專利名稱：一種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取分離谷胱甘肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種從谷胱甘肽發(fā)酵液中采 用磁性納米材料提取分離高純度谷胱甘肽的方法，屬于谷胱甘肽制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽是一種具有重要生理活性的三肽，即r-L-谷氨酰-L-半胱 氨酰-甘氨酸(glutathione, GSH)。半胱氨酸上的巰基為其活性基團，但巰基 容易引起兩個分子谷胱甘肽的偶聯(lián)，谷胱甘肽有兩種形式還原型(GSH)和氧 化型(GSSG)，在生理條件下以還原型谷胱甘肽占絕大多數(shù)，谷胱甘肽還原酶 能催化兩型間的互變。谷胱甘肽的相對分子量為307.33，熔點189 193"C，晶 體呈無色透明長柱狀，等電點為2.83。它易溶于水，可溶于稀醇、液氨。不溶 于醇，醚和丙酮。它廣泛分布于動物、植物和油料種子中。它在細胞中的功能 之一就是抵御各種毒素和致癌劑。有研究表明(孫洪剛，等.谷胱甘肽的代謝和 應(yīng)用.衛(wèi)生職業(yè)教育.2004， 10: 126-127):谷胱甘肽在小腸中能被完全吸收， 并且某些上皮細胞能利用外源谷胱甘肽去毒，這說明膳食中的谷胱甘肽決定著 人體中細胞免受損傷的程度。除作為抗毒劑外，谷胱甘肽還對一些巰基酶有激 活作用，可作為保護酶和其它蛋白巰基的抗氧化劑，在生物氧化、氨基酸轉(zhuǎn)運、 保護血紅蛋白等過程中起一定作用。另外，谷胱甘肽還具有抑制衰老、預(yù)防糖 尿病、消除疲勞等作用。谷胱甘肽在強化食品風味的同時對人體有保健作用， 它的應(yīng)用前景明顯優(yōu)于其它類型的抗氧化劑和防腐劑。最近研究還發(fā)現(xiàn)谷胱甘 肽具有抑制艾滋病的作用。因此，研究谷胱甘肽對人類的健康和生活具有重要 的意義。
經(jīng)破壁離心后的酵母谷胱甘肽粗提液濃度很低，而且含有蛋白質(zhì)、多糖、 多肽、氨基酸、色素、鹽類等很多雜質(zhì)，因此高純度、高收率的谷胱甘肽工業(yè) 化分離非常困難。目前報道的提取分離發(fā)酵液中的谷胱甘肽GSH分離方法有萃取法、銅鹽法、離子交換法、電滲析法、金屬親和層析法、雙水相分離等方法。
萃取法制備GSH所使用的溶劑可以是水、有機酸溶液和稀醇等，但提取收率低，
且造成嚴重的環(huán)境污染。銅鹽污染大，影響產(chǎn)品純度。復(fù)旦大學的苑小林等人
(苑小林，等.鮮酵母中谷胱甘肽(GSH)分離純化的初步研究[J].藥物生物技 術(shù)，1998， 5 (2): 89-91)將對氨基苯汞乙酸連接到聚苯乙烯-二乙烯基苯載體 上，形成含有機汞的化學親和樹脂，用于吸附GSH，回收率為83%，但在高濃度 鹽作用下，汞容易從樹脂上斷開，影響后續(xù)分離和產(chǎn)品純度。
在國家專利(申請?zhí)?00610040606. 3)"—種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取谷胱 甘肽的方法"中指出采用谷胱甘肽發(fā)酵液離心得酵母細胞、調(diào)節(jié)pH、沸水破 壁方法，提取細胞中的谷胱甘肽；使用001X7陽離子交換技術(shù)去除小分子物質(zhì)， 最終達到從發(fā)酵液中濃縮純化谷胱甘肽的目的，制得分子量為307.33，蛋白質(zhì) 含量為23%、提取收率為80.5°/。的白色粉末狀谷胱甘肽成品。但是，離子交換樹 脂不能徹底的去除料液中的雜質(zhì)與色素，尚不能達到結(jié)晶濃度，且在解析過程 利用鹽酸解析，在解析液pH很低，欲進行結(jié)晶，必須用堿調(diào)節(jié)pH，在溶液中產(chǎn) 生鹽份，在濃縮結(jié)晶過程形成干擾，不利于結(jié)晶。無法做到藥用98%以上的純度 要求。另外在細胞破壁時溫度控制95-10(TC，溫度過高會導(dǎo)致GSH氧化，影響 收率。而且在我國部分地區(qū)由于海拔高，在常壓下無法達到該溫度，不便于生 產(chǎn)操作。
在國家專利(申請?zhí)?00510002408. 3)"谷胱甘肽分離純化方法"中指出 選擇含有-S-R基團或-S-S-R'基團的分離介質(zhì)，將分離谷胱甘肽的介質(zhì)進行預(yù) 處理后，填裝成層析柱，用pH值1. 0-10. 0的緩沖液平衡層析柱，調(diào)pH值1. 0-10. 0 的谷胱甘肽抽提液上樣，用同樣的緩沖液沖洗后，用堿或酸洗脫，可得到只含 谷胱甘肽的洗脫液。由于介質(zhì)對谷胱甘肽的高度專一選擇吸附，可以有效的將 谷胱甘肽分離出來，實現(xiàn)從谷胱甘肽抽提液中一步分離就高度純化，谷胱甘肽結(jié)晶后可以得到純度為99°/。的產(chǎn)品。但是，該方法因為利用層析理論進行分離，
由于邊緣效應(yīng)的影響，無法進行生產(chǎn)放大。
到目前為止，谷胱甘肽的工業(yè)化分離純化存在收率低、污染嚴重、濃縮和 層析過程成本高等問題。如何提高收率、降低成本、減小對環(huán)境污染，是實現(xiàn) 工業(yè)化生產(chǎn)的重點，本發(fā)明方法具有工藝流程簡單、高效、節(jié)省成本、環(huán)境污染 小等優(yōu)點，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取分離谷胱甘肽 的方法，利用磁性納米材料對谷胱甘肽吸附的高度專一性，并結(jié)合磁性納米材 料容易被分離的特性，制備高品質(zhì)、高含量的谷胱甘肽的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為
一種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取分離谷胱甘肽的方法，其特征在于該方法包 括以下步驟
(1) 發(fā)酵液離心將下罐后的發(fā)酵液離心，離心轉(zhuǎn)速為3000 5000rpm，時間 為5 10min，得到濕酵母細胞菌體；
(2) 熱水抽提以6 10份沸騰去離子水與1份濕酵母細胞菌體的比例，將水 和濕酵母細胞菌體混合加入抽提罐后，在沸水浴中進行抽提，同時攪拌抽提液， 攪拌轉(zhuǎn)速為300 350rpm，當抽提液溫度達到85 95。C時，保溫10min 15min后， 停止抽提，將抽提液倒出，水浴降溫至室溫；
(3) 磁性納米材料吸附GSH:按照抽提液中GSH量計算，在抽提液中加入相當 于GSH 1 2倍質(zhì)量的磁性納米材料，邊加邊攪拌，使之充分均勻，攪拌轉(zhuǎn)速為 100 200rpm，加入磁性納米材料繼續(xù)攪拌20min后，用電磁場沉降吸附有GSH的 磁性納米材料；
(4) 解吸附將吸附了GSH的磁性納米材料在解吸附罐中用O. 1 0.6mol/L的 酸解析，每克磁性納米材料中加入20 30mL的解析液，使GSH從磁性納米材料上脫離，用電磁場沉降磁性納米材料，得到富含GSH的解析液；
(5) 電滲調(diào)解析液的pH值至1 6，對解析液進行電滲處理，收集富含GSH的 溶液；
(6) 減壓濃縮減壓濃縮電滲后的GSH溶液，按照下列條件進行真空度 -0. 07 -0. 098Mpa，旋轉(zhuǎn)速度40rpm,溫度50 60°C ，濃縮至GSH濃度250mg/ ml 以上，得到GSH濃縮液；
(7) 冷凍干燥將谷胱甘肽濃縮液冷凍干燥24 36小時，得到谷胱甘肽成品， 成品性狀為白色粉末。
上述步驟(l)中所述的發(fā)酵液，其發(fā)酵水平至少應(yīng)達到1650mg/L。 上述步驟(3)中所述的磁性納米材料是表面包覆有功能基團亞氨基二乙酸的
納米級&304磁性微粒，可以和谷胱甘肽的巰基發(fā)生專一性吸附，從而有效直接
的吸附谷胱甘肽。
上述步驟(4)中解析所用的酸選用硫酸、鹽酸、醋酸或硝酸。
本發(fā)明提供的上述從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取分離谷胱甘肽的方法，與現(xiàn)有 技術(shù)相比，具有以下有益效果
(1)磁性納米材料對GSH具有高度專一的選擇性吸附，幾乎完全把GSH從 谷胱甘肽抽提液中吸附到磁性納米材料上，避免了為得到高純度GSH而除去抽 提液中其他雜質(zhì)的煩瑣工序，提取收率達到98%以上，降低能耗80 90%，工作 量為原來的十分之一，并為后續(xù)純化提供了良好條件。
(2)加入0. 1 0. 6mol/L的酸進行解析，GSH和少量含-SH的物質(zhì)能夠完全 從磁性納米材料上被解析，調(diào)節(jié)溶液PH值為1 6后電滲處理，得到富含GSH 的溶液。整個過程容易集成控制，避開了層析法帶來的放大效應(yīng)、操作復(fù)雜、 生產(chǎn)周期長、投資大等不利于工業(yè)化的因素。該法操作簡單，縮短工時，減少 人力、物力消耗，節(jié)約能源，環(huán)境污染小，大大提高GSH提取收率及純度。
具體實施方式
實施例1:
取發(fā)酵水平為1650mg/L的發(fā)酵液5L，用轉(zhuǎn)速為3000rpm的離心機離心 10min，得到濕酵母細胞1500g。濕酵母細胞中GSH含量為5. 50g/kg。將1500g 濕酵母細胞加入9L沸水中，同時攪拌抽提液，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm。當抽提液溫 度達到95'C時，保溫15分鐘后，停止抽提。將抽提液流水冷卻，降溫至室溫。 抽提液中加入磁性納米材料8.25g，邊加邊攪拌，使之充分混勻，攪拌轉(zhuǎn)速為 100rpm。磁性納米材料完全加入后繼續(xù)攪拌20分鐘，用電磁場沉降吸附了 GSH 的磁性納米材料。棄去上清液，解析罐中加入O. 1M的鹽酸溶液165ml解析，使 GSH從磁性納米材料上脫離，用電磁場沉降磁性納米材料，得到富含GSH的解析 液。用等量去離子水洗磁性納米材料，洗液與解析液合并為電滲處理液。調(diào)電 滲處理液pH值1.0后，進行電滲處理，收集富含GSH的溶液。減壓濃縮電滲后 的GSH溶液，真空度-0. 098MPa，溫度50。C，得到純的谷胱甘肽濃縮液。將谷胱 甘肽濃縮液冷凍干燥24小時，得到純谷胱甘肽5. 80g。提取收率為70. 3%，得 到純度大于98. 5%的白色疏松粉末。
實施例2:
取發(fā)酵水平為1650mg/L的發(fā)酵液5L，用轉(zhuǎn)速為5000rpm的離心機離心5min， 得到濕酵母細胞1500g。濕酵母細胞中GSH含量為5. 50g/kg。將1500g濕酵母 細胞加入15L沸水中，同時攪拌抽提液，攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm。當抽提液溫度達 到85'C時，保溫10分鐘后，停止抽提。將抽提液流水冷卻，降溫至室溫。抽提 液中加入磁性納米材料16. 5g,邊加邊攪拌，使之充分混勻，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm。 磁性納米材料完全加入后繼續(xù)攪拌20分鐘，用電磁場沉降吸附了 GSH的磁性納 米材料。棄去上清液，解析罐中加入0.6M的硝酸溶液495ml解析，使GSH從磁 性納米材料上脫離，用電磁場沉降磁性納米材料，得到富含GSH的解析液。用 等量去離子水洗磁性納米材料，洗液與解析液合并為電滲處理液。調(diào)電滲處理液pH值6.0后，進行電滲處理，收集富含GSH的溶液。減壓濃縮電滲后的GSH 溶液，真空度-0.08MPa，溫度6(TC，得到純的谷胱甘肽濃縮液。將谷胱甘肽濃 縮液冷凍干燥36小時，得到純谷胱甘肽5. 92g。提取收率為71.8%，得到純度 大于98%的白色疏松粉末。 實施例3:
取發(fā)酵水平為1650mg/L的發(fā)酵液5L，用轉(zhuǎn)速為4500rpm的離心機離心8min， 得到濕酵母細胞1500g。濕酵母細胞中GSH含量為5. 50g/kg。將1500g濕酵母 細胞加入10L沸水中，同時攪拌抽提液，攪拌轉(zhuǎn)速為320rpm。當抽提液溫度達 到9CTC時，保溫13分鐘后，停止抽提。將抽提液流水冷卻，降溫至室溫。抽提 液中加入磁性納米材料10g，邊加邊攪拌，使之充分混勻，攪拌轉(zhuǎn)速為180rpm。 磁性納米材料完全加入后繼續(xù)攪拌20分鐘，用電磁場沉降吸附了 GSH的磁性納 米材料。棄去上清液，解析罐中加入0.3M的硫酸溶液250ml解析，使GSH從磁 性納米材料上脫離，用電磁場沉降磁性納米材料，得到富含GSH的解析液。用 等量去離子水洗磁性納米材料，洗液與解析液合并為電滲處理液。調(diào)電滲處理 液pH值5.0后，進行電滲處理，收集富含GSH的溶液。減壓濃縮電滲后的GSH 溶液，真空度-0.07MPa，溫度55"C，得到純的谷胱甘肽濃縮液。將谷胱甘肽濃 縮液冷凍干燥30小時，得到純谷胱甘肽5. 84g。提取收率為70.8%，得到純度 大于98%的白色疏松粉末。
對比實施例l:
取發(fā)酵水平為1650mg/L的發(fā)酵液5L，用轉(zhuǎn)速為2000rpm的離心機離心3min， 其他條件依照實施例l，結(jié)果由于離心轉(zhuǎn)速太低，時間短，沒能使酵母細胞充分 沉降而導(dǎo)致收率降低，最終僅得到谷胱甘肽4.63g，收率為56.1%。
對比實施例2:
改變抽提液溫度達到82t:，保溫8min，其它操作同實施例1，結(jié)果由于抽提溫度低，保溫時間短，使細胞破壁不徹底，僅得到谷胱甘肽4.81g，提取收率
為58. 3%。
對比實施例3:
依照實施例l得到抽提液后，在抽提液中加入磁性納米材料6g，其它操作同 實施例l，結(jié)果由于加入的磁性納米材料太少，沒能將抽提液中的谷胱甘肽完全 吸附，導(dǎo)致收率降低，僅得到谷胱甘肽4.35g，收率為52.7%。
對比實施例4:
改變解析罐中加入的解析液為0. 06M的硝酸溶液，其它操作同實施例l，結(jié) 果由于解析酸濃度過低，解析不徹底，僅得到谷胱甘肽4. 98g，提取收率為60. 3%， 純度為89. 5%。
對比實施例5:
依照實施例l，待電磁場沉降吸附了GSH的磁性納米材料，棄去上清液，在 解析罐中加入0.1M的鹽酸溶液120ml解析，使GSH從磁性納米材料上脫離，用電 磁場沉降磁性納米材料，得到富含GSH的解析液。用等量去離子水洗磁性納米 材料，洗液與解析液合并為電滲處理液。調(diào)電滲處理液pH值7.0后，進行電滲處 理，其他依照實施例l。結(jié)果由于解析液用量太少(小于20ml/g磁材料)，使得谷 胱甘肽沒有完全被解析下來，以及電滲pH值過高，導(dǎo)致谷胱甘肽收率降低，純 度降低。最終僅得到谷胱甘肽3.86g，純度88.5%，收率46.8%。
對比實施例6:
依照實施例l，電滲后得到富含谷胱甘肽的溶液。減壓濃縮電滲后的谷胱甘 肽溶液，真空度-0.06MPa，溫度70"C，結(jié)果由于真空度過低，濃度過高，再濃 縮過程中谷胱甘肽被氧化，僅得到谷胱甘肽4.36g，純度95.3%的白色疏松粉末， 提取收率為52.8%。
權(quán)利要求
1. 一種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取分離谷胱甘肽的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)發(fā)酵液離心將下罐后的發(fā)酵液離心，離心轉(zhuǎn)速為3000～5000rpm，時間為5～10min，得到濕酵母細胞菌體；(2)熱水抽提以6～10份沸騰去離子水與1份濕酵母細胞菌體的比例，將水和濕酵母細胞菌體混合加入抽提罐后，在沸水浴中進行抽提，同時攪拌抽提液，攪拌轉(zhuǎn)速為300～350rpm，當抽提液溫度達到85～95℃時，保溫10min～15min后，停止抽提，將抽提液倒出，水浴降溫至室溫；(3)磁性納米材料吸附GSH按照抽提液中GSH量計算，在抽提液中加入相當于GSH1～2倍質(zhì)量的磁性納米材料，邊加邊攪拌，使之充分均勻，攪拌轉(zhuǎn)速為100～200rpm，加入磁性納米材料繼續(xù)攪拌20min后，用電磁場沉降吸附有GSH的磁性納米材料；(4)解吸附將吸附了GSH的磁性納米材料在解吸附罐中用0.1～0.6mol/L的酸解析，每克磁性納米材料中加入20～30mL的解析液，使GSH從磁性納米材料上脫離，用電磁場沉降磁性納米材料，得到富含GSH的解析液；(5)電滲調(diào)解析液的pH值至1～6，對解析液進行電滲處理，收集富含GSH的溶液；(6)減壓濃縮減壓濃縮電滲后的GSH溶液，按照下列條件進行真空度-0.07～-0.098Mpa，旋轉(zhuǎn)速度40rpm，溫度50～60℃，濃縮至GSH濃度250mg/ml以上，得到GSH濃縮液；(7)冷凍干燥將谷胱甘肽濃縮液冷凍干燥24～36小時，得到谷胱甘肽成品，成品性狀為白色粉末。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取分離谷胱甘肽的方法， 其特征在于該方法步驟(l)中所述的發(fā)酵液，其發(fā)酵水平至少應(yīng)達到1650mg/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取分離谷胱甘肽的方法， 其特征在于該方法歩驟(3)中所述的磁性納米材料，是表面包覆有功能基團亞氨基二乙酸的納米級FeA磁性微粒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取分離谷胱甘肽的方法， 其特征在于該方法步驟(4)中解析所用的酸，選用硫酸、鹽酸、醋酸或硝酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從谷胱甘肽發(fā)酵液中提取分離谷胱甘肽的方法，它包括以下步驟發(fā)酵液離心、熱水抽提、磁性納米材料吸附GSH、解吸附、電滲、減壓濃縮及冷凍干燥。該方法利用磁性納米材料對谷胱甘肽吸附的高度專一性，并結(jié)合磁性納米材料容易被分離的特性，避免了為得到高純度GSH而除去抽提液中其他雜質(zhì)的煩瑣工序，提取收率達到98％以上，降低能耗80～90％，工作量僅為原來的十分之一，并為后續(xù)純化提供了良好條件。該方法操作簡單，減小成本，環(huán)境污染小，大大提高GSH提取收率及純度。
文檔編號C07K5/037GK101429228SQ20081023383
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月14日
發(fā)明者孫永龍, 曲國臣, 肖澤民 申請人:甘肅正生生物科技有限公司