專利名稱：一種從綠茶中提取高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從綠茶中提取表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的方法，
特別是涉及一種從綠茶中提取純化出髙純度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方 法。該方法可以應用于工業(yè)化提取高純度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯。
(二)
背景技術：
茶是中國的傳統(tǒng)飲品之一，具有抗癌、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗老年 癡呆、調節(jié)免疫功能等多種功能，其主要活性成分為茶多酚中兒茶素類物質。 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是兒茶素組分中含量最高，活性最強的一 種組分，占茶多酚制品的50% 60%，它是2-連苯酚基苯并吡喃與沒食子酸形成 的酯，具有酚類抗氧化劑的通用性，同時因其結構中有6個鄰位酚羥基而有優(yōu) 于其他兒茶素的許多性質，因此對它的生物活性和生理作用進行了廣泛研究。 中美等許多國家將EGCG列為一種潛在的抗癌新藥，研究了它對某些促癌劑、 癌細胞的增殖、某些與腫瘤有關的酶的活性的抑制作用，對誘導癌細胞的凋亡 和提高某些細胞的細胞毒增敏和對干預癌細胞信號轉導通路等作用。許多研究 已經(jīng)揭示了茶多酚的抗腫瘤、抗衰老等多種生物活性均與其抗氧化性有關，茶 多酚的抗氧化作用占有非常重要的地位。通過研究電子自旋共振和化學發(fā)光技 術，研究人員發(fā)現(xiàn)兒茶素4種單體中以(-)-EGCG對超氧自由基的清除能力最強。 在兒茶素抑制膽固醇及低濃度脂肪蛋白氧化的作用中，兒茶素抗銅促氧化能力 順序為表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)=表兒茶素沒食子酸酯(ECG)〉 表兒茶素(EC) >兒茶素(C) >表沒食子兒茶素(EGC)。在對茶葉中的單體誘
導代謝解毒酶活性的能力的研究時，發(fā)現(xiàn)EGCG對體外培養(yǎng)的HipG2肝腫瘤細 胞中NAD(P)H-醌還原酶(QR)作用有顯著性。用氣相色譜法研究兒茶素消除三甲 胺、硫化氫、吲哚氣味的機制，實驗表明，在兒茶素各個單體中，EGCG消臭 能力最強。通過研究EGCG對紫外線輻射氧化損傷的保護機制，發(fā)現(xiàn)EGCG能 減少中波紫外線(UVB)輻射引起的丙二醛沉積，增加抗氧化酶的活性；并且可能 抑制由UVB誘導的MMPlmRNA表達，減少膠原蛋白的降解。從而對UVB輻 射損傷的體外培養(yǎng)的纖維細胞起到保護作用。通過觀察幾種茶多酚對大腸桿菌、 蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、枯草桿菌、沙門氏菌及多種霉菌 和酵母菌的抑菌情況，發(fā)現(xiàn)多金農(nóng)脫咖啡因兒茶素比金農(nóng)大葉兒茶素和金農(nóng)小 葉和兒茶素的抑菌效果強，而前者中EGCG的量恰恰比后兩者高。在對口腔細 菌Porphyromonal gingivalis生長的抑制作用中，兒茶素各單體作用能力為表沒食 子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)〉表兒茶素沒食子酸酯(ECG)〉表兒茶素(EC )。 由于EGCG具有很多保健功能，因此對它的提取方法研究引起人們的關注， 因此一些提取EGCG單體的方法已被報道。(1 )髙效液相色譜(HPLC )分離與 膜蒸餾濃縮相結合，該方法用HPLC制備柱分離，截取富含EGCG餾分，然后 用膜蒸餾濃縮，最后真空干燥得到產(chǎn)品(CN 1370776A)。 (2)配制合適流動相、 固定相的溶劑體系，使用高速逆流色譜分離可以獲得高純度的兒茶素單體， EGCG純度大于98。/q (CN 1277068)。 (3)釆用重結晶法(鹽析法)與葡聚糖凝 膠LH-20柱層析法相結合，先將茶葉提取物多次重結晶(或氯化鈉鹽析)，然后 晶體溶解后過葡聚糖凝膠LH-20,收集EGCG餾分，減壓蒸餾、冷凍干燥得到 產(chǎn)品(CN1465572A、 CN 1407510A)。 (4)微孔膜過濾法和大孔型聚苯乙烯樹 脂吸附法相結合，將綠茶提取物經(jīng)微孔膜過濾，濾液通過大孔型聚苯乙烯樹脂, 稀的低級醇解析，收集含EGCG的餾分，冷凍干燥后得到產(chǎn)品(CN1465572A、
CN 1407510A)。 (5)乙酰化與硅膠色譜柱分離法相結合，將EGCG乙酰化后用 硅膠色譜柱分離，再在質子性溶劑中水解，干燥得到EGCG單體(CN 101182319A )。
這些方法的出現(xiàn)，解決了從茶葉中獲得高純度EGCG的技術。但是還存在 一些問題， 一是使用了較貴重的儀器和昂貴的化學試劑，二是產(chǎn)生大量對環(huán)境 污染的廢液，結果導致EGCG國際價格一直居高不下，因此為了降低成本探討 廉價的EGCG分離提取方法具有重要理論意義和應用價值。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了尋找一種簡單經(jīng)濟的從綠茶中提取純化出高純度的表 沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的綠茶用熱水浸提后，用咖啡因沉淀法和液相萃取法 得到EGCG粗品，然后用乙酸乙酯將EGCG粗品溶解，過硅膠色譜柱，收集組 分，得到ECG和EGCG單體，純度分別達到95%和97%以上。
本發(fā)明的具體實現(xiàn)是綠茶磨碎，用沸水浸提半小時，茶湯7(TC保溫，加 入咖啡因至20-50mmol/L與酯型兒茶素形成絡合物沉淀，室溫冷卻l-4小時，4 。C冷卻0.5-2.0小時，4°C下15000轉/分鐘(rpm )離心30分鐘,取沉淀。
在6(TC條件下用二次蒸餾水復溶，用氯仿除去咖啡因，乙酸乙酯萃取，保 留有機相，減壓蒸餾去掉乙酸乙酯，產(chǎn)物用純水復溶，-90°0超低溫冷凍干燥， 得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)粗品。
最后把表沒食子兒茶素沒食子酸酯粗品用乙酸乙酯溶解，過閃爍硅膠色譜 柱，洗脫劑是體積比為3:2的乙酸乙酯和石油醚的混合物，其石油醚的沸程為 60-90°C。并在洗脫劑中加三氟乙酸，使其濃度達0.4-0.8%。用波長為280nm的 紫外光檢測器進行洗脫峰檢測，收集兩個峰所對應的洗脫液，分別減壓蒸餾去
除有機溶劑，剩余物用蒸餾水溶解，-9(TC超低溫冷凍干燥，分別得到表兒茶素 沒食子酸酯(ECG)單體和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)單體，純度分 別為95%和大于97%。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是
1、 利用咖啡因沉淀法、液相萃取法和閃爍硅膠柱色譜法相結合，可以從茶 葉中提純出高純度的EGCG，具有很高的經(jīng)濟利用價值，同時還得到純度較高 的副產(chǎn)品ECG。
2、 工藝簡單，成本低、效益高，具有廣闊的巿場前景。
3、 整個提純過程中雖氯仿有毒，但易清除，無殘留，其它試劑均安全無毒。
4、 整個提純過程中EGCG氧化少，溶劑沸點低易除去，產(chǎn)品純度高。
(四)


圖1為本發(fā)明技術工藝流程圖。
圖中l(wèi)是商品綠茶，2是浸提茶湯，3是咖啡因沉淀離心，4是氯仿萃取除 咖啡因，5是乙酸乙酯萃取出EGCG， 6是過硅膠色譜柱，7是超低溫冷凍千燥， 8是成品。
圖2為茶湯高效液相色譜圖，EGCG含量為30.81%。
圖3咖啡因沉淀、液相萃取后產(chǎn)物高效液相色譜圖，EGCG含量為53.54%。 圖4為過硅膠色譜柱后前峰產(chǎn)物高效液相色譜圖，ECG含量為95.43%。 圖5為過硅膠色譜柱后后峰產(chǎn)物高效液相色譜圖，EGCG含量為97.67%。 圖6為過硅膠柱分離色譜圖
具體實施方式
-下面將通過具體的實例對本發(fā)明作進 一 步的詳細說明。
(l)將綠茶研碎，取茶葉末25克，置于500ml燒杯中。(2) 加350ml重蒸水，煮沸20-30分鐘，每隔一分鐘攪拌一次，抽濾，得 茶湯。將茶渣重新加入350ml重蒸水煮沸20-30分鐘，抽濾得茶湯，合并兩次茶 湯，高效液相色譜檢測EGCG含量為30.81% (如圖2)。
(3) 將茶湯置于1000ml大燒杯中,7(TC水浴保溫，加咖啡因至3Ommol/L， 完全溶解后在室溫下冷卻l-4小時，4'C下冷卻0.5-2.0小時。4"C下15000g離心 30分鐘，棄去上清，取沉淀，取6(TC重蒸水300ml將沉淀溶解，將溶液轉移至 500ml容量瓶中。
(4) 用氯仿萃取三次，每次用量150ml，棄去有機相。
(5) 水相用150ml乙酸乙酯萃取三次，保留有機相。減壓蒸餾，去掉乙酸 乙酯，加重蒸水50ml重新溶解產(chǎn)品，冷凍干燥，可得到0.710gEGCG粗品，高 效液相色譜檢測EGCG含量達到53.54% (如圖3 )。
(6) 稱取EGCG粗品O.lOOg,用乙酸乙酯溶解，過閃爍硅膠色譜柱，柱子 為(30cmx2cm I.D.)玻璃柱，洗脫劑為乙酸乙酯:石油醚(60-90°C ) =3:2,加 0.4~0.6%三氟乙酸，用波長為280mn的紫外光檢測器進行洗脫峰檢測，收集兩 個峰所對應的洗脫液，減壓蒸餾，除去有機溶劑。
(7) 用水溶解產(chǎn)物，-90匸冷凍干燥。
(8 )得到0.008g ECG和0.026g EGCG,經(jīng)高效液相色譜檢測純度分別達 到95.43% (如圖4 )和97.67% (如圖5 )。
權利要求
1、一種從綠茶中提取高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法，其特征在于將液相萃取法和閃爍硅膠柱色譜法聯(lián)用，首先將綠茶磨碎，用沸水浸提半小時，茶湯70℃保溫，加入咖啡因至20-50mmol/L與酯型兒茶素形成絡合物沉淀，室溫冷卻1-4小時，4℃冷卻0.5-2.0小時，4℃下15000轉/分鐘離心30分鐘，取沉淀，再在60℃條件下用二次蒸餾水復溶，用氯仿除去咖啡因，乙酸乙酯萃取，保留有機相，減壓蒸餾去掉乙酸乙酯，產(chǎn)物用純水復溶，-90℃超低溫冷凍干燥，得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯粗品，最后把表沒食子兒茶素沒食子酸酯粗品用乙酸乙酯溶解，過閃爍硅膠色譜柱，洗脫劑是體積比為3:2的乙酸乙酯和石油醚的混合物，其石油醚的沸程為60-90℃，并在洗脫劑中加三氟乙酸，使其濃度達0.4-0.8％，用波長為280nm的紫外光檢測器進行洗脫峰檢測，收集兩個峰所對應的洗脫液，分別減壓蒸餾去除有機溶劑，剩余物用蒸餾水溶解，-90℃超低溫冷凍干燥，分別得到表兒茶素沒食子酸酯單體和表沒食子兒茶素沒食子酸酯單體，純度分別為95％和大于97％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從綠茶中提取高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)技術及方法。所述綠茶為市面普通綠茶，通過咖啡因沉淀、液相萃取和閃爍硅膠柱色譜技術聯(lián)用純化后，可以得到高純度的EGCG，提純后EGCG純度可達到97％以上?？Х纫虺恋頋舛葹?0-50mmol/L，液相萃取劑為氯仿、乙酸乙酯，閃爍硅膠色譜柱填料為硅膠G(200-300目)，柱子長30cm，內徑2.0cm，洗脫劑為乙酸乙酯、石油醚(60-90℃)體積比為3∶2，加0.4-0.8％三氟乙酸。各種試劑均為常規(guī)試劑，經(jīng)濟易采購，除氯仿外，其它試劑均安全無毒，且氯仿易去除。本方法可應用于工業(yè)大量生產(chǎn)高純度EGCG和ECG。
文檔編號C07D311/62GK101381359SQ20081015780
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月15日 優(yōu)先權日2008年10月15日
發(fā)明者杰 周, 朱樹華, 進 王, 陳長寶, 高吉剛 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學