專利名稱：一種高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種從谷胱廿肽發(fā)酵液中提 取谷胱甘肽的方法，屬于谷胱甘肽制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽是一種具有重要生理活性的三肽，即r-L-谷氨酰-L-半胱 氨酰-甘氨酸(glutathione, GSH)。半胱氨酸上的巰基為其活性基團，但巰基 容易引起兩個分子谷胱甘肽的偶聯(lián)，谷胱廿肽有兩種形式還原型(GSH)和氧 化型(GSSG)，在生理條件下以還原型谷胱甘肽占絕大多數(shù)，谷胱甘肽還原酶 能催化兩型間的互變。谷胱甘肽的相對分子量為307.33，熔點189 193X:，晶 體呈無色透明長柱狀，等電點為2.83。它易溶于水，可溶于稀醇、液氨，不溶 于醇、醚和丙酮。它廣泛分布于動物、植物和油料種子中。它在細胞中的功能 之一就是抵御各種毒素和致癌劑。有研究表明(孫洪剛，等.谷胱甘肽的代謝和 應用.衛(wèi)生職業(yè)教育.2004， 10: 126-127):谷胱甘肽在小腸中能被完全吸收， 并且某些上皮細胞能利用外源谷胱甘肽去毒，這說明膳食中的谷胱甘肽決定著 人體中細胞免受損傷的程度。除作為抗毒劑外，谷胱甘肽還對一些巰基酶有激 活作用，可作為保護酶和其它蛋白巰基的抗氧化劑，在生物氧化、氨基酸轉(zhuǎn)運、 保護血紅蛋白等過程中起一定作用。另外，谷胱甘肽還具有抑制衰老、預防糖 尿病、消除疲勞等作用。谷胱甘肽在強化食品風味的同時對人體有保健作用， 它的應用前景明顯優(yōu)于其它類型的抗氧化劑和防腐劑。最近研究還發(fā)現(xiàn)谷胱甘 肽具有抑制艾滋病的作用。因此，研究谷胱甘肽對人類的健康和生活具有重要 的意義。
酵母的谷胱甘肽粗提液濃度非常低，而且在谷胱甘肽粗提液中常常含有很 多雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、多肽、氨基酸、鹽類等等。因此高純度、高收率的 谷胱甘肽工業(yè)化分離較困難。目前報道的有萃取法、銅鹽法、離子交換法、電
4滲析法、金屬親和層析法、雙水相分離等方法提取分離發(fā)酵液中的谷胱甘肽。
其中萃取法制備GSH所使用的溶劑可以是水、有機酸溶液和稀醇等，但
提取收率低，且造成嚴重的環(huán)境污染。 銅鹽法污染大，影響產(chǎn)品純度。
復旦大學的苑小林等人(苑小林，等.鮮酵母中谷胱甘肽(GSH)分離純化 的初步研究[J].藥物生物技術(shù)，1998， 5 (2): 89 91)將對氨基苯汞乙酸連接 到聚苯乙烯-二乙烯基苯載體上，形成含有機汞的化學親和樹脂，用于吸附GSH， 回收率為83%，但在高濃度鹽作用下，汞容易從樹脂上斷開，影響后續(xù)分離和產(chǎn) 品純度。
在國家專利(申請?zhí)?00610040606. 3)"—種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取谷胱 甘肽的方法"中指出采用谷胱甘肽發(fā)酵液離心得酵母細胞、調(diào)節(jié)pH、沸水破 壁方法，提取細胞中的谷胱甘肽；使用001X7陽離子交換技術(shù)去除小分子物質(zhì)， 最終達到從發(fā)酵液中濃縮純化谷胱甘肽的目的，制得分子量為307.33，蛋白質(zhì) 含量為23%、提取收率為80.5%的白色粉末狀谷胱甘肽成品。但是，離子交換樹 脂不能徹底的去除料液中的雜質(zhì)與色素，尚不能達到結(jié)晶濃度，且在解析過程 利用鹽酸解析，解析液PH很低，欲進行結(jié)晶，必須用堿調(diào)節(jié)pH，在溶液中產(chǎn)生 鹽份，在濃縮結(jié)晶過程形成干擾，不利于結(jié)晶。無法做到藥用98%以上的純度要 求。另外在細胞破壁時溫度控制95 100。C，溫度過高會導致GSH氧化，影響 收率。而且在我國部分地區(qū)由于海拔高，在常壓下無法達到該溫度，不便于生 產(chǎn)操作。
到目前為止，谷胱甘肽的工業(yè)化分離純化存在收率低、污染嚴重、濃縮和 層析過程成本高等問題。如何提高收率、降低成本、減小對環(huán)境污染，是實現(xiàn) 工業(yè)化生產(chǎn)的重點
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高收率、能夠保證產(chǎn)品純度，且能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為
一種高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法包括以下步驟
(1) 發(fā)酵液離心將發(fā)酵液下罐后離心，離心轉(zhuǎn)速為3000 5000rpm，時間 為5 10min，得到濕酵母細胞體；
(2) 熱水破壁將1份濕酵母細胞體加入到6 10份沸水的抽提罐中，進行攪 拌，攪拌轉(zhuǎn)速為300 350rpm，當抽提液溫度達到85 95。C時，保溫10 15分鐘 后，停止抽提，將抽提液倒出，將抽提液水浴冷卻至室溫；
(3) 抽提液離心將抽提液離心，離心轉(zhuǎn)速為3000 5000rpm，時間為5 10min，除去酵母渣，得到含有GSH的抽提液；
(4) 調(diào)節(jié)pH:在離心后的抽提液中加入酸，使料液體系處于pH 2.5 3.5的 酸性環(huán)境中，可沉淀某些雜質(zhì)，并使GSH處于穩(wěn)定狀態(tài)，防止氧化；
(5) 微濾利用O. 1 1Mm孔徑的微濾設(shè)備對調(diào)節(jié)pH后的抽提液進行過濾，以 除去懸浮的小顆粒雜質(zhì)，得到清亮透明的濾液；
(6) 陽離子樹脂分離將微濾后的料液在酸性環(huán)境的陽離子交換樹脂上進行 吸附，使GSH被吸附，然后用含有一價正離子的溶液解析，得到富含GSH的液體；
(7) 吸附樹脂分離將經(jīng)過陽離子交換樹脂分離純化后的富含GSH的液體在 吸附樹脂上再次進行吸附，然后用純水洗脫，得到純度很高的GSH液體；
(8) 減壓濃縮在-O. 07 -0. 098Mpa的真空度與55 65。C溫度下減壓濃縮 GSH溶液，使達到GSH含量在400mg/ml以上；
(9) 結(jié)晶在谷胱甘肽濃縮液中加入異丙醇或乙醇，使有機溶劑含量達到 60% 80%，調(diào)pH值至2.90 3.0，在0 4。C環(huán)境進行結(jié)晶；
卿洗晶用體積百分比濃度為70% 90%的丙酮溶液對結(jié)晶體進行洗滌； (11)真空干燥在-0. 07 -0. 098Mpa的真空度下干燥，得到98%以上純度的GSH。
上述步驟(l)中所述的發(fā)酵液，其發(fā)酵水平至少達到1650mg/L。 上述步驟(4)中，用于調(diào)節(jié)pH的酸選用鹽酸、硫酸或硝酸。 上述步驟(6)中，用于解析的一價正離子溶液選用氫氧化鈉、氯化鈉或鹽酸。 上述步驟(6)中，所述的陽離子樹脂選用磺酸基團陽離子樹脂。 上述步驟(7)中，所述的吸附樹脂選用苯乙烯系弱極性大孔吸附樹脂。 上述步驟(7)得到的GSH液體，先用截留分子量100 200的納濾膜濃縮，以
提高GSH的濃度并去除小分子雜質(zhì)，再進行步驟(8)的減壓濃縮。
本發(fā)明提供的上述高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以
下有益效果-
① 本發(fā)明從谷胱甘肽發(fā)酵液提取、分離和純化GSH，采用85 95。C時，保 溫10 15分鐘抽提，可以最大限度使GSH從酵母細胞體中溶解出來，并避免GSH 在更高溫度下氧化。
② 在抽提液中加入酸調(diào)pH到2. 5 3. 5的酸性環(huán)境，可沉淀抽提液中的部 分雜質(zhì)，在樹脂吸附過程中減少了與谷胱甘肽形成競爭的雜質(zhì)離子，提高了樹 脂對谷胱甘肽的吸附量，減輕分離壓力，并能使GSH處于酸性的穩(wěn)定環(huán)境，防 止GSH氧化。
③ 本法利用陽離子交換樹脂與吸附樹脂結(jié)合的方法分離GSH，離子交換樹 脂上解析后的料液已被除去大部分雜質(zhì)，再用吸附樹脂進行吸附時，吸附樹脂 的吸附能力大大提高，然后用純水洗脫，可直接除去料液中殘留的雜質(zhì)、鹽份 及色素，解析液可直接結(jié)晶，從而達到98%以上的目標純度。
具體實施例方式
實施例1:
取發(fā)酵水平為1650mg/L的發(fā)酵液5L，用轉(zhuǎn)速為3000rpm的離心機離心10min，得到濕酵母細胞1500g，濕酵母細胞中GSH含量為5. 50g/kg。將1500g 濕酵母細胞加入15L沸水中，同時攪拌抽提液，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm;當抽提液 溫度達到9(TC時，保溫10分鐘后，停止抽提；將抽提液流水浴冷卻，降溫至室 溫。再次用轉(zhuǎn)速為3000rpm的離心機離心10min，得到富含GSH的抽提液15L。 在抽提液中加入鹽酸調(diào)抽提液PH值為2. 5的酸性環(huán)境，用0. l陶的微濾除去沉 淀物，收集含有GSH的過濾液。上陽離子交換樹脂(磺酸基團陽離子樹脂)吸 附，然后用0.5mol/L的氯化鈉溶液解析，得到富含GSH的解析液8L，再上吸附 樹脂(苯乙烯系弱極性大孔吸附樹脂)吸附，然后用純水進行洗脫，可得到10L 無色透明無鹽份的高純度的GSH溶液，在-0.07Mpa、 65°C的條件下減壓濃縮到 400mg/ml的濃度，得到濃縮液20ml，往濃縮液中加入30ml乙醇溶液，用硫酸 調(diào)pH2. 90，在01:環(huán)境結(jié)晶，然后將得到的結(jié)晶體用90%的丙酮洗滌，在-0. 098Mpa 的真空干燥設(shè)備中干燥，得到純谷胱甘肽5. 53g，提取收率為67%，得到純度大 于98。％的白色疏松結(jié)晶型粉末。 實施例2:
取發(fā)酵水平為1650mg/L的發(fā)酵液5L，用轉(zhuǎn)速為5000rpm的離心機離心5min， 得到濕酵母細胞1500g，濕酵母細胞中GSH含量為5. 48g/kg。將1500g濕酵母 細胞加入9L沸水中，同時攪拌抽提液，攪拌轉(zhuǎn)速為330rpm。當抽提液溫度達到 85'C時，保溫15分鐘后，停止抽提；將抽提液流水冷卻，降溫至室溫。再次用 轉(zhuǎn)速為5000rpm的離心機離心5min，得到富含GSH的抽提液9L。其余條件依照 實施例1，得到純谷胱甘肽5.46g，提取收率為66.2%，得到純度大于98%的白 色疏松結(jié)晶型粉末。
實施例3:
取發(fā)酵水平為1650mg/L的發(fā)酵液5L，用轉(zhuǎn)速為3500rpm的離心機離心8min， 得到濕酵母細胞1512g，濕酵母細胞中GSH含量為5. 53g/kg。將1500g濕酵母細胞加入10L沸水中，同時攪拌抽提液，攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm。當抽提液溫度達 到95。C時，保溫12分鐘后，停止抽提；將抽提液流水冷卻，降溫至室溫。再次 用轉(zhuǎn)速為4500rpm的離心機離心6min，得到富含GSH的抽提液IOL。其余條件 依照實施例l，得到純谷胱甘肽5.62g，提取收率為67.2%，得到純度大于98% 的白色疏松結(jié)晶型粉末。
實施例4:
依照實施例1得到抽提液后用硫酸調(diào)pH3. 5，然后用lto的微濾膜過濾除去 已沉淀的雜質(zhì)，再依照實施例1的方法，得到純谷胱甘肽5. 35g，提取收率為 64. 9%，得到純度大于98%的白色疏松結(jié)晶型粉末。
實施例5:
依照實施例1得到抽提液后用硝酸調(diào)pH3. 3，然后用0. 8Pm的微濾膜過濾除 去已沉淀的雜質(zhì)，微濾后將濾液上陽離子交換樹脂(磺酸基團陽離子樹脂)吸 附，然后用0. 5mol/L的鹽酸溶液洗脫，得到富含GSH的溶液7. 6L，再上吸附樹 脂(苯乙烯系弱極性大孔吸附樹脂)吸附，然后用純水進行洗脫，可得到10L 無色透明無鹽分的高純度的GSH溶液，在-0.98Mpa、 55°C的條件下減壓濃縮到 400mg/ml的濃度，得到濃縮液20ml，往濃縮液中加入80ml乙醇溶液，用硫酸 調(diào)pH3. 0，在4"C環(huán)境結(jié)晶，然后將得到的結(jié)晶體用70%的丙酮洗滌，在-0. 07Mpa 的真空干燥設(shè)備中干燥，得到純谷胱甘肽5. 66g，提取收率為68. 6%，得到純度 大于98%的白色疏松結(jié)晶型粉末。
實施例6:
依照實施例1方法，將得到的10L無色透明無鹽分的高純度的GSH溶液， 減壓濃縮到400mg/ml的濃度，加入56ml異丙醇溶液，用鹽酸調(diào)pH2. 98，在3 'C環(huán)境結(jié)晶，然后將得到的結(jié)晶體用75%的丙酮洗滌，在-O. 085Mpa的真空干燥 設(shè)備中干燥，得到純谷胱甘肽5. 59g。提取收率為67. 7%，得到純度大于98. 5%的白色疏松結(jié)晶型粉末。
以上六個實施例均用5m3發(fā)酵液放大實驗驗證，在放大實驗中為了節(jié)約成 本，減壓濃縮前先用納濾濃縮，再用減壓濃縮，最終收率均在64%以上，純度均 達到98%以上，可以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
對比實施例l:
取發(fā)酵水平為1650mg/L的發(fā)酵液5L，用轉(zhuǎn)速為2000rpm的離心機離心 10min，得到濕酵母細胞1500g，濕酵母細胞中GSH含量為5.50g/kg。將1500g 濕酵母細胞加入15L沸水中，同時攪拌抽提液，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm;當抽提液 溫度達到98"C時，保溫10分鐘后，停止抽提；其它操作同實施例l，結(jié)果由于 溫度太高等原因而使溶解于水中的部分GSH氧化，僅得到純谷胱甘肽3.81g，提 取收率為46. 2%。
對比實施例2:
將離心得到的1500g濕酵母細胞加入6L沸水中，其它操作同實施例l，結(jié) 果由于溶劑量太小而未能使酵母細胞充分破碎，僅得到純谷胱甘肽3. 43g，提取 收率為41. 5%。
對比實施例3:
破壁離心后不用酸調(diào)節(jié)pH，其它操作同實施例1，結(jié)果得到谷胱甘肽4. 12g， 提取收率為49.9%，純度為91%。 對比實施例4:
微濾時用2.5toi的微濾膜過濾，其余條件依照實施例1，結(jié)果該孔徑的微 濾膜不能完全截留懸浮顆粒，得到的過濾液不清亮，最終得到谷胱甘肽5. 82g， 提取收率為70. 5%，但純度僅為83. 4%
對比實施例5:
陽離子交換樹脂分離后再不用吸附樹脂分離，其他操作同實施例l，結(jié)果濃縮后因雜質(zhì)太多，無法結(jié)晶。 對比實施例6:
依照實施例1方法，將得到的結(jié)晶體用50%的丙酮溶液洗滌，最終得到谷胱 甘肽3.49g，提取收率為42.3%。
權(quán)利要求
1. 一種高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)發(fā)酵液離心將發(fā)酵液下罐后離心，離心轉(zhuǎn)速為3000～5000rpm，時間為5～10min，得到濕酵母細胞體；(2)熱水破壁將1份濕酵母細胞體加入到6～10份沸水的抽提罐中，進行攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為300～350rpm，當抽提液溫度達到85～95℃時，保溫10～15分鐘后，停止抽提，將抽提液倒出，將抽提液水浴冷卻至室溫；(3)抽提液離心將抽提液離心，離心轉(zhuǎn)速為3000～5000rpm，時間為5～10min，除去酵母渣，得到含有GSH的抽提液；(4)調(diào)節(jié)pH在離心后的抽提液中加入酸，使料液體系處于pH2.5～3.5的酸性環(huán)境中，可沉淀某些雜質(zhì)，并使GSH處于穩(wěn)定狀態(tài)，防止氧化；(5)微濾利用0. 1～1μm孔徑的微濾設(shè)備對調(diào)節(jié)pH后的抽提液進行過濾，以除去懸浮的小顆粒雜質(zhì)，得到清亮透明的濾液；(6)陽離子樹脂分離將微濾后的料液在酸性環(huán)境的陽離子交換樹脂上進行吸附，使GSH被吸附，然后用含有一價正離子的溶液解析，得到富含GSH的液體；(7)吸附樹脂分離將經(jīng)過陽離子交換樹脂分離純化后的富含GSH的液體在吸附樹脂上再次進行吸附，然后用純水洗脫，得到純度很高的GSH液體；(8)減壓濃縮在-0.07～-0.098Mpa的真空度與55～65℃溫度下減壓濃縮GSH溶液，使達到GSH含量在400mg/ml以上；(9)結(jié)晶在谷胱甘肽濃縮液中加入異丙醇或乙醇，使有機溶劑含量達到60％～80％，調(diào)pH值至2.90～3.0，在0～4℃環(huán)境進行結(jié)晶；(10)洗晶用體積百分比濃度為70％～90％的丙酮溶液對結(jié)晶體進行洗滌；(11)真空干燥在-0.07～-0.098Mpa的真空度下干燥，得到98％以上純度的GSH。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法 步驟(l)中所述的發(fā)酵液，其發(fā)酵水平至少應達到1650mg/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法 步驟(4)中，用于調(diào)節(jié)pH的酸選用鹽酸、硫酸或硝酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法 步驟(6)中，用于解析的一價正離子溶液選用氫氧化鈉、氯化鈉或鹽酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法 步驟(6)中，所述的陽離子樹脂選用磺酸基團陽離子樹脂。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法 步驟(7)中，所述的吸附樹脂選用苯乙烯系弱極性大孔吸附樹脂。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法步 驟(7)得到的GSH液體，先用截留分子量100 200的納濾膜濃縮，以提高GSH 的濃度并去除小分子雜質(zhì)，再進行步驟(8)的減壓濃縮。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高純度谷胱甘肽的生產(chǎn)方法，它包括以下步驟發(fā)酵液離心得濕酵母細胞體、熱水破壁、抽提液離心、調(diào)節(jié)pH使料液體系處于酸性環(huán)境中、微濾除去懸浮小顆粒雜質(zhì)、陽離子交換樹脂吸附、吸附樹脂吸附、減壓濃縮、結(jié)晶、洗晶和真空干燥，得到純度98％以上的GSH。該方法從谷胱甘肽發(fā)酵液提取、分離和純化GSH，采用了合理的抽提條件，最大限度使GSH從酵母細胞體中溶解出來，并避免在更高溫度下氧化；抽提液在酸性環(huán)境下，可沉淀部分雜質(zhì)，提高樹脂吸附量，并能防止GSH氧化；利用陽離子交換樹脂與吸附樹脂結(jié)合的方法分離GSH，可使解析液直接結(jié)晶，從而達到98％以上的目標純度，收率高，且能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/00GK101429229SQ20081023383
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月14日
發(fā)明者孫永龍, 張會翔, 張偉波 申請人:甘肅正生生物科技有限公司