專利名稱：：血多肽及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及以動物血液為原料制備而得的血多肽以及該血多肽的用途，屬于藥品、保健品或食品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：動物血液是一種寶貴的營養(yǎng)資源。早期研究表明，動物血液中除大量的體液外，還含有紅細(xì)胞、抗體、細(xì)胞因子和無機(jī)鹽等。其中，紅細(xì)胞中有豐富的有機(jī)鐵、蛋白質(zhì)(血紅蛋白、血影蛋白等)等營養(yǎng)成分。我國每年產(chǎn)生數(shù)百萬噸動物血液，除極少量用于制備生化制品，以及少量直接食用以外，基本上都在動物宰殺時直接廢棄，造成環(huán)境破壞與資源浪費(fèi)。蛋白質(zhì)分為兩類，即動物蛋白和植物蛋白。動物蛋白是動物中提取的蛋白質(zhì)，必需氨基酸含量高，營養(yǎng)價值也相對植物蛋白高，對人體生長有益；植物蛋白由植物中提取，非必需氨基酸含量高，不易被人體吸收利用。因此，有必要在日常飲食中適當(dāng)補(bǔ)充動物蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，動物血液中含有大量血紅蛋白和血影蛋白等，屬于優(yōu)質(zhì)動物蛋白質(zhì)。但是由于蛋白質(zhì)分子量較大，直接服用動物蛋白存在不易被人體吸收的問題，因此有必要增加動物蛋白的生物利用度，使其最大限度的為人體所吸收。降低大分子物質(zhì)的分子量是提高其生物利用度的有效方法。目前降解蛋白質(zhì)大分子的方法主要有酸水解、堿水解法和酶水解法。酸水解和堿水解法需要加入6N的鹽酸或堿，降解時間長，降解溫度高，對一些氨基酸會產(chǎn)生破壞作用，產(chǎn)物顏色深，且不宜人體食用，雖經(jīng)過后處理，但不能完全除去其不良影響，具有明顯的澀味、苦味。酶水解法是目前新興的一種蛋白質(zhì)水解方法，由于其作用條件溫和、水解效率高、對人體無毒副作用，成為蛋白質(zhì)降解的首選方法?，F(xiàn)有動物血液降解方法是以新鮮動物血液為原料，經(jīng)血細(xì)胞、血漿分離、一級生物轉(zhuǎn)化、二級生物轉(zhuǎn)化等步驟制備而成，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，而且降解用酶為植物或微生物來源的生物酶，對動物來源的蛋白質(zhì)降解針對性不強(qiáng)，酶解效率不高。尤其是在酶水解法中影響因素最大的為解酶的種類和酶解條件，需要在研究過程中選擇。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供血多肽的制備方法，該方法能夠提高動物血液的利用度。本發(fā)明血多肽的制備方法包括分離動物血液蛋白按動物血液l份、細(xì)胞裂解液36份的體積配比混合，靜置；取靜置后液體離心，所得上清液加入等體積的95%乙醇中，離心所得即為動物血液蛋白；酶解將動物血液蛋白溶于10倍體積的水中，每升溶解液中加入胰酶0.62g，于3540。C反應(yīng)19小時；干燥干燥至水分含量低于5%即得。本發(fā)明血多肽的制備方法，工藝簡單，原料價廉易得，制備時間短，反應(yīng)溫度低，耗能少，使用現(xiàn)有設(shè)備即可完成產(chǎn)品的制備。本發(fā)明所解決的第二個技術(shù)問題即是提供該方法制備而得的血多肽。本發(fā)明血多肽含有如下成分總氮(以N計(jì))10.714.8%、游離氨基酸(以N計(jì))0.370.58%、鐵0.050.07%。本發(fā)明血多肽是由動物血液蛋白生物酶解產(chǎn)生的，其氨基酸含量較以植物或微生物來源的生物酶制備而得的血多肽含量高。蛋白質(zhì)根據(jù)總氮含量乘以相應(yīng)的焦耳氮轉(zhuǎn)換因子計(jì)算而得，常用系數(shù)為6.25，即蛋白質(zhì)^總氮含量x6.25。即本發(fā)明血多肽蛋白質(zhì)含量為66.87592.5%。本發(fā)明所解決的第三個技術(shù)問題即是提供了該血多肽的一種用途，即在制備耐缺氧的藥物或保健品中的用途。經(jīng)試驗(yàn)證明，本發(fā)明血多肽耐缺氧作用明顯，可治療低張性缺氧，適于氧含量低所引起的不適。具體實(shí)施例方式本發(fā)明血多肽的制備方法，包括分離動物血液蛋白，酶解，干燥等步驟。本發(fā)明動物血液來源于飼養(yǎng)的豬、牛、羊等哺乳類動物，以及雞、鴨等禽類，這些動物必須是通過檢疫的建康動物。動物血液指規(guī)模屠宰企業(yè)在屠宰過程中采用一定手段所收集的符合食品衛(wèi)生要求的可用于進(jìn)一步食用性加工的清潔動物血液。胰酶，又叫胰蛋白酶，是提取至?；蜇i胰中的一種蛋白水解酶，是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷，起到消化酶的作用。由于胰酶源于動物胰腺，因此在動物蛋白的降解中針對性強(qiáng)。上述分離動物血液蛋白的方法為按動物血液l份、細(xì)胞裂解液36份的體積配比混合，靜置；取靜置后液體離心，所得上清液加入等體積的95%乙醇中，離心所得即為動物血液蛋白。根據(jù)篩選試驗(yàn)，從成本和效果方面考慮優(yōu)選動物血液與細(xì)胞裂解液的體積配比為動物血液1份、細(xì)胞裂解液3份；具體地，細(xì)胞裂解液為0.01%0.03%的檸檬酸鈉水溶液。上述酶解過程中在動物血液蛋白溶于IO倍體積的水中，每升溶解液中加入胰酶0.62g，于3540'C反應(yīng)19小時。根據(jù)篩選試驗(yàn)，從成本和效果方面考慮優(yōu)選每升溶解液中加入胰酶12g，于3540'C反應(yīng)39小時。最優(yōu)方案為每升溶解液中加入胰酶lg，于37'C反應(yīng)3小時。干燥時，控制血多肽水分含量低于5%即可。一般采用噴霧干燥的方式，該方法簡便易行，是干燥含蛋白、多肽、氨基酸成分的液體的常用方法。噴霧干燥時采用的條件不高于220°C，進(jìn)樣速度約5ml/min。經(jīng)上述方法制備而得的血多肽含有如下成分總氮10.714.8%、游離氨基酸(以N計(jì))0.370.58%、鐵0.050.07%。本發(fā)明血多肽質(zhì)量指標(biāo)以動物血液酶解氨基酸為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，采用茚三酮顯色法測定，以甘氨酸作為對照。本發(fā)明血多肽可以制成本領(lǐng)域常規(guī)劑型，如散劑、片劑、膠囊劑、緩控釋制劑等等。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。通過以下篩選試驗(yàn)證明本發(fā)明血多肽及其制備方法的有益效果。試驗(yàn)例l篩選細(xì)胞破壁試驗(yàn)將200ml新鮮豬血按1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6(v:v)加入0.01%檸檬酸鈉水溶液，緩慢攪拌5分鐘，室溫靜置l小時后10000gxlOmiii離心，所得上清液加入等體積的95%乙醇中，6000gxl0min離心，將得到的沉淀復(fù)溶于10倍體積的雙蒸水中，每升溶解液加入自制胰酶l克，于37'C反應(yīng)1小時，測定其蛋白質(zhì)及氨基酸等含量。試驗(yàn)重復(fù)3次，以三次平均為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，結(jié)果見表l。表l篩選細(xì)胞裂解液與動物血液的體積配比<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，按36倍體積加入0.01%檸檬酸鈉水溶液所得蛋白質(zhì)、氨基酸含量幾乎一致，為節(jié)約成本，0.01%檸檬酸鈉水溶液加入量以3倍為佳。試驗(yàn)例2胰酶酶量效試驗(yàn)將200ml新鮮豬血按1:3(v:v)加入0.01%檸檬酸鈉水溶液，緩慢攪拌5分鐘，室溫靜置1小時后10000gxlOmin離心，所得上清液加入等體積的95%乙醇中，6000gxl0min離心，將得到的沉淀復(fù)溶于10倍體積的雙蒸水中，加入一定量的胰酶。設(shè)置胰酶酶量為lg/500ml、lg/700ml、lg/lL、lg/1.3L、lg/1.5L進(jìn)行酶量試驗(yàn)，以確定胰酶的加入量效關(guān)系。維持反應(yīng)鍋內(nèi)溶液5(TC的溫度至少半小時，然后由夾層通入自來水降低鍋內(nèi)溶液溫度至37°C，加入需要量的胰酶，在攪拌器連續(xù)攪拌下開始酶解反應(yīng)，期間調(diào)整通入反應(yīng)鍋夾層的蒸汽量使溫度維持在37"C，自加入胰酶起6h后酶解反應(yīng)結(jié)束。試驗(yàn)重復(fù)3次，以三次平均為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，結(jié)果見表2。表2胰酶酶量效試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，胰酶酶量以lg/lLlg/0,5L時，隨著酶量的增加，總蛋白含量/氨基酸含量幾乎不變，出于生產(chǎn)成本的考慮，以酶量以lg/lL為佳。試驗(yàn)例3水解工藝試驗(yàn)將200ml新鮮豬血按1:3(v:v)加入0.01%檸檬酸鈉水溶液，緩慢攪拌5分鐘，室溫靜置1小時后10000gxlOmin離心，所得上清液加入等體積的95%乙醇中，6000gxl0min離心，將得到的沉淀復(fù)溶于10倍體積的雙蒸水中，按lg/lL加入胰酶，考察水解時間。設(shè)計(jì)水解時間分別為l、2、3、4、5、6、7、8、9小時來觀察時間對提取成分含量的影響。試驗(yàn)重復(fù)3次，以三次平均為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，結(jié)果見表3。表3水解工藝試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，水解時間3小時至9小時，總蛋白含量、氨基酸含量幾乎不變，出于節(jié)約生產(chǎn)時間考慮，以3小時為佳。試驗(yàn)例4噴霧干燥試驗(yàn)將新鮮豬血按1:3(v:v)加入0.01%檸檬酸鈉水溶液，緩慢攪拌5分鐘，室溫靜置l小時后10000gxiOmin離心，所得上清液加入等體積的95%乙醇中，6000gxl0min離心，將得到的沉淀復(fù)溶于10倍體積的雙蒸水中，按lg/lL加入胰酶反應(yīng)3小時。將水解液噴霧干燥。設(shè)定干燥溫度為120°C、150°C、180°C、200°C、220°C、250。C和300°C，以確定最佳的干燥溫度。試驗(yàn)重復(fù)3次，以三次平均為統(tǒng)計(jì)結(jié)果，結(jié)果見表4。表4噴霧干燥試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，干燥溫度22030(TC含水量接近，出于節(jié)約生產(chǎn)時間考慮，以220'C為佳。試驗(yàn)例5血多肽吸濕性試驗(yàn)采用下述方法制備血多肽，然后對其吸濕性進(jìn)行測定。采用密閉式采血法在常溫下采集新鮮豬血。按1:3(v:v)加入0.01%檸檬酸鈉水溶液，緩慢攪拌5分鐘，室溫靜置1小時后lOOOOgxlOmin離心，所得上清液加入等體積的95%乙醇中，6000gxl0min離心，將得到的沉淀復(fù)溶于10倍體積的雙蒸水中，每升溶解液加入自制胰酶l克，于37'C反應(yīng)3小時，噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度22(TC，出風(fēng)溫度60°C，進(jìn)樣速率5mL/min，干燥過程保持?jǐn)嚢琛５醚嚯姆勰?。?zhǔn)確稱取上述血多肽粉末適量，置敝口扁稱量瓶中，在25'C75X相對濕度條件下，按一定時間間隔稱重，計(jì)算吸濕量和吸濕率(％)，結(jié)果見表5。表5本發(fā)明血多肽吸濕性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從結(jié)果看，提取粉吸濕性很弱，不需加入輔料解決其吸濕性。試驗(yàn)例6本發(fā)明血多肽穩(wěn)定性考察試驗(yàn)設(shè)置溫度、濕度考察本發(fā)明血多肽穩(wěn)定性，時間分別為0、3、6、9、12、16、18、24個月，全檢測定，結(jié)果見表6。試驗(yàn)用血多肽是以下述工藝制備而得A、分離動物血液蛋白的方法為按動物血液l份、細(xì)胞裂解液36份的體積配比混合，靜置；取靜置后液體離心，所得上清液加入等體積的95%乙醇中，離心所得即為動物血液蛋白；B、酶解將動物血液蛋白溶于10倍體積的水中，每升溶解液中加入胰酶0.62g，于3540'C反應(yīng)110小時；C、干燥干燥至血多肽水分含量低于5%，即得本發(fā)明血多肽。具體步驟如下1、稱樣準(zhǔn)確稱取一定量均勻性好的血多肽，精確到0.0001g，將稱好的本發(fā)明血多肽放于水解管中。2、水解在水解管內(nèi)加6mol/L鹽酸10ml15ml(視本發(fā)明血多肽蛋白質(zhì)含量而定)，加入新蒸餾的苯酚3滴~4滴，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍3miti—5min，再接到真空泵的抽氣管上。抽真空(接近0Pa)，然后充入高純氮?dú)?；再抽真空充氮?dú)?，重?fù)三次后，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口或擰緊螺絲蓋將已封口的水解管放在1KTC土rc的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后，取出冷卻。打開水解管，將水解液過濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50ml。容量瓶內(nèi)用去離子水定容。吸取濾液lml于5ml容量瓶內(nèi)，用真空干燥器在40'C50'C干燥，殘留物用lml2ml水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行兩次。最后蒸干，用1加1112.2的緩沖液溶解，供儀器測定用。3、測定準(zhǔn)確吸取0.200ml混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用pH2.2的檸檬酸鈉緩沖液稀釋到5ml，此標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃度為5.00nmol/50nl，作為上機(jī)測定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用氨基酸自動分析儀以外標(biāo)法測定本發(fā)明組合物測定液的氨基酸含量。4、結(jié)果計(jì)算按下式計(jì)算X本發(fā)明血多肽氨基酸的含量，單位為克每百克(g/100);c一本發(fā)明血多肽測定液中氨基酸含量，單位為納摩爾每50微升(nmol/50fil);F——本發(fā)明血多肽稀釋倍數(shù)；V——水解后本發(fā)明血多肽定容體積，單位為毫升(ml);M——氨基酸分子量；m一本發(fā)明血多肽質(zhì)量，單位為克(g);1/50一折算成每毫升本發(fā)明血多肽測定的氨基酸含量，單位為微摩爾每升109——將本發(fā)明血多肽含量由納克(ng)折算成克(g)的系數(shù)。表6檢測結(jié)果肽穩(wěn)定性良好，貯存24個月后，產(chǎn)品成分穩(wěn)定，蛋白質(zhì)、氨基酸含量穩(wěn)定。試驗(yàn)例7本發(fā)明血多肽的耐缺氧效果(常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn))試驗(yàn)動物KM種小鼠36只，體重2(M:2g。試驗(yàn)用血多肽為試驗(yàn)例6所采用的血多肽。將小鼠分為高劑量組(劑量0.4g血多肽/10g)、低劑量組(劑量0.2g血多肽/10g)與模型組(水0.4ml/10g)，每組各12只，雌雄各半，每日口服給藥，連續(xù)30d。末次給藥后60min，將小鼠置于密閉的250ml磨口瓶。記錄小鼠因缺氧而死亡的時間。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)單因素方差分析表明，各劑量組小鼠體重與對照組之間差異均無顯著意義，未見本發(fā)明血多肽對小鼠體重有影響。各組耐缺氧時間均值的差異有顯著意義(P<0.05)。經(jīng)過F檢驗(yàn)，高劑量組與對照組相比差異有極顯著性(P<0.01)，低劑量組與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。說明本發(fā)明血多肽具有耐缺氧功效。結(jié)果見表7。表7血多肽對小鼠耐缺氧的影響組另lj-體重影響(g)試驗(yàn)前試驗(yàn)后-存活時間(s)模型組19.4±0.540.8±2.8986.8±34.5低劑量組19.6±0.941.5±2.91390.9±66.5A高劑量組19.9±1.440.9±1.71625.6±40.5**注與正常對照組相比"P<0.01，*P<0.05。試驗(yàn)例8毒性觀察(1)給小鼠灌食最大給藥濃度和劑量都不致死，不能測出本發(fā)明血多肽的半數(shù)致死量。(2)用本發(fā)明血多肽進(jìn)行了大鼠致畸胎試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓微核試驗(yàn)和染色體畸變試驗(yàn)，證明本發(fā)明血多肽無致畸和致突作用。由以上的各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明血多肽無明顯毒副作用，且原料來源豐富，提取和制備成相應(yīng)的保健品、食品的方法并無特殊要求和限制，在提高機(jī)體耐缺氧能力方面具有理想的綜合藥理作用，具有很好的應(yīng)用于保健品、食品的前景，可在治療各種原因所致的缺氧癥，可發(fā)揮滿意的輔助治療、保健和康復(fù)作用。9權(quán)利要求1、血多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟A、分離動物血液蛋白按動物血液1份、細(xì)胞裂解液3～6份的體積配比混合，靜置；取靜置后液體離心，所得上清液加入等體積的95％乙醇中，離心即得動物血液蛋白；B、酶解將動物血液蛋白溶于10倍體積的水中，每升溶解液中加入胰酶0.6～2g，于35～40℃反應(yīng)1～9小時；C、干燥至水分含量低于5％即得。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的血多肽的制備方法，其特征在于所述動物血液與細(xì)胞裂解液的體積配比為動物血液l份、細(xì)胞裂解液3份。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的血多肽的制備方法，其特征在于酶解時每升溶解液中加入胰酶l2g，于3540'C反應(yīng)39小時。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的血多肽的制備方法，其特征在于酶解時每升溶解液中加入胰酶lg，于37'C反應(yīng)3小時。5、權(quán)利要求14任一項(xiàng)所述的制備方法制備而得的血多肽。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的血多肽，其特征在于它含有如下成分總氮(以N計(jì))10.714.8%、游離氨基酸(以N計(jì))0.370.58%、鐵0.050.07%。7、權(quán)利要求5所述的血多肽在制備耐缺氧的藥物、保健品或食品中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及以動物血液為原料制備而得的血多肽以及該血多肽的用途，屬于藥品、保健品或食品領(lǐng)域，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供血多肽的制備方法，該方法能夠提高動物血液的利用度，該制備方法包括分離動物血液蛋白，酶解，干燥等步驟。本發(fā)明血多肽的制備方法，工藝簡單，原料價廉易得，制備時間短，反應(yīng)溫度低，耗能少，使用現(xiàn)有設(shè)備即可完成產(chǎn)品的制備。本發(fā)明血多肽含有如下成分總氮(以N計(jì))10.7～14.8％、游離氨基酸(以N計(jì))0.37～0.58％、鐵0.05～0.07％，且耐缺氧作用明顯，可治療低張性缺氧，適于氧含量低所引起的不適。文檔編號C07K1/00GK101550178SQ200810045089公開日2009年10月7日申請日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日發(fā)明者余夢瑤,葉利明,曹定知,瑾曾,楊士明,南江,霞羅,許曉燕,費(fèi)小凡申請人:四川省中醫(yī)藥科學(xué)院