純化殘留物，以獲得57(0.08g，88％)作為淺黃色固體。1H NMR(DMSO-d6)δ0.90-0.96(m，6H，2x CH3)，1.06-1.18(m，18H，異丙基)，2.56-2.59(m，1H，H-2’a)，2.69-2.74(m，1H，H-2’b)，2.90-2.95(m，1H)，3.01-3.06(m，1H，CH-異丙基)，4.01-4.11(m，3H，H-4’，CH-異丙基)，4.40-4.50(m，2H，H-5’b，H-5’a)，5.62-5.5(m，1H，H-3’)，6.29-6.30(m，1H，H-1’)，7.33-7.39(m，4H，Ar)，7.53-7.57(m，1H，Ar)，7.73-7.74(m，2H，Ar)，8.49(s，1H，H-8)。針對(duì)C36H44N8O7S計(jì)算的LCMS為732.3，觀察到的(M+1)為733.4。
實(shí)施例8 2-異丁基氨基-9-(5-O-苯甲酰-3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤(58) 向在THF(10mL)中的化合物57(0.07g，0.09mmol)的溶液中加入丙烯胺(0.03g，0.47mmol)并在55℃下回流15h。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干燥，并通過柱層析CH2Cl2∶MeOH(9∶1)來純化殘留物，以獲得58(0.04g，83％)作為一種漿劑。1H NMR(CDCl3)δ1.18-1.20(s，6H，2xCH3)，2.43-2.50(m，1H，H-2’a)，3.01-3.03(m，1H，H-2’b)，4.09-4.18(m，2H，H-5’a)，4.25-4.28(m，1H，H-5’b)，4.44-4.53(m，2H，H-4’，CH2烯丙基)，5.10-5.25(m，3H，H-3’，烯丙基)，5.90-5.96(m，1H，CH烯丙基)，6.10-6.13(m，1H，H-1’)，7.32-7.35(m，2H，Ar)，7.46-7.48(m，1H，Ar)，7.55(s，1H，H-8)，7.89-7.91(m，2H，Ar)。針對(duì)C24H27N9O4計(jì)算的LCMS為505.2，觀察到的(M+1)為506.3。
實(shí)施例9 2-氨基-9-(3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-烯丙基氨基-9H-嘌呤(62) 向在CH2Cl2(10mL)中的化合物58(0.04g，0.07mmol)的溶液中加入在MeOH中的0.5M的NaOMe(0.03mL)的溶液。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物24h，蒸發(fā)至干燥并通過柱層析在硅膠CH2Cl2∶MeOH(9∶1)上純化，以獲得62(0.019g，73％)作為白色固體。1H NMR(CDCl3)δ2.26-2.31(dd，1H，J＝5.6Hz，13.6Hz，H-2’a)，3.09-3.12(m，1H，H-2’b)，3.69-3.73(d，1H，J＝12.8Hz，H-5’a)，3.97-4.01(d，1H，J＝12.8Hz，H-5’b)，4.19(m，3H，H-4’，CH2烯丙基)，4.53-4.55(d，1H，J＝6.0Hz，H-3’)，4.83(brs，2H，NH2)，5.14-5.16(d，1H，J＝8.0Hz，烯丙基)，5.23-5.27(d，1H，J＝16.0Hz，烯丙基)，5.88-5.92(m，2H，CH烯丙基，NH)，6.04-6.08(m，1H，H-1’)，7.46(s，1H，H-8)。針對(duì)C13H19N9O2計(jì)算的LCMS為331.1，觀察到的(M+1)為332.1。
實(shí)施例10 2-異丁基氨基-9-(5-O-苯甲酰-3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧-β-D赤-呋喃戊糖基)-6-N-甲基烯丙基氨基-9H-嘌呤(59) 向在THF(10mL)中的化合物57(0.07g，0.09mmol)的溶液中加入N-甲基丙烯胺(0.04mL，0.63mmol)并在55℃下回流15h。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干燥，并通過柱層析CH2Cl2∶MeOH(9∶1)來純化殘留物，以獲得59(0.035g，73％)作為一種漿劑。1H NMR(CDCl3)δ1.20(s，6H，2x CH3)，2.47-2.54(m，1H，H-2’a)，3.10-3.17(m，1H，H-2’b)，4.19-4.24(m，1H，H-5’a)，4.49-4.54(m，2H，H-5’b，H-4’)，4.68-4.72(m，2H，CH2烯丙基)，5.13-5.18(m，3H，H-3’，CH2烯丙基)，5.89-5.95(m，1H，CH烯丙基)，6.12-6.15(m，1H，H-1’)，7.35-7.37(m，2H，Ar)，7.48-7.50(m，1H，Ar)，7.66(s，1H，H-8)，7.91-7.93(m，2H，Ar)。針對(duì)C25H29N9O4計(jì)算的LCMS為519.2，觀察到的(M+1)為520.3。
實(shí)施例11 2-氨基-9-(3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-N-甲基烯丙基氨基-9H-嘌呤(63) 向在CH2Cl2(10mL)中的化合物59(0.03g，0.05mmol)的溶液中加入在MeOH中的0.5M的NaOMe(0.015mL)的溶液。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物24h，蒸發(fā)至干燥并通過柱層析在硅膠CHC2l2∶MeOH(9∶1)上純化，以獲得63(0.015g，75％)作為白色固體。1H NMR(CDCl3)δ2.26-2.31(m，1H，H-2’a)，2.45(s，3H，CH3)，3.10-3.14(m，1H，H-2’b)，3.71-3.80(m，1H，H-5’a)，3.97-4.01(d，1H，J＝13Hz，H-5’b)，4.18(m，1H，H-4’)，4.65(m，1H，H-3’)，4.85(brs，2H，NH2)，5.14-5.16(m，2H，CH2烯丙基)，5.88-5.92(m，1H，CH-烯丙基)，6.04-6.08(m，1H，H-1’)，7.62(s，1H，H-8)。針對(duì)C14H19N9O2計(jì)算的LCMS為345.3，觀察到的(M+1)為346.2。
實(shí)施例12 2-異丁基氨基-9-(5-O-苯甲酰-3’疊氮基-2’，3’-雙脫氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-氨基戊醇-9H-嘌呤(60) 向在THF(10mL)中的化合物57(0.08g，0.1mmol)的溶液中加入氨基戊醇(0.05g，0.54mmol)并在55℃下回流15h。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干燥，并通過柱層析CH2Cl2∶MeOH(9∶1)來純化殘留物，以獲得60(0.03g，56％)作為一種漿劑。1H NMR(CDCl3)δ1.19-1.21(s，6H，2x CH3)，1.43-1.492(m，2H，烷基)，1.56-1.67(m，8H，烷基)，2.49-2.56(m，2H，H-2’a，CH(CH3)2)，3.13-3.19(m，1H，H-2’b)，3.45-3.62(m，4H，H-5’a，H-5’b，CH2OH)，4.20-4.25(m，1H，H-4’)，4.50-4.55(m，1H，H-3’)，6.12-6.15(m，1H，H-1’)，6.20(s，1H，NH)，7.36-7.38(m，2H，Ar)，7.49-7.53(m，1H，Ar)，7.68(s，1H，H-8)，7.91-7.94(m，2H，Ar)。針對(duì)C26H33N9O5計(jì)算的LCMS為551.2，觀察到的(M+1)為552.3。
2-氨基-9-(3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-氨基戊醇-9H-嘌呤(64) 向在CH2Cl2(10mL)中的化合物57(0.04g，0.07mmol)的溶液中加入在MeOH中的0.5M的NaOMe(0.03mL)的溶液。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物24h，蒸發(fā)至干燥并通過柱層析在硅膠CH2Cl2∶MeOH(9∶1)上純化，以獲得64(0.019g，73％)作為白色固體。1H NMR(CDCl3)δ1.40(s，6H，2XCH3)，2.29-2.33(dd，1H，J＝4.4Hz，12.4Hz，H-2’a)，3.03-3.08(m，1H，H-2’b)，3.62-3.72(m，4H，H-5’a，CH2OH)，3.96-3.99(d，1H，J＝13.2Hz，H-5’b)，4.18(s，1H，H-4’)，4.53-4.54(d，1H，J＝6.4Hz，H-3’)，4.87(brs，2H，NH2)，6.03-6.07(m，1H，H-1’)，6.27(brs，1H，NH)，7.46(s，1H，H-8)。針對(duì)C15H25N9O3計(jì)算的LCMS為377.4；觀察到的(M+1)為378.2。
實(shí)施例13 2-氨基-9-(3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-6-N-2-甲基-2-氨基-丙醇-9H-嘌呤(65) 向在THF(10mL)中的化合物57(0.03g，0.04mmol)的溶液中加入2-甲基-2-氨基丙醇(0.01mL，0.13mmol)并在55℃下回流4h。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干燥，并用于隨后的反應(yīng)而無需純化。向在CH2Cl2(10mL)中的殘留物中加入在MeOH中的0.5M的NaOMe(0.02mL)的溶液。然后在室溫下攪拌24h，蒸發(fā)至干燥并通過柱層析在硅膠CH2Cl2∶MeOH(9∶1)上純化，以獲得65(0.015g，75％)作為白色固體。1H NMR(CDCl3)δ1.25(m，8H，烷基)，2.25-2.30(dd，1H，J＝5.2Hz，14.8Hz，H-2’a)，3.07-3.14(m，1H，H-2’b)，3.49(brs，2H，2X OH)，3.59-3.62(m，2H，CH2OH)，3.68-3.72(d，1H，J＝13.2Hz，H-5’a)，3.96-3.99(d，1H，J＝12.8Hz，H-5’b)，4.17(m，1H，H-4’)，4.52-4.53(d，1H，J＝5.6Hz，H-3’)，4.93(brs，2H，NH2)，6.02-6.06(m，1H，H-1’6.27(brs，1H，NH)，7.45(s，1H，H-8)。針對(duì)C14H21N9O3計(jì)算的LCMS為363.3，觀察到的(M+1)為364.2。
實(shí)施例14 抗-HIV(在PBM細(xì)胞中)分析 所述化合物的抗-HIV-1活性在人外周血單核(PBM)細(xì)胞中進(jìn)行測定，如前所述(參見Schinazi R.F.，McMillan A.，Cannon D.，Mathis R.，Lloyd R.M.Jr.，Peck A.，Sommadossi J.-P.，St.Clair M.，Wilson J.，F(xiàn)urman P.A.，Painter G.，Choi W.-B.，Liotta D.C.Antimicrob.Agents Chemother.1992，36，2423；Schinazi R.F.，Sommadossi J.-P.，Saalmann V.，Cannon D.，Xie M.-Y.，Hart G.，Smith G.，Hahn E.Antimicrob.Agents Chemother.1990，34，1061)。在無菌DMSO中制備該化合物的儲(chǔ)存液(20-40mM)，隨后在生長培養(yǎng)基中稀釋至期望的濃度。細(xì)胞以0.01的感染復(fù)數(shù)感染原型HIV-1LAI。感染后第6天，通過逆轉(zhuǎn)錄測定對(duì)由細(xì)胞上清液獲得的病毒進(jìn)行量化，其中使用(rA)n·(dT)12-18作為模板-引物。稀釋液中存在的DMSO(＜0.1％)對(duì)病毒產(chǎn)量沒有影響。包括AZT作為陽性對(duì)照。利用之前描述的中位有效法(median effective method)從濃度-效應(yīng)曲線獲得抗病毒EC50和EC90。(參見Chou T.-C.&Talalay P.Adv.EnzymeRegul.1984，22，27-55；Belen’kii M.S.&Schinazi R.F.Antiviral Res.1994，25，1-11)。
實(shí)施例15 評(píng)估通過HIV-1RT進(jìn)行的新型APN-TPs摻入 i)蛋白表送和純化利用p6HRT-PROT表達(dá)載體在細(xì)菌中過表達(dá)HIV-1RT(xxLAI背景)(參見Shi C，Mellors JW.Arecombinant retroviral system for rapid in vivo analysis of humanimmunodeficiency virus type 1 susceptibility to reverse transcriptaseinhibitors.Antimicrob Agents Chemother.1997；412781-5)，并如前述進(jìn)行均勻純化(參見Le Grice SF，Gruninger-Leitch F.Rapidpurification of homodimer and heterodimer HIV-1 reverse transcriptaseby metal chelate affinity chromatography.Eur J Biochem.1990；187307-14；Le Grice SF，Cameron CE，Benkovic SJ.Purification andcharacterization of human immunodeficiency virus type 1 reversetranscriptase.Methods Enzymol.1995；262130-44)。所純化酶的蛋白濃度利用分光光度計(jì)在280nm處進(jìn)行測定，其中采用260450M-1cm-1的消光系數(shù)(ε280)。RT的活性位點(diǎn)濃度根據(jù)前穩(wěn)態(tài)沖擊實(shí)驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算，如前所述(參見Kati WM，Johnson KA，JervaLF，Anderson KS.Mechanism and fidelity of HIV reverse transcriptase.J Biol.Chem.1992；26725988-97)。下文所述的所有反應(yīng)均采用活性位點(diǎn)濃度而實(shí)施。
ii)前穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析在所有實(shí)驗(yàn)中均采用一種與57個(gè)核苷酸的DNA模板(5’-CTCAGACCCTTTTAGTCAGAATGGAAANTCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACA-3’)退火且5’-末端標(biāo)記[γ32P]-ATP的20核苷酸DNA引物(5’-TCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3’)。該DNA模板的第30位(N)包含T或C，這允許利用相同的20核苷酸引物來評(píng)估單核苷酸摻入動(dòng)力學(xué)?？焖俅銣鐚?shí)驗(yàn)利用Kintek RQF-3儀(KintekCorporation，Clarence，PA)來進(jìn)行。在所有實(shí)驗(yàn)中，300nM RT和60nM DNA模板/引物(T/P)均在反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.5，50mM KCl)中預(yù)孵育，然后與等體積的含20mM MgCl2的相同反應(yīng)緩沖液中的核苷酸混合。反應(yīng)在10ms至30min的時(shí)間范圍內(nèi)通過用0.5M EDTA，pH 8.0淬滅而終止。將淬滅的樣品與等體積的凝膠加樣緩沖液(98％去離子甲酰胺，10mM EDTA以及1mg/mL溴酚蘭和1mg/mL二甲苯藍(lán))混合，在85℃變性5min，并將產(chǎn)物在7M尿素-16％聚丙烯酰胺凝膠上與底物分離。采用Bio-RadGS525分子成像儀(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)分析產(chǎn)物形成。
iii)數(shù)據(jù)分析利用Sigma繪圖軟件(Jandel Scientific)以及適當(dāng)?shù)姆匠?，將從?dòng)力學(xué)分析獲得的數(shù)據(jù)通過非線性回歸進(jìn)行擬合(參見Johnson KA.Rapid quench kinetic analysis of polymerases，adenosinetriphosphatases，and enzyme intermediates.MethodsEnzymol.1995；24938-61)。用于每一個(gè)特定濃度的dNTP的表觀沖擊速率常數(shù)(kobs)均通過將產(chǎn)物形成的時(shí)程擬合于方程[產(chǎn)物]＝A[1-exp(-kobst)]而測定，其中A表示沖擊幅度。轉(zhuǎn)換數(shù)(kpol)和dNTP的表觀解離常數(shù)(Kd)通過繪制表觀催化速率、kobs對(duì)dNTP濃度的曲線并將數(shù)據(jù)與以下雙曲線方程kobs＝(kpol[dNTP])/([dNTP]+Kd)擬合而獲得。
實(shí)施例16 評(píng)估新型APNs的抗HIV活性和細(xì)胞毒性 i)病毒通過將5-10μg的質(zhì)粒DNA電穿孔(Gene Pulser；Bio-Rad)入1.3×107MT-2細(xì)胞中，利用xxHIV-1LAI克隆75來制備原種病毒(stock virus，繁殖用的病毒)。轉(zhuǎn)染后第7天，收集無細(xì)胞上清液并儲(chǔ)存在-80℃下。通過從病毒體提取RNA、用DNaseI處理該提取物、通過RT-PCR擴(kuò)增RT的全長編碼區(qū)(氨基酸1-56)、純化該P(yáng)CR產(chǎn)物并利用Big Dye terminator kit(v.3.1)在ABI 3100自動(dòng)化DNA測序儀上(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，Calif.)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序來確定原種病毒的基因型。對(duì)MT-2細(xì)胞、P4/R5細(xì)胞或PBM細(xì)胞，該病毒原種的50％組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)利用三倍終點(diǎn)稀釋試驗(yàn)(6孔/稀釋度)進(jìn)行測定，并利用Reed和Muench的方程進(jìn)行計(jì)算(參見Reed LJ，Muench H.Asimple method of estimating fifty per cent endpoints.Am.J.Hyg.1938；27493-497)。
ii)單復(fù)制周期藥物敏感性測定在96孔板中，將2或3倍連續(xù)稀釋的抑制劑一式三份加入到P4/R5細(xì)胞中。用在無藥物、病毒感染的對(duì)照細(xì)胞中產(chǎn)生相對(duì)光單位值100的病毒量來感染細(xì)胞。感染后48h，向每一個(gè)孔中加入細(xì)胞裂解緩沖液和發(fā)光底物(Gal-Screen；Tropix/Applied Biosystems)，而相對(duì)光單位值利用光度計(jì)(ThermoLabSystems，Waltham，Mass.)進(jìn)行測定。病毒復(fù)制的抑制計(jì)算為抑制50％病毒復(fù)制所需的化合物濃度(EC50)。
iii)多復(fù)制周期藥物敏感性測定在96孔板中，將3倍連續(xù)稀釋的抑制劑一式三份加入到MT-2細(xì)胞中。細(xì)胞以0.01的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染，如通過終點(diǎn)稀釋在MT-2細(xì)胞中所測定的。在感染后第7天，收集培養(yǎng)上清液并用0.5％Triton X-100處理。利用商品化的酶聯(lián)免疫吸附分析(DuPont，NEN Products，Wilmington，Del.)測定上清液中的p24抗原濃度。EC50值如前所述進(jìn)行計(jì)算。
iv)PBM細(xì)胞中的藥物敏感性測定通過Ficoll-Hypaque不連續(xù)梯度離心從健康血清陰性供者分離PBM細(xì)胞，如前所述(參見Schinazi RF，Cannon DL，Arnold BH，Martino-Saltzman D.Combinations of isoprinosine and 3′-azido-3′-deoxythymidine inlymphocytes infected with human immunodeficiency virus type 1.Antimicrob.Agents Chemother.1988；321784-1787；Schinazi RF，Sommadossi JP，Saalmann V，Cannon DL，Xie MY，Hart GC，SmithGA.Hahn E.F.Activities of 3′-azido-3′-deoxythymidine nucleotidedimers in primary lymphocytes infected with human immunodeficiencyvirus type 1.Antimicrob.Agents Chemother.1990；341061-1067)。使用前，細(xì)胞用植物凝集素A(PHA，Difco，Sparks，MD)刺激2-3天。批量進(jìn)行感染1h，培養(yǎng)瓶(T25)分析為100TCID50/1×107個(gè)細(xì)胞，或者24孔板分析為200TCID50/6×107個(gè)細(xì)胞/孔。將細(xì)胞加入含10倍連續(xù)稀釋的測試化合物的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。在感染后第5天，收集培養(yǎng)上清液并用0.5％Triton X-100處理。上清液中的p24抗原濃度如上所述進(jìn)行測定。EC50和抗性倍數(shù)值如上所述進(jìn)行計(jì)算。
v)細(xì)胞毒性測定評(píng)估所有APNs對(duì)P4/R5細(xì)胞、MT-2細(xì)胞以及未感染的PHA刺激的人PBM細(xì)胞的潛在毒性作用。將對(duì)數(shù)期P4/R5、MT-2和PHA刺激的人PBM細(xì)胞以5×103至5×104個(gè)細(xì)胞/孔接種在含該測試藥物的10倍連續(xù)稀釋液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將該培養(yǎng)物孵育2-4天，然后向每個(gè)孔中加入3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)染料溶液(Promega，Madison，WI)并孵育過夜。用終止增容溶液(Promega，Madison，WI)來終止反應(yīng)，并將培養(yǎng)板在570nm的波長讀數(shù)。中位50％細(xì)胞毒性濃度(CC50)利用中位有效法從濃度-效應(yīng)曲線而確定。
實(shí)施例17 評(píng)估APNs抗耐藥性HIV的活性 進(jìn)一步評(píng)價(jià)在上文已鑒定為與其親本類似物相比具有改善的活性且更少的細(xì)胞毒性的類似物的抗一組耐藥性病毒的活性。這允許闡明新型類似物的交叉耐藥譜并與已針對(duì)3’-疊氮基-ddA和3’-疊氮基-ddG測定的耐藥性進(jìn)行比較。本研究中采用的耐藥性病毒包括HIV-1K65R、HIV-1K70E、HIV-1L74V、HIV-1M184V、HIV-1AZT2、HIV-1AZT3、HIV-1AZT7、HIV-1AZT9、HIV-1Q151M和HIV-169插入。這些病毒的基因型如上所述，并且提供在圖1中。所有這些突變病毒均在我們的HIV-1xxLAI克隆中產(chǎn)生。
實(shí)施例18 評(píng)估APNs針對(duì)耐藥性HIV的活性 i)病毒和藥物敏感性測定病毒原種如上所述進(jìn)行制備。藥物敏感性測定利用單和多復(fù)制周期試驗(yàn)而實(shí)施，上文也已經(jīng)闡述。病毒復(fù)制的抑制計(jì)算為抑制50％病毒復(fù)制所需的化合物濃度(EC50)。抗性倍數(shù)值通過突變HIV-1的EC50除以WT HIV-1的EC50而確定。
ii)統(tǒng)計(jì)分析為了確定抗性倍數(shù)值是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，將來自至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的EC50值進(jìn)行l(wèi)og10轉(zhuǎn)化，并通過SigmaStat軟件(Jandel Scientific)利用兩樣本學(xué)生t(Student’s t)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。低于0.05的P值認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
為了進(jìn)一步表征這些核苷的活性，評(píng)估了3’-疊氮基-ddA和3’-疊氮基-2’，3’-ddG針對(duì)一組突變病毒的活性。該組突變病毒包括含K65R。L74V(HIV-1L74V)。M184V(HIV-1M184V)的重組病毒，TAMS的不同組合(例如M41L/L210W/T215Y(HIV-1AZT3)，M41L/D67N/K70R/T215F/K219Q(HIV-1AZT7)或M41L/D67N/K70R/L210W/T215Y/K219Q(HIV-1AZT9)，以及多重NRTI耐藥復(fù)合體(例如，A62V/V75I/F77L/F116Y/Q151M(HIV-1Q151M)或M41L/69SS/L210W/T215Y(HIV-169插入))。結(jié)果在圖13中示出，表明3’-疊氮基-ddA和3’-疊氮基-ddG均具有抗含K65R、L74V或M184V突變的病毒的活性。與AZT相比，這兩種化合物還具有抗所有含TAM病毒的顯著活性。例如，HIV-1AZT7具有對(duì)AZT＞500抗性倍數(shù)，然而該病毒對(duì)3’-疊氮基-ddA和3’-疊氮基-ddG均低于3.5抗性倍數(shù)。然而，3’-疊氮基-ddA和3’-疊氮基-ddG對(duì)HIV-1Q151M的活性均較弱，并且3’-疊氮基-ddG還喪失了抗HIV-169插入的活性。
實(shí)施例19 評(píng)估通過突變HIV-1RTs進(jìn)行的APN核苷酸的摻入和切除 i)酶在本研究使用下列突變的HIV-1RT酶K65R RT、K70ERT、L74V RT、M184V RT、AZT2 RT、AZT3 RT、Q151M RT和69插入RT。AZT2、AZT3、Q151M和69插入RT的基因型等同于圖12中描述的那些。構(gòu)建用于這些突變RTs中的每一種的E.coli蛋白表達(dá)載體，并如前所述進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化。如上所述測定蛋白濃度和活性位點(diǎn)濃度。
ii)核苷酸摻入的動(dòng)力學(xué)分析前穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析用來測定每一種新型APN-TPs對(duì)于K65R、K70E RT、L74V RT、M184V RT和Q151M RT的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Kd和kpol。如上所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。
iii)切除測定ATP介導(dǎo)的從鏈終止模板/引物磷酸解切除該新型類似物利用WT RT、AZT2RT、AZT3RT和69插入RT來實(shí)施。上面描述的20個(gè)核苷酸的DNA引物5’-末端標(biāo)記[γ32P]-ATP，然后與適當(dāng)?shù)?7個(gè)核苷酸的DNA模板退火。該引物的3’-末端通過與WT RT和100μM適當(dāng)?shù)男揎椇塑账犷愃莆镆黄鹪?7℃孵育30min來進(jìn)行鏈終止。該32p-標(biāo)記的、鏈終止的21核苷酸引物通過在7M尿素-16％丙烯酰胺變性凝膠電泳后提取適當(dāng)?shù)臈l帶而被進(jìn)一步純化。純化的鏈終止引物隨后再次退火至適當(dāng)?shù)腄NA模板以用于磷酸解實(shí)驗(yàn)中。通過將300nM(活性位點(diǎn))WT或突變RT與60nM感興趣的鏈終止T/P復(fù)合體在50mM Tris-HCl pH 8.0，50mM KCl中一起孵育來實(shí)現(xiàn)磷酸解去除APN-MP。通過加入3.0mM ATP和10mM MgCl2啟動(dòng)反應(yīng)。整個(gè)反應(yīng)過程中始終存在無機(jī)焦磷酸酶(0.01U)。孵育一定時(shí)間后，從反應(yīng)管中取出部分并用等體積的凝膠加樣緩沖液(98％去離子甲酰胺，10mM EDTA以及1mg/mL溴酚藍(lán)和1mg/mL二甲基藍(lán))淬滅。通過變性凝膠電泳來分離產(chǎn)物，并利用Bio-Rad GS525分子成像儀同時(shí)分析底物的消失以及產(chǎn)物的形成。將數(shù)據(jù)擬合于下列單指數(shù)方程以確定ATP介導(dǎo)切除的表觀速率(kATP)[product]＝A[exp(-kATPt)]，其中A表示產(chǎn)物形成的幅度。死端式(dead-end)復(fù)合體的形成如前述來確定(參見MeyerPR，Matsuura SE，Mian AM，So AG，Scott WA.A mechanism of AZTresistancean increase in nucleotide-dependent primer unblocking bymutant HIV-1 reverse transcriptase.Mol Cell.1999；435-43；Sluis-Cremer N，Arion D，Parikh U，Koontz D，Schinazi RF，MellorsJW，Parniak MA.The 3′-azido group is not the primary determinant of3′-azido-3′-deoxythymidine(AZT)responsible for the excisionphenotype of AZT-resistant HIV-1.J Biol Chem.2005；28029047-52)。
實(shí)施例20 HepG2細(xì)胞中的線粒體毒性測定 i)APNs對(duì)細(xì)胞生長和乳酸產(chǎn)生的影響通過在0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM藥物存在的情況下孵育細(xì)胞來測定APNs對(duì)HepG2細(xì)胞生長的影響。將細(xì)胞(5×104/孔)平鋪在12孔細(xì)胞培養(yǎng)皿上，含非必需氨基酸并補(bǔ)充10％胎牛血清、1％丙酮酸鈉和1％青霉素/鏈霉素的最低必需培養(yǎng)基中，并在37℃下孵育4天。孵育結(jié)束時(shí)，利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞數(shù)量。為了測量核苷酸類似物對(duì)乳酸生成的影響，稀釋來自原種培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞并以每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞平鋪在12孔培養(yǎng)板中。加入不同濃度(0μM，0.1μM，1μM，10μM和100μM)的核苷酸類似物，并將培養(yǎng)物在37℃下在濕潤的5％CO2氣氛中孵育4天。在第4天時(shí)，測定每孔中的細(xì)胞數(shù)量并收集培養(yǎng)基。過濾該培養(yǎng)基，并利用乳酸比色分析(Sigma-Aldrich)測定培養(yǎng)基中的乳酸含量。由于乳酸產(chǎn)物可認(rèn)為是損壞線粒體功能的一個(gè)標(biāo)志物，因此在APN類似物存在的情況下在細(xì)胞生長中檢測的乳酸生成的增加水平將指示藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)。
ii)APNs對(duì)線粒體DNA合成的影響已經(jīng)開發(fā)了一種準(zhǔn)確定量線粒體DNA含量的實(shí)時(shí)PCR分析(參見Stuyver LJ，Lostia S，Adams M，Mathew JS，Pai BS，Grier J，Tharnish PM，Choi Y，ChongY，Choo H，Chu CK，Otto MJ，S chinazi RF.Antiviral activities andcellular toxicities of modified 2′，3′-dideoxy-2′，3′-didehydrocytidineanalogues.Antimicrob.Agents Chemother.2002；463854-60)。該分析用于本申請(qǐng)中描述的確定核苷類似物對(duì)線粒體DNA含量影響的所有研究中。在該分析中，將低代數(shù)HepG2細(xì)胞以5,000個(gè)細(xì)胞/孔接種在包被膠原的96孔板中。將APN類似物加入到培養(yǎng)基中以獲得0μM、0.1μM、10μM和100μM的最終濃度。在培養(yǎng)的第7天，通過利用商業(yè)上可獲得的柱子(RNeasy 96kit；Qiagen)來制備細(xì)胞核酸。這些試劑盒同時(shí)純化RNA和DNA，因此從柱子洗脫總核酸。通過用于目標(biāo)擴(kuò)增和參照擴(kuò)增的合適引物和探針，利用多重Q-PCR程序從5μl的洗脫的核酸中擴(kuò)增線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞單位II(COXII)基因以及β-肌動(dòng)蛋白或rRNA基因。對(duì)于COXII，分別采用下列正義引物、探針和反義引物5′-TGCCCGCCATCATCCTA-3′，5′-四氯-6-羧基熒光素-TCCTCATCGCCCTCCCATCCC-TAMRA-3′和5′-CGTCTGTTATGTAAAGGATGCGT-3′。對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白基因的外顯子3(GenBank登錄號(hào)E01094)，正義引物、探針和反義引物分別為5′-GCGCGGCTACAGCTTCA-3′，5′-6-FAMCACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3′和5′-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。用于rRNA基因的引物和探針從Applied Biosystems購得。由于所有基因均獲得相同的擴(kuò)增效率，因此采用比較CT法來研究線粒體DNA合成的可能抑制。比較CT法采用運(yùn)算公式，其中目標(biāo)(COXII基因)的量對(duì)內(nèi)源性參照(β-肌動(dòng)蛋白或rRNA基因)的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并且是相對(duì)于校準(zhǔn)值(第7天時(shí)的一個(gè)無藥對(duì)照)。該方法的運(yùn)算公式以2-ΔΔCT給出，其中ΔΔCT是(平均目標(biāo)測試樣品的CT-目標(biāo)對(duì)照的CT)-(平均參考測試的CT-參考對(duì)照的CT)(參見Johnson MR，K Wang，JB Smith，MJ Heslin，RB Diasio.Quantitation of dihydropyrimidinedehydrogenase expression by real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction.Anal.Biochem.2000；278175-184)。藥物存在時(shí)生長的細(xì)胞中線粒體DNA含量的下降將指示線粒體毒性。
iii)電子顯微鏡形態(tài)評(píng)估NRTI誘發(fā)的毒性已表明可引起線粒體的形態(tài)變化(例如，嵴喪失，基質(zhì)溶出和腫脹以及脂滴形成)，其可利用透射電子顯微鏡通過超結(jié)構(gòu)分析來觀察(參見Cui L，Schinazi RF，Gosselin G，Imbach JL.Chu CK，Rando RF，RevankarGR，Sommadossi JP.Effect of enantiomeric and racemic nucleosideanalogues on mitochondrial functions in HepG2 cells.Biochem.Pharmacol.1996；521577-1584；Lewis W，Levine ES，GriniuvieneB，Tankersley KO，Colacino JM，Sommadossi JP，Watanabe KA，Perrino FW.Fialuridine and its metabolites inhibit DNA polymerasegamma at sites of multiple adjacent analog incorporation，decreasemtDNA abundance，and cause mitochondrial structural defects incultured hepatoblasts.Proc Natl Acad Sci U S A.1996；933592-7；Pan-Zhou XR，L Cui，XJ Zhou，JP Sommadossi，VM Darley-Usmar.Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs onmitochondrial function in HepG2 cells.Antimicrob.Agents Chemother.2000，44，496-503)。例如，與10μM非阿尿苷(fialuridine)(FIAU；1，2′-脫氧-2′-氟-1-D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘-尿嘧啶)一起孵育的HepG2細(xì)胞的電子顯微鏡照片示出存在線粒體增大以及與線粒體功能障礙相一致的形態(tài)變化。為了確定APN是否促進(jìn)線粒體中的形態(tài)變化，在0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM APN類似物存在的情況下，將HepG2細(xì)胞(2.5×104個(gè)細(xì)胞/mL)接種在組織培養(yǎng)皿中(35mm×10mm)。在第8天，如前所述固定細(xì)胞、脫水并包埋在Eponas中。制備薄切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，隨后利用透射電子顯微鏡進(jìn)行檢查。
實(shí)施例21 Neuro2A細(xì)胞中的線粒體毒性測定 為了評(píng)估APN核苷類似物引起神經(jīng)毒性的可能性，采用小鼠Neuro2A細(xì)胞(American Type Culture Collection 131)作為模式系統(tǒng)(參見Ray AS，Hernandez-Santiago BI，Mathew JS，Murakami E，Bozeman C，Xie MY，Dutschman GE，Gullen E，Yang Z，HurwitzS，Cheng YC，Chu CK，McClure H，Schinazi RF，Anderson KS.Mechanism of anti-human immunodeficiency virus activity ofbeta-D-6-cyclopropylamino-2′，3′-didehydro-2′，3′-dideoxyguanosine.Antimicrob.Agents Chemother.2005，49，1994-2001)。利用基于3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑染料的分析，測量抑制50％細(xì)胞生長所需的濃度(CC50)，如前所述。在確定的藥物濃度下，如上所述進(jìn)行細(xì)胞乳酸和線粒體DNA水平的干擾。在所有實(shí)驗(yàn)中，ddC和AZT均被用作對(duì)照核苷類似物。
實(shí)施例22 3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷酸類似物對(duì)線粒體DNA聚合酶γ的DNA聚合酶和核酸外切酶活性的影響 i)人聚合酶γ的純化聚合酶γ的重組大和小亞單位如前所述進(jìn)行純化(參見Graves SW，Johnson AA，Johnson KA.Expression，purification，and initial kinetic characterization of the large subunit ofthe human mitochondrial DNA polymerase.Biochemistry.1998，37，6050-8；Johnson AA，Tsai Y，Graves SW，Johnson KA.Humanmitochondrial DNA polymerase holoenzymereconstitution andcharacterization.Biochemistry.2000；391702-8)。蛋白濃度利用分光光度計(jì)在280nm進(jìn)行測定，其中用于聚合酶γ大和小亞單位的消光系數(shù)分別為234,420和71,894M-1cm-1。
ii)核苷酸摻入的動(dòng)力學(xué)分析進(jìn)行前穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析以測定對(duì)APN-TP和天然dNTP底物而言，DNA聚合酶γ的摻入催化效率(k/K)。這允許確定該酶摻入修飾類似物的相對(duì)能力并預(yù)測毒性。通過DNA聚合酶γ進(jìn)行的APN核苷酸摻入的前穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析基本上如前所述來進(jìn)行(參見Murakami E，Ray AS，Schinazi RF，Anderson KS.Investigating the effects of stereochemistry onincorporation and removal of 5-fluorocytidine analogs by mitochondrialDNA polymerase gammacomparison of D-and L-D4FC-TP.AntiviralRes.2004，62，57-64；Feng JY，Murakami E，Zorca SM，JohnsonAA，Johnson KA，Schinazi RF，F(xiàn)urman PA，Anderson KS.Relationshipbetween antiviral activity and host toxicitycomparison of theincorporation efficiencies of2′，3′-dideoxy-5-fluoro-3′-thiacytidine-triphosphate analogs by humanimmunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and humanmitochondrial DNA polymerase.Antimicrob Agents Chemother.2004，48，1300-6)。簡單而言，將在50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 7.8中的聚合酶γ的大(250nM)和小(1.25mM)亞單位以及60nM DNA模板/引物的預(yù)孵育混合物加入到包含MgCl2(2.5mM)和不同濃度的核苷酸類似物的溶液中。反應(yīng)如前所述淬滅和分析。將數(shù)據(jù)擬合于上述相同的方程。
iii)用于人聚合酶γ3′5′核酸外切酶活性的分析人聚合酶γ的核酸外切酶活性通過在沒有dNTP的情況下測量切割產(chǎn)物的形成速率來研究。通過將MgCl2(2.5mM)加入到在50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 7.8中的聚合酶γ大亞單位(40nM)、小亞單位(270nM)和1,500nM鏈終止模板/引物的預(yù)孵育混合物中來啟動(dòng)反應(yīng)，并在指定的時(shí)間點(diǎn)用0.3M EDTA淬滅。所有反應(yīng)混合物均在20％變性聚丙烯酰胺測序凝膠(8M尿素)上分析，在Bio-Rad GS-525分子成像系統(tǒng)上成像，并用Molecular Analyst(Bio-Rad)定量。將較早時(shí)間點(diǎn)形成的產(chǎn)物作為時(shí)間的函數(shù)而作圖。數(shù)據(jù)通過SigmaPlot(Jandel Scientific)利用線性回歸而擬合。將線的斜率除以反應(yīng)中的活性酶濃度來計(jì)算核酸外切酶活性的kexo(參見Murakami E，Ray AS，Schinazi RF，Anderson KS.Investigating the effects ofstereochemistry on incorporation and removal of 5-fluorocytidineanalogs by mitochondrial DNA polymerase gammacomparison of D-and L-D4FC-TP.Antiviral Res.2004；6257-64；Feng JY，MurakamiE，Zorca SM，Johnson AA，Johnson KA，Schinazi RF，F(xiàn)urman PA，Anderson KS.Relationship between antiviral activity and host toxicitycomparison of the incorporation efficiencies of2′，3′-dideoxy-5-fluoro-3′-thiacytidine-triphosphate analogs by humanimmunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and humanmitochondrial DNA polymerase.Antimicrob Agents Chemother.2004；481300-6)。
實(shí)施例23 骨髓細(xì)胞毒性的分析 原代人骨髓單核細(xì)胞商業(yè)上獲自Cambrex Bioscience(Walkersville，MD)。CFU-GM分析利用雙層軟瓊脂在50單位/mL人重組粒細(xì)胞/巨細(xì)胞克隆刺激因子存在的情況下實(shí)施，而BFU-E分析利用含1單位/mL促紅細(xì)胞生成素的甲基纖維素基質(zhì)(參見Sommadossi JP，Carlisle R.Toxicity of 3’-azido-3’-deoxythymidineand 9-(1，3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine for normal humanhepatopoietic progenitor cells in vitro.Antimicrob.Agents Chemother.1987；31452-454；Sommadossi，JP，Schinazi，RF，Chu，CK，and Xie，MY.Comparison of Cytotoxicity of the(-)and(+)enantiomerof 2’，3’-dideoxy-3’-thiacytidine in normal human bone marrowprogenitor cells.Biochem.Pharmacol.1992；441921-1925)。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)均在來自3個(gè)不同供者的細(xì)胞中一式兩份進(jìn)行。AZT用作陽性對(duì)照。細(xì)胞在該化合物存在的情況下在37℃下用5％CO2孵育14-18天，并利用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆，以確定IC50。50％抑制濃度(IC50)通過最小二乘法線性回歸分析藥物濃度的對(duì)數(shù)值與BFU-E生存分?jǐn)?shù)而獲得。統(tǒng)計(jì)分析通過用于獨(dú)立非成對(duì)樣本的學(xué)生t檢驗(yàn)來進(jìn)行。
實(shí)施例24 抗HBV分析 所述化合物的抗HBV活性通過在四環(huán)素的控制下處理攜帶野生型HBV的AD-38細(xì)胞系來確定(參見Ladner S.K.，Otto M.J.，Barker C.S.，Zaifert K.，Wang G.H.，Guo J.T.，Seeger C.&King R.W.Antimicrob.Agents Chemother.1997，41，1715-20)。去除培養(yǎng)基中的四環(huán)素[Tet(-)]導(dǎo)致產(chǎn)生HBV。將來自用所述化合物處理的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中的HBV水平與未處理對(duì)照進(jìn)行比較。并且維持含四環(huán)素[Tet(+)]的對(duì)照培養(yǎng)物，以確定HBV表達(dá)的基礎(chǔ)水平。包括3TC作為陽性對(duì)照。
實(shí)施例25 細(xì)胞毒性分析 所述化合物的毒性在Vero，人PBM，CEM(人類淋巴母細(xì)胞)，MT-2和HepG2細(xì)胞中加以評(píng)價(jià)，如前所述(參見Schinazi R.F.，Sommadossi J.-P.，Saalmann V.，Cannon D.L.，Xie M.-Y.，Hart G.C.，Smith G.A.&Hahn E.F.Antimicrob.Agents Chemother.1990，34，1061-67)。包括環(huán)己酰亞胺作為陽性細(xì)胞毒性對(duì)照，并且包括暴露于溶劑的未處理細(xì)胞作為陰性對(duì)照。細(xì)胞毒性IC50利用前述的中位有效法從濃度-效應(yīng)曲線而獲得(參見Chou T.-C.&Talalay P.Adv.Enzyme Regul.1984，22，27-55；Belen’kii M.S.&Schinazi R.F.Antiviral Res.1994，25，1-11)。
實(shí)施例26 腺苷脫氨酶測定 為了確定通過腺苷脫氨酶進(jìn)行的APN核苷脫氨的傾向，將化合物與商業(yè)上可獲得的純化酶一起孵育，隨后對(duì)反應(yīng)進(jìn)行分光光度計(jì)測定。反應(yīng)條件為50mM磷酸鉀，pH 7.4以及50μM APN核苷(0.5mL)，25℃。0.002單位酶的反應(yīng)時(shí)間為7分鐘，并且0.2單位酶的反應(yīng)時(shí)間為120分鐘。(腺苷脫氨酶的單位定義為在pH 7.5和25℃下，一個(gè)單位每分鐘將1.0μmol腺苷脫氨為肌苷。)脫氧腺苷是陽性對(duì)照，其在給定的條件下利用0.002單位的酶在7分鐘內(nèi)脫氨59％。脫氧鳥苷是陰性對(duì)照。在265nm或285nm處測量光密度。將實(shí)驗(yàn)開始與結(jié)束之間的光密度差異除以消光系數(shù)，然后乘以反應(yīng)體積，以確定轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物摩爾數(shù)。產(chǎn)物摩爾數(shù)除以相當(dāng)于100％完全反應(yīng)的底物摩爾數(shù)然后乘以100從而獲得脫氨百分比。檢測限值為0.001光密度單位。
實(shí)施例27 篩選化合物56的抗性病毒 將外周血單核(PBM)細(xì)胞1以1×107個(gè)細(xì)胞接種在兩個(gè)含5mL的RPMI-1640(Mediatech Inc.，Herndon，VA)的T25培養(yǎng)瓶中，而RPMI-1640包含100mL熱滅活的胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)，83.3IU/mL青霉素，83.3μg/mL鏈霉素(Mediatech Inc.，Herndon，VA)，1.6mM L-谷氨酰胺(Mediatech Inc.，Herndon，VA)，0.0008％DEAE-葡聚糖(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，0.047％碳酸氫鈉和26IU/mL重組白細(xì)胞介素-2(Chiron Corporation，Emeryville，CA)，兩個(gè)培養(yǎng)瓶中一個(gè)是對(duì)照(未處理)，一個(gè)用藥物進(jìn)行處理。
天然PBM細(xì)胞用0.1μM的化合物56處理1小時(shí)，然后以100×TCID50接種HIV-1LAI2。處理的PBM細(xì)胞組和對(duì)照未處理PBM細(xì)胞組均允許感染1小時(shí)，向每個(gè)培養(yǎng)瓶中另外加入5mL RTU培養(yǎng)基，并在37℃孵育6天。
在第6天，從每一個(gè)培養(yǎng)瓶中取出1mL上清液，并以9,740g在4℃下離心2小時(shí)。隨后將該病毒沉淀再懸浮在溶解緩沖液中用于RT分析。利用商品化QIAmp Viral RNA mini kit(Quiagen)從培養(yǎng)上清中分離總RNA。測序在對(duì)照病毒和化合物56處理的病毒之間平行進(jìn)行，以確定如果該病毒表現(xiàn)出耐藥，則所應(yīng)用的藥物壓力能否在數(shù)周內(nèi)產(chǎn)生任何突變。
1PBM細(xì)胞通過ficoll-hypaque(Histopaque 1077Sigma)密度梯度離心從獲自American Red Cross(Atlanta，GA)的血沉棕黃層(Buffy coats)中分離，該血沉棕黃層來自健康的血清陰性供者。使用前2-3天，細(xì)胞用在500mL的RPMI-1640(Mediatech Inc.，Herndon，VA)中的3μg/mL植物凝集素A(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)活化，其中RPMI-1640包含100mL熱滅活的胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)，83.3IU/mL青霉素，83.3ug/mL鏈霉素，1.6mM L-谷氨酰胺(Mediatech Inc.，Herndon，VA)。
2HIV-1/LAI獲自疾病控制和預(yù)防中心(the Center for DiseaseControl and Prevention)，該病毒用于耐藥池，且感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1，如通過限制性稀釋法在PBM細(xì)胞中測定的，并經(jīng)篩選來啟動(dòng)感染池。
計(jì)算經(jīng)處理的病毒池相對(duì)于未處理的病毒池的抑制百分比，并在處理前每周密切監(jiān)測。在47周內(nèi)，病毒池的篩選壓力已經(jīng)從0.1μM增至3.5μM(EC50值的40倍)。
V75I早在第21周在化合物56處理的病毒池中篩選到。在大約第41周，F(xiàn)77L和H221Y也在處理的病毒池中觀察到。
實(shí)施例28 三磷酸核苷類似物的合成 三磷酸核苷類似物利用Ludwig和Eckstein′s法(Ludwig J，Eckstein F.“Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5′-O-(1-thiotriphosphates)，5′-triphosphates and2′，3′-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one”J.Org.Chem.1989，54 631-5)由相應(yīng)的核苷而合成。粗三磷酸核苷類似物將利用HiLoad 26/10Q Sepharose Fast FlowPharmacia column和梯度TEAB緩沖液(pH 7.0)通過FPLC而純化。該產(chǎn)物將通過UV分光光度計(jì)、質(zhì)子和磷NMR、質(zhì)譜和HPLC來表征。
結(jié)論綜述 圖1是xxLAI病毒的基因型的圖示。所列出的全部突變病毒均在HIV-1xxLAI克隆中產(chǎn)生。
圖2A-2B是3’-疊氮基-2’，3’-ddA和3’-疊氮基-2’，3’-ddG對(duì)一組耐藥性HIV-1的抗HIV活性的圖示。數(shù)據(jù)表明，3’-疊氮基-ddA和3’-疊氮基-ddG均對(duì)含K65R、L74V或M184V突變的病毒具有活性。與AZT相比，兩種化合物還對(duì)所有含TAM的病毒具有活性。
圖4A-4B是通過腺苷脫氨酶進(jìn)行的脫氨的圖示。作為體外腺苷脫氨酶底物的化合物可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為6-氧代核苷。例如，脫氧腺苷在體外被轉(zhuǎn)化為脫氧肌苷，并預(yù)期會(huì)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為脫氧肌苷。
圖5是化合物56抗性病毒在47周內(nèi)的發(fā)展的圖示。V75I早在第21周在化合物56處理的病毒池中篩選出。在大約第41周，F(xiàn)77L和H221Y也在處理的病毒池中觀察到。
圖6是總結(jié)了用化合物56處理接種HIV-1LAI的PBM細(xì)胞以及所得到的篩選突變的圖示?；衔?6處理的池首先早在第21周產(chǎn)生V75V/I，并且在來自化合物56的選擇壓力增加后，觀察到了F77L和H221Y。
雖然前述說明書通過為了說明的目的提供的實(shí)例教導(dǎo)了本發(fā)明的原理，但應(yīng)該理解，本發(fā)明的實(shí)施涵蓋所有如在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)的常見改變、調(diào)整和/或修改以及它們的等價(jià)物。
權(quán)利要求
1.一種式(I)的化合物
或者其藥用鹽或藥物前體，其中
X是O、CH2、S、SO2、NH、P＝O(OH)、C＝CH2，C＝CHF或C＝CF2；
R1是氫、烷基、鹵代烷基(包括CH2F、CF3)、鹵素、疊氮基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、鏈烯基、炔基、鹵代鏈烯基(包括Br-乙烯基)、烷氧基、鏈烯氧基、烷硫基、酰氧基、烷氧基?；?、烷基羰基、?；蚧蝓０被?；
R2是H，磷酸酯(包括單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或穩(wěn)定的磷酸酯藥物前體)，磷硫酰，用烷基(包括C1-C6)、鏈烯基(包括C2-C6)、炔基(包括C2-C6)、芳基(包括C6-C10)或其他藥用離去基團(tuán)取代的羰基，當(dāng)體內(nèi)給藥時(shí)其能夠提供一種化合物，其中R2是H或磷酸酯、磺酸酯(包括烷基或芳烷基磺?；?、芐基(其中苯基基團(tuán)可選地被如上文給出的芳基定義中所描述的一種或多種取代基取代)、脂質(zhì)(包括磷脂)、氨基酸、肽或膽固醇，
其中，所述堿基是通式(III)的嘌呤或修飾的嘌呤
其中
W、W1、W2和W3均獨(dú)立地是N、CH、CF、CCl、CBr、CI、CCN、CCH3、CCF3、CC(O)NH2、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)2、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR5；
R5和R6均獨(dú)立地選自H、鹵素、CN、N3、NO2、OH、NH2、SH、OR’、NHR’、N(R’)2、SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH2OH、CH2CN、CH2N3、COOH、COOR’、CONH2、CONHR、CON(R’)2、CH2COOH、CH2COOR’、CH2CONH2、CH2CONHR’、CH2CON(R’)2、C1-6烷基、C2-6鏈烯基和C2-6炔基、C3-8環(huán)烷基、芳基、雜芳基、?；⒎纪榛约巴榉蓟?；
條件為如果R1和R2是H，W是CH，W1、W2和W3是N，并且R6是NH2或NHR7，其中R7是酰基，則R5不能是C1、Br、I、C1-6烷氧基、C3-6環(huán)烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、被一種或兩種取代基取代的氨基，所述取代基獨(dú)立地選自C1-6烷基和C3-6環(huán)烷基或含有至少一個(gè)氮原子的4至6元雜環(huán)，所述環(huán)通過所述氮原子鍵合于嘌呤堿；并且
條件為對(duì)于其中堿基為式(III)的式(I)，當(dāng)R5是OH時(shí)，R6不能是NH2，并且當(dāng)R5是NH2時(shí)，R6不能是H；如果R1和R2是H，則W是CH，W1、W2和W3是N；并且
每一個(gè)R’均獨(dú)立地為低級(jí)烷基(C1-C6烷基)，低級(jí)鏈烯基，低級(jí)炔基，低級(jí)環(huán)烷基(C3-C6環(huán)烷基)芳基，烷芳基或者芳烷基，其中所述基團(tuán)可以用如上面定義的一種或多種取代基取代，例如羥烷基，氨基烷基和烷氧基烷基，或者
堿基是通式(IV)的嘌呤或修飾的嘌呤
其中
W、W2和W3均獨(dú)立地為N、CCF3、CC(O)NH2、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)2、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR5；
W4獨(dú)立地為O、S、NH或NR’；
每個(gè)R5和R6均獨(dú)立地選自H、鹵素、CN、N3、NO2、OH、NH2、SH、OR’、NHR’、N(R’)2、SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH2OH、CH2CN、CH2N3、COOH、COOR’、CONH2、CONHR、CON(R’)2、CH2COOH、CH2COOR’、CH2CONH2、CH2CONHR’、CH2CON(R’)2、C1-6烷基、C2-6鏈烯基、C2-6炔基、C3-8環(huán)烷基、芳基、雜芳基、?；?、芳烷基和烷芳基；以及
每一個(gè)R’均獨(dú)立地為C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、芳基、烷芳基或芳烷基。
2.一種式(II)的化合物
或者其藥用鹽或藥物前體，其中
X是O、CH2、S、SO2、NH、P＝O(OH)、C＝CH2、C＝CHF或C＝CF2；
Y是O或S；
Z是CH2、CH2CH2、CH2O、CH2S或CH2NH(其中，碳原子連接至磷原子)；
R1是氫，烷基，鹵代烷基，鹵素，疊氮基，氰基，硝基，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，鏈烯基，炔基，鹵代鏈烯基，烷氧基，鏈烯氧基，烷硫基，酰氧基，烷氧基?；?，烷基羰基，?；蚧蝓０被?；
R3和R4獨(dú)立地為氫、磷酸酯、二磷酸酯或一種在肝細(xì)胞中優(yōu)先去除以生成相應(yīng)的H基團(tuán)的基團(tuán)，其中術(shù)語“在肝細(xì)胞中優(yōu)先去除”表示所述基團(tuán)的至少部分在肝細(xì)胞中以高于同一基團(tuán)在非肝細(xì)胞中去除的速率的速率被去除，或者可去除的基團(tuán)是一種可以通過還原酶、酯酶、細(xì)胞色素P450或其他酶加以去除的藥用基團(tuán)；
其中，所述堿基是通式(III)的嘌呤或修飾的嘌呤
其中
每一個(gè)W、W2和W3均獨(dú)立地為N、CH、CF、CCl、CBr、CI、CCN、CCH3、CCF3、CC(O)NH2、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)2、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR5；
每一個(gè)R5和R6均獨(dú)立地選自H、鹵素(F、Cl、Br、I)、CN、N3、NO2、OH、NH2、SH、OR’、NHR’、N(R’)2、SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH2OH、CH2CN、CH2N3、COOH、COOR’、CONH2、CONHR、CON(R’)2、CH2COOH、CH2COOR’、CH2CONH2、CH2CONHR’、CH2CON(R’)2、C1-6烷基、C2-6鏈烯基和C2-6炔基、C3-8環(huán)烷基、芳基、雜芳基、?；?、芳烷基、和烷芳基；
每一個(gè)R’均獨(dú)立地為C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、芳基、烷芳基或芳烷基，或者
其中所述堿基是通式(IV)的嘌呤或修飾的嘌呤
其中
每一個(gè)W、W2和W3均獨(dú)立地為N、CH、CF、CCl、CBr、CI、CCN、CCH3、CCF3、CC(O)NH2、CC(O)NHR’、CC(O)N(R’)2、CC(O)OH、CC(O)OR’或CR5；
W4獨(dú)立地為O、S、NH或NR’；
每一個(gè)R5和R6均獨(dú)立地選自H、鹵素、CN、N3、NO2、OH、NH2、SH、OR’、NHR’、N(R’)2、SR’、OCOR’、NHCOR’、N(COR’)COR’、SCOR’、OCOOR’、NHCOR’、CH2OH、CH2CN、CH2N3、COOH、COOR’、CONH2、CONHR、CON(R’)2、CH2COOH、CH2COOR’、CH2CONH2、CH2CONHR’、CH2CON(R’)2、C1-6烷基、C2-6鏈烯基、C2-6炔基、C3-8環(huán)烷基、芳基、雜芳基、酰基、芳烷基、和烷芳基；
每一個(gè)R’均獨(dú)立地為C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、芳基、烷芳基、或芳烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的化合物，其中，所述化合物為β-L-或β-D構(gòu)型或者它們的外消旋混合物。
4.一種用于治療感染HIV-1或HIV-2的宿主的方法，包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物給予需要該治療的患者。
5.一種用于預(yù)防HIV-1或HIV-2感染的方法，包括將預(yù)防有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物給予需要該預(yù)防的患者。
6.一種用于降低宿主體內(nèi)HIV-1或HIV-2感染的生物學(xué)活性的方法，包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物給予需要該治療的患者。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述HIV-1或HIV-2感染由包含突變的病毒引起，所述突變選自由TAM突變和M184V突變組成的組。
8.一種用于治療感染HIV-1或HIV-2的宿主的方法，其包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述化合物在藥用載體內(nèi)與另一種抗HIV藥劑一起給予。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述HIV-1或HIV-2感染由包含突變的病毒引起，所述突變選自由TAM突變和M184V突變組成的組。
10.一種用于預(yù)防HIV-1或HIV-2感染的方法，包括將預(yù)防有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述化合物在藥用載體內(nèi)與另一種抗HIV藥劑一起給予需要該預(yù)防的患者。
11.一種用于治療感染HBV的宿主的方法，包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物給予需要該治療的患者。
12.一種用于預(yù)防HBV感染的方法，包括將預(yù)防有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物給予需要該預(yù)防的患者。
13.一種用于降低宿主體內(nèi)HBV感染的生物學(xué)活性的方法，包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物給予需要該治療的患者。
14.一種用于治療感染HBV宿主的方法，其包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物在藥用載體內(nèi)與另一種抗HBV藥劑一起給予。
15.一種用于預(yù)防HBV感染的方法，包括將預(yù)防有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物在藥用載體內(nèi)與另一種抗HBV藥劑一起給予需要該預(yù)防的患者。
16.一種用于治療感染HCV的宿主的方法，包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物給予需要該治療的患者。
17.一種用于預(yù)防HCV感染的方法，包括將預(yù)防有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物給予需要該預(yù)防的患者。
18.一種用于治療感染HCV的宿主的方法，其包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述化合物在藥用載體內(nèi)與另一種抗HCV藥劑一起給予。
19.一種治療HIV-1或HIV-2感染的方法，包括將有效治療量的3’-疊氮基-ddA、3’-疊氮基-ddG或它們的組合，以及一種或多種另外的抗病毒劑一起給予，其中所述一種或多種另外的抗病毒劑針對(duì)TAM突變和/或M184V突變加以選擇。
20.一種藥物組合物，包括3’-疊氮基-ddA、3’-疊氮基-ddG或它們的組合，和一種或多種針對(duì)TAM突變和/或M184V突變選擇的另外的抗病毒劑以及藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防人類患者或其他動(dòng)物宿主體內(nèi)病毒感染，特別是HIV、HBV和HCV的化合物、組合物和方法。所述化合物是3’-疊氮基-2’，3’-雙脫氧嘌呤核苷或其膦酸(衍生物)以及藥用鹽、藥物前體及其他衍生物。特別地，該化合物表現(xiàn)出抗HIV-1耐藥性突變體(包括HIV-1K65R、HIV-1K70E、HIV-1L74V、HIV-1M184V、HIV-1Q151M)的有效抗病毒活性以及針對(duì)攜帶TAMS或插入突變(包括HIV-1AZT3、HIV-1AZT7、HIV-1AZT9、HIV-1Q151M或HIV-169插入)的HIV-1RT的抑制活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述化合物是3’-疊氮基-ddA、3’-疊氮基-ddG或它們的組合，與一種或多種另外的針對(duì)TAM突變和/或M184V突變選擇的抗病毒劑以及藥用載體一起給予。
文檔編號(hào)C07H19/16GK101784557SQ200880024411
公開日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2008年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日
發(fā)明者雷蒙德·F·斯基納齊, 約翰·W·梅勒斯, 尼古拉斯·保羅·斯勒伊斯·克里默, 弗蘭克·安布拉爾, 史蒂文·J·科茨, 石俊興, 理查德·安東尼·惠特克 申請(qǐng)人:Rfs制藥公司, 埃默里大學(xué), 匹茲堡大學(xué)聯(lián)邦高等教育體系