專利名稱：：融合分子與il-15變異體的制作方法融合分子與IL-15變異體鵬申i青刻勺綠擅本申請(qǐng)案主張申請(qǐng)于2007年5月11日序列編號(hào)60/928，900的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)案的全部?jī)?nèi)容藉此并入本文作為參考。政府支揚(yáng)支持本案之研究由美國(guó)以衛(wèi)生與公眾服務(wù)部為代表進(jìn)行。
背景技術(shù)：
：T細(xì)胞受體(TCR)為免疫系統(tǒng)最主要的效應(yīng)物(effector)，其作為研發(fā)治療方法的平臺(tái)具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)?？贵w療法局限于辨識(shí)血液及胞外空間的病原體或者細(xì)胞表面上的蛋白標(biāo)靶，而T細(xì)胞受體可辨識(shí)通過MHC分子在細(xì)胞表面上展現(xiàn)的抗原(包含衍生自胞內(nèi)蛋白的抗原)。依據(jù)辨識(shí)所展現(xiàn)的抗原而變得活化之T細(xì)胞的亞型，T細(xì)胞受體以及具有T細(xì)胞受體的T細(xì)胞可參與調(diào)節(jié)各種免疫應(yīng)答。舉例而言，T細(xì)胞經(jīng)由誘導(dǎo)B細(xì)胞分化成抗體產(chǎn)生細(xì)胞而涉及體液性免疫應(yīng)答。此外，活化的T細(xì)胞發(fā)揮作用而起始細(xì)胞媒介的免疫應(yīng)答。因此，T細(xì)胞受體可辨識(shí)無(wú)法使用抗體辨識(shí)的其他標(biāo)靶。T細(xì)胞為細(xì)胞的次族群，其與其他免疫細(xì)胞類型(多形核嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性白細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞、肥胖細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞)共同構(gòu)成免疫系統(tǒng)的細(xì)胞組分。在生理?xiàng)l件下，T細(xì)胞在免疫監(jiān)控及消滅外來(lái)抗原方面發(fā)揮作用。然而，在病理?xiàng)l件下，有強(qiáng)烈的證據(jù)顯示T細(xì)胞在疾病的引發(fā)及擴(kuò)散中扮演著重要的角色。于此等疾患中，破壞T細(xì)胞免疫耐受性(中樞性或周邊性)為引發(fā)自體免疫疾病的主要基本過程?！阆嘈臫CR在免疫系統(tǒng)的發(fā)展及功能上扮演著重要的角色。舉例而言，已有報(bào)導(dǎo)指出TCR媒介細(xì)胞毒殺作用(cellkilling)、增進(jìn)B細(xì)胞增生、以及影響各種疾患(包含癌癥、過敏、病毒感染及自體免疫疾患)的發(fā)展及嚴(yán)重度。因此，期望能提供以T細(xì)胞受體為主的新穎靶向藥劑(targetingagent)，以及制造及使用該等用于治療及診斷設(shè)定之藥劑的方法。據(jù)此，特別期望能提供相較于先前技術(shù)中以抗體靶向?yàn)橹鞯膹?fù)合物而言，具有某些特定優(yōu)點(diǎn)的分子。再者，期望使用TCR將各種效應(yīng)物分子標(biāo)靶至其可提供治療效益而沒有與非靶向系統(tǒng)活性相關(guān)的副作用的疾病位置。此等之一者為IL-15(淋巴球激素(lymphokine)的四a螺旋束家族的成員)。IL-15在免疫系統(tǒng)的發(fā)展及調(diào)控上扮演多方面的角色。更詳言之，IL-15影響CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、毒殺性T細(xì)胞、B細(xì)胞、小腸壁表皮間隙淋巴球(IEL)及抗原呈遞細(xì)胞(APC)的功能、發(fā)展、存活與增生。已證實(shí)1卜15-/-基因轉(zhuǎn)殖小鼠與IL-15Ra-/_基因轉(zhuǎn)殖小鼠兩者皆缺乏周邊NK細(xì)胞與毒殺性T細(xì)胞族群、某些IEL亞群、以及大部分記憶表型CD8+T細(xì)胞，暗示IL-15在此等細(xì)胞類型的發(fā)展、增生及/或存活上發(fā)揮功能。IL-15受體(R)由三種多肽所組成型別特異性IL-15R阿伐(IL-15Ralpha)(〃IL-15Ra〃或〃IL-15Ra〃)、IL-2/IL-15R貝他(IL-2/IL-15Rbeta)(〃IL-2RP〃或〃IL-15Rb")及共同的伽瑪鏈(gammachain)("yC"或"gC〃，其為多種細(xì)胞激素受體所共有者)。IL-15訊息傳遞可經(jīng)由IL-15Ra、IL-2RP及YC的異三聚體復(fù)合物；經(jīng)由IL-2RP及YC的異三聚體復(fù)合物產(chǎn)生。新的IL-15作用機(jī)制為轉(zhuǎn)呈遞作用(transpresentation)機(jī)制，其中，IL-15及IL-15Ra由抗原呈遞細(xì)胞(單核球及樹突細(xì)胞)協(xié)同地表達(dá)，結(jié)合至IL-15Ra的IL-15轉(zhuǎn)呈遞至鄰近的僅表達(dá)IL-15RPYC受體之NK細(xì)胞或CD8T細(xì)胞。就發(fā)生于免疫突觸的協(xié)同剌激事件(co-stimulatoryevent)而言，IL-15轉(zhuǎn)呈遞作用目前顯示為活體內(nèi)IL-15作用的主要機(jī)制，且其顯示出在腫瘤免疫監(jiān)控上扮演主要的角色(Waldmann，TA，2006，NatureRev.Immunol.6:595-601)?？扇苄訧L-2Ra次單元(其導(dǎo)致含有外顯子3(exon3)缺失及在N端的所謂〃sushi"結(jié)構(gòu)域(domain)的同型異構(gòu)物(isoform))已顯示承載有負(fù)責(zé)細(xì)胞激素結(jié)合作用的大部分結(jié)構(gòu)要素。單獨(dú)的IL-2Ra為IL-2的低親和性受體(Kd10nM)，而IL-15Ra則以高親和性與IL-15結(jié)合(Kd100pM)。因此，可溶性IL-2Ra與IL-15能夠在溶液中形成安定的異二聚體復(fù)合物，且此等復(fù)合物能夠經(jīng)由該中間型或高親和性IL-15R復(fù)合物調(diào)控(亦即，剌激或阻斷)免疫應(yīng)答(Mortieretal.2006.JBiolChem281:1612-1619;Stoklaseketal.2006.JImmunol177:6072-6080;Rubinsteinetal.2006.ProcNatlAcadSciUSA103:9166-9171)。以IL-15對(duì)免疫系統(tǒng)的已知功效為前提，為了宿主效益已探討有多種以IL-15為主的方法來(lái)操控免疫系統(tǒng)。IL-15的給予已被用來(lái)支援免疫應(yīng)答或加強(qiáng)免疫系統(tǒng)重建，而阻斷IL-15的活性則可抑制自體免疫應(yīng)答或其他不適的免疫應(yīng)答(Waldmann，TA，2006，NatureRev.Immunol.6:595-601)。事實(shí)上，全身性IL-15治療的限制之一為可能引發(fā)自體免疫疾病。其他限制包含在標(biāo)準(zhǔn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中此種細(xì)胞激素的制造困難，以及其在活體內(nèi)的半衰期非常短。因此，有需要生產(chǎn)具適當(dāng)免疫剌激性治療形式的IL-15,其顯現(xiàn)較長(zhǎng)的活體內(nèi)半衰期、增加的免疫細(xì)胞結(jié)合活性、或增強(qiáng)的生物活性。此外，亦需要有效的IL-15拮抗劑。理想地，此等分子宜為選擇性地標(biāo)靶至疾病位置，以避免不必要的全身性中毒并且提供更有效的治療效益。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供具有治療用途的多種IL-15變異體與可溶性融合復(fù)合物，以及制造該等蛋白的方法。本發(fā)明提供使用本發(fā)明的可溶性融合復(fù)合物殺死靶細(xì)胞的方法。此處所述的IL-15變異體與可溶性復(fù)合物具有潛在的治療效用。因此，于一態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種可溶性融合蛋白復(fù)合物，其包括至少兩種可溶性融合蛋白，其中，第一融合蛋白包含第一生物性活性多肽，其共價(jià)連結(jié)至介白素-15(interleukin-15，IL-15)或其功能性片段，第二融合蛋白包括第二生物性活性多肽，其共價(jià)連結(jié)至可溶性介白素-15受體a(IL-15Ra)多肽或其功能性片段，其中第一融合蛋白的IL-15結(jié)構(gòu)域結(jié)合至第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra結(jié)構(gòu)域以形成可溶性融合蛋白復(fù)合物。于一具體例中，第一與第二生物性活性多肽中的一個(gè)包括第一可溶性T細(xì)胞受體(TCR)或其功能性片段。于另一具體例中，該生物性活性多肽的另一個(gè)包括該第一可溶性TCR或其功能性片段，因而創(chuàng)造具有增加的結(jié)合活性的多價(jià)TCR融合蛋白復(fù)合物。于再一具體例中，該另一個(gè)生物性活性多肽包括不同于該第一可溶性TCR的第二可溶性TCR或其功能性片段。于此態(tài)樣的另一具體例中，該TCR對(duì)于特定抗原的識(shí)別有特異性。于此態(tài)樣的再一具體例中，該TCR為包括a與b鏈TCR的異二聚體。于此態(tài)樣的又一具體例中，該TCR包括單鏈TCR多肽。于再一具體例中，該單鏈TCR多肽包括TCRV-a鏈，其通過肽接頭序列(p印tidelinkersequence)共價(jià)連結(jié)至TCRV-13鏈。于再另一具體例中，該單鏈TCR進(jìn)一步包括共價(jià)連結(jié)至TCRV-13鏈的可溶性TCRCP鏈片段。于另一具體例中，該單鏈TCR進(jìn)一步包括共價(jià)連結(jié)至TCRV_a鏈的可溶性TCRCa鏈片段。于再一具體例中，該第一與第二生物性活性多肽的一個(gè)或兩個(gè)包括抗體或其功能性片段。于又另一具體例中，該抗體對(duì)于特定抗原的識(shí)別有特異性。于再一具體例中，該抗體為單鏈抗體或單鏈Fv。于另一特定具體例中，該單鏈抗體包括免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(immunoglobulinlightchainvariabledoamin)，其通過多月太接頭序歹lj共價(jià)連結(jié)至免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域。于上述態(tài)樣之一具體例中，該第一生物性活性多肽通過多肽接頭序列共價(jià)連結(jié)至IL-15(或其功能性片段)。于上述態(tài)樣之另一具體例中，該第二生物性活性多肽通過多肽接頭序列共價(jià)連結(jié)至IL-15Ra多肽(或其功能性片段)。于另一具體例中，該TCR結(jié)構(gòu)域的抗原包括呈遞于MHC或HLA分子的肽抗原。于再一具體例中，該肽抗原來(lái)自于腫瘤相關(guān)多肽或病毒編碼多肽。于另一具體例中，該抗體結(jié)構(gòu)域的抗原包括細(xì)胞表面受體或配體。于再一具體例中，該抗原包括CD抗原、細(xì)胞激素或趨化激素受體或配體、生長(zhǎng)因子受體或配體、組織因子、細(xì)胞粘合分子、MHC/MHC樣分子、FC受體、Toll樣受體、NK受體、TCR、BCR、正向/負(fù)向協(xié)同剌激受體或配體、死亡受體或配體、腫瘤相關(guān)抗原、或病毒編碼抗原。于上述態(tài)樣之另一具體例中，該IL-15Ra多肽包括能結(jié)合IL-15的IL-15受體a的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。于上述態(tài)樣之另一具體例中，該IL-15Ra多肽包括IL-15asushi結(jié)構(gòu)域(Weietal.JournalofImmunology,2001，167:277-282)或IL-15aAE3結(jié)構(gòu)域(Andersonetal.1995.J.Biol.Chem.270:29862-29869，Duboisetal.1999.J.Biol.Chem.274:26978-26984)。于另一態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種IL-15變異體(此處亦稱為IL-15突變體)，其具有不同于天然(或野生型)IL-15蛋白以及結(jié)合至IL-15Ra多肽的氨基酸序列，且其作用為IL-15激動(dòng)劑或拮抗劑。本發(fā)明的具體例提供一種作為非融合蛋白或作為可溶性融合蛋白的IL-15變異體，其包括上述生物性活性多肽。其中，使用該IL-15變異體來(lái)代替該IL-15結(jié)構(gòu)域。于上述態(tài)樣之一具體例中，本發(fā)明的特征在于編碼此處所述任一態(tài)樣或具體例中的第一融合蛋白之核酸序列。9于上述態(tài)樣之一具體例中，本發(fā)明的特征在于編碼此處所述任一態(tài)樣或具體例中的第二融合蛋白之核酸序列。于上述態(tài)樣之一具體例中，本發(fā)明的特征在于編碼此處所述任一態(tài)樣或具體例中的IL-15變異體之核酸序列。于一具體例中，該核酸序列進(jìn)一步包括可操作性地連結(jié)至編碼該融合蛋白或IL-15變異體的序列的啟動(dòng)子、翻譯起始信號(hào)與前導(dǎo)序列。于另一具體例中，上述核酸序列的任一個(gè)包括在DNA載體中。于另一態(tài)樣中，本發(fā)明的特征在于一種制造上述態(tài)樣中的可溶性融合蛋白復(fù)合物的方法，該方法包括將上述態(tài)樣及具體例中編碼第一融合蛋白的DNA載體導(dǎo)入第一宿主細(xì)胞，在足以于細(xì)胞或培養(yǎng)基中表達(dá)該第一融合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該第一宿主細(xì)胞，由該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化該第一融合蛋白，將上述態(tài)樣及具體例中編碼該第二融合蛋白的DNA載體導(dǎo)入第二宿主細(xì)胞，在足以于細(xì)胞或培養(yǎng)基中表達(dá)該第二融合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該第二宿主細(xì)胞，由該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化該第二融合蛋白，以及在足以使第一融合蛋白的IL-15結(jié)構(gòu)域與第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生結(jié)合的條件下，混合該第一與第二融合蛋白以形成該可溶性融合蛋白復(fù)合物。于另一態(tài)樣中，本發(fā)明的特征在于一種制造上述態(tài)樣中的可溶性融合蛋白復(fù)合物的方法，該方法包括將上述態(tài)樣及具體例中編碼該第一融合蛋白的DNA載體與上述態(tài)樣及具體例中編碼該第二融合蛋白的DNA載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在足以于細(xì)胞或培養(yǎng)基中表達(dá)該融合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，且使第一融合蛋白的IL-15結(jié)構(gòu)域與第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生聯(lián)合，以形成該可溶性融合蛋白復(fù)合物，由該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化該可溶性融合蛋白復(fù)合物。于又一態(tài)樣中，本發(fā)明的特征在于一種制造上述態(tài)樣中的可溶性融合蛋白復(fù)合物的方法，該方法包括將編碼該第一與第二融合蛋白的權(quán)利要求28的DNA載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在足以于細(xì)胞或培養(yǎng)基中表達(dá)該融合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，且使第一融合蛋白的IL-15結(jié)構(gòu)域與第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生聯(lián)合，以形成該可溶性融合蛋白復(fù)合物，由該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化該可溶性融合蛋白復(fù)合物。于上述方法的其他態(tài)樣中，使用編碼該IL-15變異體的DNA載體代替編碼該第一融合蛋白的DNA載體，以產(chǎn)生能表達(dá)該IL-15變異體的宿主細(xì)胞且使該IL-15變異體與第二融合蛋白的IL-15Ra結(jié)構(gòu)域發(fā)生聯(lián)合，以形成可溶性融合蛋白復(fù)合物。于另一態(tài)樣中，本發(fā)明的特征在于一種制造上述態(tài)樣中的IL-15變異體的方法，該方法包括將上述態(tài)樣及具體例中編碼IL-15變異體的DNA載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在足以于細(xì)胞或培養(yǎng)基中表達(dá)該IL-15變異體的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，由該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化該IL-15變異體。于另一態(tài)樣中，本發(fā)明的特征在于一種殺死靶細(xì)胞的方法，該方法包括使多種細(xì)胞與上述任一態(tài)樣或具體例中的可溶性融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體接觸，其中，該多種細(xì)胞進(jìn)一步包括承載有為上述態(tài)樣中的IL-15結(jié)構(gòu)域所識(shí)別的IL-15R鏈的免疫細(xì)胞，以及承載有為上述態(tài)樣中的生物性活性多肽的至少一個(gè)所識(shí)別的抗原的靶細(xì)胞；在該靶細(xì)胞的抗原與該免疫細(xì)胞的IL-15R鏈之間形成特異性結(jié)合復(fù)合物(橋聯(lián))，其足以結(jié)合與活化該免疫細(xì)胞；以及通過所結(jié)合的經(jīng)活化免疫細(xì)胞殺死該靶細(xì)胞。于該方法的一具體例中，該靶細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞。于該方法的另一具體例中，該生物性活性多肽包括TCR。于該方法的又一具體例中，該靶細(xì)胞的抗原包括呈遞于MHC或HLA分子且可為TCR所識(shí)別的腫瘤或病毒編碼肽抗原。于該方法的再一具體例中，該免疫細(xì)胞為T細(xì)胞、LAK細(xì)胞或NK細(xì)胞。于另一態(tài)樣中，本發(fā)明的特征在于一種預(yù)防或治療患者的疾病的方法，其中，該疾病細(xì)胞表達(dá)疾病相關(guān)抗原，該方法包括對(duì)該患者給予包括識(shí)別疾病相關(guān)抗原的生物性活性多肽的上述任一態(tài)樣或具體例中的可溶性融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體，在抗原表達(dá)的疾病細(xì)胞與IL-15R表達(dá)的免疫細(xì)胞之間形成特異性結(jié)合復(fù)合物(橋聯(lián))，其足以定位該免疫細(xì)胞，以及傷害或殺死該疾病細(xì)胞，其足以預(yù)防或治療患者的疾病。于一態(tài)樣中，本發(fā)明的特征在于一種預(yù)防或治療患者的疾病的方法，其中，該疾病細(xì)胞表達(dá)疾病相關(guān)抗原，該方法包括將承載該IL-15R鏈的免疫細(xì)胞與包括識(shí)別疾病相關(guān)抗原的生物性活性多肽的權(quán)利要求1至22中的可溶性融合蛋白復(fù)合物混合，對(duì)患者給予免疫細(xì)胞_融合蛋白復(fù)合物，在抗原表達(dá)的疾病細(xì)胞與IL-15R表達(dá)的免疫細(xì)胞之間形成特異性結(jié)合復(fù)合物(橋聯(lián))，其足以定位該免疫細(xì)胞，以及傷害或殺死該疾病細(xì)胞，其足以預(yù)防或治療患者的疾病。于另一態(tài)樣中，本發(fā)明的特征在于一種預(yù)防或治療患者的疾病的方法，其中，該患者細(xì)胞表達(dá)疾病相關(guān)抗原，該方法包括對(duì)該患者給予包括識(shí)別疾病相關(guān)抗原的生物性活性多肽的上述任一態(tài)樣或具體例中的可溶性融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體，將可溶性融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體定位至該疾病細(xì)胞，其中，該可溶性融合蛋白復(fù)合物的IL-15結(jié)構(gòu)域或IL-15變異體與承載該IL-15R鏈的免疫細(xì)胞結(jié)合，以及抑制該免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答。于該方法的一具體例中，該疾病為癌癥或病毒感染。于該方法的另一具體例中，該疾病為免疫疾患、自體免疫疾病或炎性疾患。于該方法的另一具體例中，該疾病相關(guān)抗原為肽/MHC復(fù)合物。于另一具體例中，本發(fā)明的特征在于一種剌激哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給予有效量的上述任一態(tài)樣或具體例中的可溶性融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體。于另一具體例中，本發(fā)明的特征在于一種抑制哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給予有效量的上述任一態(tài)樣或具體例中的可溶性融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體。圖l(A與B)為概要圖。(A)為描述含有單鏈TCR多肽的融合蛋白復(fù)合物實(shí)例的概要圖。(B)為描述包括融合蛋白復(fù)合物的代表性融合蛋白構(gòu)筑體的概要圖。圖2(A至C)由三個(gè)圖所組成。(A)描述pNEF38-c264scTCR/huIL15表達(dá)載體的圖譜。(B)顯示c264scTCR/huIL15融合基因的序列。(C)顯示c264scTCR/huIL15融合蛋白的序列，其包含前導(dǎo)序列。圖3(A至C)由三個(gè)圖所組成。(A)描述pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15表達(dá)載體的圖譜。(B)顯示c264scTCR-hinge-huIL15融合基因的序列。(C)顯示c264scTCR-hinge-huIL15融合蛋白的序列，其包含前導(dǎo)序列。圖4(A至C)由三個(gè)圖所組成。(A)描述pNEF38-c264scTCR/huIL15RaDE3表達(dá)載體的圖譜。(B)顯示c264scTCR/huIL15RaAE3融合基因的序列。(C)顯示c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白的序列，其包含前導(dǎo)序列。圖5(A至C)由三個(gè)圖所組成。(A)描述pNEF38-c264scTCR/huIL15RaSushi表達(dá)載體的圖譜。(B)顯示c264scTCR/huIL15RaSushi融合基因的序列。(C)顯示c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白的序列，其包含前導(dǎo)序列。圖6(A至C)由三個(gè)圖所組成。(A)描述pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15RaSushi表達(dá)載體。(B)顯示c264scTCR-hinge-huIL15RaSushi融合基因的序列。(C)顯示c264scTCR-hinge-huIL15RaSushi融合蛋白的序列，其包含前導(dǎo)序列。圖7為pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaSushi表達(dá)載體的圖譜。圖8為pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaDE3表達(dá)載體的圖譜。圖9(A與B)闡述表達(dá)TCR/IL15Ra融合蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的特性。(A)為兩個(gè)顯示融合蛋白表達(dá)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析的圖。(B)為顯示融合蛋白產(chǎn)生的以TCR為主的ELISA結(jié)果的圖。圖10(A與B)顯示TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白通過還原SDSPAGE的分析。(A)顯示含有c264scTCR/huIL15或c264scTCR/huIL15RaSushi的細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮液。(B)顯示含有c264scTCR/huIL15或c264scTCR/huIL15RaAE3的細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮液。圖ll(A至C)顯示TCR/IL15、TCR/IL15Ra及融合蛋白復(fù)合物通過尺寸排出層析(sizeexclusionchromatography)的分析。(A)為顯示c264scTCR/huIL15之SEC層析圖譜的圖。(B)為顯示c264scTCR/huIL15RaSushi之SEC層析圖譜的圖。(C)為顯示c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白復(fù)合物之SEC層析圖譜的圖。圖12(A與B)為TCR/IL15Ra及融合蛋白復(fù)合物通過尺寸排出層析的分析。(A)為說明c264scTCR/huIL15RaAE3之SEC層析圖譜的圖。(B)為說明c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白復(fù)合物之SEC層析圖譜的圖。圖13為顯示通過流式細(xì)胞儀所測(cè)得的TCR/IL15、TCR/IL15Ra及融合蛋白復(fù)合物對(duì)細(xì)胞呈遞的肽/MHC復(fù)合物的結(jié)合性的圖。圖14(A至D)由四個(gè)圖所組成。(A)顯示成熟人類IL15蛋白(SEQIDN0:1)的序列，藍(lán)色底線的殘基為表1所示的IL-15變異體中經(jīng)取代者。(B)描述pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8A及pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8N表達(dá)載體。(C)顯示pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8A及pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8N基因的序歹lj。(D)顯示pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8A及pNEF38-c264scTCR-hinge-huIL15D8N融合蛋白的序列，其包含前導(dǎo)序列。改變藍(lán)色底線的核苷酸以產(chǎn)生指定的IL-15變異體。圖15為顯示以融合蛋白及復(fù)合物染色，接著經(jīng)TCR特異性肽/MHC試劑的承載有IL-15R的CTLL2細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析圖。圖16(A至C)為顯示通過流式細(xì)胞儀所測(cè)得的TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15(包括天然與變異型IL15)的二聚體融合蛋白復(fù)合物對(duì)于呈遞于載入肽的細(xì)胞的同源性肽/MHC復(fù)合物之結(jié)合性的圖。亦顯示于未載入肽的細(xì)胞的二聚體融合蛋白復(fù)合物之背景結(jié)合率。(A)為顯示TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15wt(天然型)、或TCR/IL15D8N或TCR/IL15D8A變異體的二聚體復(fù)合物對(duì)于呈遞于細(xì)胞的同源性肽/MHC復(fù)合物之結(jié)合性的圖。(B)為顯示TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15wt(天然型)的二聚體復(fù)合物對(duì)于未載入肽的細(xì)胞的微量背景結(jié)合率的圖。TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15D8N或TCR/IL15D8A變異體的二聚體復(fù)合物對(duì)未載入肽的細(xì)胞未見到背景結(jié)合率。(C)為顯示以TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15wt(天然型)、或TCR/IL15N72D、TCR/IL15D8N或TCR/IL15D8A變異體的二聚體復(fù)合物染色的承載有IL-15RPyC的32DP細(xì)胞之流式細(xì)胞儀分析圖。觀察到含有TCR/IL15N72D的復(fù)合物的IL-15RPYC結(jié)合性增強(qiáng)，以及含有TCR/IL15D8N或TCR/IL15D8A的復(fù)合物的IL-15RPyC結(jié)合性降低。圖17(A與B)為顯示通過ELISA所測(cè)得的野生型、拮抗劑及激動(dòng)劑TCR/IL15融合蛋白對(duì)于同源性肽/MHC復(fù)合物與IL15Ra之結(jié)合活性的圖。(A)為顯示融合蛋白對(duì)于同源性肽/MHC復(fù)合物之結(jié)合活性的分析。(B)為顯示融合蛋白對(duì)于IL15Ra之結(jié)合活性的分析。圖18為顯示通過細(xì)胞增生試驗(yàn)所測(cè)得的融合蛋白及融合蛋白復(fù)合物維持承載有IL15R的細(xì)胞生長(zhǎng)的圖。圖19(A至C)為顯示通過細(xì)胞增生試驗(yàn)所測(cè)得的包括IL-15變異體的TCR/IL-15融合蛋白抑制或增進(jìn)承載有IL15R的細(xì)胞生長(zhǎng)的能力的圖。(A)為顯示包括IL-15變異體的融合蛋白抑制承載有高親和性IL15R(a|3Y受體復(fù)合物)的CTLL-2細(xì)胞增生的活性的圖。(B)為顯示包括IL-15變異體的融合蛋白抑制或增進(jìn)承載有低親和性IL15R(ey受體復(fù)合物)的32DP細(xì)胞增生的活性的圖。(C)為顯示包括IL-15變異體的融合蛋白阻斷承載有高親和性IL15R(a|3Y受體復(fù)合物)的CTLL-2細(xì)胞之TCR/IL15wt剌激性增生的活性的圖。圖20描述活體外培養(yǎng)NK細(xì)胞與TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15的二聚體融合蛋白復(fù)合物對(duì)異體移植荷腫瘤裸小鼠存活率的影響。對(duì)無(wú)胸腺裸小鼠注射人類NSCLCA549-A2細(xì)胞，以建立肺臟轉(zhuǎn)移。將單離自異源供體小鼠脾臟的經(jīng)純化NK細(xì)胞與rhlL-2、MARTlscTCR-IL2、c264scTCR-IL2或c264scTCR-IL15/c264scTCR-IL15Ra于活體外培養(yǎng)并授受性轉(zhuǎn)移(adoptivetransfer)至經(jīng)環(huán)磷醯胺(cyclophosphamide,CTX)預(yù)先處理之荷腫瘤小鼠，如圖中說明所示。描繪出處理之后的存活率百分比。圖21闡述表l，其顯示IL-15變異體中的氨基酸置換以及此等變異對(duì)IL-15活性的影響。圖22A至B分別闡述IL-15的氨基酸序列(SEQIDNO:1)及IL-15的核酸序列(SEQIDNO:2)。具體實(shí)施例方式已確立IL-15穩(wěn)定地結(jié)合至IL-15Ra的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，且所得復(fù)合物能夠經(jīng)由該中間型或高親和性IL-15R復(fù)合物調(diào)控(亦即，剌激或阻斷)免疫應(yīng)答(l至4)。此外，已證實(shí)單鏈TCR或抗體多肽可融合至細(xì)胞激素及其他免疫效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域，且此等雙特異性融合分子保有兩種融合結(jié)構(gòu)域的功能活性(5至8)。再者，已顯示多價(jià)型TCR對(duì)其配體提供增強(qiáng)的結(jié)合性(9)。定義以下定義是為用于下列文字說明中的特定術(shù)語(yǔ)而提供。說明書及權(quán)利要求書中所使用的單數(shù)形式〃a"、〃an"及〃the"包含復(fù)數(shù)指稱，除非內(nèi)容中另行清楚規(guī)定。舉例而言，術(shù)語(yǔ)〃細(xì)胞〃包含多個(gè)細(xì)胞，包含其混合物。術(shù)語(yǔ)〃核酸分子〃包括多個(gè)核酸分子。此處所使用的術(shù)語(yǔ)〃包括〃意指組成物及方法包含所記載的元素，但不排除其他元素。當(dāng)用于界定組成物及方法時(shí)，〃實(shí)質(zhì)上由…所組成〃應(yīng)指排除對(duì)組合具任何實(shí)質(zhì)重要性的其他元素。因此，此處所定義的實(shí)質(zhì)上由元素所組成的組成物將不排除得自單離及純化方法的微量污染物以及醫(yī)藥上可接受的載劑，例如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等。〃由…所組成〃應(yīng)指排除超過微量的其他成分及用于給予本發(fā)明組成物的實(shí)質(zhì)方法步驟的元素。由此等轉(zhuǎn)折語(yǔ)各自界定的具體例皆于本發(fā)明的范疇中?！贵w〃為結(jié)合至特定抗原決定基(印itope)的任何免疫球蛋白，包含抗體及其片段。該術(shù)語(yǔ)涵括多株抗體、單株抗體、嵌合抗體及單鏈抗體，以及雙特異性抗體。此處所使用的術(shù)語(yǔ)〃抗原〃意指會(huì)引發(fā)免疫系統(tǒng)制造抗體或特定細(xì)胞媒介的免疫應(yīng)答與其對(duì)抗的任何物質(zhì)。疾病相關(guān)抗原為與任何疾病相關(guān)的任何物質(zhì)。此處所使用的術(shù)語(yǔ)〃生物性活性多肽〃意指氨基酸序列，例如蛋白質(zhì)、多肽或肽；糖或多糖；脂質(zhì)或醣脂、醣蛋白、或脂蛋白，其可產(chǎn)生此處討論的所欲效果，包含TCR或抗體融合蛋白復(fù)合物與抗原的結(jié)合活性。此處所使用的術(shù)語(yǔ)〃細(xì)胞〃意圖包含任何原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、初級(jí)細(xì)胞或永生化細(xì)胞系(immortalizedcellline)、組織或器官中的此等細(xì)胞的任何群集。優(yōu)選地，細(xì)胞得自哺乳動(dòng)物(尤其是人類)的來(lái)源，且可經(jīng)一種或多種病原體感染。依據(jù)本發(fā)明的〃宿主細(xì)胞〃可為任何來(lái)源的經(jīng)轉(zhuǎn)染(transfected)、經(jīng)轉(zhuǎn)形(transformed)、經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduced)或經(jīng)感染(infected)的細(xì)胞，包含原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞，或者其可為可用于增殖此處所述核酸的任何來(lái)源的細(xì)胞。此處所使用的術(shù)語(yǔ)〃共軛分子〃意指通過化學(xué)方法或其他適當(dāng)方法共價(jià)連結(jié)(亦即，融合)的TCR或抗體分子與效應(yīng)物分子(通常為化學(xué)分子或合成分子)。若有需要，共軛分子可經(jīng)由肽接頭序列或載體分子于一個(gè)或數(shù)個(gè)位置融合。或者，肽接頭或載體可用于協(xié)助構(gòu)筑共軛分子。特別優(yōu)選的共軛分子為共軛毒素或可檢測(cè)性標(biāo)記。此處所使用的術(shù)語(yǔ)〃效應(yīng)物分子〃意指氨基酸序列，例如蛋白質(zhì)、多肽或肽；糖或多糖；脂質(zhì)或醣脂、醣蛋白、或脂蛋白，其可產(chǎn)生此處討論的所欲效果，包含IL-15結(jié)構(gòu)域、IL-15變異體或IL-15受體(例如IL-15Ra、IL-2RP或yC)、或其功能性片段。術(shù)語(yǔ)〃融合分子〃及〃融合蛋白〃可交互地使用且意指通過重組方法、化學(xué)方法或其他適當(dāng)方法共價(jià)連結(jié)(亦即，融合)的生物性活性多肽(通常為TCR或抗體)與效應(yīng)物分子(通常為蛋白質(zhì)或肽序列)。若有需要，融合分子可經(jīng)由肽接頭序列于一個(gè)或數(shù)個(gè)位置融合?；蛘?，肽接頭可用于協(xié)助構(gòu)筑融合分子。特別優(yōu)選的融合分子為融合蛋白。一般而言，融合分子亦可包括共軛分子。術(shù)語(yǔ)〃宿主細(xì)胞〃意指含有選殖載體或表達(dá)載體的任何原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。此14術(shù)語(yǔ)亦包含彼等經(jīng)基因工程而在宿主細(xì)胞的染色體或基因體中含有經(jīng)選殖基因的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。此處所使用的術(shù)語(yǔ)〃免疫應(yīng)答〃意指經(jīng)由涉及不同的粘合及活化步驟的多因子過程剌激免疫細(xì)胞并從血液將免疫細(xì)胞召集至淋巴組織以及非淋巴組織的過程?；罨瘲l件引發(fā)細(xì)胞激素、生長(zhǎng)因子、趨化激素及其他因子的釋放，向上調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞上的黏合分子及其他活化分子的表達(dá)，促進(jìn)黏合、形態(tài)變化及/或與趨化作用同時(shí)的外滲作用(extravasation)通過組織，增加細(xì)胞增生及細(xì)胞毒殺活性，剌激抗原呈遞以及提供其他表型變化(包括產(chǎn)生記憶細(xì)胞類型)。免疫應(yīng)答亦意指免疫細(xì)胞抑制或調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的發(fā)炎或細(xì)胞毒殺活性的活性。此處所使用的術(shù)語(yǔ)〃多核苷酸〃及〃核酸分子〃可交互地使用，其意指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合型。多核苷酸可含有去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及/或其類似物。核苷酸可具有任何三維立體結(jié)構(gòu)，且可執(zhí)行任何已知或未知的功能。術(shù)語(yǔ)〃多核苷酸〃包含例如單股、雙股及三螺旋分子、基因或基因片段、外顯子(exon)、內(nèi)含子(intron)、mRNA、tRNA、rRNA、核糖酶(ribozyme)、反義分子(antisensemolecule)、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、適體(aptamer)、質(zhì)體、載體、經(jīng)單離的任何序列DNA、經(jīng)單離的任何序列RNA、核酸探針、及引子。核酸分子亦可包括經(jīng)修飾的核酸分子(例如，包括經(jīng)修飾的堿基、糖類及/或核苷酸間接頭)。術(shù)語(yǔ)〃多肽〃意指無(wú)論其大小，優(yōu)選地實(shí)質(zhì)上由任意的20個(gè)天然氨基酸所組成的任何聚合物。盡管術(shù)語(yǔ)〃蛋白質(zhì)〃常用來(lái)指相對(duì)較大的蛋白質(zhì)，〃肽〃常用來(lái)指小的多肽，在此領(lǐng)域中此等術(shù)語(yǔ)常部分重疊使用。除非另行注明，否則術(shù)語(yǔ)〃多肽〃一般是指蛋白質(zhì)、多肽、及肽。通過標(biāo)準(zhǔn)分子分級(jí)技術(shù)(例如離心或SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳)進(jìn)行判定時(shí)，依據(jù)本發(fā)明普遍適用的肽一般介于約O.1至100KD之間或更大而高達(dá)約1000KD，優(yōu)選地介于約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30及50KD之間。術(shù)語(yǔ)〃預(yù)防(prevent)"、〃預(yù)防(preventing)"、〃預(yù)防(prevention)"、〃預(yù)防性治療(prophylactictreatment)"等意指降低個(gè)體發(fā)展疾患或病癥的可能性，該個(gè)體不具有疾患或病癥，但有發(fā)展疾患或病癥的風(fēng)險(xiǎn)或容易發(fā)展疾患或病癥。術(shù)語(yǔ)〃單鏈抗體〃意指以單鏈形式為主的抗體。單鏈抗體可由抗體的最小結(jié)合次單元所組成。單鏈抗體可在單一安定折疊的多肽鏈上僅組合抗體的彼等抗原結(jié)合區(qū)域。依此，相較于典型的免疫球蛋白，單鏈抗體具有相當(dāng)小的尺寸，但其仍保有抗體的抗原特異性結(jié)合性質(zhì)。單鏈抗體可連結(jié)至廣范圍的配體，例如效應(yīng)物分子或藥物共軛體。此處所使用的術(shù)語(yǔ)〃可溶性〃意指在低G力離心(例如，于標(biāo)準(zhǔn)離心機(jī)中每分鐘低于約30，000轉(zhuǎn))的情形下不容易從水性緩沖液(例如，細(xì)胞培養(yǎng)基)沉降的融合分子(尤其是融合蛋白)。再者，于低濃度或無(wú)陰離子性或非離子性界面活性劑存在下，若融合分子在高于約5至37°C的溫度及在中性pH值或接近中性pH值仍維持于水溶液中，則該融合分子為可溶性的。于此等條件下，可溶性蛋白通常具有低沉降值，例如，低于約10至50沉降單位(svedbergunit)。此處所述及的水溶液典型地具有緩沖化合物以確立pH值，典型地，其介于約5至9的pH范圍內(nèi)，且離子強(qiáng)度范圍介于約2mM及500mM之間。有時(shí)，添加蛋白酶抑制劑或溫和的非離子性界面活性劑。此外，若有需要，可添加載體蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)而達(dá)到少量mg/ml。例示性水性緩沖液包含標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽緩沖鹽水、tris緩沖鹽水、或其他廣為人知的緩沖液及細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)配物。術(shù)語(yǔ)〃剌激(stimulate)"或〃剌激(stimulating)"意指增加、放大、增強(qiáng)、提高免疫應(yīng)答。剌激可為正向改變。例示性增加可為例如，增加5%、10%、25%、50%、75%或甚至90至100%。其他例示性增加包含增加2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、或甚至100倍。術(shù)語(yǔ)〃抑制(suppress)"或〃抑制(su卯ressing)"意指減少、減弱、降低、遏止或平抑免疫應(yīng)答。抑制可為負(fù)向改變。例示性減少可為例如，減少5%、10%、25%、50%、75%或甚至90至100%。例示性減少包含減少2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、或甚至100倍。術(shù)語(yǔ)〃T細(xì)胞受體〃(TCR)意指參與T細(xì)胞應(yīng)答抗原呈遞的活化作用的整合性膜蛋白(integralmembraneprotein)復(fù)合物的多肽。T細(xì)胞經(jīng)由ap異二聚體T細(xì)胞受體(TCR)辨識(shí)結(jié)合至MHC產(chǎn)物的肽。TCR庫(kù)具有廣泛的多樣性，該多樣性由抗體重鏈及輕鏈基因中所使用的相同基因重排機(jī)制所創(chuàng)造[Toneg,，S.(1988)Biosci.R印.8:3-26]。大部分的多樣性產(chǎn)生于編碼a及P鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)3(complementaritydeterminingregion3，CDR3)的可變(variable,V)區(qū)及連接(joining,J)區(qū)(或變異(diversity,D)區(qū))的接合處[DavisandBjorkman(1988)Nature334:395-402]。然而，TCR不會(huì)如同抗體般，可能不會(huì)巧合地，進(jìn)行體細(xì)胞點(diǎn)突變。TCR亦不會(huì)進(jìn)行與抗體相同程度的親和性成熟(affinitymaturation)。TCR在其自然產(chǎn)生時(shí)顯現(xiàn)出具有范圍介于105至107M—1的親和性，而抗體則典型地具有范圍介于105至109M—1的親和性[Davisetal.(1998)An皿.Rev.Immunol.16:523-544;Eisenetal.(1996)Adv.ProteinChem.49:1-56]。盡管在TCR中缺乏體細(xì)胞突變可能與較低親和性相關(guān)，但亦有主張認(rèn)為TCR具有較高親和性并不具有選擇優(yōu)勢(shì)。事實(shí)上，T細(xì)胞活化作用的序列觸發(fā)(serial-triggering)[Valituttietal.(1995)Nature375:148-151]及云力態(tài)校正(kineticproofreading)[Rabinowitzetal.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1401-1405]模型皆提出較長(zhǎng)的分離速率(off-rates)(與較高親和性相關(guān))將不利于訊息傳遞過程。較高親和性的TCR亦可能無(wú)法維持T細(xì)胞應(yīng)答所需的肽特異性。舉例而言，結(jié)合于MHC溝(MHCgroove)中的肽呈現(xiàn)有限的可及表面(accessiblesurface)[Bjorkman，P.J.(1997)Cell89:167-170]，其可能進(jìn)而限制在相互作用可產(chǎn)生能量的量。另一方面，通過將能量導(dǎo)向MHC螺旋來(lái)提升TCR的親和性可能將導(dǎo)致負(fù)向選擇期間的胸腺缺失[Bevan，M.J.(1997)Immunity7:175-178]。術(shù)語(yǔ)"TCR"涵括多株T細(xì)胞受體、單株T細(xì)胞受體、嵌合T細(xì)胞受體、人類化T細(xì)胞受體、異二聚體T細(xì)胞受體及單鏈T細(xì)胞受體或其功能性片段，包含包括有TCRVa及VP結(jié)構(gòu)域的分子。術(shù)語(yǔ)"TCR"亦涵括揭示于例如，2008年3月19日申請(qǐng)且案名為〃TCELLRECEPT0RFUSIONSANDCONJUGATESANDMETHODSOFUSETHERE0F〃的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案以及美國(guó)專利公開案US200301-44474A1中的T細(xì)胞受體。術(shù)語(yǔ)〃載體〃為能夠在宿主細(xì)胞中自行復(fù)制且可接受外來(lái)DNA的核酸分子。載體帶有其本身的復(fù)制起始點(diǎn)、可用于插入外來(lái)DNA的一種或多種限制性內(nèi)切酶的獨(dú)特識(shí)別位置、以及通常帶有篩選標(biāo)志(selectablemarker)(例如，編碼抗生素抗性的基因)、且常帶有用于表達(dá)所插入的DNA的識(shí)別序列(例如，啟動(dòng)子)。常見的載體包含質(zhì)體載體及噬菌體載體。T細(xì)胞受體(TCR)T細(xì)胞為細(xì)胞的次族群，其與其他免疫細(xì)胞類型(多形核嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性白細(xì)胞、嗜堿性白細(xì)胞、肥胖細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞)共同構(gòu)成免疫系統(tǒng)的細(xì)胞組分。在生理?xiàng)l件下，T細(xì)胞在免疫監(jiān)控及消滅外來(lái)抗原方面發(fā)揮作用。然而，在病理?xiàng)l件下，有強(qiáng)烈的證據(jù)顯示T細(xì)胞在疾病的引發(fā)及擴(kuò)散中扮演著重要的角色。于此等疾患中，破壞T細(xì)胞免疫耐受性(中樞性或周邊性)為引發(fā)自體免疫疾病的主要基本過程。TCR由至少7個(gè)跨膜蛋白(transmembraneprotein)所構(gòu)成。經(jīng)二硫鍵連結(jié)的(aP)異二聚體形成單型抗原辨識(shí)單元，而CD3的恒定鏈(invariantchain)(其由e(印silon)、Y(gamma)、S(delta)與;(zeta)及n(eta)鏈所組成)負(fù)責(zé)與結(jié)合至訊息傳遞路徑的配體聯(lián)合，造成T細(xì)胞活化而發(fā)揮細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。無(wú)論TCR鏈的基因多樣性為何，所有已知的次單元皆共有兩種結(jié)構(gòu)特征。首先，該等次單元為具有單一跨膜結(jié)構(gòu)域(singletransmembranespanningdomain)(可會(huì)g為a_螺旋)的跨膜蛋白。其次，所有TCR鏈皆具有在預(yù)定跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)有帶電荷氨基酸的不尋常特征。恒定鏈具有單一負(fù)電荷，其在小鼠與人類之間具保守性，而可變鏈則擁有一個(gè)(TCR-P)或兩個(gè)(TCR-a)正電荷。TCR-a的跨膜序列在多種物種中具高度保守性，因此可在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上扮演重要的功能角色。含有親水性氨基酸精氨酸及賴氨酸的八肽序列(oct即印tidesequence)在物種之間為相同。T細(xì)胞應(yīng)答是由結(jié)合至TCR的抗原所調(diào)控。其中一種類型的TCR為由a及|3鏈(類似免疫球蛋白的可變(V)及恒定(C)區(qū))所組成的膜結(jié)合性異二聚體。TCRa鏈包含共價(jià)連結(jié)的V-a及C-a鏈，而|3鏈則包含共價(jià)連結(jié)至C-P鏈的V-P鏈。V_a及V-P鏈形成在主要組織相容性復(fù)合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)(在人類中稱為HLA復(fù)合物)的背景中可與超級(jí)抗原(superantigen)或抗原結(jié)合的囊狀物或凹口。參見DavisAnn.Rev.ofImmunology3:537(1985)fundamentalImmunology3rdEd.，W.PaulEd.RsenPressLTD.NewYork(1993)。融合蛋白本發(fā)明的可溶性融合蛋白及共軛分子復(fù)合物包括至少兩種可溶性融合蛋白，其中，第一融合蛋白包含第一生物性活性多肽，其共價(jià)連結(jié)至介白素-15(interleukin-15，IL-15)或其功能性片段，第二融合蛋白包括第二生物性活性多肽，其共價(jià)連結(jié)至可溶性介白素-15受體a(IL-15Ra)多肽或其功能性片段，其中第一融合蛋白的IL_15結(jié)構(gòu)域結(jié)合至第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra結(jié)構(gòu)域以形成可溶性融合蛋白復(fù)合物。于某些實(shí)例中，生物性活性多肽之一個(gè)包括第一可溶性TCR或其片段。該生物性活性多肽之另一個(gè)或第二生物性活性多肽包含第一可溶性TCR或其功能性片段，因而創(chuàng)造多價(jià)TCR融合蛋白復(fù)合物，其具有相較于單價(jià)TCR而言，對(duì)同源性配體增加的結(jié)合活性。再者，該另一個(gè)生物性活性多肽包括不同于該第一可溶性TCR的第二可溶性TCR或其功能性片段。于某些實(shí)例中，相較于天然TCR而言，所產(chǎn)生的TCR具有較高的親和性，或?qū)ν葱耘潴w增加的結(jié)合活性。若此處所述的本發(fā)明可溶性TCR對(duì)其配體具有較高的結(jié)合性(avidity)或親和性，則其適用于作為細(xì)胞表面結(jié)合性抗原的特異性探針。于本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)例中，TCR特定抗原的辨識(shí)具有特異性。于例示性具體例中，TCR為包括a鏈(此處稱為a、阿伐(alpha)或a鏈)及P鏈(此處稱為P、貝他(beta)或b鏈)的異二聚體。于其他例示性具體例中，TCR包括單鏈TCR多肽。單鏈TCR可包括通過肽接頭序列共價(jià)連結(jié)至TCRV_|3鏈的TCRV-a鏈。單鏈TCR可進(jìn)一步包括共價(jià)連結(jié)至TCRV-13鏈的可溶性TCRCP鏈片段。單鏈TCR可進(jìn)一步包括共價(jià)連結(jié)至TCRV-a鏈的可溶性TCRCa鏈片段。于再一具體例中，第一與第二生物性活性多肽的一個(gè)或兩個(gè)包括抗體或其功能性片段。此處所使用的術(shù)語(yǔ)〃生物性活性多肽〃或〃效應(yīng)物分子〃意指可產(chǎn)生此處討論的所欲效果的氨基酸序列，例如蛋白質(zhì)、多肽或肽；糖或多糖；脂質(zhì)或醣脂、醣蛋白、或脂蛋白。效應(yīng)物分子亦包含化學(xué)藥劑。亦涵括編碼生物性活性或效應(yīng)物蛋白、多肽、或肽的效應(yīng)物分子核酸。因此，適當(dāng)?shù)姆肿影{(diào)節(jié)因子、酶、抗體或藥物，以及DNA、RNA及寡核苷酸。生物性活性多肽或效應(yīng)物分子可為天然存在的，或者，其可例如通過重組或化學(xué)合成法從已知成分合成，且可包含異源組分。通過標(biāo)準(zhǔn)分子分級(jí)技術(shù)(例如離心或SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳)進(jìn)行判定時(shí)，生物性活性多肽或效應(yīng)物分子一般介于約0.1至100KD之間或更大而高達(dá)約1000KD，優(yōu)選地介于約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30及50KD之間。本發(fā)明的所欲效果包含，但不限于例如在預(yù)防或治療疾病方面形成具有增加的結(jié)合性的TCR融合蛋白復(fù)合物、殺死靶細(xì)胞，以例如引發(fā)細(xì)胞增生或細(xì)胞死亡、起始免疫應(yīng)答，或者作為用于診斷目的之檢測(cè)分子。對(duì)于此等檢測(cè)可使用檢定法，例如包含下列連續(xù)步驟的檢定法培養(yǎng)細(xì)胞以使其增生，使該細(xì)胞與本發(fā)明的TCR融合復(fù)合物接觸，接著評(píng)估TCR融合復(fù)合物是否抑制該細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)展。依據(jù)本發(fā)明共價(jià)連結(jié)效應(yīng)物分子至TCR肽提供多個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的TCR融合復(fù)合物可制造成含有單一效應(yīng)物分子，包含具有已知結(jié)構(gòu)的肽。此外，種類繁多的效應(yīng)物分子可在相似的DNA載體中制造。換言之，不同效應(yīng)物分子庫(kù)可連結(jié)至TCR分子，以用于呈遞經(jīng)感染細(xì)胞或疾病細(xì)胞。再者，就治療應(yīng)用而言，可對(duì)個(gè)體給予編碼連結(jié)至效應(yīng)物肽的TCR分子的DNA表達(dá)載體以于活體內(nèi)表達(dá)TCR融合復(fù)合物，而不對(duì)個(gè)體給予TCR分子。此等方法避免典型地與制備重組蛋白相關(guān)的昂貴純化步驟，且避免與習(xí)知方法相關(guān)的抗原攝取及加工的復(fù)雜步驟。如所述，此處揭示的融合蛋白組分(例如，效應(yīng)物分子，如細(xì)胞激素、趨化激素、生長(zhǎng)因子、蛋白毒素、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其他生物活性分子以及任何肽接頭)可依幾乎任合方式組織，限制條件為該融合蛋白具有其所謀求的功能。特定而言，若有需要，融合蛋白的各組分可通過至少一個(gè)適當(dāng)?shù)碾慕宇^序列而彼此隔開。此外，融合蛋白可包含標(biāo)識(shí)物(tag)，以例如幫助融合蛋白的修飾、辨別及/或純化。更具體的融合蛋白如下文實(shí)施例中所述。[接頭]本發(fā)明的融合復(fù)合物優(yōu)選地亦包含插至于IL-15或IL-15Ra結(jié)構(gòu)域與生物性活性多肽之間的可撓性接頭序列(flexiblelinkersequence)。接頭序列使生物性活性多肽對(duì)IL-15或IL-15Ra結(jié)構(gòu)域的有效定位得以達(dá)成，而使該兩種結(jié)構(gòu)域的功能活性得以發(fā)揮。于生物性活性多肽為TCR的具體例中，接頭序列定位TCR分子結(jié)合溝，使得T細(xì)胞受體可辨識(shí)呈遞MHC-肽復(fù)合物，且可運(yùn)送效應(yīng)物分子至所欲位置。通過以下揭示的檢定法測(cè)定時(shí)，效應(yīng)物分子成功的呈遞可調(diào)控細(xì)胞的活性或者引發(fā)或抑制T細(xì)胞增生，或者起始或抑制對(duì)特定位置的免疫應(yīng)答，該檢定法包含活體外檢定法，其包含下列連續(xù)步驟培養(yǎng)T細(xì)胞以使其增生，使該T細(xì)胞與本發(fā)明的TCR融合復(fù)合物接觸，接著評(píng)估TCR融合復(fù)合物是否抑制該細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)展。于某些具體例中，可溶性融合蛋白復(fù)合物具有接頭，其中，第一生物性活性多肽通過多肽接頭序列共價(jià)連結(jié)至IL-15(或其功能性片段)。于其他具體例中，此處所述的可溶性融合蛋白復(fù)合物具有接頭，其中，第二生物性活性多肽通過多肽接頭序列共價(jià)連結(jié)至IL-15Ra多肽(或其功能性片段)。接頭序列優(yōu)選地由能得到可有效地定位用于辨識(shí)呈遞抗原的TCR分子結(jié)合溝的肽的核苷酸序列所編碼。此處所使用的詞語(yǔ)〃生物性活性多肽對(duì)IL-15或IL-15Ra結(jié)構(gòu)域的有效定位〃或其他類似詞語(yǔ)意指將連結(jié)至IL-15或IL-15Ra結(jié)構(gòu)域的生物性活性多肽予以定位，使得IL-15或IL-15Ra結(jié)構(gòu)域能夠彼此產(chǎn)生相互作用，以形成蛋白復(fù)合物。于某些具體例中，IL-15或IL-15Ra結(jié)構(gòu)域經(jīng)有效定位，而得以與免疫細(xì)胞產(chǎn)生相互作用，以起始或抑制免疫反應(yīng)、或者抑制或剌激細(xì)胞的發(fā)展。優(yōu)選地，接頭序列包括約7至20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地，約8至16個(gè)氨基酸。接頭序列優(yōu)選地為具可撓性，因而不會(huì)將生物性活性多肽或效應(yīng)物分子固定于單一種非所欲構(gòu)形?？墒褂媒宇^序列以例如隔開識(shí)別位置與融合分子。詳言之，肽接頭序列可在生物性活性多肽及效應(yīng)物分子之間進(jìn)行定位，以例如將其化學(xué)性交聯(lián)以及提供分子可撓性。接頭優(yōu)選地主要包括具有小側(cè)鏈的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸及絲氨酸，以提供可撓性。優(yōu)選地，約80或90%或更高的接頭序列包括甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸殘基，尤其是甘氨酸及絲氨酸殘基。對(duì)于包括異二聚體TCR的融合蛋白復(fù)合物，接頭序列宜連結(jié)至TCR分子的b鏈，盡管接頭序列亦可附接至TCR分子的a鏈?；蛘撸宇^序列可連結(jié)至TCR分子的a鏈及b鏈兩個(gè)。當(dāng)此等13肽鏈與a鏈同時(shí)表達(dá)時(shí)，連結(jié)的TCR-效應(yīng)物肽會(huì)折疊而產(chǎn)生如圖1所概述的功能性TCR分子。一種適當(dāng)?shù)慕宇^序列為ASGGGGSGGG(亦S卩，AlaSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly)，優(yōu)選地連結(jié)至TCR的b結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)氨基酸?？墒褂冒魏螖?shù)目的可撓性接頭設(shè)計(jì)的不同接頭序列，其已成功地用于將抗體可變區(qū)連接在一起，參見Whitlow,M.etal.，(1991)Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:97-105。于某些實(shí)例中，對(duì)于共價(jià)連結(jié)效應(yīng)物分子至TCRb鏈分子，接頭的氨基酸序列應(yīng)能從TCRI3鏈的C-端殘基至效應(yīng)物分子的N-端殘基橫跨適當(dāng)?shù)木嚯x。適當(dāng)?shù)慕宇^序列可憑經(jīng)驗(yàn)輕易地鑒別。此外，接頭序列適當(dāng)?shù)拇笮〖靶蛄幸嗫赏ㄟ^以TCR分子的預(yù)定大小及形狀為基準(zhǔn)的習(xí)知電腦模擬技術(shù)測(cè)得?！愣?，本發(fā)明融合蛋白復(fù)合物的制備可通過此處所揭示的程序以及通過經(jīng)認(rèn)可的重組DNA技術(shù)來(lái)完成，該重組DNA技術(shù)涉及例如聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)(PCR)、制備質(zhì)體DNA、以限制酶酶切DNA、制備寡核苷酸、DNA的粘結(jié)(ligation)、單離mRNA、將DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞、宿主的轉(zhuǎn)形或轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)宿主。此外，融合分子可使用離液劑(chaotropicagent)以及廣為人知的電泳法、離心法及層析法而單離及純化。參見Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryMa皿al(2nded.(1989);以及Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork(1989)中與此等方法相關(guān)的內(nèi)容。此處所使用的本發(fā)明生物性活性多肽或效應(yīng)物分子可包含諸如細(xì)胞激素、趨化激素、生長(zhǎng)因子、蛋白毒素、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其他活性蛋白(例如酶)等因子。生物性活19性多肽亦可包含其他化合物的共軛體，例如非蛋白毒素、細(xì)胞毒性藥劑、化學(xué)治療藥劑、可檢測(cè)性標(biāo)記、放射活性物質(zhì)等。本發(fā)明的細(xì)胞激素界定為由細(xì)胞所產(chǎn)生且影響其他細(xì)胞且負(fù)責(zé)任何數(shù)目的細(xì)胞免疫性多重效果的任何因子。細(xì)胞激素的實(shí)例包含，但不限于IL-2家族、干擾素(IFN)、IL-10、IL-1、IL-17、TGF及TNF細(xì)胞激素家族，以及IL-1至IL-35、IFN-a、IFN-P、IFN-y、TGF_P、TNF_a及T卿。于本發(fā)明的一態(tài)樣中，第一融合蛋白包括第一生物性活性多肽，其共價(jià)連結(jié)至介白素-15(IL-15)結(jié)構(gòu)域或其功能性片段。IL-15為影響T細(xì)胞活化及增生的細(xì)胞激素。在影響免疫細(xì)胞活化及增生上，IL-15活性在某些方面類似于IL2，盡管已對(duì)主要的差異進(jìn)行充分的定性(Waldmann，TA，2006，NatureRev.Immunol.6:595-601)。于本發(fā)明的另一態(tài)樣中，第一融合蛋白包括為IL-15變異體(此處亦稱為IL-15突變體)的介白素-15(IL-15)結(jié)構(gòu)域。IL-15變異體優(yōu)選地包括與天然(或野生型)IL-15蛋白不同的氨基酸序列。IL-15變異體優(yōu)選地與IL-15Ra多肽結(jié)合且作用為IL-15激動(dòng)劑或拮抗劑。優(yōu)選地，具有激動(dòng)劑活性的IL-15變異體具有極大的激動(dòng)劑活性。于某些具體例中，無(wú)關(guān)于其與IL-15Ra的聯(lián)合作用，IL-15變異體可作用為IL-15激動(dòng)劑或拮抗劑。IL-15激動(dòng)劑可例示為相較于野生型IL-15而言具有相當(dāng)?shù)幕蛟黾拥纳锘钚哉摺L-15拮抗劑可例示為相較于野生型IL-15而言具有減少的生物活性者，或具有抑制IL-15媒介的應(yīng)答的能力者。于某些實(shí)例中，IL-15變異體以增加或減少的活性結(jié)合至IL-15RI3yC受體。于某些具體例中，相較于天然的IL-2序列，IL-15變異體的序列具有至少一個(gè)氨基酸變異，例如取代(substitution)或刪除(deletion)，此等變異導(dǎo)致IL-15激動(dòng)劑或拮抗劑活性。優(yōu)選地，氨基酸取代/刪除在IL-15與IL-15RP及/或YC發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)域中。更優(yōu)選地，氨基酸取代/刪除不會(huì)影響IL-15Ra多肽的結(jié)合性或產(chǎn)生IL-15變異體的能力。用以產(chǎn)生IL-15變異體的適當(dāng)氨基酸取代/刪除可如此處所提供經(jīng)由理性或隨機(jī)的誘變及功能檢定，依據(jù)推定的或已知的IL-15結(jié)構(gòu)、IL-15與同源分子(例如，具有已知結(jié)構(gòu)的IL-2)的比較而加以辨別，或者可利用其他經(jīng)驗(yàn)方法加以辨另ij。此外，適當(dāng)?shù)陌被崛〈蔀轭~外氨基酸的保守性或非保守性改變及插入。優(yōu)選地，本發(fā)明的IL-15變異體在成熟人類IL-15序列的位置8、61、65、72、92、101、108或111含有一個(gè)或超過一個(gè)氨基酸取代/刪除；尤其，D8N(〃D8"意指在天然成熟人類IL-15序列中的氨基酸及殘基位置，而〃N"意指在IL-15變異體該位置上的取代氨基酸殘基)、D8A、D61A、N65A、N72R或Q108A取代產(chǎn)生具有拮抗劑活性的IL-15變異體，而N72D取代將產(chǎn)生具有激動(dòng)劑活性的IL-15變異體。盡管在本發(fā)明的一態(tài)樣中IL-15變異體為融合蛋白復(fù)合物的組分，在其他態(tài)樣中IL-15變異體為非融合蛋白。優(yōu)選地，非融合型的IL-15變異體為可溶性細(xì)胞激素，其作用為IL-15激動(dòng)劑或拮抗劑。于某些具體例中，非融合性IL-15變異體與IL-15Ra形成復(fù)合物，而于其他具體例中，非融合性IL-15變異體與IL-15Ra獨(dú)立作用。類似于細(xì)胞激素，本發(fā)明的趨化激素定義為當(dāng)暴露于其他細(xì)胞時(shí)負(fù)責(zé)任何數(shù)目的細(xì)胞免疫性多重效果的任何化學(xué)因子或分子。適當(dāng)?shù)内吇に乜砂?，但不限于CXC、CC、C及CX3C趨化激素家族，以及CCL-1至CCL-28，以及CXC-1至CXC-17、XCL-1、XCL-2、CX3CL1、MIP-lb、IL-8、MCP-1及Rantes。生長(zhǎng)因子包含當(dāng)暴露于特定細(xì)胞時(shí)會(huì)引發(fā)所影響的細(xì)胞的增生及/或分化的任何分子。生長(zhǎng)因子包含蛋白質(zhì)與化學(xué)分子，其中某些包含GM-CSF、G-CSF、人類生長(zhǎng)因子及干細(xì)胞生長(zhǎng)因子。其他生長(zhǎng)因子亦可適用于本文所述的用途。毒素或細(xì)胞毒性藥劑包含當(dāng)暴露于細(xì)胞時(shí)對(duì)生長(zhǎng)具有致死效果或抑制效果的任何物質(zhì)。更詳言之，效應(yīng)物分子可為例如植物或細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞毒素，舉例而言，如白喉毒素(diphtheriatoxin，DT)、志賀毒素(shigatoxin)、相思子毒素(abrin)、霍舌L毒素(choleratoxin)、蓖麻毒素(ricin)、阜草素(saporin)、綠月農(nóng)桿菌夕卜毒素(pseudomonasexotoxin,PE)、商足各抗病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein)或白豐對(duì)素(gelonin)。此等毒素的生物性活性片段在此技藝中為廣知者，且包含例如DTA鏈及蓖麻毒素A鏈。此外，毒素可為在細(xì)胞表面具活性的藥劑，舉例而言，如磷脂酶(phospholipaseenzyme)(例如，磷脂酶C)。再者，效應(yīng)物分子可為化學(xué)治療藥物，舉例而言，如長(zhǎng)春地辛(vindesine)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、長(zhǎng)春堿(vinblastin)、甲氨喋呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、博來(lái)霉素(bleomycin)或順鉬(cisplatin)。此外，效應(yīng)物分子可為適用于診斷或影像學(xué)研究的可檢測(cè)性標(biāo)記分子。此等標(biāo)記包含生物素(biotin)或鏈霉親和素/親和素(str印tavidin/avidin)、可檢測(cè)性納米粒子(nanoparticle)或結(jié)晶、酶或其催化性活性片段、螢光標(biāo)記(例如，綠色螢光蛋白、FITC、藻紅素(phycoerythrin)、細(xì)胞色素(cychome)、德州紅(texasred)或量子點(diǎn)(quantumdots));放射核種(radionuclide)，例如碘-131、紀(jì)-90、錸-188或鉍-212;磷光分子或化學(xué)冷光分子、或可經(jīng)PET、超音波或MRI檢測(cè)的標(biāo)記(例如，以Gd為主的對(duì)比劑或以順磁金屬離子(paramagneticmetalion)為主的對(duì)比劑)。參見例如Moskaug，etal.J.Biol.Chem.264，15709(1989);Pastan，Letal.Cell47，641，1986;Pastanetal.，RecombinantToxinsasNovelTherapeuticAgents,Ann.Rev.Biochem.61，331，(1992);〃ChimericToxins"OlsnesandPhil，Ph翻ac.Ther.，25，355(1982);PCT公開案案號(hào)WO94/29350;PCT公開案案號(hào)W094/04689;PCT公開案案號(hào)W02005046449及美國(guó)專利5，620，939中有關(guān)制造及使用包括效應(yīng)物或標(biāo)識(shí)物的蛋白的內(nèi)容。包含共價(jià)連結(jié)的IL-15及IL-15Ra結(jié)構(gòu)域的蛋白融合或共軛復(fù)合物具有多種重要用途。舉例而言，包括TCR的蛋白融合或共軛復(fù)合物可用于運(yùn)送IL-15/IL-15Ra復(fù)合物至能夠與TCR特異性結(jié)合的某些細(xì)胞。因此，蛋白融合或共軛復(fù)合物提供選擇性傷害或殺死包括配體的細(xì)胞的手段。能夠受到包括TCR的蛋白融合或共軛復(fù)合物所傷害或殺死的細(xì)胞或組織的實(shí)例包含表達(dá)一種或多種能夠受到TCR特異性結(jié)合的配體的腫瘤及經(jīng)病毒或細(xì)菌感染的細(xì)胞。容易受到傷害或殺死的細(xì)胞或組織可通過此處所揭示的方法輕易地檢驗(yàn)出來(lái)。本發(fā)明的IL-15及IL-15Ra多肽在氨基酸序列上適當(dāng)?shù)貙?duì)應(yīng)于天然存在的IL-15及IL-15Ra分子，例如，人類、小鼠或其他嚙齒動(dòng)物、或其他哺乳動(dòng)物的IL-15及IL-15Ra分子。在某些情形中，使本發(fā)明的蛋白融合或共軛復(fù)合物成為多價(jià)(例如，增加sc-TCR的價(jià)數(shù))可為有利的。特定而言，融合蛋白復(fù)合物的IL-15與IL-15Ra結(jié)構(gòu)域之間的相互作用提供產(chǎn)生多價(jià)復(fù)合物的手段。此外，通過使用例如標(biāo)準(zhǔn)生物-鏈霉親和素標(biāo)記技術(shù)，或通過共軛結(jié)合至適當(dāng)固體擔(dān)體(例如，乳膠珠)，可經(jīng)由在一及四個(gè)蛋白(相同或不同)之21間共價(jià)或非共價(jià)連結(jié)在一起而制造多價(jià)融合蛋白。經(jīng)化學(xué)性交聯(lián)連結(jié)的蛋白(例如，交聯(lián)成樹枝狀聚合物(dendrimer))亦為適當(dāng)?shù)亩鄡r(jià)物種。舉例而言，可通過納入具有化學(xué)反應(yīng)性側(cè)鏈(例如，Cys或His)的氨基酸殘基或是編碼可經(jīng)修飾的標(biāo)識(shí)物序列(例如，生物素化BirA標(biāo)識(shí)物)的序列而修飾蛋白。此等氨基酸標(biāo)識(shí)物或化學(xué)反應(yīng)性氨基酸可位于融合蛋白的各種不同位置，優(yōu)選地，于生物性活性多肽或效應(yīng)物分子的活性位置的末端。舉例而言，可溶性融合蛋白的C-端可共價(jià)連結(jié)至標(biāo)識(shí)物或包含此等反應(yīng)性氨基酸的其他融合蛋白?？杉{入適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈以化學(xué)性連結(jié)兩個(gè)或更多個(gè)融合蛋白至適當(dāng)?shù)臉渲罹酆衔锘蚱渌{米粒子，以獲得多價(jià)分子。樹枝狀聚合物為合成性化學(xué)聚合物，其可于表面具有的任一種多種不同官能基(D.Tomalia，AldrichimicaActa，26:91:101(1993))。依據(jù)本發(fā)明所使用的例示性樹枝狀聚合物包含例如E9星爆型聚胺樹枝狀聚合物(E9starburstpolyaminedendrimer)及E9燃燒型聚胺樹枝狀聚合物(E9combustpolyaminedendrimer)，其可連結(jié)胱氨酸殘基。核酸及載體(核酸)本發(fā)明另提供編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸序列(尤其是DNA序列)。優(yōu)選地，該DNA序列由適用于染色體外復(fù)制的載體(例如，噬菌體、病毒、質(zhì)體、噬菌粒(phagemid)、粘質(zhì)體(cosmid)、YAC或離合染色小體(印isome))所攜帶。特定而言，編碼所欲融合蛋白的DNA載體可用于增進(jìn)此處所述的制備方法以及獲得顯著大量的融合蛋白?？蓪⒃揇NA序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，亦即，含有所插入蛋白質(zhì)編碼序列(protein-codingsequence)的轉(zhuǎn)錄及翻譯用必要元素的載體。可使用各種宿主-載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)蛋白質(zhì)編碼序列。此等系統(tǒng)包含經(jīng)病毒(例如，牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；經(jīng)病毒(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物，如含有酵母菌載體的酵母菌，或經(jīng)噬菌體DNA、質(zhì)體DNA或粘質(zhì)體DNA轉(zhuǎn)形的細(xì)菌。根據(jù)所用的宿主_載體系統(tǒng)，可使用多種適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄及翻譯元素的任一個(gè)。參見上述Sambrooketal.及上述Ausubeletal.。本發(fā)明包含制造可溶性融合蛋白復(fù)合物的方法，該方法包括將此處所述編碼該第一與第二融合蛋白的DNA載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在足以于細(xì)胞或培養(yǎng)基中表達(dá)該融合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，且使第一融合蛋白的IL-15結(jié)構(gòu)域與第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生聯(lián)合，以形成可溶性融合蛋白復(fù)合物，由該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化該可溶性融合蛋白復(fù)合物?！愣?，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的DNA載體包括通過磷酸二酯鍵連結(jié)的核苷酸序列，其以5'朝向3'方向包括用于導(dǎo)入的編碼TCR鏈的第一核苷酸序列的第一選殖位置，該第一核苷酸序列操作性連結(jié)至編碼效應(yīng)物分子的序列。由DNA載體所編碼的融合蛋白組分可呈匣盒形式(cassetteformat)提供。術(shù)語(yǔ)〃匣盒(cassette)〃意指通過標(biāo)準(zhǔn)重組方法可輕易地將各組分取代另一個(gè)組分。特定而言，當(dāng)所編碼的融合復(fù)合物是用來(lái)對(duì)抗可能具有或具有發(fā)展出血清型(serotype)的能力的病原體時(shí)，配置成匣盒形式的DNA載體尤其適宜。通過使用適當(dāng)?shù)恼辰Y(jié)酶(ligase)，將編碼TCR分子的序列連結(jié)至編碼效應(yīng)物肽的序列，以制造編碼TCR融合復(fù)合物的載體。編碼呈遞的肽的DNA可通過從天然來(lái)源(例如，從適當(dāng)?shù)募?xì)胞系)單離DNA而得，或通過已知合成方法(例如，磷酸三酯方法)而得。參見例如OligonucleotideSynthesis,IRLPress(MJ.Gait，ed.，1984)。亦可使用市面上可購(gòu)得的寡核苷酸自動(dòng)合成劑來(lái)制備合成性寡核苷酸。一旦經(jīng)過單離后，編碼TCR分子的基因可通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或其他此技藝中已知的手段加以擴(kuò)增。用以擴(kuò)增TCR肽基因的適當(dāng)PCR引子可將限制酶切割位置(restrictionsite)加入PCR產(chǎn)物中。PCR產(chǎn)物優(yōu)選地包含效應(yīng)物肽所需的剪接位置(splicesite)以及恰當(dāng)表達(dá)及分泌TCR-效應(yīng)物融合復(fù)合物所需的前導(dǎo)序列。PCR產(chǎn)物亦優(yōu)選地包含編碼接頭序列的序列，或用于粘結(jié)此等序列的限制酶切割位置。此處所述的融合蛋白優(yōu)選地通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制成。舉例而言，一旦編碼TCR蛋白的DNA分子經(jīng)單離后，序列可連結(jié)至編碼效應(yīng)物多肽的另一個(gè)DNA分子。編碼TCR分子的核苷酸序列可直接接合至編碼效應(yīng)物肽的DNA序列，或者，更詳言之，此處所討論的編碼接頭序列的DNA序列可插置于編碼TCR分子的序列與編碼效應(yīng)物肽的序列之間，并使用適當(dāng)?shù)恼辰Y(jié)酶予以接合。所得雜合DNA分子可在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)，以產(chǎn)生TCR融合復(fù)合物。將DNA分子彼此以5'朝向3'方向粘結(jié)，使得粘結(jié)后，所編碼多肽的翻譯讀框(translationalframe)不會(huì)改變(亦及，DNA分子彼此以符合讀框(in-frame)的方式連結(jié))。所得DNA分子編碼符合讀框的融合蛋白。其他核苷酸序列亦可納入基因構(gòu)筑體中。舉例而言，啟動(dòng)子序列(其控制編碼融合至效應(yīng)物肽的TCR肽的序列的表達(dá))或前導(dǎo)序列(其將TCR融合復(fù)合物導(dǎo)向細(xì)胞表面或培養(yǎng)基)可納入構(gòu)筑體中或存在于構(gòu)筑體所插入的表達(dá)載體中。特別優(yōu)選者為免疫球蛋白或CMV啟動(dòng)子。于獲得的變異TCR編碼序列中，熟習(xí)此技藝者將了解TCR衍生的蛋白可在不會(huì)喪失或降低生物活性的情形下通過某些氨基酸的取代、添加、刪除、以及翻譯后修飾而加以修飾。特定而言，已廣知保守性氨基酸取代(亦即，以一氨基酸取代具有相似大小、電荷、極性及構(gòu)形的另一個(gè)氨基酸)不太可能會(huì)顯著地改變蛋白質(zhì)功能。為蛋白質(zhì)構(gòu)造成分的20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可大致分成下列四個(gè)保守性氨基酸群組非極性(疏水性)群組，包含丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸及纈氨酸；極性(不帶電，中性)群組，包含天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸；正電(堿性)群組，包含精氨酸、組氨酸及賴氨酸；以及負(fù)電(酸性)群組，包含天冬氨酸及谷氨酸。于蛋白質(zhì)中以一氨基酸取代相同群組內(nèi)的另一個(gè)氨基酸不太可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性具有不利的影響。核苷酸序列之間的同源性(homology)可通過DNA雜合分析測(cè)得，其中，雙股DNA雜合體的安定性取決于所發(fā)生的堿基配對(duì)程度。高溫及/或低鹽含量的條件降低雜合體的安定性，且可改變此等條件以預(yù)防具有低于選定的同源性程度的序列發(fā)生緩冷配對(duì)(annealing)。舉例而言，對(duì)于具有約55%G_C含量(G_Ccontent)的序列，40至50°C，6倍SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉緩沖液)及0.1%SDS(十二基硫酸鈉)的雜合及洗滌條件表示約60至70%同源性；50至65t:，l倍SSC及0.1%SDS的雜合及洗滌條件表示約82至97%同源性；以及52°C，0.1倍SSC及0.1%SDS的雜合及洗滌條件表示約99至100%同源性。亦可利用比較核苷酸及氨基酸序列(以及測(cè)定同源性程度)用的廣范圍電腦程式，而提供市面上可購(gòu)得的軟體及免費(fèi)軟體資源的表單可見于Ausubeletal.(1999)?？杉磿r(shí)取得的序列比較及多重序列比對(duì)演算法分別為基本區(qū)域比對(duì)搜尋工具(BasicLocalAlignmentSearchTool,BLAST)(Altschuletal.，1997)及ClustalW程式(ClustalWprograms)。BLAST可于全球資訊網(wǎng)上在ncbi.nlm.nih.gov取得，而ClustalW的版本可在2.ebi.ac.uk取得。融合蛋白的組分幾乎可依任何順序加以配置，惟其各者能夠?qū)嵤┢渌A(yù)期的功能。舉例而言，于一具體例中，TCR是位于效應(yīng)物分子的C或N端。本發(fā)明優(yōu)選效應(yīng)物分子的大小為有助于彼等結(jié)構(gòu)域所預(yù)期的功能者。本發(fā)明的效應(yīng)物分子可通過各種方法(包含廣知的化學(xué)交聯(lián)方法)制造并融合至TCR。參見例如Means,G.E.andFeeney，R.E.(1974)inChemicalModificationofProteins,Holden-Day。亦參見S.S.Wong(1991)inChemistryofProteinConjugationandCross-Linking,CRCPress。然而，一般而言，使用重組操作來(lái)制造符合讀框的融合蛋白為優(yōu)選者。如所述，可依數(shù)種方式來(lái)配置依據(jù)本發(fā)明的融合分子或共軛分子。于示例性配置中，TCR的C-端操作性連結(jié)至效應(yīng)物分子的N-端。若有需要，該連結(jié)可通過重組方法達(dá)成。然而，于另一配置中，TCR的N-端連結(jié)至效應(yīng)物分子的C-端。或者，或此外，有需要時(shí)，可將一種或多種額外的效應(yīng)物分子插入TCR融合復(fù)合物或共軛復(fù)合物。(載體及表達(dá))可利用多種策略來(lái)使本發(fā)明的蛋白融合復(fù)合物表達(dá)。舉例而言，可通過已知手段(例如，通過使用限制酶在載體中制造切位以用于插入構(gòu)筑體，隨后進(jìn)行粘結(jié)作用)將上述的TCR基因融合構(gòu)筑體并入適當(dāng)?shù)妮d體。接著，將含有基因構(gòu)筑體的載體導(dǎo)入適當(dāng)宿主中以用于表達(dá)TCR融合肽。參見如上述之Sambrooketal.?？苫谂c選殖操作流程相關(guān)的因素憑經(jīng)驗(yàn)選擇適當(dāng)載體。舉例而言，載體應(yīng)可與所用的宿主相容且具有對(duì)于該宿主而言恰當(dāng)?shù)膹?fù)制單元(r印licon)。再者，載體必須能夠容納編碼所欲表達(dá)的TCR融合復(fù)合物的DNA序列。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包含真核細(xì)胞及原核細(xì)胞，優(yōu)選地為那些可輕易轉(zhuǎn)形且在培養(yǎng)基中顯現(xiàn)快速生長(zhǎng)性的細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞包含例如大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillussubtillus)等原核生物，以及例如動(dòng)物細(xì)胞及酵母菌菌株(例如，啤酒酵母(S.cerevisiae))等真核生物。一般而言，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為優(yōu)選者，尤其是J558、NS0、SP2-0或CH0。其他適當(dāng)?shù)乃拗靼缋ハx細(xì)胞，如Sf9。使用習(xí)知的培養(yǎng)條件。參見如上述之Sambrook。接著，可篩選安定的經(jīng)轉(zhuǎn)形細(xì)胞系或經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。表達(dá)本發(fā)明TCR融合復(fù)合物的細(xì)胞可通過已知程序測(cè)定。舉例而言，連結(jié)至免疫球蛋白的TCR融合復(fù)合物的表達(dá)可通過對(duì)所連結(jié)的免疫球蛋白具特異性的ELISA及/或通過免疫轉(zhuǎn)印法(immunoblotting)予以測(cè)定。用于檢測(cè)包括連結(jié)至IL-15或IL-15Ra結(jié)構(gòu)域的TCR的融合蛋白的表達(dá)的其他方法揭示于實(shí)施例中。如以上所概述，宿主細(xì)胞可用于制備目的，以增殖編碼所欲融合蛋白的核酸。因此，宿主細(xì)胞可包含特別謀求產(chǎn)生融合蛋白的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。因此，特定而言，宿主細(xì)胞包含酵母菌、蠅類、蟲類、植物、蛙類、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及能夠增殖編碼該融合物的核酸的器官?？墒褂玫牟溉閯?dòng)物細(xì)胞系的非限制性實(shí)例包含CHOdhfr-細(xì)胞(UrlaubandChasm，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4216(1980))、293細(xì)胞(Grahametal，JGen.Virol.，36:59(1977))、或骨髓瘤細(xì)胞，如SP2或NSO(GalfreandMilstein，Meth.Enzymol.，73(B):3(1981))。能夠增殖編碼所欲融合蛋白的核酸的宿主細(xì)胞亦涵括非哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞，包含昆蟲(例如，草地貪夜蛾(Sp.frugiperda))、酵母菌(例如，啤酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、克魯維酵母(K.lactis)、漢森酵母(H.polymorpha);如Fleer，R.，CurrentOpinioninBiotechnology,3(5):486496(1992)中所概論)、真菌及植物細(xì)胞。亦涵括某些原核生物，例如大腸桿菌(E.coli)及桿菌屬(Bacillus)?？赏ㄟ^用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼所欲融合蛋白的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)〃轉(zhuǎn)染(transfecting)"或"轉(zhuǎn)染(transfection)"意圖涵括用于將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的所有習(xí)知技術(shù)，包含磷酸鈣共沉淀法(calciumphosphateco-precipitation)、DEAE-葡聚糖媒介的轉(zhuǎn)染(DEAE-dextran-mediatedtransfection)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofection)、電穿孑L(electroporation)、微注身寸(microinjection)、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)及/或插入。用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的適當(dāng)方法可見于如上述的Sambrooketal以及其他實(shí)驗(yàn)室課本。根據(jù)本發(fā)明，可使用各種啟動(dòng)子(轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū))。恰當(dāng)啟動(dòng)子的選擇取決于所提出的表達(dá)宿主。可使用得自異源性來(lái)源的啟動(dòng)子，只要其在所選的宿主中具有功能即可。啟動(dòng)子的選擇亦取決于肽或蛋白質(zhì)所欲的產(chǎn)生效率及程度。常使用誘發(fā)性啟動(dòng)子(例如，tac)以急劇地增加大腸桿菌中的蛋白質(zhì)表達(dá)程度。蛋白質(zhì)的過量表達(dá)(overe鄧ression)可能對(duì)宿主細(xì)胞有害。結(jié)果，可能會(huì)限制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。使用誘發(fā)性啟動(dòng)子系統(tǒng)使得宿主細(xì)胞得以在誘發(fā)基因表達(dá)之前培育至可接受的密度，藉此促進(jìn)較高的產(chǎn)物產(chǎn)率。根據(jù)本發(fā)明，可使用各種訊息序列?？墒褂门cTCR編碼序列同源的訊息序列。或者，亦可使用經(jīng)選定或設(shè)計(jì)成會(huì)在表達(dá)宿主中有效分泌及制造加工的訊息序列。舉例而言，適當(dāng)?shù)挠嵪⑿蛄?宿主細(xì)胞配對(duì)包含用于在枯草桿菌中表達(dá)的枯草桿菌sacB訊息序列(B.subtilissacBsignalsequence)，及啤酒酵母a_交配因子(Saccharomycescerevisiaea-matingfactor)或用于巴其jf德畢赤酵母分泌作用的巴其j德畢赤酵母酸磷酸鹽phol訊息序歹lj(P.pastorisacidphosphatasepholsignalsequence)。訊息序列可通過編碼該訊息肽酶(signalp印tidase)切割位置的序列直接連接至蛋白質(zhì)編碼序列，或通過由通常少于十個(gè)密碼子(codon)所組成的短核苷酸橋聯(lián)(bridge)連接至蛋白質(zhì)編碼序列，其中，該橋聯(lián)確保正確的下游TCR序列讀框。已對(duì)真核生物蛋白表達(dá)系統(tǒng)鑒別出用于增進(jìn)轉(zhuǎn)錄及翻譯的元素。舉例而言，將花椰菜鑲嵌病毒(cauliflowermosaicvirus,CaMV)啟動(dòng)子1000堿基對(duì)(bp)定位于異源性啟動(dòng)子任一側(cè)可在植物細(xì)胞中提升轉(zhuǎn)錄程度10至400倍。表達(dá)構(gòu)筑體亦應(yīng)包含適合的翻譯起始序列。為了恰當(dāng)?shù)姆g起始而將表達(dá)構(gòu)筑體納入Kozak—致性序列(Kozakconsensussequence)的修飾作用可增加翻譯程度10倍。通常使用篩選標(biāo)志，其可為表達(dá)構(gòu)筑體的一部分或與表達(dá)構(gòu)筑體分開(例如，由表達(dá)載體攜帶)，使得該標(biāo)志可插入不同于感興趣的基因的位置。標(biāo)志的實(shí)例包含賦予對(duì)抗生素的抗性的標(biāo)志(例如，bla對(duì)大腸桿菌宿主細(xì)胞賦予對(duì)胺芐青霉素(ampicillin)的抗性，nptll對(duì)廣大種類的原核細(xì)胞及真核細(xì)胞賦予對(duì)卡那霉素(kanamycin)的抗性)或容許宿主在基本培養(yǎng)基(minimalmedium)生長(zhǎng)的標(biāo)志(例如，HIS4使巴斯德畢赤酵母或補(bǔ)25充有組氨酸的啤酒酵母(His.sup,S.cerevisiae)能夠在組氨酸缺乏下生長(zhǎng))。篩選標(biāo)志具有其本身的轉(zhuǎn)錄及翻譯起始及終止調(diào)節(jié)區(qū)，而使該標(biāo)志得以獨(dú)立表達(dá)。若利用抗生素抗性作為標(biāo)志，則用于篩選的抗生素濃度將視抗生素而異，一般介于10至600g抗生素/培養(yǎng)基(mL)的范圍。通過使用已知的重組DNA技術(shù)來(lái)組裝表達(dá)構(gòu)筑體(Sambrooketal.，1989;Ausubeletal.，1999)。限制酶酶切及粘結(jié)為用于連接兩個(gè)DNA片段的基本步驟。DNA片段的終端在粘結(jié)之前可能需要予以修飾，此修飾作用可通過填補(bǔ)突出部分(overhang)、以核酸酶(nuclease)(例如，ExoIII)刪除片段的終端部分、定點(diǎn)突變(sitedirectedmutagenesis)、或通過以PCR添加新的堿基對(duì)而完成?？墒褂枚嘟宇^(polylinker)及接合子(adaptor)來(lái)促進(jìn)所選擇片段的連接。表達(dá)構(gòu)筑體典型地在利用酶切、粘結(jié)及大腸桿菌的轉(zhuǎn)形的循環(huán)之階段中予以組裝。多種適用于構(gòu)筑表達(dá)構(gòu)筑體的選殖載體在此技藝中為已知者(lambda.ZAPandpBLUESCRIPTSK_1，Stratagene，LaJoIIa，Calif，pET，NovagenInc.，Madison，Wis.-記載于Ausubeletal.，1999)，且對(duì)本發(fā)明而言特定的選擇并不重要。選殖載體的選擇將受到經(jīng)選定以用來(lái)將表達(dá)構(gòu)筑體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(genetransfersystem)所影響。在各階段結(jié)束時(shí)，所得構(gòu)筑體可通過酶切、DNA序列、雜合及PCR分析予以分析。表達(dá)構(gòu)筑體可以選殖載體構(gòu)筑體(線性或環(huán)狀)的形式轉(zhuǎn)形至宿主中，或可從選殖載體中移除而以其本身使用或?qū)雮鬟f載體(deliveryvector)。傳遞載體促使表達(dá)構(gòu)筑體在所選定的宿主細(xì)胞類型中的導(dǎo)入及維持。表達(dá)構(gòu)筑體是通過多種已知基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(例如，自然轉(zhuǎn)形能力(naturalcompetence)、化學(xué)媒介的轉(zhuǎn)形、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)形(protoplasttransformation)、電穿孑L、基因槍轉(zhuǎn)形(biolistictransformation)、轉(zhuǎn)染或共軛)的任一個(gè)導(dǎo)入宿主細(xì)胞(Ausubeletal.，1999;Sambrooketal.，1989)。所選擇的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)取決于所使用的宿主細(xì)胞及載體系統(tǒng)。舉例而言，可通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)形或電穿孔將表達(dá)構(gòu)筑體導(dǎo)入啤酒酵母。啤酒酵母的電穿孔可輕易完成，且產(chǎn)生與原生質(zhì)球狀體轉(zhuǎn)形(spheroplasttransformation)相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)形效率。本發(fā)明另提供用于單離感興趣的融合蛋白的制程。在此過程中，已導(dǎo)入操作性連結(jié)至調(diào)節(jié)序列的編碼感興趣的蛋白質(zhì)之核酸的宿主細(xì)胞(例如，酵母菌、真菌、昆蟲、細(xì)菌或動(dòng)物細(xì)胞)是在融合蛋白存在下于培養(yǎng)基中以生產(chǎn)規(guī)模生長(zhǎng)，以剌激編碼感興趣的融合蛋白的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。隨后，從所收取的宿主細(xì)胞中或從培養(yǎng)基中單離感興趣的融合蛋白?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)從培養(yǎng)基中或從所收取的宿主細(xì)胞中單離感興趣的蛋白質(zhì)。特定而言，可使用純化技術(shù)由各種器具(包含轉(zhuǎn)瓶(rollerbottle)、旋轉(zhuǎn)瓶(spi皿erflask)、組織培養(yǎng)盤、生物反應(yīng)器或發(fā)酵器)大規(guī)模(亦即，以至少毫克(milligram)量)表達(dá)及純化所欲融合蛋白。所表達(dá)的蛋白融合復(fù)合物可通過已知方法單離及純化。典型地，將培養(yǎng)基離心，接著通過親和性或免疫親和性層析(例如，蛋白-A(Protein-A)或蛋白_G(Protein-G)親和性層析)，或包括使用與融合復(fù)合物(例如，經(jīng)連結(jié)的TCR或其免疫球蛋白區(qū))結(jié)合的單株抗體的免疫親和性操作流程來(lái)純化上清液。本發(fā)明的融合蛋白可通過已知技術(shù)的適當(dāng)組合予以分離及純化。此等技術(shù)包括例如利用溶解度的方法，如鹽沉淀及溶劑沉淀；利用分子量的不同的方法，如透析、超過濾、凝膠過濾及SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳；利用電荷的不同的方法，如離子交換管住層析；利用特定親和性的方法，如親和性層析；利用疏水性的不同的方法，如逆相高效液相層析；以及利用等電點(diǎn)的不同的方法，如等電焦集電泳，金屬親和性管柱，如Ni-NTA。參見如上述的Sambrooketal.及Ausubeletal.有關(guān)于此等方法的內(nèi)容。優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白為實(shí)質(zhì)上純的。換言之，融合蛋白已從自然伴隨而得的細(xì)胞取代物中單離，使得融合蛋白優(yōu)選地以至少80%或90%至95%同質(zhì)性(homogeneity)(w/V)存在。對(duì)于許多醫(yī)藥、臨床及研究應(yīng)用而言，具有至少98至99%同質(zhì)性(w/w)的融合蛋白為最優(yōu)選者。一旦經(jīng)實(shí)質(zhì)純化后，融合蛋白應(yīng)為實(shí)質(zhì)上不含污染物(對(duì)于治療應(yīng)用而言)。一旦經(jīng)部分純化或純化至實(shí)質(zhì)純度后，可溶性融合蛋白可于治療上使用，或在實(shí)施如此處所揭示的活體外或活體內(nèi)分析中使用。實(shí)質(zhì)純度可通過各種標(biāo)難技術(shù)(例如，層析及凝膠電泳)予以測(cè)定。本發(fā)明的經(jīng)截頭(truncated)TCR融合復(fù)合物含有足以被截頭的TCR分子，故該TCR融合復(fù)合物可在表達(dá)后分泌至培養(yǎng)基中。因此，經(jīng)截頭TCR融合復(fù)合物將不包含富有疏水性殘基的區(qū)域，典型地為TCR分子的跨膜及細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。因此，舉例而言，對(duì)于本發(fā)明優(yōu)選的經(jīng)截頭DR1TCR分子而言，TCR分子的b鏈約第199至237個(gè)殘基及a鏈約第193至230個(gè)殘基優(yōu)選地不包含在經(jīng)截頭TCR融合復(fù)合物中。本發(fā)明的TCR融合及共軛復(fù)合物適用于與受感染的細(xì)胞或可能因一種或多種疾病而成為受感染的細(xì)胞于活體外或活體內(nèi)使用。方法(治療)本發(fā)明包含預(yù)防或治療患者的疾病的方法，其中，該疾病細(xì)胞表達(dá)疾病相關(guān)抗原，該方法包括對(duì)該患者給予包括識(shí)別疾病相關(guān)抗原的生物性活性多肽的可溶性融合蛋白復(fù)合物，在抗原表達(dá)的疾病細(xì)胞與IL-15R表達(dá)的免疫細(xì)胞之間形成特異性結(jié)合復(fù)合物(橋聯(lián))，其足以定位該免疫細(xì)胞，以及傷害或殺死該疾病細(xì)胞，其足以預(yù)防或治療患者的疾病。本發(fā)明包含預(yù)防或治療患者的疾病的方法，其中，該疾病細(xì)胞表達(dá)疾病相關(guān)抗原，該方法包括將承載該IL-15R鏈的免疫細(xì)胞與包括識(shí)別疾病相關(guān)抗原的生物性活性多肽的可溶性融合蛋白復(fù)合物(例如，肽/MHC復(fù)合物)混合，對(duì)患者給予免疫細(xì)胞-融合蛋白復(fù)合物，在抗原表達(dá)的疾病細(xì)胞與IL-15R表達(dá)的免疫細(xì)胞之間形成特異性結(jié)合復(fù)合物(橋聯(lián))，其足以定位該免疫細(xì)胞，以及傷害或殺死該疾病細(xì)胞，其足以預(yù)防或治療患者的疾病。本發(fā)明亦包含殺死靶細(xì)胞的方法，該方法包括使多種細(xì)胞與可溶性融合蛋白復(fù)合物接觸，其中，該多種細(xì)胞進(jìn)一步包括承載有權(quán)利要求1的IL-15結(jié)構(gòu)域所識(shí)別的IL-15R鏈的免疫細(xì)胞，以及承載有此處所述的生物性活性多肽的至少一個(gè)所識(shí)別的抗原的靶細(xì)胞；在該靶細(xì)胞的抗原與該免疫細(xì)胞的IL-15R鏈之間形成特異性結(jié)合復(fù)合物(橋聯(lián))，其足以結(jié)合與活化該免疫細(xì)胞；以及通過所結(jié)合的經(jīng)活化免疫細(xì)胞殺死該靶細(xì)胞。本發(fā)明亦包含經(jīng)由產(chǎn)生可溶性融合蛋白復(fù)合物而增加IL-15的活體內(nèi)半衰期及/或增進(jìn)其安定結(jié)合免疫細(xì)胞的能力(例如，增加細(xì)胞表面滯留時(shí)間)的方法。舉例而言，如此處所述，執(zhí)行融合蛋白復(fù)合物的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)及細(xì)胞表面滯留時(shí)間的評(píng)估并與IL-15比較?；谄渲委熇眯缘母纳?，具有增加的血清半衰期或細(xì)胞表面滯留時(shí)間的融合蛋白復(fù)合物為優(yōu)選者?？芍委煹募膊〉膶?shí)例包含，但不限于腫瘤形成(neoplasia)(包含癌癥)、或病毒感染?！[瘤形成〃意指由不當(dāng)?shù)母叱潭燃?xì)胞分裂、不當(dāng)?shù)牡统潭燃?xì)胞雕亡(即optosis)或這二個(gè)所造成的任何疾病，或?qū)е虏划?dāng)?shù)母叱潭燃?xì)胞分裂、不當(dāng)?shù)牡统潭燃?xì)胞雕亡或此二者的任何疾病。舉例而言，癌癥為腫瘤形成的實(shí)例。癌癥的實(shí)例包含，但不限于白血病(例如，急性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血病、急性成髓細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、急性骨髓單核細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、急性紅細(xì)胞性白血病、慢性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemiavera)、淋巴瘤(何杰金氏癥(Hodgkin'sdesease)、非何杰金氏癥)、巨球蛋白血癥(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、重鏈疾病(heavychaindisease)、及實(shí)體腫瘤，如肉瘤及惡性腫瘤(例如，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、依汶氏腫瘤(Ewing'stumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳突腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精母細(xì)胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤(Wilm'stumor)、子宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠瘤、星狀細(xì)胞瘤、神經(jīng)管胚細(xì)胞瘤、顱咽瘤、類室管膜瘤、松果腺瘤、血管母細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、寡樹突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經(jīng)胚細(xì)胞瘤、及視網(wǎng)膜胚細(xì)胞瘤)。淋巴增生性疾患亦視為增生性疾病。本發(fā)明亦包含剌激哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給予有效量的如此處所述的可溶性融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體。本發(fā)明亦包含抑制哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給予有效量的如此處所述的可溶性融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體。于免疫抑制的情形中，包括IL-15拮抗劑或缺乏與IL-1513yc復(fù)合物結(jié)合的能力之IL-15結(jié)構(gòu)域的融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體可為特別有利者。至于融合蛋白復(fù)合物治療的使用說明，可將經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞以單一血清型的病原體感染。接著，將受感染的細(xì)胞與指定的融合蛋白復(fù)合物于活體外接觸。如以上所討論，配置融合蛋白復(fù)合物，使得毒殺性結(jié)構(gòu)域通過TCR的聯(lián)合而呈現(xiàn)至受感染的細(xì)胞。將生物活性分子導(dǎo)入細(xì)胞后(一般而言，低于約30分鐘)，使該細(xì)胞引發(fā)所欲的效應(yīng)高達(dá)約2至24小時(shí)，典型地約18小時(shí)的時(shí)間。在此時(shí)間后，在適當(dāng)緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基中洗滌該細(xì)胞，接著評(píng)估存活率。對(duì)通過融合蛋白復(fù)合物的細(xì)胞毒殺或傷害所分配的時(shí)間將隨所選特定效應(yīng)物分子而異。然而，存活率則經(jīng)?？稍诩s2至6小時(shí)，且高達(dá)約24小時(shí)之后評(píng)估。下文中將更詳細(xì)地說明，細(xì)胞存活率可通過監(jiān)測(cè)某些廣知的染料(例如，臺(tái)盼藍(lán)(trypanblue))或發(fā)光體的攝入性而輕易地予以測(cè)定及定量。與本發(fā)明的融合蛋白復(fù)合物一起培養(yǎng)的細(xì)胞可通過標(biāo)準(zhǔn)方法分析存活率。于一例示性方法中，細(xì)胞存活率可通過測(cè)定在培養(yǎng)后或培養(yǎng)期間的DNA復(fù)制而輕易地予以分析。舉例而言，優(yōu)選的分析涉及一種或多種可檢測(cè)性標(biāo)記核苷(如放射性標(biāo)記胸腺嘧啶核苷)的細(xì)胞攝入。該攝入可通過多種習(xí)知方法(包含三氯乙酸(TCA)沉淀，隨后進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù))方便地測(cè)得。其它細(xì)胞存活率方法包含廣知的臺(tái)盼藍(lán)排除技術(shù)(trypanblueexclusiontechnique)或以WST-1為主的增生分析。本發(fā)明融合復(fù)合物的TCR分子在氨基酸序列上適當(dāng)?shù)貙?duì)應(yīng)天然存在的TCR分子，例如，人類、小鼠或其他且嚙齒動(dòng)物、或其他哺乳動(dòng)物的TCR分子。因此，用于抑制自體免疫或發(fā)炎反應(yīng)的本發(fā)明治療方法包含融合蛋白復(fù)合物，其包括對(duì)疾病相關(guān)抗原具結(jié)合特異性的T細(xì)胞受體或抗體。優(yōu)選地，給予〃經(jīng)截頭的〃可溶性TCR復(fù)合物，亦即，TCR復(fù)合物不含有跨膜部分。融合蛋白復(fù)合物亦包括作用為IL-15拮抗劑的IL-15變異體以抑制不必要的免疫應(yīng)答。給予之后，TCR或抗體結(jié)構(gòu)域?qū)⑷诤系鞍讖?fù)合物標(biāo)靶至疾病位置，于此處IL-15拮抗劑抑制自體免疫或發(fā)炎反應(yīng)。此種融合蛋白復(fù)合物可特別適用于治療過敏、自體免疫疾病(例如，多發(fā)性硬化癥)、胰島素依賴性糖尿病及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或移植排斥。類似的非靶向方法可使用拮抗劑IL-15變異體作為非融合蛋白而進(jìn)行。用于引發(fā)免疫應(yīng)答的本發(fā)明其他治療方法為在任何共同剌激性效應(yīng)物分子(例如，細(xì)胞激素)存在下給予有效量的本發(fā)明蛋白融合復(fù)合物，藉以在與生物性活性多肽結(jié)合的呈遞抗原的所在處引發(fā)所欲的免疫應(yīng)答。本發(fā)明不同的療法亦可與其它已知治療劑(例如，消炎藥物)組合使用，以提供對(duì)疾患更有效的治療。舉例而言，免疫抑制性蛋白融合復(fù)合物或IL-15變異體可與消炎藥物(例如，皮質(zhì)類固醇及非類固醇藥物)組合使用，以用于治療自體免疫疾患及過敏。本發(fā)明的化合物尤其適用于具有或疑有惡性疾病、疾患或病癥的人類患者。本發(fā)明的化合物特別適用于標(biāo)靶至人類患者中的特定腫瘤抗原?？梢罁?jù)本發(fā)明治療的疾病的具體實(shí)例包含癌癥，例如乳癌、前列腺癌等；病毒感染，例如HCV、HIV等；以及此處所述及病癥的其他特定疾患。不期望受到理論所局限，咸信本發(fā)明的多重及不同共價(jià)連結(jié)化合物(亦即，至少IL-15與至少一個(gè)TCR組合)可例如通過增加IL-15對(duì)個(gè)體的耙抗原的標(biāo)耙性=而顯著地增進(jìn)IL-15的效力。再者，通過共價(jià)連結(jié)的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的共軛物實(shí)質(zhì)上同時(shí)對(duì)個(gè)體細(xì)胞呈遞IL-15及TCR，該效果可能無(wú)法通過以未共價(jià)連結(jié)化合物的藥物〃調(diào)和液(cocktail)〃調(diào)配物給予相同化合物而輕易地達(dá)成。亦有報(bào)導(dǎo)指出利用一種藥物的治療可進(jìn)而使患者對(duì)另一個(gè)藥物敏感。因此，經(jīng)由本發(fā)明的共軛物實(shí)質(zhì)上同時(shí)對(duì)個(gè)體細(xì)胞呈遞IL-15及TCR可例如通過提供協(xié)同性結(jié)果及/或通過增進(jìn)產(chǎn)生免疫應(yīng)答而增進(jìn)藥物活性。(診斷)對(duì)特定pMHC配體具特異性的高親和性或多價(jià)TCR蛋白適用于診斷動(dòng)物，包含咸信患有與特定pMHC相關(guān)的疾病的人類。本發(fā)明的融合蛋白復(fù)合物適用于實(shí)質(zhì)上檢測(cè)任何抗原，包含但不限于彼等與腫瘤病癥、異常蛋白、自體免疫疾病或細(xì)菌、真菌、病毒、原生動(dòng)物、酵母菌、線蟲或其他寄生蟲感染或寄生相關(guān)者。于用于檢測(cè)個(gè)體的腫瘤或病毒感染細(xì)胞或組織的一方法中，其中，在MHC復(fù)合物的背景中該細(xì)胞或組織包括呈遞于細(xì)胞或組織上的腫瘤或病毒相關(guān)肽抗原，該方法包括a)在所呈遞的肽抗原與TCR之間形成特異性結(jié)合復(fù)合物的條件下，對(duì)個(gè)體給予包括可溶性TCR的本發(fā)明可溶性融合蛋白復(fù)合物；以及b)檢測(cè)特異性結(jié)合復(fù)合物，作為包括所呈遞的腫瘤或病毒相關(guān)肽抗原的腫瘤或病毒感染細(xì)胞或組織的指標(biāo)。29融合蛋白復(fù)合物亦可用于診斷會(huì)產(chǎn)生異常蛋白的某些基因疾患。融合蛋白復(fù)合物的例示性應(yīng)用為診斷及治療具有已知的pMHC的自體免疫疾病。關(guān)于引起免疫破壞的自體抗原(autoantigen)，已對(duì)第I型糖尿病進(jìn)行相當(dāng)完整的定性。多發(fā)性硬化癥、腹腔疾病、發(fā)炎性腸胃疾病、克隆氏癥(Crohn'sdisease)及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為此等應(yīng)用的其他候選疾病。包括IL-15變異體多肽的本發(fā)明融合蛋白復(fù)合物可尤其適用于此等應(yīng)用。舉例而言，如此處所述，對(duì)于包括TCR分子的融合蛋白復(fù)合物，IL-15變異體結(jié)構(gòu)域與IL-15Ra多肽之間的相互作用產(chǎn)生具有增進(jìn)的抗原結(jié)合活性的多價(jià)TCR分子。再者，IL-15變異體含有氨基酸變異，其可能消除對(duì)承載IL-15RI3YC受體的細(xì)胞的結(jié)合性，藉此降低對(duì)免疫細(xì)胞的非特異性或非靶向結(jié)合。結(jié)果，利用此等融合蛋白復(fù)合物可達(dá)成增進(jìn)的TCR特異性抗原檢測(cè)。此外，如此處所述，本發(fā)明的融合蛋白復(fù)合物可另外經(jīng)由肽標(biāo)識(shí)物序列或共軛至可檢測(cè)性標(biāo)記而予以多聚體化。劑量及給予本發(fā)明化合物的給予可通過各種適當(dāng)?shù)耐緩竭M(jìn)行，包含口服、局部(包含經(jīng)皮、口頰或舌下)、經(jīng)鼻及非經(jīng)腸道(包含腹膜內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)注射)，一般以口服或非經(jīng)腸道為優(yōu)選者。亦應(yīng)了解的是優(yōu)選的給予方法及劑量可依例如接受者的狀況及年齡而異。本發(fā)明化合物可單獨(dú)用于療法中或聯(lián)合其他藥劑(例如彼等具有經(jīng)認(rèn)可的藥理活性者)來(lái)治療所欲的適應(yīng)癥。例示性藥劑包含經(jīng)認(rèn)可的療法，例如外科手術(shù)、放射線、化學(xué)療法及其他形式的免疫療法(例如，疫苗、以抗體為主的療法)。需要時(shí)，可在此等療法之前、期間或之后給予本發(fā)明化合物。盡管可單獨(dú)給予一種或多種本發(fā)明化合物，其亦可呈與習(xí)知賦形劑混合的醫(yī)藥組成物的一部分存在，該賦形劑亦即醫(yī)藥上可接受的有機(jī)或無(wú)機(jī)載劑物質(zhì)，其適用于非經(jīng)腸道、口服或其他所欲給予方式以及不會(huì)與活性化合物有害地反應(yīng)且不會(huì)對(duì)其接受者有害。本發(fā)明的醫(yī)藥組成物一般包括一種或多種本發(fā)明的融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體或編碼此等化合物的DNA構(gòu)筑體，連同一種或多種可接受的載劑。從可與調(diào)配物的其他成分相容且不會(huì)對(duì)其接受者有害的意義上而言，載劑必須為〃可接受的〃。適當(dāng)?shù)尼t(yī)藥上可接受的載劑包括，但不限于水、鹽溶液、醇類、植物油、聚乙二醇、明膠、乳糖、淀粉醣(amylose)、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟(viscousparaffin)、香料油、脂肪酸單甘油酯及二甘油酯、石油醚脂肪酸酯(petroethralfattyacidester)、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮(polyvinylpyrrolidone)等?？蓪⑨t(yī)藥制劑進(jìn)行消毒，以及若有需要，與輔助劑混合，該輔助劑為例如，潤(rùn)滑劑、防腐劑、安定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽類、緩沖劑、著色劑、調(diào)味劑及/或芳香族物質(zhì)等，該等輔助劑不會(huì)與活性化合物有害地反應(yīng)。對(duì)于非經(jīng)腸道的應(yīng)用，尤其適當(dāng)者為溶液(優(yōu)選地為油性或水性溶液)及懸浮液、乳液或植入物(包含栓劑)。安瓿為方便的單位劑型。對(duì)于經(jīng)腸道的應(yīng)用，尤其適當(dāng)者為錠劑、丸劑或膠囊，其具有滑石及/或碳水化合物載劑、粘結(jié)劑等，載劑優(yōu)選地為乳糖及/或玉米淀粉及/或馬鈴薯淀粉?？墒褂锰菨{、酏劑等，于該等制劑中采用甜的媒劑?？烧{(diào)配成緩釋型組成物，其包含其中活性成分例如通過微包囊、多重包覆等而受到可差異性解的涂層所保護(hù)的彼等物質(zhì)。本發(fā)明的治療性化合物亦可并入脂質(zhì)體(liposome)中。該并入可依據(jù)已知的脂質(zhì)體制備程序(例如，聲裂法(sonication)及擠出法(extrusion))而進(jìn)行。制備脂質(zhì)體的適當(dāng)習(xí)知方法亦揭示于例如A.D.Banghametal.，J.Mol.Biol.，23:238-252(1965);F.Olsonetal.，Biochim.Biophys.Acta,557:9-23(1979);F.Szokaetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.，75:4194-4198(1978);S.Kimetal.，Biochim.Biophys.Acta,728:339-348(1983);以及Mayeretal.，Biochim.Biophys.Acta,858:161-168(1986)。本發(fā)明亦提供引起哺乳動(dòng)物(例如，人類)的免疫應(yīng)答的方法，其包含對(duì)哺乳動(dòng)物(例如，人類)注射疫苗以對(duì)抗致病原(infectiousagent)或靶疾患(例如，癌癥)。此等方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物給予有效量的包括編碼本發(fā)明融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體的DNA載體的DNA序列。融合蛋白復(fù)合物及IL-15變異體的表達(dá)載體的制備敘述于上文以及以下實(shí)施例中。已有報(bào)導(dǎo)指出給予質(zhì)體DNA的方法、由經(jīng)給予個(gè)體的細(xì)胞攝入該DNA的方法、以及表達(dá)蛋白質(zhì)的方法。參見Ulmer，J.B.，etal.，Science(1993)259:1745-1749。編碼本發(fā)明融合蛋白復(fù)合物與IL-15變異體的DNA載體優(yōu)選地通過肌肉內(nèi)注射適當(dāng)?shù)亟o予至哺乳動(dòng)物(包含人類)。將cDNA給予至哺乳動(dòng)物的骨胳肌，隨后由肌肉細(xì)胞攝入所給予的表達(dá)載體以及表達(dá)該DNA所編碼的蛋白質(zhì)已詳述于Ulmeretal.，且其代表例示性操作流程[Ulmer，J.B.，etal.'Science259:1745-1749]。對(duì)于指定治療應(yīng)用而言最理想的劑量可通過習(xí)知手段測(cè)得。除了治療人類疾患之外，本發(fā)明融合蛋白復(fù)合物及IL-15變異體以及編碼此等分子的本發(fā)明DNA構(gòu)筑體對(duì)于獸醫(yī)應(yīng)用將具有重要的用途，例如，治療家畜(例如，牛、羊等)及寵物(例如，狗及貓)的疾患。應(yīng)了解的是，本發(fā)明指定的融合蛋白復(fù)合物及IL-15變異體或編碼該融合蛋白復(fù)合物及IL-15變異體的DNA構(gòu)筑體用于指定療法的實(shí)際優(yōu)選量將依下列各者而異欲使用的特定一種或多種活性化合物、所調(diào)配的特定組成物、應(yīng)用模式、特定給予位置、患者的體重、一般健康狀況、性別等、欲治療的特定適應(yīng)癥等，以及由彼等熟習(xí)此技藝者(包含主治醫(yī)師或獸醫(yī))所認(rèn)定的其他此種因子。對(duì)指定給予操作流程而言最理想的給予率可由彼等熟習(xí)此技藝者使用習(xí)知的劑量決定測(cè)試法輕易地測(cè)得，該劑量決定測(cè)試法是例如對(duì)于前述指導(dǎo)方針及此處所揭示的分析而進(jìn)行。實(shí)施例應(yīng)了解，本發(fā)明不應(yīng)意圖局限于所述實(shí)施例；或更確切而言，本發(fā)明應(yīng)意圖包含此處所提供的任何及所有應(yīng)用以及具通常技藝者所知的
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)的所有等價(jià)變化型。實(shí)施例1-包含scTCR/huIL15及scTCR/huIL15Ra融合蛋白的融合蛋白復(fù)合物的設(shè)計(jì)已確立IL-15穩(wěn)定地結(jié)合至IL-15Ra的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，且所得復(fù)合物能夠經(jīng)由該中間型或高親和性IL-15R復(fù)合物調(diào)控(亦即，剌激或阻斷)免疫應(yīng)答(l至4)。此外，已證實(shí)單鏈TCR或抗體多肽可融合至細(xì)胞激素及其他免疫效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域，且此等雙特異性融合分子保有兩種融合結(jié)構(gòu)域的功能活性(5至8)。再者，已顯示多價(jià)型TCR對(duì)其配體提供增強(qiáng)的結(jié)合性(9)。因此，本發(fā)明的特征為融合蛋白復(fù)合物，其包括至少一種融合蛋白，其中，第一TCR多肽融合至IL-15;以及至少一種融合物，其中，第二TCR多肽融合IL-15Ra的細(xì)31胞外結(jié)構(gòu)域，使得該兩種融合蛋白經(jīng)由IL-15與IL-15Ra結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合相互作用而形成復(fù)合物。于此融合蛋白復(fù)合物中，TCR多肽可相同或不同，且呈單鏈或異二聚體形式。含有單鏈TCR多肽的融合蛋白復(fù)合物的實(shí)例概要顯示于圖1A。于此融合蛋白復(fù)合物中，多價(jià)TCR結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渑潴w提供增加的結(jié)合性/親和性。例示性配體包括，但不限于肽/MHC復(fù)合物。IL-15/IL-15Ra結(jié)構(gòu)域提供免疫調(diào)控活性。包括融合蛋白復(fù)合物的代表性融合蛋白構(gòu)筑體概要顯示于圖1B。于此等構(gòu)筑體中，TCR多肽為由肽接頭序列((G4S)4)連結(jié)的TCR-Va及TCR-VP-CP結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成的單鏈TCR(264scTCR)。scTCR多肽直接或經(jīng)由肽接頭序列融合至IL-15或IL-15Ra結(jié)構(gòu)域。開始scTCR多肽為容許可溶性表達(dá)的訊息肽(或前導(dǎo)肽)序列。隨后訊息肽在蛋白質(zhì)運(yùn)送期間被切割，以產(chǎn)生成熟的融合蛋白。于融合蛋白復(fù)合物的其他實(shí)例中，可使抗體結(jié)構(gòu)域取代描繪于圖1A及1B中的TCR結(jié)構(gòu)域。此等抗體可呈單鏈或異二聚體形式。對(duì)于上述任一種融合蛋白復(fù)合物，序列可為人類序列或非人類序列(例如，但不限于小鼠序列)。此等序列可用于作為部分或所有融合蛋白結(jié)構(gòu)域。此外，結(jié)構(gòu)域的配置可不同，只要融合蛋白保有可溶性及功能即可。實(shí)施例2-c264scTCR/huIL15基因融合物于表達(dá)載體中的構(gòu)筑對(duì)于p53(aa264-272)-特異性TCR的TCR基因的單離及定性如前文所述(5至7)。為獲得人類IL15及IL15Ra基因，以HIST0PAGUE-1077(Sigma)從200mL輸血者的血液(Lot#2238789，CommunityBloodBank,Miami,FL)中單離人類PBMC。在C02培養(yǎng)器，于含有10%FBS的MDM中，以30ng/ml的PMA(Sigma)、200ng/ml的依諾霉素(ionomycin)、及220ng/ml的重組人類IL2將細(xì)胞(1.5X107)活化10天。將經(jīng)活化的細(xì)胞(每mLIX107)冷凍于_70C，以供進(jìn)一步應(yīng)用。為從經(jīng)活化的PBMC中純化總RNA，依據(jù)制造者的操作流程使用RNEASYPLUSMINI(Qiagen)。自總RNA擴(kuò)增含有編碼區(qū)以及5'及3'側(cè)區(qū)(flankingregion)部分的人類IL15基因，該擴(kuò)增為利用前引子(frontprimer)5'-CACCTTGCCATAGCCAGCTCTTC-3'與后弓l子(backprimer)5'-GTCTAAGCAGCAGAGTGATGTTTG-3'通過SUPERSCRIPTIIIOne-St印RT-PCRPlatinumTagHiFi(Invitrogen)，依據(jù)下列條件而進(jìn)行對(duì)于反轉(zhuǎn)錄(RT);55C，30分鐘；94C，2分鐘；對(duì)于擴(kuò)增cDNA;94C，30秒;53C，30秒；68C，1分鐘;x40個(gè)循環(huán)；68C，5分鐘。通過在1%瓊脂糖凝膠(agarosegel)上電泳而分開并單離600bp的人類IL15PCR-cDNA產(chǎn)物。以Qiaquick凝膠萃取套組(QiaquickGelExtractionKit(Qiagen))從瓊脂糖中純化cDNA產(chǎn)物。自600bp人類IL15cDNA擴(kuò)增成熟人類IL15蛋白的基因，該擴(kuò)增為利用前引子5'-TGGTTAACAACTGGGTGAATGTAATAAGTG-3'與后引子5'-ACGCGTTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTGGAC-3'通過PfuUltra(Stratagene)于下列PCR條件下而進(jìn)行94C，1分鐘；63C，1分鐘；72C，1分鐘；x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。將成熟人類IL15蛋白基因從凝膠純化并依據(jù)制造者的操作流程以TOPO反應(yīng)選殖入穿梭載體(shuttlevector)pcDNA3.1DirectionalTOPO表達(dá)載體(Invitrogen)?；谠\斷型PCR(diagnosticPCR)鑒定含有成熟人類IL15蛋白基因插入物的純系(clone)，該鑒定是利用前引子5'-TGGTTAACAACTGGGTGAATGTAATAAGTG-3'與后引子5'-ACGCGTTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTGGAC-3'通過RedTag(Sigma)于下列條件下而進(jìn)行94C，1分鐘；63C，1分鐘；72C，1分鐘;x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。依據(jù)制造者的操作流程利用QUICKSTARTKIT(BeckmanCoulter)以Ge謹(jǐn)eLabDyeTerminationCycleSequencing進(jìn)行DNA定序來(lái)確認(rèn)正確純系的序列。通過以Hpal及MluI酶切將成熟人類IL15蛋白基因從穿梭載體移出，并粘結(jié)至經(jīng)Hpal及Mlul酶切的表達(dá)載體pNEF38-c264scTCR。pNEF38-c264scTCR表達(dá)載體含有編碼連結(jié)至p53(aa264-272)肽特異性可溶性嵌合單鏈TCR蛋白的免疫球蛋白輕鏈前導(dǎo)(或分泌訊息)序列(c264scTCR)的基因片段(5)。載體亦含有5'調(diào)節(jié)/增強(qiáng)子(enhancer)區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)及啟動(dòng)子區(qū)、翻譯調(diào)節(jié)/起始/終止序列(包含Kozak—致性序列及poly-A終止區(qū))、以及具有推定的基質(zhì)結(jié)合調(diào)節(jié)元素(matrixattachmentregulatoryelement)的3'調(diào)節(jié)區(qū)。載體亦含有容許在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(SV40啟動(dòng)子/neoR基因/poly-A)及細(xì)菌(ori/amp基因)中選擇性生長(zhǎng)的DNA序列。將編碼成熟人類IL15蛋白的DNA片段選殖進(jìn)入pNEF38-c264scTCR載體而得到包括下列序列的c264scTCR/huIL15融合基因3'-免疫球蛋白輕鏈前導(dǎo)子-264TCRV-a-肽接頭-264TCRV-I3-人類TCRC-P-人類IL_15。所得載體(pNEF38-c264scTCR/huIL15)(如圖2A所示)是基于診斷型PCR予以鑒定并通過DNA定序再確認(rèn)。c264scTCR/huIL15融合基因及蛋白質(zhì)的序列(包含前導(dǎo)序列)分別顯示于圖2B及圖2C。實(shí)施例3-含有突變的人類IgGl鉸鏈區(qū)(hingeregion)的c264scTCR/huIL15基因融合物于表達(dá)載體中的構(gòu)筑pNEF38-c264scTCR/huIL15載體的構(gòu)筑詳述于實(shí)施例2。使用來(lái)自人類IgGlH鏈的突變鉸鏈區(qū)(其中，三個(gè)半胱氨酸殘基經(jīng)由三個(gè)絲氨酸殘基所取代)連結(jié)至c264scTCR及huIL15。鉸鏈區(qū)是從前述的264scTCR/IgGl基因突變及擴(kuò)增而來(lái)(7)，該擴(kuò)增是利用前引子5'-TGGTGGGTTAACGAGCCCAAATCTTCTG-3'與后引子5'-ATTATTACGCGTTGGAGACGGTGGAGATG-3'通過PfuUltra(Stratagene)于下列PCR條件進(jìn)行:94C，30秒;65C，30秒；70C，1分鐘；x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。通過在1%瓊脂糖凝膠上電泳而分開并單離70bp突變的人類IgGl鉸鏈PCR-cDNA產(chǎn)物。以Qi叫uick凝膠萃取套組(Qiagen)從瓊脂糖中純化cDNA產(chǎn)物。以Hpal及Mlul酶切突變鉸鏈區(qū)基因并粘結(jié)至經(jīng)Hpal及Mlul酶切的pNEF38-c264scTCR。基于診斷型PCR鑒定含有突變鉸鏈區(qū)基因插入物的純系，該鑒定是利用前引子5'-TGAGTGATCGATACCACCATGGAGACAGACAC-3'與后引子5'-ATTATTACGCGTTGGAGACGGTGGAGATG-3'通過RedTag(Sigma)于下列條件下進(jìn)行:94C，30秒;64C，30秒；70C，1分鐘;x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。自實(shí)施例2所述的pNEF38-c264scTCR/huIL15載體擴(kuò)增huIL15，該擴(kuò)增是利用前引子5'-TGGTGGACGCGTAACTGGGTGAATG-3'與后引子5'-TGGTGGTCTAGAATTATCAAGAAGTGTTGATG-3'通過PfuUltra(Stratagene)于下列PCR條件下而進(jìn)行:94C，30秒;65C，30秒;70C，1分鐘；x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。通過在1%瓊脂糖凝膠上電泳而分開并單離380bphuIL15PCR-cDNA產(chǎn)物。以Qiaquick凝膠萃取套組(Qiagen)從瓊脂糖中純化cDNA產(chǎn)物。以Mlul及Xbal酶切huIL15基因并粘結(jié)至經(jīng)Mlul及Xbal酶切的含有突變鉸鏈基因的pNEF38-c264scTCR?；谠\斷型PCR鑒定含有huIL15基因插入物的純系，該鑒定是利用前引子5'-TGAGTGATCGATACCACCATGGAGACAGACAC-3'與后引子5'-TGGTGGTCTAGAATTATCAAGAAGTGTTGATG-3'通過RedTag(Sigma)于下列條件下進(jìn)行94C，30秒；64C，2分鐘；70C，2分鐘；x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。依據(jù)制造者的操作流程利用QUICKSTARTKIT(Beck腿nCoulter)以Ge謹(jǐn)eLabDyeTerminationCycleSequencing進(jìn)行DNA定序來(lái)確認(rèn)正確純系的序列。pNEF38-c264scTCR表達(dá)載體詳述于上述實(shí)施例2。編碼突變的人類IgGl鉸鏈區(qū)及成熟人類IL15蛋白的DNA片段選殖進(jìn)入pNEF38-c264scTCR載體而得到包括下列序列的c264scTCR-hmt-huIL15融合基因3'_免疫球蛋白輕鏈前導(dǎo)子-264TCRV-a-肽接頭-264TCRV-P-人類TCRC-P-突變的人類IgGl鉸鏈-人類IL_15。所得載體(pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15)(如圖3A所示)是基于診斷型PCR予以鑒定并通過DNA定序再確認(rèn)。c264scTCR-hmt-huIL15融合基因及蛋白質(zhì)的序列(包含前導(dǎo)序列)分別顯示于圖3B及圖3C。實(shí)施例4-c264scTCR/huIL15RaAE3基因融合物于表達(dá)載體中的構(gòu)筑如上所述制備PBMC的總RNA。自PBMC的總RNA擴(kuò)增含有編碼區(qū)以及5'及3'側(cè)區(qū)部分的人類IL15Ra基因，該擴(kuò)增是利用前引子5'-AGTCCAGCGGTGTCCTGTGG-3'與后引子5'-TGACGCGTTTAAGTGGTGTCGCTGTGCCCTG-3'通過SUPERSCRIPTIIIOne-St印RT-PCRPlatinumTagHiFi(Invitrogen)依據(jù)下列條件而進(jìn)行對(duì)于RT;55C，30分鐘；94C，2分鐘；對(duì)于擴(kuò)增cDNA;94C，1分鐘；66C，1分鐘；72C，1分鐘；x35個(gè)循環(huán)；72C，5分鐘。通過在l^瓊脂糖凝膠上電泳而分開并單離970bp人類IL15RaPCRcDNA產(chǎn)物。以Qiaquick凝膠萃取套組(Qiagen)從瓊脂糖中純化cDNA產(chǎn)物。自970bp人類IL15RacDNA擴(kuò)增人類IL15Ra細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因，該擴(kuò)增是利用前引子5'-TGGTTAACATCACGTGCCCTCCCCCCATG-3'與后引子5'-TGACGCGTTTAAGTGGTGTCGCTGTGCCCTG-3'通過PfiiULTRA(Stratagene)于下列PCR條件下而進(jìn)行94C，1分鐘；72C，2分鐘；x35個(gè)循環(huán)，72C，10分鐘。將人類IL15Ra細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因從凝膠純化并依據(jù)制造者的操作流程以T0P0反應(yīng)選殖入穿梭載體pcDNA3.1DirectionalT0P0表達(dá)載體(Invitrogen)?；谠\斷型PCR選擇含有正確人類IL15Ra細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因插入物的純系，并依據(jù)制造者的操作流程利用QUICKSTARTKIT以GenomeLabDyeTerminationCycleSequencing進(jìn)行DNA定序予以確認(rèn)。該基因經(jīng)判定為人類IL15RaAE3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因。通過以Hpal及MluI酶切將人類IL15RaAE3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因從穿梭載體移出，并粘結(jié)至經(jīng)HpaI及MluI酶切的pNEF38-c264scTCR。將編碼人類IL15RaAE3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段選殖進(jìn)入pNEF38-c264scTCR載體而得到包括下列序列的c264scTCR/huIL15Ra融合基因3'-免疫球蛋白輕鏈前導(dǎo)子-26410V-a-肽接頭-264TCRV-P-人類TCRC-P-IL15RaAE3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。含有正確IL15RaAE3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域基因插入物的所得載體(pNEF38-c264scTCR/huIL15RaDE3)(如圖4A所示)是基于診斷型PCR予以鑒定并通過DNA定序再確認(rèn)。的序列c264scTCR/huIL15RaAE3基因及蛋白質(zhì)分別顯示于圖4B及圖4C。實(shí)施例5-c264scTCR/huIL15RaSushi基因融合物于表達(dá)載體中的構(gòu)筑如上所述制備PBMC的總RNA。自970bp人類IL15RacDNA(參見實(shí)施例3)擴(kuò)增人類IL15RaSushi基因，該擴(kuò)增是利用前引子5'-TGGTTAACATCACGTGCCCTCCCCCCATG-3'與后引子5'-TTGTTGACGCGTTTATCTAATGCATTTGAGACTGG-3'通過PfuUltra(Stratagene)于下列PCR條件下而進(jìn)行94C，1分鐘；66C，1分鐘；70C，1分鐘;x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。將人類IL15RaSushi基因的PCR產(chǎn)物從凝膠純化并以Hpal及Mlul酶切。將該基因粘結(jié)至經(jīng)Hpal及Mlul酶切的pNEF38-c264scTCR。將編碼人類IL15RaSushi結(jié)構(gòu)域的DNA片段選殖進(jìn)入pNEF38-c264scTCR載體而得到包括下列序列的c264scTCR/huIL15Ra融合基因3'_免疫球蛋白輕鏈前導(dǎo)子-264TCRV-a-肽接頭-264TCRV-P-人類TCRC_P-人類IL15RaSushi。含有正確人類IL15RaSushi基因插入物的所得載體(如圖5A所示)是基于診斷型PCR予以鑒定并通過DNA定序再確認(rèn)。c264scTCR/huIL15RaSushi基因及蛋白質(zhì)的序列分別顯示于圖5B及圖5C。實(shí)施例6-含有突變的人類IgGl鉸鏈區(qū)的c264scTCR/huIL15RaSushi基因融合物于表達(dá)載體中的構(gòu)筑如上所述構(gòu)筑pNEF38-c264scTCR/huIL15RaSushi載體。使用來(lái)自人類IgGlH鏈的突變鉸鏈區(qū)(其中，三個(gè)半胱氨酸殘基經(jīng)由三個(gè)絲氨酸殘基所取代)連結(jié)至c264scTCR及huIL15RaSushi。如上所述，將該鉸鏈區(qū)突變、擴(kuò)增、粘結(jié)、及確認(rèn)。自上述pNEF38-c264scTCR/huIL15RaSushi載體擴(kuò)增huIL15RaSushi，該擴(kuò)增是利用前引子5'-TAATAAACGCGTATCACGTGCCCTC-3'與后引子5'-TGGTGGTCTAGATTATCATCTAATGCATTTG-3'通過PfuUltra(Stratagene)于下列PCR條件下而進(jìn)行:94C，30秒;65C，30秒;70C，1分鐘；x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。通過在1%瓊脂糖凝膠上電泳而分開并單離250bphuIL15RaSushiPCR-cDNA產(chǎn)物。以Qiaquick凝膠萃取套組(Qiagen)從瓊脂糖中純化cDNA產(chǎn)物。以Mlul及Xbal酶切huIL15RaSushi基因并粘結(jié)至經(jīng)MluI及Xbal酶切的含有突變鉸鏈基因的pNEF38-c264scTCR?；谠\斷型PCR鑒定含有huIL15基因插入物的純系，該鑒定是利用前引子5'-TGGTGGGTTAACGAGCCCAAATCTTCTG-3'與后引子5'-TGGTGGTCTAGATTATCATCTAATGCATTTG-3'通過RedTag(Sigma)于下列條件下進(jìn)行94C，30秒；65C，1分鐘；70C，1分鐘;x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。依據(jù)制造者的操作流程利用QUICKSTARTKIT(Beck腿nCoulter)以Ge謹(jǐn)eLabDyeTerminationCycleSequencing進(jìn)行DNA定序來(lái)確認(rèn)正確純系的序列。pNEF38-c264scTCR表達(dá)載體為如上所述。將編碼突變的人類IgGl鉸鏈區(qū)及人類IL15RSushi蛋白的DNA片段選殖進(jìn)入pNEF38-c264scTCR載體而得到包括下列序列的c264scTCR-hmt-huIL15RSushi融合基因3'-免疫球蛋白輕鏈前導(dǎo)子-264TCRV-a-肽接頭-264TCRV-P-人類TCRC_P-突變的人類IgGl鉸鏈-人類IL15RSushi。所得載體(pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15RSushi)(如圖6所示)是基于診斷型PCR予以鑒定并通過DNA定序再確認(rèn)。c264scTCR-hmt-huIL15RSushi融合基因及蛋白質(zhì)的序列(包含前導(dǎo)序列)分別顯示于圖6B及圖6C。實(shí)施例7-c264scTCR/huIL15RaSushi及c264scTCR/huIL15基因于單一表達(dá)載體中的構(gòu)筑為達(dá)成在單一表達(dá)宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的兩種融合蛋白，將編碼c264scTCR/huIL15RaSushi及c264scTCR/huIL15的基因選殖入單一表達(dá)載體。自實(shí)施例5所述的模板通過PfuUltra(Stratagene)擴(kuò)增c264scTCR/huIL15RaSushi基因，該擴(kuò)增是利用前引子5'-TGAGTGTCCGGAACCACCATGGAGACAGACAC-3'與后引子5'-TTGTTGGCGGCCGCTTATCATCTAATGCATTTGAG-3'于下列條件下進(jìn)行94C，1分鐘；68C，1分鐘；72C，2分鐘；x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。將264scTCR/huIL15RaSushi基因的PCR產(chǎn)物從凝膠純化，以BspEI及Notl酶切并粘結(jié)至經(jīng)BspEI及Notl酶切th印SUN34Rl表達(dá)載體。pSUN34Rl表達(dá)載體含有兩個(gè)用于選殖感興趣的基因的位置以及5'調(diào)節(jié)/增強(qiáng)子區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)及啟動(dòng)子區(qū)、翻譯調(diào)節(jié)/起始/終止序列(包含Kozak—致性序列及poly-A終止區(qū))、及內(nèi)含子以及具有調(diào)節(jié)元素的3'區(qū)。此載體亦含有容許在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(SV40啟動(dòng)子/neoR基因/poly-A)及細(xì)菌(ori/amp基因)中選擇性生長(zhǎng)的DNA序列。含有正確c264scTCR/IL15RSushi基因插入物的載體是基于診斷型PCR予以鑒定并通過DNA定序再確認(rèn)。自實(shí)施例2所述的模板擴(kuò)增c264scTCR/huIL15基因，該擴(kuò)增是利用前引子5'-TGAGTGATCGATACCACCATGGAGACAGACAC-3'與后引子5'-TGAGTGTTCGAATTATCAAGAAGTGTTGATGAAC-3'于下列條件下進(jìn)行94C，1分鐘；65C，1分鐘；72C，2分鐘；x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。將c264scTCR/huIL15基因的PCR產(chǎn)物從凝膠純化，以Clal及Csp451酶切并粘結(jié)至經(jīng)Clal及Csp451酶切的pSUN34Rl-c264scTCR/huIL15RaSushi表達(dá)載體。含有正確c264scTCR/huIL15基因插入物的所得載體(pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaSushi)(如圖7所示)是基于診斷型PCR予以鑒定并通過DNA定序再確認(rèn)。此載體含有c264scTCR/36huIL15RaSushi及c264scTCR/huIL15基因。實(shí)施例8-c264scTCR/huIL15RaAE3及c264scTCR/huIL15基因于單一表達(dá)載體中的構(gòu)筑自實(shí)施例4所述的模板通過PfuUltra(Stratagene)擴(kuò)增c264scTCR/huIL15RaAE3融合基因，該擴(kuò)增是利用前引子5'-TGAGTGTCCGGAACCACCATGGAGACAGACAC-3'與后引子5'-TTGTTGGCGGCCGCTTATCAAGTGGTGTCGCTG-3'于下列條件下進(jìn)行94C，1分鐘；68C，1分鐘；72C，2分鐘；x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。將c264scTCR/huIL15RaAE3基因的PCR產(chǎn)物從凝膠純化，以BspEI及Notl酶切并粘結(jié)至經(jīng)BspEI及Notl酶切的表達(dá)載體pSUN34Rl。含有正確c264scTCR/huIL15RaAE3基因插入物的載體是基于診斷型PCR予以鑒定并通過DNA定序再確認(rèn)。擴(kuò)增c264scTCR/huIL15基因并選殖進(jìn)入如實(shí)施例7所述的表達(dá)載體。含有正確c264scTCR/huIL15基因插入物的所得載體(pSun-c264scTCRIL15/c264scTCRIL15RaDE3)(如圖8所示)是基于診斷型PCR予以鑒定并通過DNA定序再確認(rèn)。此載體含有c264scTCR/huIL15RaAE3及c264scTCR/huIL15基因。實(shí)施例9-產(chǎn)生融合蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞系的生成可通過多種不同的轉(zhuǎn)形、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法將表達(dá)載體導(dǎo)入各種宿主細(xì)胞系。于一此等方法中，將CH0-K1細(xì)胞(5X104)接種于6孔盤并于C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)一整夜。依據(jù)制造者的操作流程，使用10iiLMirusTransIT-LTl試劑(Mirus)，以5yg含有TCR/IL15及/或TCR/IL15Ra融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后一天將細(xì)胞以4mg/mLG418(Invitrogen)篩選。具G418抗性的細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)充以及通過3至5回合如下文所述的MACS篩選來(lái)富集化(enrich)TCR融合蛋白表達(dá)細(xì)胞。將細(xì)胞于10mMEDTA中剝離并以含有10%FBS的MDM洗滌一次。將細(xì)胞再懸浮(107個(gè)細(xì)胞于100iiL)并與5iig經(jīng)R-藻紅素(R-Phycoerythrin，PE)共軛的p53(aa264-272)/HLA-A2四聚體試劑于4C培養(yǎng)15分鐘。將細(xì)胞洗滌一次并與經(jīng)抗PE抗體共軛的磁珠(MiltenyiBiotec)于4C培養(yǎng)15分鐘。將細(xì)胞載入磁性管柱(于磁場(chǎng)中)，并以洗滌緩沖液(含有0.5%BSA的PBS)去除未結(jié)合的細(xì)胞。將管柱從磁場(chǎng)中移走后，以含有10%FBS的IMDM沖提與管柱結(jié)合的細(xì)胞。基于在制造/分泌過程的期間細(xì)胞表面上的可溶性融合蛋白的短暫呈現(xiàn)，此程序使融合蛋白表達(dá)細(xì)胞富集化。在各富集化作用后，監(jiān)測(cè)融合蛋白的細(xì)胞表面聯(lián)合作用。將通過流式細(xì)胞儀所測(cè)得的與細(xì)胞表面結(jié)合的融合蛋白濃度與通過ELISA所測(cè)得的存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中的可溶性融合蛋白濃度進(jìn)行比較。該比較的實(shí)例顯示于圖9A及9B。于此實(shí)例中，經(jīng)pNEF38-c264scTCR/huIL15RaSushi轉(zhuǎn)染的CH0-K1細(xì)胞通過MACS富集化一至五次，接著接種(1Xl()6個(gè)細(xì)胞/孔)于6孔盤。24小時(shí)后，接著將細(xì)胞以10mMEDTA剝離，以MDM+10%FBS洗滌一次，并以0.6iig經(jīng)PE共軛的p53(aa264-272)/HLA-A2四聚體或相同量的對(duì)照組經(jīng)PE共軛的CMVpp65(aa495-503)/HLA-A2四聚體于4C染色(2X105個(gè)細(xì)胞/100iiL的IMDM+10%FBS)30分鐘。將細(xì)胞洗滌一次并通過流式細(xì)胞儀分析與細(xì)胞表面聯(lián)合的可溶性融合蛋白濃度，如圖9A所示。分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基的可溶性融合蛋白濃度亦如前述通過TCR特異性ELISA，利用捕捉抗體(抗人類TCRCP抗體(BFl))及檢測(cè)抗體(生物素化抗人類37TCRCP抗體(W4F))予以測(cè)定(5)，如圖9B所示。結(jié)果顯示以磁珠為主的富集化過程所得到的轉(zhuǎn)染株產(chǎn)生的可溶性融合蛋白濃度增加。接著，將經(jīng)富集化的轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過極限稀釋(limitingdilution)次選殖(subclone)三次，并基于分泌至培養(yǎng)基中的可溶性融合蛋白濃度(由前述ELISA所測(cè)得)篩選生產(chǎn)細(xì)胞系(productioncellline)。在適于生成可溶性融合蛋白的條件(亦即，燒瓶、旋轉(zhuǎn)器、發(fā)酵器、培養(yǎng)袋、培養(yǎng)瓶)使生產(chǎn)細(xì)胞系擴(kuò)充并生長(zhǎng)于MDM+10%FBS或不含血清的培養(yǎng)基中。于某些情形中，將宿主細(xì)胞利用不同表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染以生成能夠表達(dá)多種融合蛋白的轉(zhuǎn)染株。表達(dá)一種融合蛋白的轉(zhuǎn)染株亦可利用一種或多種表達(dá)載體再轉(zhuǎn)染，以生成表達(dá)多種融合蛋白的轉(zhuǎn)染株。細(xì)胞亦利用一個(gè)含有超過一種融合蛋白基因的表達(dá)載體(如例示于實(shí)施例7及8者)轉(zhuǎn)染，以生成表達(dá)多種融合蛋白的轉(zhuǎn)染株。所得細(xì)胞可用于制造于細(xì)胞培養(yǎng)基中呈可溶性分子形式的本發(fā)明多成分型融合蛋白復(fù)合物。經(jīng)由U.S.S.N.09/204，979中所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選方法亦可達(dá)到高濃度的融合蛋白或融合蛋白復(fù)合物產(chǎn)量。實(shí)施例10-TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白或融合蛋白復(fù)合物的純化本發(fā)明的可溶性融合蛋白或融合蛋白復(fù)合物可使用各種方法從宿主細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基中純化，該等方法包含利用在溶劑中的選擇性分溶或溶解度的方法、或者利用基于電荷、疏水性、親水性、尺寸大小及/或?qū)ε潴w的選擇性或半選擇性結(jié)合的分離的方法(亦即，經(jīng)由層析)。可經(jīng)由使用適當(dāng)?shù)牡鞍渍郫B條件而自不可溶性物質(zhì)中生成可溶性融合蛋白或融合蛋白復(fù)合物。于一實(shí)例中，通過使用辨識(shí)人類TCR-CP結(jié)構(gòu)域的抗體(BF1)的親和性層析而自細(xì)胞培養(yǎng)基中純化c264scTCR/IL15融合蛋白。典型地，首先將含有經(jīng)BF1共軛的S印harose的管柱以20mMTris-HClpH8.O(載入緩沖液(loadingbuffer))平衡，接著以2ml/分鐘載入含有c264scTCR/IL15融合蛋白的pH經(jīng)調(diào)整的細(xì)胞培養(yǎng)基。接著，將管柱以5管柱容積的載入緩沖液洗滌，以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，并將c264scTCR/IL15融合蛋白以4管柱容積的0.5M檸檬酸鈉(pH4)沖提。收集后，將沖出液通過2MTris-HCl(pH8.0)調(diào)整至pH8.0。將經(jīng)純化的蛋白予以緩沖交換(bufferexchange)為PBS，并使用0.22ym過濾器過濾。將BF1管柱以50mM甘氨酸-HCl(pH3.0)予以剝離，并存放在20%乙醇，4C中，以供進(jìn)一步使用。融合蛋白可進(jìn)一步通過離子交換及/或尺寸排出層析予以純化。將含有c264scTCR/IL15、c264scTCR/IL15RaSushi及c264scTCR/IL15RaAE3融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮液通過上述方法純化，并將經(jīng)純化融合蛋白樣品在還原條件下通過在SDS聚丙烯醯胺凝膠上電泳而進(jìn)行分析，隨后以考馬斯亮藍(lán)(Coomassiebrilliantblue)予以染色。此等凝焦的實(shí)例顯示于圖10。主要的蛋白質(zhì)條帶對(duì)應(yīng)于基于融合蛋白序列所預(yù)期的正確分子量。實(shí)施例11-TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白的融合蛋白復(fù)合物的生成IL15以高親和性而特異性結(jié)合至細(xì)胞外IL15Ra結(jié)構(gòu)域(4)。因此，承載IL-15及IL15Ra結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的復(fù)合物可在各種條件下形成，包含于表達(dá)細(xì)胞之內(nèi)或于細(xì)胞外以未經(jīng)純化或經(jīng)純化的融合蛋白形成。于一實(shí)例中，可將等摩爾量(molaramount)的經(jīng)純化融合蛋白于適當(dāng)條件下(亦即，于室溫10分鐘，)混合，以形成融合蛋白復(fù)合物。可使用各種技術(shù)監(jiān)測(cè)復(fù)合物的形成，該等技術(shù)包含直接結(jié)合分析、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析、免疫沉淀、表面電漿共振、或基于復(fù)合物尺寸大小、活性或其他性質(zhì)的分析。舉例而言，如圖ll所示，尺寸排出層析可基于分子量監(jiān)測(cè)包括c264scTCR/huIL15及c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白的復(fù)合物的形成。于此研究中，將約100iig的c264scTCR/huIL15(0.5mg/ml)載于Superdex200HR10/30管柱以供分析。c264scTCR/huIL15的計(jì)算分子量為約57kD?；赟EC圖譜(圖11)，估計(jì)分子量為約98kD，顯示此融合蛋白似乎為單體。同樣地，將約60g的c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白(0.3mg/ml)載于S卯erdex管柱。c264scTCR/huIL15RaSushi的計(jì)算分子量為約52kD?；赟EC圖譜(圖11B)，融合蛋白的估計(jì)分子量為約81kD，再次顯示此融合蛋白為單體。過去其他以TCR為主體的融合蛋白的SEC分析顯示類似的糖化融合蛋白的計(jì)算分子量與估計(jì)分子量之間的差異。當(dāng)以等摩爾量混合c264scTCR/huIL15及c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白并將約126iig的混合蛋白(0.63mg/ml)載于管柱時(shí)，獲得圖11所示的圖譜。估計(jì)兩個(gè)主要波峰的分子量一個(gè)為約170kD，其為兩個(gè)融合蛋白的異二聚體；而另一個(gè)為約91kD，其似乎為單體型融合蛋白的混合物。因此，在混合的c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白制備物中出現(xiàn)170kD物種為可生成本發(fā)明融合蛋白復(fù)合物的證據(jù)。亦進(jìn)行包括c264scTCR/huIL15及c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白的融合蛋白復(fù)合物的分析。將約100iig的c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白(0.5mg/ml)載于Superdex管柱。c264scTCR/huIL15RaAE3的計(jì)算分子量為約60kD?；赟EC圖i普(圖12A)，該蛋白的估計(jì)分子量為約173KD，顯示此蛋白是以同型二聚體(homodimer)存在。當(dāng)以等摩爾量混合c264scTCR/huIL15及c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白并將約118iig的混合蛋白(0.59mg/ml)載于管柱，獲得圖12B所示的圖譜。估計(jì)兩個(gè)主要波峰的分子量一個(gè)為>210kD，其似乎為兩個(gè)異二聚體所構(gòu)成的四聚體；而另一個(gè)為約93kD，其似乎為c264scTCR/huIL15單體。因此，在混合的c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白制備物中出現(xiàn)170kD物種為可生成本發(fā)明融合蛋白復(fù)合物的證據(jù)。實(shí)施例12-TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白的融合蛋白復(fù)合物顯現(xiàn)出對(duì)肽/MHC復(fù)合物增強(qiáng)的結(jié)合性對(duì)上述所生成的融合蛋白復(fù)合物結(jié)合TCR特異性抗原p53(aa264-272/HLA-A2.1的能力進(jìn)行定性。為生成呈遞此抗原的細(xì)胞，于26C以p53(aa264-272)肽載入HLA-A2.1陽(yáng)性T2細(xì)胞一整夜，接著以5X106細(xì)胞/mL存放于液態(tài)氮中。將未與肽共同培養(yǎng)的T2細(xì)胞作為對(duì)照組。將載入p53肽的T2細(xì)胞或?qū)φ战MT2細(xì)胞解凍并再懸浮于lmL的MDM+10XFBS中。接著，以0.5iig的下列融合蛋白將細(xì)胞(5X105/100yL)于室溫染色30分鐘c264scTCR/huIL15、c264scTCR/huIL15RaSushi、c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi復(fù)合物。將細(xì)胞以洗滌緩沖液(含有O.5%BSA及0.05%疊氮化鈉的PBS)洗滌一次，并于lOOyL洗滌緩沖液中以O(shè).liig生物素化小鼠單株抗人類TCRCP抗體(BF1)于室溫染色30分鐘。將細(xì)胞洗滌一次并于lOOiiL洗滌緩沖液中以O(shè).5iig經(jīng)R-藻紅素共軛的鏈霉親和素于室溫染色30分鐘。洗滌并再懸浮該細(xì)胞以供通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。如圖13所示，各融合蛋白能夠?qū)d入p53肽的細(xì)胞進(jìn)行特異性染色。此外，c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白復(fù)合物經(jīng)由多價(jià)c264scTCR結(jié)構(gòu)域而對(duì)呈遞于T2細(xì)胞的p53(aa264-272)/HLA-A2.1復(fù)合物呈現(xiàn)增強(qiáng)的特異性結(jié)合性。特定而言，相較于單體c264scTCR/huIL15或c264scTCR/huIL15RaSushi融合蛋白，二聚體融合蛋白復(fù)合物對(duì)載入p53肽的T2細(xì)胞顯現(xiàn)出較佳的染色。此等數(shù)據(jù)顯示相較于單體型融39合蛋白，多聚體融合蛋白復(fù)合物將提供較佳的抗原辨識(shí)性質(zhì)。實(shí)施例13-huIL-15突變基因的生成以及c264scTCR-hmt-huIL15突變基因表達(dá)載體的構(gòu)筑如上所述，c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi多月太能夠經(jīng)由IL-15與IL-15Ra結(jié)構(gòu)域的相互作用而形成復(fù)合物，且多價(jià)融合蛋白復(fù)合物對(duì)肽/MHC復(fù)合物具有增強(qiáng)的結(jié)合性?；谠鰪?qiáng)的結(jié)合活性，此融合蛋白復(fù)合物具有作為抗原特異性或靶向研究的診斷及治療劑的優(yōu)點(diǎn)。如此處所表明，融合蛋白的IL-15/IL-15Ra結(jié)構(gòu)域與表達(dá)IL-15受體的細(xì)胞結(jié)合的能力亦為所期望的特征。然而，有些應(yīng)用中，增加或降低IL-15/IL-15Ra結(jié)構(gòu)域與表達(dá)IL15受體的細(xì)胞的相互作用的能力及/或影響表達(dá)IL15受體的細(xì)胞的反應(yīng)的能力將為有利的。舉例而言，在主要目標(biāo)為使用融合蛋白復(fù)合物特異性檢測(cè)肽/MHC復(fù)合物的應(yīng)用(亦即，研究及診斷用途)中，減少此相互作用可為適宜的。于治療應(yīng)用中，生成能夠增加或降低IL-15媒介的應(yīng)答的含有IL-15結(jié)構(gòu)域的融合蛋白復(fù)合物亦可為適宜的。為解決此問題，已進(jìn)行突變分析來(lái)鑒定IL-15中影響其對(duì)IL-2/15RI3Yc復(fù)合物的結(jié)合性但不影響其對(duì)IL-15Ra的相互作用的殘基。所得突變可創(chuàng)造IL-15變異體，包含拮抗劑或激動(dòng)劑。除了用于本發(fā)明的融合蛋白以外，所得IL-15拮抗劑及激動(dòng)劑亦可具有作為可溶性細(xì)胞激素(亦即，非融合蛋白)或作為具有IL-15Ra結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物以供研究、診斷或治療應(yīng)用的效用。舉例而言，于治療策略中，IL-15拮抗劑可用于抑制不想要的免疫應(yīng)答，而IL-15激動(dòng)劑可用于剌激免疫應(yīng)答，以治療各種疾病?；贗L-15與IL-2的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)之間的比較，數(shù)個(gè)氨基酸被鑒定為可能影響IL-15與IL-15Ra、IL-15RP及/或YC之間的相互作用。如表1及圖14A所示，所創(chuàng)造的IL-15變異體中，成熟人類IL-15蛋白對(duì)IL-15RPYc受體的可能結(jié)合位置，于位置8、61、65、72及108的氨基酸(基于成熟天然人類IL-15序列予以編號(hào))，為各自經(jīng)取代或各自與兩個(gè)或更多個(gè)其他取代組合。位置8的天冬氨酸經(jīng)丙氨酸或天冬酰胺所取代。位置61的天冬氨酸經(jīng)丙氨酸所取代。位置65的天冬酰胺經(jīng)丙氨酸或天冬氨酸所取代。位置72的天冬酰胺經(jīng)精氨酸或天冬氨酸所取代。位置108的谷氨酰胺經(jīng)丙氨酸所取代。位置8的Asp及位置108的Gin兩者各自經(jīng)丙氨酸所取代。位置8的Asp及位置65的Asn兩者各自經(jīng)天冬酰胺或丙氨酸所取代。位置8的Asp及位置65的Asn兩者各自經(jīng)絲氨酸或精氨酸所取代。使用重疊PCR(overla卯ingPCR)來(lái)生成IL-15突變體。舉例而言，為生成位置8的Asp經(jīng)丙氨酸或天冬酰胺殘基取代的突變體，使用pNEF38-c264scTCR/huIL15載體作為模板來(lái)擴(kuò)增兩個(gè)重疊的c-DNA片段，該擴(kuò)增是利用片段l的前引子5'-TGGTGGACGCGTAACTGGGTGAATG-3'與片段l的后引子5'-AGATCTTCAATTTTTTTCAAMKHACTTATTACATTCACCCAG-3'以及利用片段2的前引子5'-ACTGGGTGAATGTAATAAGTDMKTTGAAAAAAATTGAAGATC-3'與片段2的后引子5'-TGGTGGTCTAGATTATCAAGAAGTGTTGATG-3'通過PfuUltra(Stratagene)于下列PCR條件下而進(jìn)行94C，1分鐘；66C，1.5分鐘；72C，1.5分鐘；x35個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。通過在1%瓊脂糖凝膠上電泳而分開并單離片段l及片段2的PCR-cDNA產(chǎn)物。以Qiaquick凝膠萃取套組(Qiagen)從瓊脂糖中純化cDNA產(chǎn)物。將片段1及片段2的PCR-cDNA產(chǎn)物融合在一起，該融合是利用PfuUltra(Stratagene)于下列PCR條件下而進(jìn)行94C，1分鐘；66C，1.5分鐘；72C，1.5分鐘；x10個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增重疊的PCR-cDNA片段，該擴(kuò)增是利用前引子5'-TGGTGGACGCGTAACTGGGTGAATG-3'與后引子5'-TGGTGGTCTAGATTATCAAGAAGTGTTGATG-3'通過PfuUltra(Stratagene)于下列PCR條件下而進(jìn)行94C，1分鐘；64C，1.5分鐘；69C，1.5分鐘；x30個(gè)循環(huán)；72C，10分鐘。通過在1%瓊脂糖凝膠上電泳而分開并單離huIL-15突變的PCR-cDNA產(chǎn)物。以Qiaquick凝膠萃取套組(Qiagen)從瓊脂糖中純化cDNA產(chǎn)物。以Mlul及Xbal酶切huIL15突變基因并粘結(jié)至經(jīng)Mlul及Xbal酶切的pNEF38-c264scTCR-hmt。依據(jù)制造者的操作流程利用QUICKSTARTKIT(BeckmanCoulter)以GenomeLabDyeTerminationCycleSequencing進(jìn)行DNA定序來(lái)確認(rèn)含有于位置8具有丙氨酸或天冬酰胺取代的huIL15基因的純系。pNEF38-c264scTCR表達(dá)載體如上所述。將編碼突變的人類IL-15蛋白的DNA片段選殖入pNEF38-c264scTCR載體而得到包括下列序列的c264scTCR-hmt-huIL15D8A或c264scTCR-hmt-huIL15D8N融合基因3'-免疫球蛋白輕鏈前導(dǎo)子-64TCRV-a-肽接頭-264TCRV-I3-人類TCRC-P-突變的人類IgGl鉸鏈_人類IL15D8A或-人類IL15D8N。將所得載體(pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8A或pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8N)(如圖14B所示)通過DNA定序確認(rèn)。pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8A或pNEF38-c264scTCR-hmt-huIL15D8N融合基因及蛋白質(zhì)的序列(包含前導(dǎo)序列)分別顯示于圖14C及圖14D。如上所述以類似方式將其他突變導(dǎo)入所構(gòu)筑的表達(dá)載體。如實(shí)施例9所述將表達(dá)載體導(dǎo)入CH0.K1細(xì)胞以生成安定的轉(zhuǎn)染株。TCR/IL15融合蛋白及包括IL-15變異體的融合蛋白復(fù)合物的制造及純化是使用類似于實(shí)施例10及11所述的方法而進(jìn)行。呈可溶性細(xì)胞激素形式的IL-15變異體的生成可經(jīng)由此技藝中已知的各種方法進(jìn)行，該等方法包含于原核及真核表達(dá)系統(tǒng)中制造(參見例如W09527722;Hsuetal.2005J.Immunol.175:7226)。實(shí)施例14-TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白以及融合蛋白復(fù)合物的功能定性基于實(shí)施例9中所述的使用p53(aa264-272)/HLA-A2.1試劑的ELISA及細(xì)胞染色法，以及實(shí)施例12中所述的抗原呈遞細(xì)胞染色法證實(shí)融合蛋白TCR結(jié)構(gòu)域的功能性結(jié)合。如實(shí)施例ll所述，證實(shí)融合蛋自IL15及IL15Ra結(jié)構(gòu)域相互作用的能力。再者，可經(jīng)由各種方法評(píng)估IL15及IL15Ra結(jié)構(gòu)域的功能活性，該等方法包含結(jié)合至IL-2/15RPYc受體或調(diào)控承載有IL-15受體的免疫細(xì)胞的活性。于一實(shí)例中，將表達(dá)異三聚體IL-15R(a|3yc鏈)的CTLL-2細(xì)胞與0.5yg的下列個(gè)別融合蛋白于室溫培養(yǎng)30分鐘c264scTCR/huIL15、264scTCR/huIL15RaSushi或c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi復(fù)合物。將細(xì)胞以洗滌緩沖液(含有0.5%BSA及0.05%疊氮化鈉的PBS)洗滌一次，并以0.5iig經(jīng)R-藻紅素(PE)共軛的p53(aa264-272)/HLA-A2四聚體于室溫染色30分鐘。洗滌并再懸浮該細(xì)胞以供通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。如圖15所示，c264scTCR/huIL15融合蛋白及c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi復(fù)合物經(jīng)由其huIL15結(jié)構(gòu)域與CTLL-2細(xì)胞上的IL-15受體的聯(lián)合作用可利用能辨識(shí)所結(jié)合的融合蛋白c264scTCR結(jié)構(gòu)域的經(jīng)PE共軛的p53(aa264-272)/HLA-A2四聚體與以檢測(cè)。此等結(jié)果顯示融合蛋白/融合蛋白復(fù)合物的IL-15及TCR結(jié)構(gòu)域皆能夠與其同源性配體功能性地相互作用。此外，CTLL-2細(xì)胞依賴細(xì)胞激素生長(zhǎng)且可對(duì)重組人類IL-15產(chǎn)生應(yīng)答。發(fā)展出使用CTLL-2細(xì)胞的以細(xì)胞為主的WST-l增生分析來(lái)評(píng)估融合蛋白及融合蛋白復(fù)合物的IL-15生物活性。WST-1(Roche)為可通過代謝活性細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的去氫酶而轉(zhuǎn)化成甲臜(formazan)的試劑。于WST-1分析中，通過440至450nm吸光度的量值所測(cè)得的培養(yǎng)基中甲臜的量直接與培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)成比例。于37C，在C02培養(yǎng)器中，將CTLL-2細(xì)胞(2X104/200iiL)與下列指定濃度的融合蛋白(0至28ng/mL)于96孔盤中培養(yǎng)3天c264scTCR/huIL15、c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi復(fù)合物或c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaAE3復(fù)合物。將該細(xì)胞與10iiL的WST-1培養(yǎng)4小時(shí)之后，收取100iiL的培養(yǎng)基，以利用微量滴定盤判讀機(jī)進(jìn)行440至450nm吸光度測(cè)定。如圖16所示，c264scTCR/huIL15融合蛋白可以低至1.8ng/mL(31.25pM)的濃度維持CTLL-2細(xì)胞增生，顯示c264scTCR/huIL15融合蛋白經(jīng)由高親和性的IL15受體活化CTLL-2細(xì)胞。令人感興趣的是，融合蛋白復(fù)合物亦維持CTLL-2細(xì)胞增生，但達(dá)到較低的程度，顯示在與c264scTCR/huIL15RaSushi或c264scTCR/huIL15RaAE3形成復(fù)合物之后，c264scTCR/huIL15剌激活性受到抑制(分別為一倍或四倍)。此結(jié)果顯示c264scTCR/huIL15對(duì)高親和性IL15受體的結(jié)合性受到c264scTCR/huIL15RaSushi或c264scTCR/huIL15RaAE3融合蛋白的抑制。此等結(jié)果提供融合蛋白及融合蛋白復(fù)合物可于不同條件下活化或抑制免疫細(xì)胞的應(yīng)答的證據(jù)。對(duì)僅表達(dá)中間型親和性的IL-1513yc受體的細(xì)胞系(例如，32DP細(xì)胞系(參見下文))進(jìn)行類似的分析。于某些情形中，當(dāng)IL15呈具有IL15Ra結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物形式時(shí)，可能會(huì)增強(qiáng)IL15剌激承載有IL-15R的細(xì)胞增生的生物活性(1至3)。評(píng)估c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi或c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaAE3復(fù)合物對(duì)細(xì)胞增生的剌激，其可提供融合蛋白復(fù)合物可剌激或活化免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答的其他證據(jù)。實(shí)施例15-TCR/IL15RaSushi及TCR/IL15變異體的二聚體融合蛋白復(fù)合物對(duì)肽/腿C復(fù)合物顯現(xiàn)出TCR特異性結(jié)合，但對(duì)IL-15RPyc受體顯現(xiàn)出較低的結(jié)合對(duì)如上所述包括IL-15變異體的融合蛋白復(fù)合物結(jié)合TCR特異性抗原p53(aa264-272)/HLA-A2.1的能力進(jìn)行定性。為了生成呈遞p53(aa264-272)/HLA-A2.1的細(xì)胞，于37C在lxPLE(AltorBioscience)存在下以20iiMp53(aa264-272)肽載入HLA-A2.1-陽(yáng)性T2細(xì)胞(2X107mL)2至3小時(shí)。將未與肽共同培養(yǎng)的T2細(xì)胞及表達(dá)IL-2/15RPyc的32D13細(xì)胞作為對(duì)照組。接著，將載入p53肽的T2細(xì)胞、對(duì)照組T2細(xì)胞或32DI3細(xì)胞(2X107100iiL)與320nM下列二聚體融合蛋白復(fù)合物于4C培養(yǎng)30分鐘l)c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi、2)c264scTCR/huIL15D8A+c264scTCR/huIL15RaSushi、以及3)c264scTCR/huIL15D8N+c264scTCR/huIL15RaSushi。通過于4C培養(yǎng)160nM經(jīng)純化的c264scTCRhuIL15融合蛋白及160nM經(jīng)純化的c264scTCRhuIL15RaSushi融合蛋白3小時(shí)而生成此等復(fù)合物。染色之后，將細(xì)胞以洗滌緩沖液(含有0.5%BSA及0.05%疊氮化鈉的PBS)洗滌一次，并于100yL洗滌緩沖液中以0.5iig生物素化小鼠單株抗人類TCRC13抗體(BF1)于4C染色30分鐘。將細(xì)胞洗滌一次并于100yL洗滌緩沖液中以0.5g經(jīng)R-藻紅素共軛的鏈霉親和素于4C染色30分鐘。洗滌并再懸浮該細(xì)胞以供通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。如圖17A所示，對(duì)于特異性染色載入p53肽的T2細(xì)胞而言，c264scTCR/huIL15D8A+c264scTCR/huIL15RaSushi復(fù)合物及c264scTCR/huIL15D8N+c264scTCR/huIL15RaSushi復(fù)合物顯現(xiàn)出與c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi復(fù)合物相等的活性。此等結(jié)果顯示在此等融合復(fù)合物各者中的多價(jià)scTCR結(jié)構(gòu)域具有完整的功能。然而，如圖17B及圖17C所示，對(duì)于對(duì)照組T2細(xì)胞(圖17B)及IL-15RPyc-陽(yáng)性32DP細(xì)胞(圖17C)，相較于野生型c264scTCR/IL15融合蛋白復(fù)合物，突變的c264scTCR/huIL15融合蛋白復(fù)合物顯現(xiàn)出較低的背景染色。因此，此等包括IL-15變異體(D8A及D8N)的融合蛋白復(fù)合物不會(huì)對(duì)呈遞于32DP細(xì)胞的IL-15RPYc受體顯現(xiàn)出結(jié)合活性。利用其他包括IL-15變異體的融合蛋白進(jìn)行IL-15RPYc受體結(jié)合性的類似研究并總結(jié)于表l。結(jié)果顯示包括IL-15變異體的本發(fā)明融合蛋白及融合蛋白復(fù)合物保有辨識(shí)肽/MHC復(fù)合物的活性并對(duì)IL-15RPyc受體展現(xiàn)出降低或增加的結(jié)合活性。為確認(rèn)上述融合蛋白功能性TCR與IL-15結(jié)構(gòu)域，通過ELISA分析測(cè)定肽/腿C及IL-15Ra結(jié)合活性。于4C，在3小時(shí)的期間，以于碳化緩沖液(pH9.1)(碳酸氫鈉35mM，Na2C0317.5mM，NaCl50mM)的20nMBF1、抗TCRCP抗體、或20nMTCR/IL15RaSushi預(yù)先涂覆96孔微量滴定盤。將該盤以洗滌緩沖液(咪唑40mM，NaC1150mM)洗滌4次，并以1%BSA-PBS封阻(block)10分鐘。添加濃度0.03-4nM的指定融合蛋白至該盤，并于室溫培養(yǎng)30分鐘。洗滌該盤4次。將經(jīng)BF1捕捉的融合蛋白與1yg/mL經(jīng)HRP共軛的p53/HLA-A2.1四聚體于室溫培養(yǎng)45分鐘，并將經(jīng)TCR/IL15RaSushi捕捉的融合蛋白與50ng/mL生物素化小鼠抗人類IL-15于室溫培養(yǎng)30分鐘。洗滌4次后，將與生物素化小鼠抗人類IL-15共同培養(yǎng)的該盤與0.25i！g/mLHRP-鏈霉親和素培養(yǎng)15分鐘。將該盤洗滌4次，與過氧化酶受質(zhì)ABT培養(yǎng)1至10分鐘并顯色，以供利用微量滴定盤判讀機(jī)的405nm吸光度測(cè)定。如圖18A及圖18B所示，多種融合蛋白對(duì)p53/HLA-A2四聚體共有類似的TCR特異性結(jié)合活性，且對(duì)IL15RaSushi共有相等的IL-15結(jié)合活性。利用其他包括IL-15變異體的融合蛋白進(jìn)行IL-15Ra結(jié)合性的類似研究并總結(jié)于表l。結(jié)果顯示包括IL-15變異體的本發(fā)明融合蛋白及融合蛋白復(fù)合物保有辨識(shí)肽/MHC復(fù)合物及IL-15Ra受體的活性。實(shí)施例16-TCR/IL15突變體融合蛋白及融合蛋白復(fù)合物的功能定性如上所表明，包括IL-15拮抗劑或激動(dòng)劑的融合蛋白可有用于作為靶向藥劑，以用于在疾病位置抑制或剌激IL-15媒介的應(yīng)答(亦即，T細(xì)胞或NK細(xì)胞活性)。為了測(cè)定此等融合蛋白影響免疫應(yīng)答的IL-15生物活性，利用表達(dá)高親和性IL-15R(a|3Yc鏈)的CTLL-2細(xì)胞及利用表達(dá)中間型IL-15R(PYc鏈)的32DP細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增生研究。于37C，在C02培養(yǎng)器中，將細(xì)胞(2X104/200iiL)與0.4至40nM的上述TCR/IL15融合蛋白于96孔盤中培養(yǎng)3天。將該細(xì)胞與10iiL的WST-1培養(yǎng)4小時(shí)之后，收取150yL的培養(yǎng)基，以利用微量滴定盤判讀機(jī)進(jìn)行440nm吸光度測(cè)定。如圖19A及圖19B所示，包括野生型IL-15結(jié)構(gòu)域的c264scTCR/huIL15融合蛋白可分別以低至40pM或lnM的濃度維持CTLL-2及32DP細(xì)胞增生。令人感興趣的是，相較于包括野生型IL-15結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，包括具有在位置72以氨基酸將天冬酰胺取代成天冬氨酸的IL15變異體的融合蛋白(c264scTCR/huIL15N72D)在維持32DP細(xì)胞系增生上更具活性，顯示出低至80pM(圖19B)濃度的生物活性。在此方面，包括IL-15變異體的融合蛋白(huIL15N72D)顯示出極佳的激動(dòng)劑活性。在具有一對(duì)一比例的c264scTCR/IL15RaSushi的復(fù)合物中，c26scTCR/huIL15N72D對(duì)T2細(xì)胞上的p53/HLA-A2.1復(fù)合物具有類似于c264scTCR/huIL15wt的結(jié)合能力(圖17A)，但對(duì)32DP細(xì)胞上的IL-15RPYc受體則顯現(xiàn)出增加的結(jié)合能力(圖17C)。相反地，相較于c264scTCR/huIL15wt融合蛋白，包括在位置8(c264scTCR/huIL15D8N或c264scTCR/huIL15D8A)、位置65(c264scTCR/huIL15N65A)、位置108(c264scTCR/huIL15Q108A)具有取代的IL-15變異體，或在位置72(c264scTCR/huIL15N72R)具有不同取代的IL-15變異體的融合蛋白在維持CTLL-2及32DI3細(xì)胞的增生上皆具有較低的活性(圖19A及圖19B)。利用其他包括IL-15變異體的融合蛋白進(jìn)行IL-15相依性增生活性的類似研究并總結(jié)于表1。該數(shù)據(jù)支持下述假設(shè)IL-15蛋白在位置8、61、65、72及108的突變可產(chǎn)生對(duì)IL-15R具有降低的結(jié)合性且對(duì)剌激免疫應(yīng)答具有極少或不具有活性的IL-15拮抗劑。位置72取代的結(jié)果意外地得到一個(gè)突變體(c264scTCR/huIL15N72R)，其作用為IL-15拮抗劑，而不同的突變體(c264scTCR/huIL15N72D)則顯示出對(duì)IL-15R增加的結(jié)合性及對(duì)剌激免疫應(yīng)答增強(qiáng)的活性。于典型的情況中，IL-15由樹突細(xì)胞表面上的IL15Ra轉(zhuǎn)呈遞(trans-present)至記憶T細(xì)胞、NKT細(xì)胞或NK細(xì)胞上的IL-15RPyc受體，以維持細(xì)胞存活及剌激免疫應(yīng)答。拮抗劑應(yīng)通過與IL15Ra結(jié)合而阻斷IL-15的轉(zhuǎn)呈遞作用。為評(píng)估拮抗劑融合蛋白是否可與c264scTCR/huIL15wt競(jìng)爭(zhēng)以阻斷其維持CTLL-2細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，在50nM(100倍摩爾過量)的各種c264scTCR/huIL15突變體融合蛋白存在或不存在下，將4X104個(gè)CTLL-2細(xì)胞與0.5nM的c264scTCR/huIL15wt于37C在C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)24小時(shí)。將該細(xì)胞與10iiL的WST-1培養(yǎng)4小時(shí)之后，收取150iiL的培養(yǎng)基，以利用微量滴定盤判讀機(jī)進(jìn)行440nm吸光度測(cè)定。如圖19C所示，c264scTCR/huIL15wt維持CTLL-2細(xì)胞增生的能力在100倍以上的c加4scTCRyhuILlSDSN、c加4scTCR/huILlSDSA、c加4scTCR/huILlSDSA/Q108A、c264scTCR7huIL15Q108A或c264scTCR/huIL15D8N/N65A的存在下被完全地阻斷，而在c264scTCR/huIL15N72R融合蛋白的存在下則下降62%。此結(jié)果顯示此等融合蛋白為c264scTCR/IL15融合蛋白的拮抗劑?；诖说鹊鞍着cIL-15Ra結(jié)合但不與IL-15RPyc受體結(jié)合的能力所預(yù)期，此數(shù)據(jù)指出c264scTCR/huIL15突變體融合蛋白為IL-15活性的功能性拮抗劑。利用此處所述其他TCR/IL15融合蛋白與IL-15變異體進(jìn)行類似研究，以證實(shí)IL-15拮抗劑及激動(dòng)劑活性。如表1所總結(jié)，IL-15在位置8、61、65、72及108的取代顯示出影響IL-15對(duì)IL-15R(PYc鏈)結(jié)合性的能力。IL-15在位置92、101及111的其他取代亦將作為IL-15R相互作用的可能結(jié)合位置而予以評(píng)估。此外，包含所有或數(shù)個(gè)此等殘基的取代的變化組合可創(chuàng)造有效的IL-15拮抗劑或激動(dòng)劑。包含上述的分子，欲加以評(píng)估的IL-15變異體包含彼等具有下列改變者在位置8改變成丙氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、賴氨酸、蘇氨酸或酪氨酸；在位置61改變成丙氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、賴氨酸、蘇氨酸或酪氨酸；在位置65改變成丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸；在位置72改變成丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸；以及在位置92、101、108或111改變成丙氨酸或絲氨酸。實(shí)施例17-通過TCR/IL15及TCR/IL15Ra融合蛋白及融合蛋白復(fù)合物的細(xì)胞-細(xì)胞接合及免疫細(xì)胞再標(biāo)靶(retargeting)為證實(shí)融合蛋白或融合蛋白復(fù)合物可將承載有IL-15受體的細(xì)胞與承載有肽/MHC的靶細(xì)胞橋聯(lián)，將T2細(xì)胞載入p53(aa264-272)肽或?qū)φ战MCMV卯65(aa495-503)肽，接著以二氫乙啶(dihydroethidium)標(biāo)記。將CTLL-2細(xì)胞以f丐黃綠素AM(calceinAM)標(biāo)記，將兩個(gè)經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞族群混合并在融合蛋白或融合蛋白復(fù)合物的存在或不存在下培養(yǎng)。在融合蛋白復(fù)合物不存在下或?qū)2細(xì)胞載入對(duì)照組肽時(shí)，通過流式細(xì)胞儀評(píng)估時(shí)，預(yù)期細(xì)胞會(huì)保持兩個(gè)清楚區(qū)別的族群。然而，當(dāng)將T2細(xì)胞載入p53(aa264-272)并在融合蛋白或復(fù)合物的存在下與CTLL-2細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，雙重染色的細(xì)胞族群外觀為T2細(xì)胞經(jīng)由融合蛋白或融合蛋白復(fù)合物接合至CTLL-2細(xì)胞的指標(biāo)。同樣地，可進(jìn)行研究來(lái)證實(shí)融合蛋白復(fù)合物可橋聯(lián)承載有IL-15受體的免疫細(xì)胞與承載有肽/MHC的靶細(xì)胞，并將免疫細(xì)胞毒性導(dǎo)向靶細(xì)胞。舉例而言，將T2細(xì)胞載入p53(aa264-272)肽或?qū)φ战MCMVpp65(aa495-503)肽，接著以f丐黃綠素AM標(biāo)記。以不同的比例混合承載IL-15受體的免疫效應(yīng)物細(xì)胞(亦即，經(jīng)活化的NK細(xì)胞或T細(xì)胞)，并在融合蛋白復(fù)合物的存在或不存在下于適當(dāng)條件培養(yǎng)(亦即，于37C培養(yǎng)2至4小時(shí))。通過標(biāo)準(zhǔn)方法，基于鈣黃綠素從T2靶細(xì)胞至培養(yǎng)基的釋放而評(píng)估細(xì)胞毒性。測(cè)定鈣黃綠素-AM的特異性釋放或與自然釋放鈣黃綠素-AM的非特異性對(duì)照組進(jìn)行比較。在融合蛋白復(fù)合物不存在下或?qū)2細(xì)胞載入對(duì)照組肽時(shí)，預(yù)期得到低濃度的靶細(xì)胞細(xì)胞毒性。然而，當(dāng)將T2細(xì)胞載入p53(aa264-272)并在融合蛋白或復(fù)合物的存在下與免疫效應(yīng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，T2細(xì)胞的特異性裂解(lysis)為免疫效應(yīng)物細(xì)胞經(jīng)由融合蛋白復(fù)合物再標(biāo)靶p53肽呈遞細(xì)胞的指標(biāo)。利用呈遞p53(aa264-272)/HLA-A2.1復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞系作為靶細(xì)胞進(jìn)行類似研究。實(shí)施例18-活體內(nèi)證實(shí)IL-15變異體激動(dòng)劑、TCR/IL15融合蛋白及融合蛋白復(fù)合物的抗腫瘤功效使用實(shí)驗(yàn)性異體移植腫瘤模型來(lái)測(cè)定融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體激動(dòng)劑是否具有活體內(nèi)抗腫瘤活性。已利用于其他TCR為主的融合蛋白的類似動(dòng)物功效研究(5至7)中使用的表達(dá)p53(aa264-272)/HLA-A2.1復(fù)合物的人類腫瘤細(xì)胞系(例如，A375黑色素瘤、MDA-MB-231乳腺癌、PANC1胰腺癌)。舉例而言，將A375人類黑色素瘤細(xì)胞皮下注射至裸小鼠側(cè)腹，并使腫瘤建立3天。對(duì)荷腫瘤小鼠靜脈每日注射c264scTCR/huIL15+c264scTCR/huIL15RaSushi復(fù)合物或IL-15變異體激動(dòng)劑(劑量范圍-O.1至2mg/kg)、或等劑量體積(dosevolumeequivalent)的PBS，共注射4天或更多天。研究期間，測(cè)量腫瘤尺寸并計(jì)算腫瘤體積。預(yù)期所有經(jīng)PBS處理的小鼠會(huì)發(fā)展出腫瘤。在某些或所有經(jīng)融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體激動(dòng)劑處理的小鼠中，腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用或完全的腫瘤退化(tumorregression)為該處理的抗腫瘤效果的指標(biāo)。其他替代性給藥計(jì)畫(包含多周期給藥(multi-cycledosing))亦可證實(shí)融合蛋白或IL-15變異體激動(dòng)劑的抗腫瘤功效。對(duì)于通過融合蛋白復(fù)合物的c264scTCR-結(jié)構(gòu)域的抗原特異性辨識(shí)作用，可使用缺乏p53(aa264-272)/HLA-A2.1復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞系(例如，HT-29或AsPC-1(5，9))作為對(duì)照組?？墒褂冒ㄆ渌鸗CR結(jié)構(gòu)域的替代性融合蛋白復(fù)合物(亦即，對(duì)CMVpp65(aa495-503)肽具特異性者(9))作為非腫瘤靶向?qū)φ战M。此外，在異體移植荷腫瘤小鼠中進(jìn)行授受性細(xì)胞轉(zhuǎn)移研究。舉例而言，將承載有IL-15受體的免疫細(xì)胞(例如，原初(nai've)或經(jīng)活化(或記憶型)脾細(xì)胞、NK細(xì)胞或T細(xì)45胞)從小鼠中單離，并與c264scTCR/huIL15+c264scTCR7huIL15RaSushi復(fù)合物或激動(dòng)劑IL-15變異體于容許結(jié)合至該細(xì)胞的條件下培養(yǎng)。于某些情形中，將使用融合蛋白復(fù)合物或激動(dòng)劑IL-15變異體來(lái)活化免疫細(xì)胞。接著，將經(jīng)IL-15變異體活化的細(xì)胞或經(jīng)融合蛋白復(fù)合物包覆的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至荷A375腫瘤的裸小鼠。對(duì)照組包含轉(zhuǎn)移未經(jīng)處理的免疫細(xì)胞、單獨(dú)的融合蛋白復(fù)合物、及PBS。監(jiān)測(cè)到腫瘤生長(zhǎng)，且預(yù)期所有經(jīng)PBS處理的小鼠會(huì)發(fā)展出腫瘤。在某些或所有經(jīng)IL-15變異體活化的細(xì)胞或經(jīng)融合蛋白復(fù)合物包覆的細(xì)胞中，腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用或完全的腫瘤退化為該處理的抗腫瘤效果的指標(biāo)?；蛘撸琁L-15變異體或融合蛋白復(fù)合物及免疫細(xì)胞是同時(shí)給予，或同時(shí)或不同時(shí)分開給予。對(duì)于荷腫瘤宿主，免疫細(xì)胞可為自體性(autologous)或異源性(allogeneic)。改變所轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)及給藥計(jì)畫以評(píng)估及最佳化抗腫瘤功效。如上所述，利用其他腫瘤細(xì)胞系或融合蛋白復(fù)合物來(lái)測(cè)定抗原靶向在任何所觀察的抗腫瘤活性中所扮演的角色。實(shí)施例19-以TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白復(fù)合物活體外處理免疫細(xì)胞，隨后進(jìn)行授受性細(xì)胞轉(zhuǎn)移而在異體移植腫瘤動(dòng)物模型中提供增進(jìn)的存活率為證實(shí)預(yù)先與TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白復(fù)合物共同培養(yǎng)的經(jīng)富集化異源小鼠NK細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抗腫瘤功效，使用人類NSCLCA549A2腫瘤細(xì)胞于裸小鼠的實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型中進(jìn)行下列研究。將無(wú)胸腺裸小鼠(每組n=4，雌性，5至6周齡)經(jīng)由側(cè)尾靜脈以5X106個(gè)細(xì)胞/小鼠靜脈內(nèi)(IV)注射人類NSCLC腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549-A2。A549-A2細(xì)胞系代表帶有表達(dá)人類HLA-A2.1cDNA的載體的p53陽(yáng)性A549親本的轉(zhuǎn)染株。收集來(lái)自A2小鼠(B6背景)的脾臟，并使用得自MiltenyiBiotech,Inc.的NK細(xì)胞單離套組依據(jù)制造者的操作指南單離NK細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，通過通過金屬篩網(wǎng)(60網(wǎng)目)于HBSS中均質(zhì)化脾臟而制備脾細(xì)胞的單一細(xì)胞懸浮液。于ACK紅細(xì)胞裂解緩沖液中使紅細(xì)胞裂解。將細(xì)胞與生物素_抗體調(diào)和液(10yL，對(duì)于107細(xì)胞)于4至8C培養(yǎng)10分鐘。測(cè)定白細(xì)胞的數(shù)目，并對(duì)每l(^個(gè)細(xì)胞添加30iiL的緩沖液(PBSpH7.2，0.5%BSA及2mMEDTA)及20iiL的抗生物素微珠(anti-biotinMicroBead)，并將混合物于4至8C培養(yǎng)15分鐘。將細(xì)胞于2mL緩沖液中洗滌并以300xg離心10分鐘。將細(xì)胞再懸浮于500yL緩沖液中，以用于載入MACS管柱。收集流通物(flowthrough)并使用FACScan分析測(cè)定NK細(xì)胞的純度。為了活化細(xì)胞，在c264scTCR/IL15:c264scTCR7IL15Ra融合蛋白復(fù)合物、TCR-IL2融合蛋白或rhlL-2的存在或不存在下，將NK細(xì)胞(5X106)于T25瓶中在補(bǔ)充有10%FBS的10mlRPMI1640于37C培養(yǎng)一整夜。添加濃度為0.8iig/mL的c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra融合蛋白復(fù)合物及TCR-IL2融合蛋白，以及添加濃度為0.2yg/mL的rhlL-2。培養(yǎng)一整夜后，收取細(xì)胞，并將細(xì)胞于100yL的0.5mg/mLc264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra融合蛋白復(fù)合物或TCR-IL2融合蛋白或O.125mg/mLrhlL-2在冰上預(yù)先培養(yǎng)30分鐘。于PBS(lmL)中洗滌后，將細(xì)胞以10Xl(f個(gè)/mL再懸浮于PBS中以供授受性轉(zhuǎn)移。于第1天，經(jīng)由尾靜脈對(duì)小鼠靜脈內(nèi)注射A549A2腫瘤細(xì)胞(5X106)以建立肺腫瘤。腫瘤細(xì)胞注射后第14天，將小鼠隨機(jī)分配成5組(n-4)。于第14及21天，經(jīng)由腹膜內(nèi)注射以200mg/kg的劑量以環(huán)磷醯胺(CTX)處理小鼠。于第16及22天，以經(jīng)不同融合蛋白或rhlL-2預(yù)先培養(yǎng)的NK細(xì)胞(1Xl(f個(gè)/小鼠)進(jìn)行靜脈內(nèi)注射，并將接收PBS的小鼠作為對(duì)照組。處理計(jì)畫總結(jié)如下組別CTXNK細(xì)胞劑量(mg/kg)注射(腹膜內(nèi))劑量(x106)注射(靜脈內(nèi))CTX200第14及2t天0箄16及22天CTX+NK/r亂2200第14及21天1第16及22天CTX+NK/MART-1scTCR-IL2200第14及21天1第16及22天CTX+NK/c264scTCR-IL2200第14及21天1第16及22天CTX+NK/c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra融合蛋白復(fù)合物200第14及21天1第16及22天每天監(jiān)測(cè)荷腫瘤小鼠的存活率。犧牲垂死的小鼠并計(jì)為死亡。腫瘤注射后存活超過100天的小鼠視為已痊愈。在CTX、CTX+NK/rhlL-2、CTX+NK/MARTlscTCR-IL2、CTX+NK/c264scTCR-IL2及c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra融合蛋白復(fù)合物處理組中的小鼠存活中間值分別為52、67.5、64.5、85.5及80天(圖20)。因此，相較于在單獨(dú)經(jīng)化學(xué)療法處理或在經(jīng)非靶向MARTscTCR-IL2或rhlL-2活化的NK細(xì)胞處理的荷腫瘤動(dòng)物中所觀察到的存活時(shí)間中間值，授受性轉(zhuǎn)移經(jīng)c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra活化的NK細(xì)胞得到較長(zhǎng)的存活時(shí)間中間值。此試驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果指出以c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra活化及標(biāo)靶至小鼠NK細(xì)胞可提供增強(qiáng)的抗腫瘤活性。實(shí)施例20-通過延長(zhǎng)的細(xì)胞表面滯留時(shí)間證明TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白復(fù)合物對(duì)承載有IL-15R的免疫細(xì)胞增強(qiáng)的結(jié)合性融合蛋白復(fù)合物在承載有IL-15R的細(xì)胞上的細(xì)胞表面滯留時(shí)間可能影響融合蛋白將效應(yīng)物細(xì)胞標(biāo)靶至及橋聯(lián)TCR特異性腫瘤細(xì)胞的能力。為探討此，通過流式細(xì)胞儀直接比較scTCR/IL-15融合蛋白、TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白復(fù)合物及重組IL-15對(duì)承載有IL-15RapyC受體的CTLL-2細(xì)胞及承載有IL-15RPyC受體的CTLL-2細(xì)胞32DP細(xì)胞的結(jié)合性。與各種蛋白質(zhì)培養(yǎng)后，將細(xì)胞加以洗滌并在培養(yǎng)基中于37t:培養(yǎng)高達(dá)180分鐘，利用經(jīng)PE標(biāo)記的抗IL-15單株抗體檢測(cè)留在細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)濃度。比較初始時(shí)間零染色與后續(xù)的各時(shí)間以測(cè)定各蛋白結(jié)合至IL-15R的細(xì)胞表面滯留時(shí)間。相較于IL-15,scTCR/IL-15融合蛋白或TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白復(fù)合物的細(xì)胞表面滯留時(shí)間增加為受體結(jié)合活性增強(qiáng)且更安定的指標(biāo)。實(shí)施例21-相較于IL-15而言，小鼠中的TCR/IL15融合蛋白及TCR/IL15:TCR/IL15Ra融合蛋白復(fù)合物的活體內(nèi)半衰期增加于HLAA2.1/Kb_基因轉(zhuǎn)殖小鼠品系中評(píng)估c264scTCR/IL-15、c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra復(fù)合物、重組IL-15或可溶性IL-15:IL-15Ra復(fù)合物的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。HLA-A2.1結(jié)構(gòu)域(c264scTCR/IL-2限定)的存在可能影響此融合蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)，而可提供比其他小鼠品系更相關(guān)的〃人類化〃觀點(diǎn)藥物動(dòng)力學(xué)。對(duì)小鼠靜脈內(nèi)注射等摩爾量的c264scTCR/IL-15、c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra復(fù)合物、重組IL-15或可溶性IL-15:IL-15Ra復(fù)合物，在注射后5分鐘至2周的多個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集血液。使用上述ELISA模式評(píng)估融合蛋白的血清濃度。利用標(biāo)準(zhǔn)IL-15特異性ELISA檢測(cè)IL-15的濃度。使用曲線嵌合軟體(例如，WinNonlin)測(cè)定c264scTCR/IL-15、c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra復(fù)合物、重組IL-15或可溶性IL-15:IL-15Ra復(fù)合物的活體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。相較于重組IL-15或可溶性IL-15:IL-15Ra復(fù)合物，c264scTCR/IL_15或c264scTCR/IL15:c264scTCR/IL15Ra復(fù)合物升高的Cmax值、增加的血清半衰期或降低的清除率為下述者的指標(biāo)TCR-IL15融合物或TCR/IL15:TCR/IL-15Ra復(fù)合物的生成將提供相較于單獨(dú)的IL-15所觀察到的藥物動(dòng)力學(xué)而言更有利的藥物動(dòng)力學(xué)。實(shí)施例22-活體內(nèi)證實(shí)IL-15變異體拮抗劑、TCR/IL15融合蛋白及融合蛋白復(fù)合物的免疫抑制效果使用實(shí)驗(yàn)性自體免疫關(guān)節(jié)炎模型來(lái)測(cè)定融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體拮抗劑是否具有活體內(nèi)免疫抑制活性。已證實(shí)在HLA-DR4-基因轉(zhuǎn)殖小鼠中給予第II型膠原蛋白(CII)之后可引發(fā)自體免疫關(guān)節(jié)炎(Rosloniecetal.1998.JImmunol.160:2573-8)。此外，已對(duì)涉及此疾病病理學(xué)的CII特異性T細(xì)胞定性。如先前實(shí)施例所述，使用來(lái)自此等T細(xì)胞的TCR基因來(lái)構(gòu)筑適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體及宿主細(xì)胞系，以生成包括IL-15變異體拮抗劑的CIIscTCR/IL15以及CIIscTCR/IL15RaSushi融合蛋白。通過給予CII而引發(fā)關(guān)節(jié)炎后，對(duì)HLA-DR4-基因轉(zhuǎn)殖小鼠每日靜脈內(nèi)給予CIIscTCR/IL15-拮抗劑+CIIscTCR/IL15RaSushi復(fù)合物或IL-15變異體拮抗劑(劑量范圍-0.1至2mg/kg)，或等劑量體積的PBS，共注射4天或更多天。研究期間，對(duì)小鼠足關(guān)節(jié)的發(fā)炎程度予以評(píng)估及計(jì)分，等級(jí)為0至4。預(yù)期所有經(jīng)PBS處理的小鼠皆發(fā)展出關(guān)節(jié)炎。在某些或所有經(jīng)融合蛋白復(fù)合物或IL-15變異體處理的小鼠中的關(guān)節(jié)炎抑制作用(例如，降低的發(fā)病率或臨床評(píng)分)為該處理的免疫抑制效果的指標(biāo)。其他替代性給藥計(jì)畫(包含多周期給藥)亦可證實(shí)融合蛋白或IL-15變異體的免疫抑制功效?？墒褂冒ㄆ渌鸗CR結(jié)構(gòu)域的替代性融合蛋白復(fù)合物(亦即，對(duì)p53肽具特異性者)作為非疾病靶向?qū)φ战M，以證實(shí)靶向TCR融合蛋白的特異性具有將免疫抑制活性導(dǎo)向疾病位置的能力。參考資料的并入48本申請(qǐng)案全文所引用的所有參考資料、專利、申請(qǐng)中的專利案及已公開專利的內(nèi)容均藉此特地以參考資料的方式并入。等價(jià)物熟習(xí)此技藝者使用不超出例行的實(shí)驗(yàn)將了解或能夠確定此處所述本發(fā)明的特定具體例的許多等價(jià)物。這些等價(jià)物意圖涵括于權(quán)利要求書中。參考資料1.Mortier，E.，A.Quemener，P.Vusio，I.Lorenzen，Y.Boublik，J.Grotzinger，A.Plet，andY.Jacques.2006.Solubleinterleukin-15rec印toralpha(IL-15Ralpha)-sushiasaselectiveandpotentagonistofIL_15actionthroughIL-15Rbeta/gamma.HyperagonistIL_15xIL_15Ralphafusionproteins.JBiolChem281:1612-1619.2.Stoklasek，T.A.，K.S.Schl墜，andLLefrancois.2006.CombinedIL-15/IL_15RalphaimmunotherapymaximizesIL—15activityinvivo.JImmunol177:6072-6080.3.Rubinstein,M.P.，M.Kovar，J.F.Purton，J.H.Cho，0.Boyman，C.D.Surh，andJ.Sprent.2006.ConvertingIL_15toasuperagonistbybindingtosolubleIL-15R{alpha}.ProcNatlAcadSciUSA103:9166-9171.4.Waldma皿，T.A.2006.Thebiologyofinterleukin_2andinterleukin-15:implicationsforcancertherapyandvaccinedesign.NatRevImmunol6:595—601.5.Belmont，H.J.，S.Price—Schiavi，B.Liu，K.F.Card,H.I.Lee，K.P.Han，J.Wen，S.Tang，X.Zhu，J.Merrill,P.A.Chavillaz，J.L.Wong，P.R.Rhode,andH.C.Wong.2006.Potentantitumoractivityofatumor-specificsolubleTCR/IL-2fusionprotein.ClinImmunol121:29-39.6.Card,K.F.，S.A.Price-Schiavi，B.Liu，E.Thomson,E.Nieves，H.Belmont，J.Builes，J.A.Jiao，J.Hernandez,J.Weidanz，LSherman,J.LFrancis,A.Amirkhosravi，andH.C.Wong.2004.Asolublesingle_chainT_cellreceptorIL—2fusionproteinretainsMHC_restrictedpeptidespecificityandIL_2bioactivity.CancerImmunolImm皿other53:345_357.7.Mosquera，L.A.，K.F.Card,S.A.Price-Schiavi，H.J.Belmont,B.Liu，J.Builes，X.Zhu，P.A.Chavaillaz，H.I.Lee，J.A.Jiao，J.LFrancis,A.Amirkhosravi,R.LWong，andH.C.Wong.2005.InVitroandInVivoCharacterizationofaNovelAntibody-LikeSingle-ChainTCRHumanlgGlfusionProtein.JImmunol174:4381-4388.8.Penichet，M.L，E.T.Harvill，andS.LMorrison.1997.Antibody_IL_2fusionproteins:anovelstrategyforimmuneprotection.HumAntibodies8:106—118.9.Zhu，X.，H.J.Belmont，S.Price-Schiavi，B.Liu，H.I.Lee，M.Fer鍾dez，R丄Wong，J.Builes，P.R.Rhode,andH.C.Wong.2006.Visualizationofp53264-272/HLA-A柳201ComplexesNaturallyPresentedonTumorCellSurfacebyaMultimericSolubleSingle—ChainTCellReceptor.JImmunol176:3223—3232.49權(quán)利要求一種可溶性融合蛋白復(fù)合物，包括至少兩種可溶性融合蛋白，其中，第一融合蛋白包括(a)第一生物性活性多肽，所述第一生物性活性多肽共價(jià)連結(jié)至(b)介白素-15(IL-15)多肽或其功能性片段；以及第二融合蛋白包括(c)第二生物性活性多肽，所述第二生物性活性多肽共價(jià)連結(jié)至(d)可溶性介白素-15受體α(IL-15Ra)多肽或其功能性片段；其中第一融合蛋白的IL-15結(jié)構(gòu)域結(jié)合至第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra結(jié)構(gòu)域以形成可溶性融合蛋白復(fù)合物。2.根據(jù)權(quán)利要求l的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述第一與第二生物性活性多肽的一個(gè)包括第一可溶性T-細(xì)胞受體(TCR)或其功能性片段。3.根據(jù)權(quán)利要求2的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述生物性活性多肽的另一個(gè)包括權(quán)利要求2的第一可溶性TCR或其功能性片段，因而創(chuàng)造具有增加的結(jié)合活性的多價(jià)TCR融合蛋白復(fù)合物。4.根據(jù)權(quán)利要求2的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述生物性活性多肽的另一個(gè)包括不同于所述第一可溶性TCR的第二可溶性TCR或其功能性片段。5.根據(jù)權(quán)利要求2至4的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述TCR對(duì)于特定抗原的識(shí)別有特異性。6.根據(jù)權(quán)利要求2至4的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述TCR為包括a與b鏈TCR的異二聚體。7.根據(jù)權(quán)利要求2至4的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述TCR包括單鏈TCR多肽。8.根據(jù)權(quán)利要求7的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述單鏈TC包括TCRV-a鏈，所述TCRV-a鏈通過肽接頭序列共價(jià)連結(jié)至TCRV-b鏈。9.根據(jù)權(quán)利要求8的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述單鏈TCR進(jìn)一步包括共價(jià)連結(jié)至TCRV-b鏈的可溶性TCRCb鏈片段。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述單鏈TCR進(jìn)一步包括共價(jià)連結(jié)至TCRV-a鏈的可溶性TCRCa鏈片段。11.根據(jù)權(quán)利要求l的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述第一與第二生物性活性多肽中的一個(gè)或兩個(gè)包括抗體或其功能性片段。12.根據(jù)權(quán)利要求ll的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述抗體對(duì)于特定抗原的識(shí)別有特異性。13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述抗體為單鏈抗體或單鏈Fv。14.根據(jù)權(quán)利要求13的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述單鏈抗體包括免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)通過多肽接頭序列共價(jià)連結(jié)至免疫球蛋白重鏈可變區(qū)。15.根據(jù)權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述IL-15多肽為包括不同于天然IL-15多肽的氨基酸序列的IL-15變異體。16.根據(jù)權(quán)利要求15的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述IL-15變異體作用為IL-15激動(dòng)劑或拮抗劑。17.根據(jù)權(quán)利要求15的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述IL-15變異體，與所述天然IL-15多肽相比，對(duì)于IL-15RPYC受體具有增加或減少的結(jié)合活性。18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述IL-15變異體的序列，與所述天然IL-15序列相比，具有至少一個(gè)氨基酸改變。19.根據(jù)權(quán)利要求18的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述氨基酸改變?yōu)榕cIL-15RI3和/或YC相互作用的IL-15結(jié)構(gòu)域中的氨基酸取代或刪除。20.根據(jù)權(quán)利要求18的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述氨基酸改變?yōu)槌墒烊祟怚L-15序列(SEQIDN0:1)的位置8、61、65、72、92、101、108或111的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代或刪除。21.根據(jù)權(quán)利要求18的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述氨基酸改變?yōu)樗龀墒烊祟怚L-15序列的位置8的D取代為N或A、位置61的D取代為A、位置65的N取代為A、位置72的N取代為R或位置108的Q取代為A，或所述取代的任何組合。22.根據(jù)權(quán)利要求21的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述氨基酸改變產(chǎn)生IL-15變異體，其具有IL-15拮抗劑活性，或者其與所述天然IL-15多肽相比，對(duì)于IL-15RPYC受體具有減少的結(jié)合活性。23.根據(jù)權(quán)利要求18的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述氨基酸改變?yōu)樗龀墒烊祟怚L-15序列的位置72的N取代為D。24.根據(jù)權(quán)利要求23的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述氨基酸改變產(chǎn)生IL-15變異體，其具有IL-15激動(dòng)劑活性，或者其與所述天然IL-15多肽相比，對(duì)于IL-15RPYC受體具有增加的結(jié)合活性。25.根據(jù)權(quán)利要求1至24的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述第一生物性活性多肽為通過多肽接頭序列共價(jià)連結(jié)至IL-15多肽(或其功能性片段)。26.根據(jù)權(quán)利要求1至25的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述第二生物性活性多肽為通過多肽接頭序列共價(jià)連結(jié)至IL-15Ra多肽(或其功能性片段)。27.根據(jù)權(quán)利要求5的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述TCR結(jié)構(gòu)域的抗原包括呈遞于MHC或HLA分子的肽抗原。28.根據(jù)權(quán)利要求27的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述肽抗原來(lái)自于腫瘤相關(guān)多肽或病毒編碼多肽。29.根據(jù)權(quán)利要求12的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述抗體結(jié)構(gòu)域的抗原包括細(xì)胞表面受體或配體。30.根據(jù)權(quán)利要求12或29的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述抗原包括CD抗原、細(xì)胞因子或趨化因子受體或配體、生長(zhǎng)因子受體或配體、細(xì)胞黏合分子、MHC/MHC樣分子、FC受體、Toll樣受體、NK受體、TCR、BCR、正向/負(fù)向協(xié)同剌激受體或配體、死亡受體或配體、腫瘤相關(guān)抗原或病毒編碼抗原。31.根據(jù)權(quán)利要求1至30與73至74的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述IL-15Ra多肽包括能結(jié)合IL-15多肽的IL-15受體a的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。32.根據(jù)權(quán)利要求1至31與73至74中任一項(xiàng)的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述IL-15Ra多肽包括IL-15asushi結(jié)構(gòu)域或IL-15aAE3結(jié)構(gòu)域。33.—種核酸序列，其編碼權(quán)利要求1至30與73至74中任一項(xiàng)的第一融合蛋白。34.—種核酸序列，其編碼權(quán)利要求1至32與73至74中任一項(xiàng)的第二融合蛋白。35.根據(jù)權(quán)利要求33或34的核酸序列，其中所述核酸序列進(jìn)一步包括可操作性地連結(jié)至所述編碼融合蛋白的序列的啟動(dòng)子、翻譯起始信號(hào)與前導(dǎo)序列。36.—種DNA載體，包括權(quán)利要求33的核酸序列。37.—種DNA載體，包括權(quán)利要求34的核酸序列。38.—種DNA載體，包括權(quán)利要求33與34的核酸序列。39.—種制造權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白復(fù)合物的方法，所述方法包括a)將編碼第一融合蛋白的權(quán)利要求36的DNA載體導(dǎo)入第一宿主細(xì)胞；b)在足以表達(dá)細(xì)胞或培養(yǎng)基中的所述第一融合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第一宿主細(xì)胞；c)由所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化所述第一融合蛋白；d)將編碼第二融合蛋白的權(quán)利要求37的DNA載體導(dǎo)入第二宿主細(xì)胞；e)在足以表達(dá)細(xì)胞或培養(yǎng)基中的所述第二融合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第二宿主細(xì)胞；禾口f)由所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化所述第二融合蛋白；以及g)在足以使所述第一融合蛋白的IL-15結(jié)構(gòu)域與所述第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra結(jié)構(gòu)域之間結(jié)合的條件下，混合所述第一與第二融合蛋白以形成所述可溶性融合蛋白復(fù)合物。40.—種制造權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白復(fù)合物的方法，所述方法包括a)將編碼第一融合蛋白的權(quán)利要求36的DNA載體與編碼第二融合蛋白的權(quán)利要求37的DNA載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；b)在足以表達(dá)細(xì)胞或培養(yǎng)基中的所述融合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，且使所述第一融合蛋白的IL-15結(jié)構(gòu)域與所述第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra結(jié)構(gòu)域之間聯(lián)合，以形成所述可溶性融合蛋白復(fù)合物；以及c)由宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化所述可溶性融合蛋白復(fù)合物。41.一種制造權(quán)利要求1的可溶性融合蛋白復(fù)合物的方法，所述方法包括a)將編碼第一與第二融合蛋白的權(quán)利要求38的DNA載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；b)在足以表達(dá)細(xì)胞或培養(yǎng)基中的所述融合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，且使所述第一融合蛋白的IL-15結(jié)構(gòu)域與所述第二融合蛋白的可溶性IL-15Ra結(jié)構(gòu)域之間聯(lián)合，以形成所述可溶性融合蛋白復(fù)合物；以及c)由宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基純化可溶性融合蛋白復(fù)合物。42.—種殺死靶細(xì)胞的方法，所述方法包括a)使多種細(xì)胞與權(quán)利要求1至32的可溶性融合蛋白復(fù)合物接觸，其中所述多種細(xì)胞進(jìn)一步包括承載有權(quán)利要求1的IL-15結(jié)構(gòu)域所識(shí)別的IL-15R鏈的免疫細(xì)胞，以及承載有權(quán)利要求1的生物性活性多肽中的至少一個(gè)所識(shí)別的抗原的靶細(xì)胞；b)在所述靶細(xì)胞的抗原與所述免疫細(xì)胞的IL-15R鏈之間形成足以結(jié)合與活化所述免疫細(xì)胞的特異性結(jié)合復(fù)合物(橋聯(lián))；以及c)通過所述經(jīng)結(jié)合活化的免疫細(xì)胞殺死所述靶細(xì)胞。43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述靶細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞。44.根據(jù)權(quán)利要求42或43的方法，其中所述生物性活性多肽包括TCR。45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述靶細(xì)胞的抗原包括呈遞于MHC或HLA分子且可為所述TCR所識(shí)別的腫瘤或病毒編碼肽抗原。46.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述免疫細(xì)胞為T-細(xì)胞、LAK細(xì)胞或NK細(xì)胞。47.—種于患者預(yù)防或治療疾病的方法，其中所述疾病細(xì)胞表達(dá)疾病相關(guān)抗原，所述方法包括a)對(duì)患者給予包括有識(shí)別疾病相關(guān)抗原的生物性活性多肽的權(quán)利要求1至32及73至74中任一項(xiàng)的可溶性融合蛋白復(fù)合物；b)在表達(dá)抗原的所述疾病細(xì)胞與表達(dá)IL-15R的免疫細(xì)胞之間形成足以定位所述免疫細(xì)胞的特異性結(jié)合復(fù)合物(橋聯(lián))；以及c)傷害或殺死所述疾病細(xì)胞，足以于所述患者預(yù)防或治療所述疾病。48.—種于患者預(yù)防或治療疾病的方法，其中所述疾病細(xì)胞表達(dá)疾病相關(guān)抗原，所述方法包括a)將承載IL-15R鏈的免疫細(xì)胞與包括識(shí)別疾病相關(guān)抗原的生物性活性多肽的權(quán)利要求1至22與73中任一項(xiàng)的可溶性融合蛋白復(fù)合物混合；b)對(duì)所述患者給予所述免疫細(xì)胞-融合蛋白復(fù)合物的混合物；c)在表達(dá)抗原的所述疾病細(xì)胞與表達(dá)IL-15R的所述免疫細(xì)胞之間形成足以定位所述免疫細(xì)胞的特異性結(jié)合復(fù)合物(橋聯(lián))；以及d)傷害或殺死所述疾病細(xì)胞，足以于所述患者預(yù)防或治療所述疾病。49.根據(jù)權(quán)利要求47或48的方法，其中所述疾病為癌癥或病毒感染。50.根據(jù)權(quán)利要求47或48的方法，其中所述疾病相關(guān)抗原為肽/MHC復(fù)合物。51.—種于哺乳動(dòng)物剌激免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物給予有效量的權(quán)利要求1至32與73至74中任一項(xiàng)的可溶性融合蛋白復(fù)合物。52.—種于哺乳動(dòng)物抑制免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物給予有效量的權(quán)利要求1至32與73至74中任一項(xiàng)的可溶性融合蛋白復(fù)合物。53.根據(jù)權(quán)利要求1至32與73至74中任一項(xiàng)的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述可溶性融合蛋白的至少一個(gè)包括可檢測(cè)標(biāo)記。54.根據(jù)權(quán)利要求53的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記為生物素、鏈霉親和素、酶或其催化性片段、放射性核素、納米粒子、順磁金屬離子或熒光、磷光或化學(xué)發(fā)光分子。55.—種檢測(cè)細(xì)胞或組織的方法，所述細(xì)胞或組織包括呈遞于所述細(xì)胞或組織的抗原，所述方法包括a)使所述細(xì)胞或組織與權(quán)利要求54的至少一種可溶性融合蛋白在使所述抗原與所述可溶性融合蛋白的生物性活性多肽之間形成特異性結(jié)合復(fù)合物的條件下接觸；b)在適合于去除未結(jié)合至所述抗原的可溶性融合蛋白的條件下清洗所述細(xì)胞與組織；以及c)檢測(cè)所述特異性結(jié)合復(fù)合物，作為包括所述抗原的細(xì)胞或組織的指標(biāo)。56.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述生物性活性多肽包括TCR且所述抗原包括呈遞于MHC或HLA分子且為所述TCR所識(shí)別的肽抗原。57.—種IL-15變異體，包括不同于天然IL-15氨基酸序列的氨基酸序列，其中所述IL-15變異體，與所述天然IL-15多肽相比，對(duì)于IL-15RPYC受體具有增加或減少的結(jié)合活性。58.根據(jù)權(quán)利要求57的IL-15變異體復(fù)合物，其中所述IL-15變異體作用為IL-15激動(dòng)劑或拮抗劑。59.根據(jù)權(quán)利要求57的IL-15變異體復(fù)合物，其中所述IL-15變異體的序列，與所述天然IL-2序列相比，具有至少一個(gè)氨基酸改變。60.根據(jù)權(quán)利要求59的IL-15變異體復(fù)合物，其中所述氨基酸改變?yōu)榕cIL-15RP和/或YC相互作用的IL-15結(jié)構(gòu)域的氨基酸取代或刪除。61.根據(jù)權(quán)利要求59的IL-15變異體復(fù)合物，其中所述氨基酸改變?yōu)槌墒烊祟怚L-15序列的位置8、61、65、72、92、101、108或111的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代或刪除。62.根據(jù)權(quán)利要求59的IL-15變異體復(fù)合物，其中所述氨基酸改變?yōu)樗龀墒烊祟怚L-15序列的位置8的D取代為N或A、位置61的D取代為A、位置65的N取代為A、位置72的N取代為R或位置108的Q取代為A，或所述取代的任何組合。63.根據(jù)權(quán)利要求62的IL-15變異體復(fù)合物，其中所述氨基酸改變產(chǎn)生IL-15變異體，其具有IL-15拮抗劑活性，或者其與天然IL-15多肽相比，對(duì)于IL-15RPYC受體具有減少的結(jié)合活性。64.根據(jù)權(quán)利要求59的IL-15變異體復(fù)合物，其中所述氨基酸改變?yōu)樗龀墒烊祟怚L-15序列的位置72的N取代為D。65.根據(jù)權(quán)利要求64的IL-15變異體復(fù)合物，其中所述氨基酸改變產(chǎn)生IL-15變異體，其具有IL-15激動(dòng)劑活性，或者其與天然IL-15多肽相比，對(duì)于IL-15RPYC受體具有增加的結(jié)合活性。66.—種核酸序列，其編碼權(quán)利要求57至65的IL-15變異體。67.—種DNA載體，其包括權(quán)利要求66的核酸序列。68.—種宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求67的載體。69.—種制造權(quán)利要求57的IL-15變異體的方法，所述方法包括b)在足以表達(dá)所述IL-15變異體的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求68的宿主細(xì)胞；從而制造所述IL-15變異體。70.根據(jù)權(quán)利要求70的方法，進(jìn)一步包括純化所述IL-15變異體。71.—種于哺乳動(dòng)物剌激免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物給予有效量的權(quán)利要求57至65的IL-15變異體。72.—種于哺乳動(dòng)物抑制免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物給予有效量的權(quán)利要求57至65的IL-15變異體。73.根據(jù)權(quán)利要求l的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述第一生物性活性多肽包括TCRa多肽或其功能性片段，以及所述第二生物性活性多肽包括TCRI3多肽或其功能性片段。74.根據(jù)權(quán)利要求l的可溶性融合蛋白復(fù)合物，其中所述第一生物性活性多肽包括抗體重鏈多肽或其功能性片段，以及所述第二生物性活性多肽包括抗體輕鏈多肽或其功能性片段。全文摘要本發(fā)明提供具有治療與診斷用途的可溶性融合蛋白復(fù)合物與IL-15變異體，以及制造該等蛋白的方法。本發(fā)明另外提供使用本發(fā)明之融合蛋白復(fù)合物與IL-15變異體刺激或抑制免疫應(yīng)答的方法。文檔編號(hào)C07K14/00GK101743249SQ200880024119公開日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年5月9日優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日發(fā)明者H·C·王,K·韓,P·羅德,X·朱申請(qǐng)人:阿爾托生物科學(xué)有限公司