專利名稱：苊并雜環(huán)類化合物及其在制備BH3類似物類Bcl-2家族蛋白抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新的8-氧-8/f-苊射l,2-b]吡咯-9-腈的氧代、硫代、酮類或酯 類取代衍生物及其在體內(nèi)、體外的模擬BH3-only蛋白，競爭性結(jié)合和拮抗Bcl-2， Bcl-Xt和Mcl-l蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用和作為抗癌化合物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
分子靶向抗腫瘤藥物正在成為繼細(xì)胞毒劑類抗腫瘤藥物之后，新藥研發(fā)的 熱點(diǎn)和市場化的新生代產(chǎn)品。Bcl-2蛋白，是拮抗和逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤永生性的最重 要的分子靶點(diǎn)。所以，特異性拮抗Bcl-2蛋白的藥物，將通過專一誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 凋亡，終于實(shí)現(xiàn)高選擇性、安全、高效、低痛苦抗癌的目標(biāo)。在Bcl-2抑制劑中， 以BH3類似物(BH3mimetics)的抗腫瘤效果最為顯著，藥效學(xué)活性最好，毒 副作用最低。此外，也必須同時具備廣譜拮抗Bcl-2家族蛋白的抗凋亡成員(包 括Bcl-2，Bcl-xL和Mcl-l蛋白)的能力。
但到目前為止，以Bcl-2為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物尚無上市產(chǎn)品，僅有的19個 臨床前Bcl-2抑制劑中，有三個效果最優(yōu)的分別處于臨床I, II, III期。分別是 由美國伊利諾州阿伯特實(shí)驗室研發(fā)的ABT-737， Gemin X公司研發(fā)的 Obatoclax(GX15-070)，和美國Ascenta公司的AT-101 。它們都是BH3類似物， 與Bcl-2蛋白的競爭結(jié)合常數(shù)達(dá)到nM級，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它15個同類分子。但是 它們都存在不足Gossypol， Obatoclax的BH3類似程度不足，不是絕對的BH3 類似物，也就是具有不依賴BAX/BAK的細(xì)胞毒性，說明存在其他的作用靶點(diǎn)， 因此具有毒副作用。Obatoclax正因此面臨淘汰。ABT-737雖然是絕對的BH3類 似物，但是不能與Mcl-l作用，不能廣譜抑制Bcl-2家族蛋白，因而嚴(yán)重限制了 其使用范圍。
本發(fā)明人既往研究的成果中公開了一系列8-氧-8/Z-苊并[l,2-b]吡咯-9-腈的 苊并雜環(huán)類化合物，并指出這類化合物具有有通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤生長 的活性(中國專利，授權(quán)公告號CN1304370C)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在獲得更多具有良好的抑制Bcl-2家族蛋白(包括Bcl-2， Bcl-xL和 Mcl-l蛋白)活性的BH3類似物。
本發(fā)明所述的苊并雜環(huán)類化合物具有如卜的分子結(jié)構(gòu)通式
其中
(I) R^XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基、硫嗎啉基，R2=H， R3=H，R4=CN、
cooh、 coor6或conhr7;
(II) RLH， R2=XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基、硫嗎啉基，R3=H， R4=CN、
cooh、 coor6或conhr7;
(III) R^H， R2=H， 113=四氫吡喃-4-氧基、四氫噻喃-4-氧基、噻吩甲氧基、 噻吩甲氨基、硫嗎啉基，R4=CN;
<formula>formula see original document page 4</formula>
其中X = 0、 S、羰基、酯基、酰胺；
R5= a、 (CH2)nAr - (o,m,; ) Y, Y = CH3 、 N02、 Ph、 F, Cl、 Br、 CF3、
OCH3、 SCH3、 NH2(n=0-4); b、四氫吡喃基、四氫噻喃基； R6 = CH^C2H5; R7 = CH3、 C2Hs或Ar。 本發(fā)明的化合物合成主要分為兩種途徑。
第一種合成途徑是以具有很好的剛性共平面性并且強(qiáng)缺電子的8-氧-8H-苊 并[l,2-b]吡咯-9-腈為原料，與親核試劑醇，硫醇或酚，硫酚類發(fā)生芳香氫親核取 代反應(yīng)，得到3-取代，4取代或6-取代的8-氧-8H-苊并[l,2-b]吡咯-9-腈，腈基再 經(jīng)過水解，酯化，酰胺化得到相應(yīng)的酸，酯，酰胺(分子結(jié)構(gòu)通式1)，反應(yīng)式
如下:<formula>formula see original document page 5</formula>
(通式1)
8-氧-8H-苊射l,2-b]吡咯-9-腈在溶劑(四氫呋喃，乙腈，吡啶，二甲基甲酰 胺或二甲基亞砜)中，與適量的醇，硫醇，酚，硫酚類親核試劑反應(yīng)，溫度為 20 100°C °C，反應(yīng)時間0.5 24小時。冷卻后減壓蒸出部分溶劑后，過濾或直 接柱層析即可得產(chǎn)品3或6-單取代氧基-8-氧代-8H-苊并[l,2-b]吡咯-9-腈。
3或6-單取代氧基-8-氧代-8H-苊射l,2-b]吡咯-9-腈在濃硫酸的條件下水解 可以得到其對應(yīng)的酸類，在與相應(yīng)的醇或者胺反應(yīng)即可得到相應(yīng)的酯類及酰胺 類化合物。
第二種合成途徑是以苊醌為原料，以濃硫酸作溶劑，加入液溴回流2h，得 到溴代苊醌。先用溴代苊醌與醇，硫醇，酚，硫酚反應(yīng)得到相應(yīng)的取代苊醌。 取代苊醌與乙腈在硅膠弱酸性催化的條件下反應(yīng)得到3- (2-氧代-2氫-苊)-丙 二腈之后，在K2C03催化，乙腈回流0.5 6h冷卻后減壓蒸除部分溶劑后，過濾 或直接柱層析即可制得相應(yīng)的3或4-單取代氧基-8-氧代-811-苊射1，2七]吡咯-9-腈。之后的水解，酯化，酰胺化條件同第一條合成路徑。
第二條合成路徑不同于第一條的條件在于先取代，后成環(huán)，這樣可以得到3， 4位兩種同分異構(gòu)體而不是以前的3， 6位。反應(yīng)式見下圖
<formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula>
對通過上述方法獲得的化合物，我們通過多種手段檢測了它們的BH3類似
程度，以及它們對Mcl-l和Bcl-2的抑制作用。結(jié)果表明，本發(fā)明的上述具有新 的結(jié)構(gòu)的化合物具有極高的BH3類似程度，可以有效抑制Md-l和Bel-2蛋白。
基于此，本發(fā)明指出上述苊并雜環(huán)類化合物可用于制備BH3類似物類Bcl-2 家族蛋白抑制劑，并進(jìn)一步用于制備抗腫瘤藥物。所述的Bcl-2家族蛋白抑制劑 或相應(yīng)的抗腫瘤藥物可以是化合物的單質(zhì)制劑或者是有效量的所述苊并雜環(huán)類 化合物與適量的藥用輔劑混合形成的組合物。并可以根據(jù)藥用需要，根據(jù)現(xiàn)有 技術(shù)中的制劑方法將其制成需要的劑型。
本發(fā)明所述的上述苊并雜環(huán)類化合物及其制劑模擬BH3-only蛋白，競爭性 結(jié)合和拮抗Bcl-2,Bcl-XL和Mcl-l蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，實(shí)現(xiàn)其作為抗 癌化合物的應(yīng)用。


本發(fā)明附圖8幅:
附圖1是熒光偏振方法檢測化合物與FAM-Bid肽段競爭結(jié)合Bcl-2蛋白的 動力學(xué)曲線；
附圖2是化合物在細(xì)胞水平上干擾Bcl-2/Bax之間相互作用結(jié)果不圖(不同 濃度)；
附圖3是化合物在細(xì)胞水平上干擾Bcl-2/Bax之間相互作用結(jié)果不圖(不同 作用時間)；
附圖4是Bax蛋白與線粒體共定位檢測化合物的BH3類似度陽性結(jié)果不圖；附圖5是Bax蛋白與線粒體共定位檢測化合物的BH3類似度陰性結(jié)果示圖； 附圖6是化合物依賴BAX/BAK的細(xì)胞毒性實(shí)驗結(jié)果(Gossypol為非特異 性對照)；
附圖7是化合物對Mcl-l抑制作用Western印記檢測電泳圖； 附圖8是化合物對Bcl-2抑制作用Western印記檢測電泳圖。
具體實(shí)施例方式
50毫升乙腈中加入1克8-氧-8H苊并[l，2-b]吡咯-9-腈，0.47克對甲基苯酚， 回流攪拌3小時，蒸出部分溶劑，層析柱分離得產(chǎn)品3-(對甲苯氧基)-8-氧-811-苊并[l,2-b]吡咯-9-腈，收率40%。 M.p. 232-233°C; 1H NMR (400M， CDC13): S 8.916 (dd, J=8.8Hz， 1H), 8.623 (d， J=8.8Hz， 1H)， 8.447 (d， J=6.4Hz, 1H)， 7.859 (t， J=8.0Hz， 1H), 8.324 (d, J=8.4Hz, 2H)， 7.101 (d， J=8.4Hz， 2H)， 7.016 (d， J=8.4Hz， 2H) ，3.256 (s, 3H)。
稱取0.93g苯氧基苊醌，0.3g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅膠柱中， 快速淋洗，過柱完畢之后旋干得紅色固體。稱重10.1g，產(chǎn)率92%。取0.6g 3-苯氧基-(2-氧代-2氫-苊)-丙二腈，加入0.08gK2CO3， 20ml乙腈加熱回流3h， 反應(yīng)完畢之后旋干反應(yīng)液。層析柱分離(CH2C12:石油醚=2: 1)得到橙紅色固 體，核磁檢驗同分異構(gòu)體比例l: 0.3。利用制備液相分離的到兩種同分異構(gòu)體。
實(shí)施例l<formula>formula see original document page 7</formula>
實(shí)施例2<formula>formula see original document page 8</formula>
第一組分A: M.p. 265-267°C; NMR (400M, CDC13): 5 8.927 (d, J=8.0Hz， 1H), 8.630 (d, J=8.8Hz, IH)， 8.450 (d, J=7.2Hz, 1H), 7.876 (t, J=8.0Hz,lH),7.754 (t, J=8.0Hz,2H)， 7.392 (t, J=7.6Hz, IH), 7.233 (d, J=7.6Hz, 2H), 7.028 (d, J=8.4Hz,lH)。
第二組分B: M.p. 282-283 °C; 'H NMR (400M, CDC13): 5 9.047 (dd, J=8.0Hz， IH)， 8.850 (dd, J=7.6Hz， IH)， 8.213 (d, J=8.2Hz, IH), 7.999 (t， J=8.0Hz，lH),7.561 (t J=8.0Hz,2H), 7.410 (t, J=7.0Hz， IH)， 7.251 (d, J=8.8Hz, 2H)， 6.899 (d, J=8.4Hz，lH)。
實(shí)施例3
稱取l.Og對甲苯氧基苊醌，0.3g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅膠柱 中，快速淋洗，過柱完畢之后旋干得紅色固體。稱重lL2g，產(chǎn)率93%。取0.7g 3-苯氧基-(2-氧代-2氫-苊)-丙二腈，加入0.08g K2C03， 20ml乙腈加熱冋流 4h，反應(yīng)完畢之后旋干反應(yīng)液。層析柱分離(CH2C12:石油醚=1: 1)得到橙紅 色固體，核磁檢驗同分異構(gòu)體比例1:0.4。利用制備液相分離的到兩種同分異構(gòu) 體。<formula>formula see original document page 9</formula>
第一組分A: M.p. 232-233°C; ^NMR (400M, CDC13): S 8.916 (dd, J=8.8Hz， IH), 8.623 (d, J二8.8Hz, IH)， 8.447 (d， J=6.4Hz， IH), 7.859 (t, J=8.0Hz， IH)， 8.324 (d, J=8.4Hz， 2H), 7.101 (d, J=8.4Hz， 2H)， 7.016 (d， J=8.4Hz， IH)， 2.351(s, 3H)。
第二組分B: M.p. 258-260°C; 'H NMR (400M, CDC13): S 8.987 (dd， J=8.8Hz， IH), 8.858 (d， J=8.8Hz, IH), 8.208 (d, J=8.4Hz, IH), 7.986 (t, J=8.0Hz, IH), 8.333 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.112 (d， J=8.4Hz, 2H), 6.889 (d, J=8.4Hz, IH)， 2.349(s, 3H)。
實(shí)施例4稱取1.0g間甲苯巰基苊醌，0.3g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅膠柱
中，快速淋洗，過柱完畢之后旋干得紅色固體。稱重12.2g，產(chǎn)率91%。取0.7g 2-苯巰基-(2-氧代-2氫-苊)-丙二腈，加入0.08gK2CO3， 20ml乙腈加熱回流 4h，反應(yīng)完畢之后旋干反應(yīng)液。層析柱分離(CH2C12:石油醚=1: 1)得到紅色 固體，核磁檢驗同分異構(gòu)體比例1: 0.25。利用制備液相分離的到兩種同分異構(gòu) 體。
第一組分A: M.p. 255-257。C; NMR (400M, CDC13): 5 8.826 (dd，片8.8Hz， 1H), 8.513 (d, J=8.8Hz, 1H), 8.327 (d， J=6.4Hz, 1H), 7.659 (t， J=8.0Hz, 1H)， 8.014 (d, J=8.4Hz， 2H), 6.901 (d， J=8.4Hz, 2H), 6.896 (d, J=8.4Hz, lH),2.353(s, 3H)。
第二組分B: M.p. 269-271 。C; 麗R (400M, CDC13): 5 8.877 (dd， J=8.8Hz， 1H), 8.748 (d, J=8,8Hz, 1H), 8.108 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.856 (t， J=8.0Hz， 1H), 8.123 (d, J=8.4Hz， 2H), 6.892 (d, J=8.4Hz, 2H)， 6.679 (d, J=8.4Hz， lH),2.355(s, 3H)。
實(shí)施例5
<formula>formula see original document page 10</formula>
50毫升乙腈中加入1克8-氧-肌苊射l,2-b]吡咯-9-腈，0.5克對甲基苯酚， 回流攪拌6小時，蒸發(fā)部分溶劑，層析柱分離得產(chǎn)品6-(2-噻吩甲氧基)-8-氧-8界 苊并[l，2-b]吡咯-9-腈，收率45。/。。M.p. 241-243°C; ^NMR(400M, CDC13): 5 8.685 (dd, J=8.7Hz， 1H), 8.433 (d， J=8.7Hz， 1H)， 8.014 (d， J=6.4Hz， 1H), 7.75 (t， J=8.0Hz, 1H)， 7.251 (s, J=8.4Hz， 2H), 6.985 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.232 (d, J=8.4Hz， 2H)。
實(shí)施例6
稱取l.Og間氟苯羰基苊醌，0.4g丙二腈用二氯甲垸溶解之后，加入硅膠柱 中，快速淋洗，過柱完畢之后旋干得深紅色固體。稱重10.5g，產(chǎn)率85%。取0.8g2-氟羰基-(2-氧代-2氫-苊)-丙二腈，加入0.08g K2C03， 20ml乙腈加熱回流 3h，反應(yīng)完畢之后旋干反應(yīng)液。層析柱分離(CH2C12:石油醚=2: 1)得到深紅 色固體，核磁檢驗同分異構(gòu)體比例1: 0.2。利用制備液相分離得到兩種同分異 構(gòu)體。<formula>formula see original document page 11</formula>第一組分A: M.p. 285-287°C; 'H NMR (400M, CDC13): 5 8.726 (dd, J=8.8Hz， 1H), 8.423 (d, J=8.8Hz, 1H), 8.015 (d, J=6.4Hz， IH)， 7.598 (t, J=8.0Hz, 1H), 8.003 (d， J=8.4Hz, 2H), 6.853 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.756 (d, J=8.4Hz, IH)。
第二組分B: M.p. 269-271 °C; NMR (400M, CDC13): S 8.568 (dd, J=8.8Hz， IH)， 8.478 (d, J=8.8Hz, 1H), 8.006 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.568 (t, J=8.0Hz, 1H), 8.045 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.908(d, J=8.4Hz, 2H), 6.596 (d, J=8.4Hz, IH)。
實(shí)施例7
稱取1.0g苯基酰胺苊醌，0.4g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅膠柱中， 快速淋洗，過柱完畢之后旋干得深紅色固體。稱重11.2g，產(chǎn)率86%。取0.8g苯 酰胺-(2-氧代-2氫-苊)-丙二腈，加入0.08gK2CO3， 20ml乙腈加熱回流3h， 反應(yīng)完畢之后旋干反應(yīng)液。層析柱分離(CH2C12:石油醚=2: 1)得到深紅色固 體，核磁檢驗同分異構(gòu)體比例l: 0.4。利用制備液相分離得兩種同分異構(gòu)體。<formula>formula see original document page 12</formula>第一組分A: M.p. 281-283 °C; !HNMR (400M, CDC13): S 9.112 (d, J=8.0Hz， IH)， 8.945 (d， J=8.8Hz， IH)， 8.682 (d, J=7.2Hz， IH)， 8.452 (t， J=8.0Hz,lH), 8.312 (s, 1H)，7.986 (t, J=8.0Hz，2H)， 7.627 (t, J=7.6Hz， IH)， 7.433 (d， J=7.6Hz, 2H), 7.241 (d, J=8.4Hz,lH)。
第二組分B: M.p. 293-294°C; ^NMR (400M, CDC13): S 9.213 (dd, J=8.0Hz， 1H), 9.012 (dd, J=7.6Hz, 1H), 8.685 (d， J=8.2Hz, IH)， 8.428 (t, J=8.0Hz,lH), 8.320 (s， 1H)，7.896 (t， J=8.0Hz，2H), 7.675 (t， J=7.0Hz, 1H), 7.531 (d, J=8.8Hz, 2H), 7.015 (d, J=8.4Hz，lH)。
實(shí)施例8
稱取1.0g 4-四氫吡喃氧基苊醌，0.4g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅 膠柱中，快速淋洗，過柱完畢之后旋干得深紅色固體。稱重lL2g，產(chǎn)率86%。 取0.8§4-四氫吡喃-(2-氧代-2氫-苊)-丙二腈，加入0.08gK2CO3， 20ml乙腈 加熱回流9h，反應(yīng)完畢之后旋干反應(yīng)液。層析柱分離(CH2C12:石油醚=2: 1) 得到深紅色固體，核磁檢驗同分異構(gòu)體比例1: 0.4。利用制備液相分離的到兩種同分異構(gòu)體。
<formula>formula see original document page 13</formula>
第一組分A: M.p. 230-231°C ; ^ NMR (400M, CDC13): S 8.601 (d, J=8.0Hz， 2H), 8.134 (d, J=8.8Hz， 1H), 7.945 (dd, J=8.0Hz， 1H), 7.452 (d, J=8.4Hz,lH), 3.822 (t， J=4,8Hz ，4H),3.815(t， J=5.0Hz ,4H),3.766 (t, J=5.2Hz,lH)。
第二組分B: M.p. 242-244°C; 畫R (400M, CDC13): S 8.568 (d, J=8.0Hz， 2H), 8.115 (d， J=8.8Hz, IH)， 7.856 (dd, J=8.0Hz， IH)， 7.326 (d, J=8.4Hz，lH)， 3.796 (t, J=4.8Hz ，4H),3.807(t, J=5.0Hz ,4H)，3.791 (t, J=5.2Hz,lH)。
實(shí)施例9
<formula>formula see original document page 13</formula>
在50ml單口燒瓶中,加入60ml濃硫酸或者25ml發(fā)煙硫酸，在0 5t下，分批加入0.05mo1的3-苯氧基-8-氧-8/f-苊并[l,2-b]吡咯-9-腈，lh內(nèi)加完,加完后在室溫 繼續(xù)反應(yīng)16h,反應(yīng)混合物為粘稠的深棕紅色。然后小心緩慢的將其滴入碎冰中, 同時劇烈攪拌,滴完后靜置，濾餅用大量水洗滌,直至濾餅呈中性,濾餅干燥后得深 黃色產(chǎn)品。產(chǎn)率96%。 M.p. 248°C; 'HNMR (400M, CDC13): S 11.42 (s，lH),8.965 (dd, J=8.0Hz， 1H), 8.750 (dd, J=7.8Hz, 1H), 8.313 (d， J=8.2Hz, 1H), 7.999 (t, J=8.2Hz,lH),7.561 (t， J=8.2Hz,2H), 7.410 (t, J=7.0Hz， 1H)， 7.251 (d, J=8.8Hz, 2H), 6.963 (d, J=8.4Hz,lH)。
實(shí)施例10
<formula>formula see original document page 14</formula>
在100ml單口燒瓶中，依次加入O.Olmol 3-苯氧基-8-氧-8//-苊并[1,2-b]吡咯 -9-腈，50ml乙腈做溶劑，0.02mmol的碳酸鉀做縛酸計，過量10倍的碘甲烷,氮?dú)?保護(hù)下，加熱至4(TC反應(yīng)15h。減壓蒸去乙腈，加入二氯甲烷使反應(yīng)物充分溶 解，過濾之后旋干濾液，得黃棕色粗產(chǎn)品。硅膠柱層析分離，展開劑二氯甲 烷—甲醇(40: 1)，得深黃色產(chǎn)品。產(chǎn)率92。/。。M.p. 213°C; ^NMR(400M， CDC13): 5 9.102 (d， J=7.2Hz，lH), 8.965 (dd, J-8.0Hz， 1H), 8.850 (dd, J-7.8Hz， 1H), 8.233 (d, J=8.2Hz, 1H), 7.856(t， J=8.2Hz,lH),7.453 (t， J=8.2Hz,2H)， 7.350 (t, J=7.2Hz， 1H): 7.325 (d, J=8.4Hz， 2H)， 6.785 (d, J=8.4Hz，lH), 3.213 (s， 3H)。實(shí)施例11
在100ml單口燒瓶中,依次加入O.Olmol 3-甲氧基-8-8-11-苊并[1,2-13]吡咯-9-酸，50ml DMF做溶劑，0.02mmol的三乙胺,0.01mmo1的(EtO)2P(K))CN,過量10 倍的叔丁胺，常溫反應(yīng)lh。反應(yīng)完畢得到黃色固體，產(chǎn)率85%。 M.p. 237°C; & NMR (400M, CDC13): S8.746 (dd， J=8.0Hz， 1H), 8.650 (dd, J=7.8Hz, 1H)， 8.213 (d， J=8.2Hz, 1H), 7.846 (t, J=8.0Hz,lH)，7.352 (t, J=8.0Hz,2H), 7.210 (t， J=7.4Hz, IH), 7.051 (d, J=8.4Hz， 2H), 6.963 (d, J=8.4Hz,lH)， 3.721(s, 3H)， 3.113 (m, 2H)， 1.568(dd, J=5.6Hz ，2H), 1.421(m, J=5.7Hz ,2H), 0.968(t, J=6.2Hz ,3H)。
實(shí)施例12
通過熒光偏振分析法檢測化合物的BH3類似程度
合成一個帶有21個氨基酸的Bid BH3肽段(氨基酸79-99: QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)，并在N端標(biāo)記上6-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯 (FAM)作為熒光標(biāo)簽(FAM-Bid)。競爭結(jié)合實(shí)驗中所用的反應(yīng)體系為 GST-Bcl-2蛋白(40nM)或Mcl-1蛋白，和FAM-Bid多肽(5nM)溶于反應(yīng)緩 沖液中(100mMK3PO4,pH7.5; lOOpg/ml牛y白蛋白；0.02%疊氮化鈉)。在 96孔板中，每孔加入IOO^iL反應(yīng)體系，然后加入lpL不同濃度的溶于DMSO 的待檢測化合物(3-硫嗎啉8-氧-8/Z-苊并[l,2-b]吡咯-9-腈)母液至實(shí)驗設(shè)計所需 終濃度。同時設(shè)立兩個對照組， 一個對照組為反應(yīng)體系中只含有Bcl-2或Mcl-1 和FAM-Bid(相當(dāng)于0%抑制率)，另一對照組中的反應(yīng)體系只含有FAM-Bid肽 段。96孔板經(jīng)過4個小時的避光孵育后，進(jìn)行酶標(biāo)儀上檢測。熒光極化值(mP) 在由530nm波長激發(fā)產(chǎn)生的4S5nm發(fā)射波長下測量。Ki值根計算公式推導(dǎo)得 出。試驗結(jié)果如附圖l所示。該化合物與Bcl-2蛋白的競爭結(jié)合常數(shù)為310nM。
按照上述相同的試驗方法檢測其他6個化合物(如下結(jié)構(gòu)式所示)的BH3 類似程度，它們與Bcl-2和Md-1蛋白的結(jié)合常數(shù)在也是nM級，分別為600nM,890nM, 560nM, 790nM, 510nM， 710nM。
實(shí)施例13
活細(xì)胞內(nèi)熒光偏振能量轉(zhuǎn)移(FRET)檢測化合物的BH3類似性
利用磷酸鈣共沉淀的方法將2嗎Bcl-2-CFP和Bax-YFP質(zhì)粒分別或同時轉(zhuǎn)染 至Hda細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24小時后，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板(2405個/孔)，加 入溶于DMSO的待檢測化合物(3-硫嗎啉8-氧-8/f-苊并[l,2-b]吡咯-9-腈)至終 濃度(2， 5， 10和15pM)，藥物作用24小時后(如附圖2a)， PBS清洗細(xì)胞3 次，用GENIOS熒光酶標(biāo)儀(TECAN, Swiss)檢測熒光值。在時間依賴的實(shí)驗 中，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于6孔板后，加入40]aM化合物，藥物作用3、 6和24 小時(附圖2b)，讀板檢測熒光。在只轉(zhuǎn)染Bcl-2-CFP質(zhì)粒的細(xì)胞組中記錄475nm 發(fā)射波長值，激發(fā)波長為433nm。在只轉(zhuǎn)染Bax-YFP質(zhì)粒的細(xì)胞組中記錄527nm 發(fā)射波長值，激發(fā)波長為505nm。對共轉(zhuǎn)染Bcl-2-CFP和Bax-YFP質(zhì)粒的細(xì)胞 實(shí)驗組記錄527nm和475nm發(fā)射波長值，激發(fā)波長為433nm。 527nm發(fā)射熒光 與475nm發(fā)射熒光相比值即為FRET，將單獨(dú)轉(zhuǎn)染對照組的FRET值設(shè)為1.0，表示兩蛋白未發(fā)生熒光偏振能量轉(zhuǎn)移。在共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，由于Bcl-2蛋白和 Bax蛋白的相互作用使得FRET值增加至2.0，而隨著加藥濃度和時間的增加， 對兩蛋白相互作用的干擾增強(qiáng)，F(xiàn)RET隨之減弱。細(xì)胞活力由MTT法進(jìn)行測定。 試驗結(jié)果如附圖2和附圖3所示，該化合物在2pM，作用3h即可干擾Bcl-2/Bax 之間的相互作用，呈濃度時間依賴趨勢。
按照上述相同的試驗方法檢測其他7個化合物(如下結(jié)構(gòu)式所示)，試驗 證明這些化合物均具有細(xì)胞內(nèi)模擬BH3-only蛋白的作用。
<formula>formula see original document page 17</formula>
實(shí)施例"
通過Bax蛋白與線粒體共定位檢測化合物的BH3類似度
利用磷酸鈣共沉淀方法將5|igBax-YFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 小時后，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板(0.2><106個/孔)，加入10pM待檢測化合物 (3-硫嗎啉8-氧-8樂苊并[l，2-b]吡咯-9-腈)，作用6小時后，PBS清洗并同50nMMito Tracker Red CMXRos (線粒體特異探針；紅色)避光孵育lOmin， PBS清 洗三次后，Radiance2000激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad， USA)掃描熒光圖像。 同時進(jìn)行雙通道掃描， 一個通道掃描Bax-YFP的綠色熒光，另一通道掃描指示 線粒體的CMXRos探針紅色熒光，兩通道圖像相互疊加顯示共定位情況。當(dāng)Bax 蛋白定位于線粒體上，綠色熒光與紅色熒光疊加成橘色，如附圖4所示；對照 附圖5顯示不能驅(qū)動BAX向線粒體移位，共定位失敗的試驗結(jié)果。
按照上述相同的試驗方法檢測其他5個化合物(如下結(jié)構(gòu)式所示)，結(jié)果 顯示他們均具有驅(qū)動BAX向線粒體移位的作用，說明具有細(xì)胞內(nèi)模擬BH3-only 蛋白的作用。
<formula>formula see original document page 18</formula>
實(shí)施例15
化合物依賴BAX/BAK的細(xì)胞毒性實(shí)驗驗證其BH3類似物的特性
磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染3pg BAX/BAK干擾質(zhì)粒至MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24小時 后，收集細(xì)胞，Western檢測RNA干擾后BAX和BAK蛋白表達(dá)情況，相同處 理無質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組設(shè)為對照組。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板中(1><105個/孔)，平行進(jìn)行未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞組的對照實(shí)驗，按實(shí)驗設(shè)計濃度梯度加入待檢
測化合物(3-硫嗎啉8-氧-8if-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈)，作用48小時后，MTT檢 測細(xì)胞活力，結(jié)果如附圖6所示，Gossypol作為非特異性BH3類似物與本發(fā)明 的化合物對比平行處理，可見3-硫嗎啉8-氧-8/Z-苊并[l,2-b]吡咯-9-腈具有絕對 依賴BAX/BAK的細(xì)胞毒性。
按照上述相同的試驗方法檢測其他6個化合物(如下結(jié)構(gòu)式所示)，結(jié)果 顯示下述化合物具有絕對依賴BAX/BAK的作用特點(diǎn)。
實(shí)施例16
Western印記檢測化合物對Mcl-l和Bcl-2的抑制作用 收集細(xì)胞樣品后，以lxl06/50pl細(xì)胞裂解液(62.5mM Tris-HCL pH 6.8; 2%SDS; 10%甘；50mMDTT; 0.01%溴酚藍(lán))低溫裂解，離心，取蛋白卜.清， IO(TC煮沸樣品5分鐘，12% SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜，相應(yīng)抗體檢測目的蛋白， 辣根過氧化酶標(biāo)記二抗并結(jié)合ECL顯色法檢測目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量。附圖7和附圖8分別顯示待檢測化合物G-硫嗎啉8-氧-8iZ-苊并[l,2-b]吡咯-9-腈) 對Mcl-l和Bcl-2的抑制作用。
經(jīng)同樣方法對檢測6個化合物(如下結(jié)構(gòu)式所示)，它們均具有抑制Mcl-2 蛋白的作用。
<formula>formula see original document page 20</formula>
權(quán)利要求
1、一類苊并雜環(huán)類化合物，其分子結(jié)構(gòu)通式為其中(I)R1＝XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基、硫嗎啉基，R2＝H，R3＝H，R4＝CN、COOH、COOR6或CONHR7；(II)R1＝H，R2＝XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基、硫嗎啉基，R3＝H，R4＝CN、COOH、COOR6或CONHR7；(III)R1＝H，R2＝H，R3＝四氫吡喃-4-氧基、四氫噻喃-4-氧基、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基、硫嗎啉基，R4＝CN；其中X＝O、S、羰基、酯基、酰胺；R5＝a、(CH2)nAr-(o，m，p)Y，Y＝CH3、NO2、Ph、F，Cl、Br、CF3、OCH3、SCH3、NH2(n＝0-4)；b、四氫吡喃基、四氫噻喃基；R6＝CH3或C2H5；R7＝CH3、C2H5或Ar。
2、權(quán)利要求1所述的苊并雜環(huán)類化合物在制備BH3類似物類Bcl-2家族蛋 白抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及苊并雜環(huán)類化合物及其在制備BH3類似物類Bcl-2家族蛋白抑制劑中的應(yīng)用，該化合物是在8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的3，4，6位引入各種氧代物和硫代物，羰基化合物，酯基化合物以及酰基化合物，或進(jìn)一步將9-腈取代為酸，酯酰，胺基所得到的化合物。本發(fā)明所述的上述苊并雜環(huán)類化合物模擬BH3-only蛋白，在體外和細(xì)胞內(nèi)競爭性結(jié)合和拮抗Bcl-2，Bcl-x_L和Mcl-1蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，可用于制備抗癌化合物。
文檔編號C07D209/70GK101423491SQ20081022874
公開日2009年5月6日 申請日期2008年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日
發(fā)明者吳桂葉, 婷 宋, 張志超 申請人:大連理工大學(xué)