專利名稱：可溶性vegfr雙功能融合受體、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一類雙功能融合受體、 其制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤尤其是惡性腫瘤是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類健康的疾病，在各種疾病所 致死亡中高居第二位。而且近年來，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。惡性腫瘤治療 效果差，晚期轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后多不佳。目前臨床上所采用的常規(guī)治療方法如放、 化療和手術(shù)治療雖然在很大程度上緩解了病痛，延長了生存時間，但這些方法 均存在很大的局限性，其療效難以進(jìn)一步提高。
腫瘤的生長有兩個明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長期轉(zhuǎn)為有血管 的快速增殖期，血管的生成使腫瘤能獲得足夠的營養(yǎng)而完成血管切換期，如果 沒有血管的生成，原發(fā)腫瘤的生長不超過l 2mm，轉(zhuǎn)移則無法實現(xiàn)。血管內(nèi)皮 生長因子(VEGF)是一類能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、促進(jìn)新生血管的形成、提高 血管通透性的生長因子，它與細(xì)胞表面的血管內(nèi)皮生長因子受體結(jié)合，通過激 活酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮功能。在腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞、腫瘤侵入的巨 噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激腫瘤血管內(nèi)皮細(xì) 胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)血管形成，促進(jìn)腫瘤持續(xù)生長,并提高血管通 透性，引起周圍組織纖維蛋白沉著，促進(jìn)單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞侵潤，有 利于腫瘤基質(zhì)形成和腫瘤細(xì)胞進(jìn)入新生血管,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，因而抑制腫瘤血管 生成被認(rèn)為是當(dāng)前最具有前途的腫瘤治療方法之一。Genentech公司的抗癌 新藥Avastin (抗VEGF人源化抗體)已于20Q4年2月獲得美國FDA批準(zhǔn)上市，用于一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，并有望用于其它腫瘤，包括非小細(xì)胞肺癌和腎癌的
治療。此外，用可溶性受體阻斷VEGF和VEGFR的傳導(dǎo)途徑也被證明是一種行之有 效的方法。VEGF家族包括VEGF、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E及PIGF(胎盤 生長因子)，它們之間的氨基酸序列高度同源，都與同型的酪氨酸激酶受體結(jié)合。 血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)屬于酪氨酸激酶受體超家族，它們有相似的結(jié) 構(gòu)，均由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)組成。目前發(fā)現(xiàn)的VEGFR主要有3種 VEGFRl(Flt-1) ， VEGFR2(KDR)， VEGFR3。與VEGFR1結(jié)合的主要是VEGF、 VEGF-B， 與VEGFR2結(jié)合的主要是VEGF、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E，與VEGFR3結(jié)合的主要 是VEGF-C、 VEGF-D。 VEGFR1和VEGFR2主要位于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，VEGFR1 主要介導(dǎo)細(xì)胞骨架重排及引起細(xì)胞遷移，VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化由VEGFR2 介導(dǎo)。VEGFR3特異表達(dá)在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中，在動脈、靜脈、毛細(xì)血管內(nèi)皮中基 本沒有表達(dá)。VEGF-C和VEGF-D可通過VEGF-C/VEGF-D/VEGFR3信號系統(tǒng)發(fā)揮作 用，從而導(dǎo)致腫瘤淋巴管的增生和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[NeufeldG等，F(xiàn)ASEBJ， 1999， 13: 9—22]。 Regeneron制藥公司將VEGFRl膜外區(qū)與抗體Fc進(jìn)行融合，制備了 VEGFR-Fc融合蛋白，它能與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR競爭性結(jié)合VEGF和 VEGF-B，從而抑制VEGF和VEGF-B的生物活性，阻斷新生血管的形成，實驗結(jié)果 表明VEGFR1-Fc具有比Avastin更強(qiáng)的抗腫瘤作用[Wulff C等，J Clin Endocrinol Metab. 2001， 86 (7) : 3377-86. Holash J等，PNAS 2002 ，17: 11393 - 11398]。但是，無論是Avastin還是VEGFR1-Fc都是通過阻斷VEGF或/和 VEGF-B所誘導(dǎo)的生物學(xué)功能，即抑制腫瘤的血管生成來發(fā)揮抗腫瘤作用。它們 均不能與VEGF-C或VEGF-D相結(jié)合，而VEGF-C和VEGF-D可誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)淋巴管生成， 進(jìn)而促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，所以它們不能抑制腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
因此，研究出既能與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR競爭性結(jié)合VEGF和VEGF-B， 還能與VEGF-C或VEGF-D相結(jié)合，從而不僅抑制VEGF和VEGF-B的生物活性，阻斷 新生血管的形成，還能阻斷VEGF-C和VEGF-D對腫瘤內(nèi)淋巴管生成的誘導(dǎo)，防止 腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高效抗腫瘤藥物一直是本領(lǐng)域的技術(shù)人員急待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了
1. 一種可溶性雙功能VEGFR融合受體，為包含VEGFR1和VEGFR3在內(nèi)的融合蛋 白，既能與VEGF和VEGF-B結(jié)合，還能與VEGF-C或VEGF-D相結(jié)合。
2. 上述1所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體，為VEGFRIg，其輕鏈的氨基酸序 列為SEQ ID N0:8所示，重鏈的氨基酸序列為SEQ ID N0:10所示的。
3. 上述2所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體VEGFRIg的突變體，為VEGFRIgM， 其輕鏈的氨基酸序列為SEQ ID N0:14所示，重鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO: 10 所示。
4. 上述1所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體，為VEGFRFc，其特征在于有兩 個相同的多肽鏈通過二硫鍵結(jié)合，其中多肽鏈的氨基酸序列為SEQ ID N0:12所 示。
5. —種分離的核酸分子，編碼上述1-4任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受 體。
6. —種分離的核酸分子，編碼上述2所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體 VEGFRIg，其中編碼輕鏈的核苷酸序列為SEQ ID N0:7，編碼重鏈的核苷酸序列 為SEQ ID NO:9。
7. —種分離的核酸分子，編碼上述3所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體 VEGFRIg的突變體VEGFRIgM,其中編碼輕鏈的核苷酸序列為SEQ ID N0:13,編 碼重鏈的核苷酸序列為SEQ ID N0:9。
8. —種分離的核酸分子，編碼上述4所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體 VEGFRFc中的多肽鏈，具有SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。9. 一種載體，含有上述5、 6、 7、 8任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列 操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，其中載體可以為pDRl， pcDNA3. 1 ( + )， pc薩3. 1/ZE0(+) ， pDHFR之一。
10. 上述9所述的載體，為pcDNA3. 1 ( + )或pcDNA3. 1/ZE0(+)。
11. 一種宿主細(xì)胞，含有上述9所述的載體，為真核細(xì)胞。
12. 上述ll所述的宿主細(xì)胞，為哺乳動物細(xì)胞。
13. 上述12所述的宿主細(xì)胞，為CH0細(xì)胞。
14. 一種制備上述1-4任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體的方法，該方法 包括
a) 在表達(dá)條件下，培養(yǎng)上述11-13任一所述的宿主細(xì)胞，表達(dá)雙功能融合 受體，
b) 分離或純化所述的雙功能融合受體。
15. —種組合物，含有上述1-4任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體和藥學(xué) 上可接受的載體。
16. 上述1-4任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體在制備抗腫瘤藥物中的 用途。
17. 上述15所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
18. 上述16、 17任一所述的用途，還包括和其它的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。
任何編碼VEGFR1和VEGFR3的合適的DNA都適合于本發(fā)明，這樣的結(jié)構(gòu)包 括從RT — PCR激活的淋巴細(xì)胞mRNA中分離得到的VEGFR1，從根據(jù) embl|AR860556|AR860556中序列全基因合成的VEGFR 3 ，或從其他cDNA文庫中 獲得的。
本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，可以為pDRl (如圖1)， pCDNA3. 1， pDHFF之一，表達(dá)載體中包括連接有合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列的融合DNA序列。哺乳動物或昆蟲宿主細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可用于本發(fā)明的融合蛋白的表達(dá)，
COS ，CH0，NS0， sf9及sf21等均可適用于本發(fā)明。
可用的宿主細(xì)胞為含有上述載體的原核細(xì)胞，可以為DH5a， BL21(DE3)，TG1 之一。
本發(fā)明中公開的V E G F R雙功能融合受體的制備方法為在表達(dá)條件下， 培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)雙功能融合受體，分離或純化所述的雙功能融 合受體。
利用上述方法，可以將融合蛋白純化為基本均一的物質(zhì)，例如在SDS-PAGE 電泳上為單一條帶。
可以利用親和層析的方法對本發(fā)明公開的融合蛋白進(jìn)行分離純化，根據(jù)所 利用的親和柱的特性，可以使用常規(guī)的方法例如高鹽緩沖液、改變PH等方法洗 脫結(jié)合在親和柱上的融合蛋白多肽。
在本發(fā)明的一個實施例中，本發(fā)明公開的上述可溶性雙功能VECFR融合受 體蛋白VEGFRIg是通過以下方法得到的VEGFR 1基因是通過RT—PCR激活的淋 巴細(xì)胞mRNA中分離得到的，VEGFR3基因根據(jù)embl | AR860556 | AR860556中序列 全基因合成，VEGFR 1基因信號肽和I g 2-3區(qū)與輕鏈恒定區(qū)(k constant region) 基因連接，并且被克隆到pDRl載體的HinD工ll和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，VEGFR3 基因信號肽和I g卜2區(qū)與重鏈恒定區(qū)(I gGl constant region)基因連接， 同樣被亞克隆到另一pDR載體的HinDIll和EcoRI酶切位點(diǎn)之間。上述質(zhì)粒一 起用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO-Kl細(xì)胞，并用含600u g/ml G418和250p g/ml Zeocin 的選擇培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達(dá)可溶性雙功能VEGFR融合受體VEGFRIg的細(xì)胞克 隆.利用Protein A柱通過親和層析從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清中純化可溶性雙功能 VEGFR融合受體蛋白VEGFRIg。在本發(fā)明的另一個實施例中，公開了上述可溶性雙功能VECFR融合受體蛋
白VEGFRFc的制備方法，為將上述獲得的VEGFR3基因信號肽和I g 1_2區(qū)與 VEGFR 1基因I g 2-3區(qū)用overlapPCR的方法連接，再將獲得的融合基因的3' 端與人抗體Fc基因(SEQ ID N0:5)相連，并且被克隆到pDRl載體的HindI工I 和EcoRI酶切位點(diǎn)之間。上述質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CH0-Kl細(xì)胞，并用含600 u g/ml G418的選擇培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達(dá)可溶性雙功能VEGFR融合受體VEGFRFc 的細(xì)胞克隆.利用Protein A柱通過親和層析從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清中純化可溶 性雙功能VEGFR融合受體蛋白VEGFRFc。
發(fā)明的申請人對上述的可溶性雙功能VECFR融合受體進(jìn)親和力檢測、抑制 HUVEC細(xì)胞增殖、體內(nèi)抑瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等實驗，實驗結(jié)果表明，本發(fā)明公開 的可溶性雙功能VEGFR融合受體可以與VEGF、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D結(jié)合， 同時具有可溶性VEGFR1和VEGFR3的功能，可以結(jié)合VEGF、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D四種血管內(nèi)皮生長因子，阻斷其信號傳導(dǎo)通路。 一方面，它能夠能阻斷 血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化，增值，分化和遷移，既阻斷腫瘤中新生血管的形成、減 少腫瘤的供血和供氧，限制腫瘤的生長，又能降低血管通透性，減少腫瘤通過 血管發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)會。另一方面，它能夠阻斷淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的激活，阻斷腫瘤 中新生淋巴管的形成，阻止腫瘤細(xì)胞順淋巴管轉(zhuǎn)移的功能。這樣，就幾乎全部 阻斷VEGF/VEGFR傳導(dǎo)途徑，阻斷腫瘤中內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、抑制新生血管的形 成、降低血管通透性、減少腫瘤的供血和供氧，同時也可阻斷腫瘤內(nèi)淋巴管生 成，抑制腫瘤的淋巴管轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤治療療效。此外，這個雙功能 融合受體VEGFR1/VEGFR3-Fc將具有比VEGFR1-Fc和VEGFR3-Fc更大的分子量， 因而其半衰期將明顯延長，實驗表明，在相等劑量下，雙功能融合受體具有比聯(lián)合應(yīng)用VEGFR1-Fc和VEGFR3-Fc更好的抗腫瘤治療效果。
本發(fā)明公開上述可溶性雙功能VECFR融合受體蛋白，可以和藥學(xué)上可以接 受的輔料一起組成藥物制劑組合物從而更穩(wěn)定地發(fā)揮療效，這些制劑可以保證 本發(fā)明公開的融合受體蛋白氨基酸核心序列的構(gòu)像完整性，同時還要保護(hù)蛋白 質(zhì)的多官能團(tuán)防止其降解(包括但不限于凝聚、脫氨或氧化)。通常情況下，對 于液體制劑，通?？梢栽?。 C-8。 C條件下保存至少穩(wěn)定一年，對于凍干制劑， 在30° C至少六個月保持穩(wěn)定。在這里制劑可為制藥領(lǐng)域常用的混懸、水針、 凍干等制劑，優(yōu)選水針或凍干制劑，對于本發(fā)明公開的上述可溶性雙功能VECFR 融合受體蛋白的水針或凍干制劑，藥學(xué)上可以接受的輔料包括表面活性劑、溶 液穩(wěn)定劑、等滲調(diào)節(jié)劑和緩沖液之一或其組合，其中表面活性劑包括非離子型 表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫20或80);poloxamer(如poloxamer 188); Triton;十二烷基硫酸鈉(SDS);月桂硫酸鈉；十四垸基、亞油基或十八 垸基肌氨酸；Pluronics; MONAQUATTm等，其加入量應(yīng)使雙功能VECFR融合受 體蛋白的顆?；厔葑钚?，溶液穩(wěn)定劑可以為糖類，包括還原性糖和非還原性 糖，氨基酸類包括谷氨酸單鈉或組氨酸，醇類包括三元醇、高級糖醇、丙二醇、 聚乙二醇之一或其組合，溶液穩(wěn)定劑的加入量應(yīng)該使最后形成的制劑在本領(lǐng)域 的技術(shù)人員認(rèn)為達(dá)到穩(wěn)定的時間內(nèi)保持穩(wěn)定狀態(tài)，等滲調(diào)節(jié)劑可以為氯化鈉、 甘露醇之一，緩沖液可以為TRIS、組氨酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液之一。
上述制劑為包含雙功能VECFR融合受體蛋白的組合物，在對包括人在內(nèi)的 動物給藥后，抗腫瘤效果明顯。具體來講，對腫瘤的預(yù)防和/或治療有效，可以 作為抗腫瘤藥物使用。
本發(fā)明所指的腫瘤，包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，腫瘤 組織的來源包括但不限于腎上腺、膽囊、骨、骨髓、腦、乳腺、膽管、胃腸道、 心臟、腎臟、肝臟、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲狀旁腺、陰莖、前列腺、皮膚、 唾液腺、脾臟、睪丸、胸腺、甲狀腺和子宮。除了上述的腫瘤外，還可用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤如膠質(zhì)細(xì)胞多樣性瘤、星細(xì)胞瘤等，此外眼部的腫瘤包括基 底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤等，還包括內(nèi)分泌腺腫瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng) 腫瘤、胃腸道胰腺內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，生殖系統(tǒng)腫瘤及頭頸部腫瘤等。這里不再 一一列舉。
本發(fā)明所稱的抗腫瘤藥物，指具有抑制和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴 隨腫瘤生長相關(guān)癥狀發(fā)展的延遲和/或這些癥狀嚴(yán)重程度的降低，它進(jìn)一步還包 括己存在的腫瘤生長伴隨癥狀的減輕并防止其他癥狀的出現(xiàn)，還也減少或防止 轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中雙功能VECFR融合受體蛋白及其組合物在對包括人在內(nèi)的動物給
藥時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴(yán)重性，以及給藥途徑而異， 可以參考動物實驗的結(jié)果和種種情況，總給藥量不能超過一定范圍。具體講靜
脈注射的劑量是1 1800mg/天。
本發(fā)明公開的雙功能VECFR融合受體蛋白及其組合物還可以和其他的抗腫 瘤藥聯(lián)合給藥，用于腫瘤的治療，這些抗腫瘤藥包括1、細(xì)胞毒類藥物(1)作 用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物垸化劑如氮芥類、亞硝尿類、甲基磺酸酯類；鉑 類化合物如順鉑、卡鉑和草酸鉑等；絲裂霉素(MMC); (2)影響核酸合成 的藥物二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核 苷合成酶抑制劑如氟尿嘧啶類(5FU、 FT—207、卡培他濱)等；嘌呤核苷合成 酶抑制劑如6 —巰基嘌呤(6—MP)和6—TG等；核苷酸還原酶抑制劑如羥基 脲(HU)等；DNA多聚酶抑制劑如阿糖胞苷(Ara-C)和健擇(Gemz)等；(3) 作用于核酸轉(zhuǎn)錄的藥物選擇性作用于DNA模板，抑制DNA依賴RNA聚合 酶，從而抑制RNA合成的藥物如放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、 阿克拉霉素、光輝霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的藥物紫杉醇、泰索帝、長春花堿、長春瑞濱、鬼臼鹼類、高三尖杉酯堿；(5)其他細(xì)胞毒藥 門冬酰胺酶主要抑制蛋白質(zhì)的合成；2、激素類抗雌激素三苯氧胺、屈洛昔 芬、依西美坦等；芳香化酶抑制劑氨魯米特、蘭特隆、來曲唑、瑞寧德等； 抗雄激素氟它氨RH-LH激動劑/拮抗劑諾雷德、依那通等；3、生物反應(yīng)調(diào) 節(jié)劑主要通過機(jī)體免疫功能抑制腫瘤干擾素；白細(xì)胞介素一2 ;胸腺肽類; 4、單克隆抗體美羅華(MabThera) ; Cetuximab (C225);赫賽汀(Trastuzumab) Bevacizumab (Avastin) ;5、其他括一些目前機(jī)制不明和有待進(jìn)一步研究的藥物； 細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑如維甲類；細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。本發(fā)明公開的雙功能VECFR融合 受體蛋白及其組合物可以和上述的抗腫瘤藥物之一或其組合聯(lián)合用藥。


圖l pDRl表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖，hCMV表示人巨細(xì)胞病毒Major Immediate早期
啟動子；BGH pA表示Bovine growth hormone多腺苷化信號；SV40 ori表示
SV40病毒早期復(fù)制起點(diǎn)；DHFR表示二氫葉酸還原酶基因；pUC origin為質(zhì)粒復(fù)
制起點(diǎn)；AMP為氨芐青霉素抗性基因；
圖2.VEGFRIg-L基因結(jié)構(gòu)示意圖3. VEGFRIg-H基因結(jié)構(gòu)示意圖4 VEGFRIg雙功能融合受體結(jié)構(gòu)示意圖5 . VEGFRFc基因結(jié)構(gòu)示意圖;
圖6 VEGFRFc雙功能融合受體結(jié)構(gòu)示意圖7.雙功能融合受體與VEGF-A結(jié)合力實驗；
圖8.雙功能融合受體與VEGF-C結(jié)合力實驗；圖9.雙功能融合受體與VEGF-A的競爭抑制曲線；
圖IO.雙功能融合受體與VEGF-C的競爭抑制曲線；
圖ll.雙功能融合受體抑制VEGF-A引起的HUVEC細(xì)胞增殖活性實驗
圖12.雙功能融合受體抑制VEGF-C引起的HUVEC細(xì)胞增殖活性實驗
圖13.雙功能融合受體體內(nèi)血藥濃度時間曲線
圖14.可溶性雙功能VEGFR融合受體體內(nèi)抑制腫瘤生長曲線
具體實施例方式
以下實施例、實驗例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的 限制。實施例不包括對傳統(tǒng)方法的詳細(xì)描述，如那些用于構(gòu)建載體和質(zhì)拉的方 法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質(zhì)拉的方法或?qū)①|(zhì)粒引入宿主細(xì)胞 的方法.這樣的方法對于本領(lǐng)域中具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的，并且在 許多出版物中都有所描述，包括Sambrook， J. ， Fritsch， E. F. and Maniais， T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold spring Harbor Laboratory Press. 實施例1.人抗體輕、重鏈恒定區(qū)和Fc區(qū)基因的克隆
用淋巴細(xì)胞分離液分離健康人淋巴細(xì)胞，用Trizol試劑(Invitrogen公司產(chǎn) 品)提取總RNA，根據(jù)文獻(xiàn)(Cell， 1980,22: 197-207)和文獻(xiàn)(Nucleic Acids Research, 1982， 10: 4071-4079)報道的序列分別設(shè)計引物擴(kuò)增抗體重鏈和輕 鏈恒定區(qū)基因，并用引物FC有義GAAGCTTAATAATGGCCCGGGCGAGCCCAAATC TTGTGAC和FC反義CGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGG擴(kuò)增抗體Fc區(qū)。PCR反應(yīng)均 采用熱啟動，反應(yīng)條件94。C分鐘；94aC 45秒，60°C 45秒，72°C 1分10秒，30個循環(huán)；72。C10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到pGEM-T 載體中，測序驗證后確認(rèn)獲得了正確的克隆。SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2分別 顯示了重鏈恒定區(qū)(CH)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4 分別顯示了輕鏈恒定區(qū)(CL)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ IDN0:5和SEQ IDN0:6 分別顯示了 Fc區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正確克隆記作 pGEM-T/CH、 pGEM-T/CL和pGEM-T/Fc。 實施例2:可溶性雙功能VEGFR融合受體的構(gòu)建
用淋巴細(xì)胞分離液分離健康人淋巴細(xì)胞，用Trizol試劑(Invitrogen公司產(chǎn) 品)提取總 RNA， 以引物 VEGFR11 有義
TGCTTCTCACAGGATCTAGTTCAGGTTCAAAATTAAAAGATCCTG ，VEGFR12反義
司合成)，做RT — PCR獲得VEGFR1基因I g 1-3區(qū)，裝入PGEM-T載體 (PGEM-T/VEGFR1)， VEGFR3基因根據(jù)embl | AR860556 | AR860556中序列請上海 生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司全基因合成，VEGFR l基因信號肽(以引物VEGFRll 有義 TAAGCTTGCCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGAC;VEGFRll 反義 A CGAAAGGTCTACCTCCGGAACTAGATCCTGTGAGAAG以PGEM-T/VEGFR 1為模板擴(kuò)增)和I g 2-3 區(qū)(以引物 VEGFR12有義TCCGGAGGTAGACCTTTCG; VEGFR 12 反
PGEM-T/VEGFR1為模板擴(kuò)增)與人抗體輕鏈恒定區(qū)(k constant region)基因(以 引物L(fēng)C有義ACTGTGGCTGCACCATCTGT; LC反義GAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTG 以pGEM-T/CL為模板)以overlapPCR連接(序列見SEQIDNO: 1 )，并且被克隆到pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)中，挑選陽性克隆，測序正確，以HinDIII 和EcoRI酶切(Promega公司產(chǎn)品)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收獲得lkb的酶 切片斷與同酶切的質(zhì)粒pDRl(圖7)用T4 DNA連接酶(Invitrogen公司產(chǎn)品) 進(jìn)行連接，構(gòu)建成真核表達(dá)載體pDR(VEGFRIg-L)。圖2為VEGFRIg-L的基因結(jié) 構(gòu)圖。SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8分別顯示了 VEGFRIg-L的核苷酸和氨基酸 序列。
VEGFR3基因信號肽和I g 1-2區(qū)(以引物VEGFR31有義
TGGACGGCCTGGTGAGTGACTACTCCATGACCCCCCCGACCTTGAACATC ; VEGFR31反義 AGCTAGCGCCTGTGATGTGCACCAGGAAG,以PGEM-T/VEGFR1為模板擴(kuò)增)，經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳純化回收PCR產(chǎn)物并克隆到pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)中，篩選 陽性克隆測序。將測序正確的克隆用HindIII和NheI雙酶消化，回收700bp酶 切片斷與與同酶切的質(zhì)粒pGEM-T/CH連接，挑選正確克隆后以HinDI11和EcoRI 酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收2.3kb片段，與同酶切的質(zhì)粒pDRl(圖9)用 T4 DNA連接酶(Invitrogen公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接，構(gòu)建成真核表達(dá)載體 pDR(VEGFRIg-H)。圖3為VEGFRIg- H的基因結(jié)構(gòu)圖。SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10 分別顯示了 VEGFRIg- H的核苷酸和氨基酸序列。
于3.5cm組織培養(yǎng)皿中接種3 X 105 CHO-Kl細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至90%-95% 融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染取質(zhì)粒10ug(質(zhì)粒pDR(VEGFRIg-H)4ug，質(zhì)粒pDR (VEGFRIg-L) 6 u g)禾口 20 u 1 Upofectamine2000 Reagent [Invitrogen公司產(chǎn) 品]分別溶于500u 1無血清DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混 合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中的含血清培養(yǎng)基，然后將形成的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入到 板中，C02孵箱培養(yǎng)4小時后補(bǔ)加2ml含l(B血清的匿EM完全培養(yǎng)基，置于C02 孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染進(jìn)行24h后細(xì)胞換含600[jg/ml G418和250|jg/ml Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆。取細(xì)胞培養(yǎng)上清用ELISA檢測篩選高表達(dá) 克隆小鼠抗人IgG (CH2)包被于ELISA板，4。C過夜，用2%BSA-PBS于37°C 封閉2小時，加入待測的培養(yǎng)上清和標(biāo)準(zhǔn)品(Human myeloma IgGl， k) ， 37°C孵 育2小時，加入服P-小鼠抗人IgG (CH3)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，37°C孵育1小時，加 入TMB于37°C作用5分鐘，最后用H2S04終止反應(yīng)，測OD，值。將篩選得到的高 表達(dá)克隆用無血清培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用Protein A親和柱(GE公司產(chǎn)品)分離 純化VEGFRIg融合受體，經(jīng)測序，和SEQ ID N0:8、 SEQ ID NO:IO序列一致， 將純化融合受體用PBS進(jìn)行透析，最后以紫外吸收法定量。圖4為VEGFRIg融 合受體結(jié)構(gòu)圖。
上述獲得的VEGFR3基因信號肽和I g 1-2區(qū)與VEGFR 1基因I g 2-3區(qū)用 overlapPCR的方法連接，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收獲得1. 3kb并且被克隆到 pGEM-T載體體(Promega公司產(chǎn)品)中，挑選陽性克隆，測序正確，以HinDIll 和Smal雙酶切(Promega公司產(chǎn)品)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收獲得1. 3kb 的酶切片斷N端連接PGEM-T/Fc ( I gGl Fc) (Sequence 9)，挑選陽性克隆，， 以HinDIll和EcoRI雙酶切(Promega公司產(chǎn)品)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收 獲得2kb的酶切片段與同酶切的質(zhì)粒pDRl用T4 DNA連接酶(Invitrogen公司 產(chǎn)品)進(jìn)行連接，構(gòu)建成真核表達(dá)載體pDR (VEGFRFc)。圖5為VEGFRFc的基因 結(jié)構(gòu)圖。SEQ ID NO: 11禾卩SEQ ID NO: 12分別顯示了 VEGFRFc的核苷酸和氨基 酸序列。于3.5cm組織培養(yǎng)皿中接種3 X 105 CH0-Kl細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至90 % -95 %融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染取pDR (VEGFRFc)質(zhì)粒10 y g和20 u 1 Lipofectamine2000 Reagent[Invitrogen公司產(chǎn)品]分別溶于500ul無血清 DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使 DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成，其間用3rnl無血清的DMEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中的含血 清培養(yǎng)基，然后將形成的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入到板中，C02孵箱培養(yǎng)4小時后 補(bǔ)加2ml含10%血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于COj瞎箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染進(jìn)行24h 后細(xì)胞換含600|jg/ml G418的選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆。取細(xì)胞培養(yǎng)上清用 ELISA檢測篩選高表達(dá)克隆小鼠抗人IgG (CH2)包被于ELISA板，4°C過夜， 用2%BSA-PBS于37°C封閉2小時，加入待測的培養(yǎng)上清和標(biāo)準(zhǔn)品(Human myeloma IgGl，K)， 37。C孵育2小時，加入服P-小鼠抗人IgG (CH3)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，37。C 孵育1小時，加入TMB于37。C作用5分鐘，最后用H2S04終止反應(yīng)，測OD祝)值。 將篩選得到的高表達(dá)克隆用無血清培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用Protein A親和柱(GE 公司產(chǎn)品)分離純化VEGFRFc融合受體，經(jīng)測序，與SEQ ID N0:12序列一致， 將純化融合受體用PBS進(jìn)行透析，最后以紫外吸收法定量。圖6為VEGFRFc融 合受體結(jié)構(gòu)圖。
以 pDR(VEGFRIg-L)為模板，以引物 VEGFR1LCM 有義tccgt aGAGGACCTGattgaccaaagcaattccc 禾Q VEGFR1LCM 反 義 GGTCAATCAGGTCCTCTACGGAAGCTCTCTTATTT為點(diǎn)突變引物，以引物VEGFR1LC有義 Gadget tgccgccgtccatggtcagctactgggacaccggggtcctgctgtgcgcgctgctcagctgtc tgcttctcacaggatctagttccggaggtagacctttcgt;Lc antisense:
GAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTG為首尾引物，用overlap的方法進(jìn)行點(diǎn)突變，擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產(chǎn)物并克隆到pGEM-T載體(Promega公司 產(chǎn)品)中，篩選陽性克隆測序。將測序正確的克隆用HinDIII和EcoRI酶切， 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收lkb片段，與同酶切的質(zhì)粒pDRl(圖1)用T4 DNA 連接酶(Invitrogen公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接，構(gòu)建成真核表達(dá)載體 pDR(VEGFRIg-LM) 。 SEQ工D N0:13和SEQ ID NO: 14分別顯示了 VEGFRIg-LM的 核苷酸和氨基酸序列。
于3.5cm組織培養(yǎng)皿中接種3 X 105 CH0-K1細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)至90%-95% 融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染取質(zhì)粒10ug(質(zhì)粒pDR(VEGFRIg-H)4ug，質(zhì)粒pDR (VEGFRIg-LM)6u g)禾口 20 ti 1 Lipofectamine2000 Reagent [Invitrogen公司產(chǎn) 品]分別溶于500yl無血清DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混 合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成，其間用3ml無血清的DMEM 培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中的含血清培養(yǎng)基，然后將形成的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入到 板中，C02孵箱培養(yǎng)4小時后補(bǔ)加2ml含10。/。血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于C02 孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染進(jìn)行24h后細(xì)胞換含600|jg/ml G418和250|jg/ml Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆。取細(xì)胞培養(yǎng)上清用ELISA檢測篩選高表達(dá) 克隆小鼠抗人IgG (CH2)包被于ELISA板，4°C過夜，用2%BSA-PBS于37°C 封閉2小時，加入待測的培養(yǎng)上清和標(biāo)準(zhǔn)品(Human myeloma IgGl， k) ， 37°C孵 育2小時，加入HRP-小鼠抗人IgG (CH3)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，37。C孵育l小時，加 入TMB于37°C作用5分鐘，最后用H2S04終止反應(yīng)，測OD柳值。將篩選得到的高 表達(dá)克隆用無血清培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，用Protein A親和柱(GE公司產(chǎn)品)分離 純化VEGFRIgM融合受體，經(jīng)測序，與SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 10序列一致， 將純化融合受體用PBS進(jìn)行透析，最后以紫外吸收法定量。實驗例
實驗例1:可溶性雙功能VEGFR融合受體親和力檢測實驗-ELISA法
實驗步驟分別將VEGF、 VEGF-C (腿D公司產(chǎn)品)用O. 05mmol/L碳酸鈉.碳 酸氫鈉緩沖液(pH 9. 6)稀釋成2ug/ml， 100 ul /孔，4。C包被過夜。3%脫脂 奶室溫封閉2h后，加入不同濃度的可溶性VEGFR融合受體VEGFRlFc、 VEGFR3Fc、 VEGFRFc、 VEGFRIg、 VEGFRIgM， 100u 1 /孔，每個濃度取3個平行孔，室溫孵育 2 h。棄上清液，PBS洗滌3次，加入按效價稀釋好的服P標(biāo)記的小鼠抗人IgG單抗 (DAKO公司產(chǎn)品)，50 ul/ L，室溫孵育45 min。 PBS充分洗滌后，OPD避光顯 色，加入2 mol/L H2S04終止反應(yīng)后，置酶標(biāo)儀(Elx型自動酶標(biāo)比色儀，美國 BIO-TEK公司)中測定492 n m吸光度(A492)值。
實驗結(jié)果如圖7，圖8所示。
實驗結(jié)果表明可溶性VEGFR融合受體VEGFRIgM、 VEGFRIg可同時結(jié)合 VEGF-A、 VEGF-C，且結(jié)合力與VEGFRlFc和VEGFR3Fc相似，VEGFRFc與兩者的結(jié)合 較弱。而VEGFRlFc僅能與VEGF-A結(jié)合，VEGFR3Fc僅能與VEGF-C結(jié)合。 實驗例2:可溶性雙功能VEGFR融合受體親和力檢測實驗
實驗步驟不同量的可溶性VEGFR融合受體與50ng的VEGFRlFc(分別為AP標(biāo)記 的VEGFR 1 Fc (見文章Suppression of tumor angiogenesis and growth by gene transfer of a soluble form of vascular endothelial growth factor receptor into a remote organ . Takayama， -K， Cancer-Res. 2000 Apr 15; 60(8): 2169-77 )、 VEGFR 3 Fc(見文章Inhibition of l卿hangiogenesis with resulting lymphedema in transgenic mice expressing soluble VEGF rec印tor-3 TAIJA MAKINEN NATURE MEDICINE 2001 4 7 199-205)混合并在室溫濕育l個小時。將混合物轉(zhuǎn)移到用VEGF165 (200ng/孔)或VEGF-C (200ng/ 孔)(R&D公司產(chǎn)品)包被的96孔微量滴定權(quán)并在室溫繼續(xù)溫育2小時，然后將滴 定板洗5次，加入AP的底物以對結(jié)合的VEGFRFc— AP分子定量.然后計算IC 5 0，即，50%抑制VEGFR融合受體與VEGF結(jié)合所需要的VEGFR融合受體濃度。如 圖9，圖10所示，結(jié)果表明，可溶性VEGFR融合受體VEGFRIgM、 VEGFRIg既能競爭 性抑制VEGF-A與VEGFRlFc的結(jié)合，又能競爭性抑制VEGF-C與VEGFR3Fc的結(jié)合， VEGFRFc對兩者也有一定的競爭抑制作用，而VEGFRlFc和VEGFR3Fc僅能抑制其相 應(yīng)融合受體的結(jié)合
實驗例3:可溶性雙功能VEGFR融合受體抑制HUVEC細(xì)胞增殖實驗
實驗步驟取生長狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5X104/ml，接 種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，200ul/孔，于37。C、 5% C02孵箱中培養(yǎng)24 h后換無血清 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入不同濃度梯度的VEGFR融合受體，分別以 VEGFRlFc， VEGFR3Fc,無關(guān)抗體Rituximab為對照，每個濃度取3個平行孔，37°C 孵育l h，加入終濃度為25 ng/ml的VEGF-A或100 ng/ml的VEGF-C繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，加入10ul[3 H]. TdR(18. 5 kBq/孔)，37。C孵箱中孵育7 h，細(xì)胞收集器收 集細(xì)胞于玻璃纖維濾膜上，采用[3H]液閃計數(shù)儀進(jìn)行測定。如圖ll，圖12所示， 結(jié)果表明可溶性融合受體VEGFRIg、 VEGFRIgM可同時抑制VEGF-A、 VEGF-C引起的 HUVEC細(xì)胞增殖，VEGFRFc對兩者也有一定的競爭抑制作用，而VEGFRlFc和 VEGFR3Fc只能分別抑制VEGF-A、 VEGF-C引起的HUVEC細(xì)胞增殖的活性。 實驗例4: VEGF受體融合蛋白藥代動力學(xué)檢測
實驗步驟四周齡C57BL/6雌性小鼠(體重15-19g)皮下注射(s.c.) 60 u g (0.4ug / u 1*150 u 1)/mice①VEGFRlFc、②VEGFR3Fc、③VEGFRIg、④VEGFRIgM， PBS,分別于注射后lhr， 6 hr， 24hr， 48hr， 4d， 7d， 10d， 13d， 16d， 20d后取血，每只小鼠取血約100P1 (內(nèi)眥靜脈取血)加O. 1%的肝素混勻， 離心4000rpm*20min。取上清，棄沉淀。ELISA檢測血漿中抗體的濃度(以小 鼠抗人CH3單克隆抗體包被96孔板，加血漿后，以服P標(biāo)記的小鼠抗人CH2單克隆 抗體檢測)。檢測結(jié)果如圖13所示，VEGFRIgM的體內(nèi)半衰期較長，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 VEGFRlFc。其24小時濃度達(dá)到最高，在6-48小時維持較高的濃度(6. 3-8. 5ug /ml)并持續(xù)到13天后仍有0.01ug /ml。
實驗例5:可溶性雙功能VEGFR融合受體體內(nèi)抑制腫瘤生長實驗
實驗步驟為檢測可溶性雙功能VEGFR融合受體體內(nèi)抑瘤活性，首先用LM3細(xì)胞 (人肝癌細(xì)胞)，接種于到雌性重癥免疫缺陷小鼠(第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心) 右脅側(cè)皮下，接種腫瘤當(dāng)天給予可溶性雙功能VEGFR融合受體 25mg/kg(VEGFRIgM、 VEGFRIg)及對照VEGFRlFc， VEGFR3Fc和PBS，然后隔天皮下 注射持續(xù)4周.6周后，每3天測量腫瘤的長寬，計算腫瘤體積，結(jié)果如圖14所示。 結(jié)果表明VEGFRIgM受體融合蛋組腫瘤大小顯著小于VEGFRIg組及對照 VEGFRlFc，VEGFR3Fc和PBS組(P<0.01)，
實驗例6:可溶性雙功能VEGFR融合受體體內(nèi)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移實驗
實驗步驟用LM3細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)，接種于到雌性重癥免疫缺陷小鼠(第二軍 醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)右脅側(cè)皮下，接種腫瘤當(dāng)天給予可溶性雙功能VEGFR融合 受體25mg/kg(VEGFRIgM、 VEGFRIg)及對照VEGFRlFc， VEGFR3Fc和PBS，然后隔天皮 下注射持續(xù)4周.6周后處死小鼠，檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的大小。 實驗結(jié)果見表l
表l可溶性雙功能融合受體抑制腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移活性(x士s， n=10)表轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)計數(shù)及重量比較組別轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目/ 只(6只/組)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)平均重 量(克)
PBS e6.0±1.01.3±0.4
陰性對照 Rituximab5,8±1.21.3±0.3
VEGFRlFc4.3±0.61.2 ±0.4
VEGFR3Fc b1.2 ±0.21.3±0.3
VEGFRIgM "0.5±0.21.0±0.2
VEGFRIg c0.3±0.11.1±0.3
注a， VEGFRIgM組與VEGFRlFc組，P=0.007; b， VEGFR3Fc組與VEGFRlFc 組，P=0.007; c， VEGFRIg組與VEGFRlFc組，P=0.008; d， VEGFRIg與 VEGFRIgM組，P=0.009; e，與陰性對照組，p>0.3。(非配對t檢驗) 上述結(jié)果表明，VEGFR融合受體可明顯抑制腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。 從以上實驗結(jié)果可以看出，本發(fā)明公開的上述可溶性雙功能VEGFR融合受體 達(dá)到了本發(fā)明的目的。SEQUENCE LISTING 〈110〉上海中信國健藥業(yè)有限公司 上海國健生物技術(shù)研究院 〈120>可溶性V E G F R雙功能融合受體、其制備方法及用途 <130〉 Wulff C等，J Clin Endocrinol Metab. 2001， 86(7) :3377-86 〈磨 14
<170> Patentln version 3.4 〈210〉 1 〈211〉 990 <212> 腦A
<213〉 Gammal chain constant region DNA sequence <400〉 1
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60
ggcacagcggccctgggctgcctggtc犯ggactacttccccg朋ccggtgscggtgtcg120
tggaactc已ggcgccctgaccsgcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180
ggactctactccctcagcagcgtggtg已ccgtgccctccagcagcttgggC3CCC3印CC240
tacatctgca3CgtgMtC3caagcccagcaacaccaaggtgg3C3卿gagttgagccc300
a犯tcttgtgcacatgcccaccgtgcccagcacctgaactCCtgggggg￡L360
ccgtcagtcttcctcttcccccca^33ccc■ggacaccctcatgatctcccggacccct420
g3ggtcacatgcgtggtggtggax;gtg兆ccacgaagaccctgaggtcaa gttcsactgg480
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agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcacc鄉(xiāng)actggctg犯tggCMg600
gagtacaagtgcaaggtctxctcccagcccccatcgagaa aaccatctcc660
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stgacceLagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatc780
gccgtggagtggg卿g,tgggcagccggag犯caact3ca^g3ccacgcctcccgtg840
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cageieLgagcctctccctgtccccgggt犯a990
<210> 2
〈211〉 318
〈212> DNA
<213〉 Kappa chain constant region DNA sequence
<400〉 2
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Gammal chain 3
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693
1
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Cys Leu Leu Gly
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Ser 150 Glu
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Leu Tyr Ser
Gly Thr Gin Thr Lys Val His Thr Cys
Ser Val Phe
Ser Arg Thr
Glu Asp Pro
Val His Asn
Thr
Tyr Leu Asn Gly
Arg
Lys 200
Val 185 Glu
Ala 170 Val
Glu 155 Lys
Pro 140
Val
Thr
Leu 125 Glu
Pro 110 Phe
Asp
95
Pro
Thr
80
Lys
Cys
Pro Pro
Val Thr Cys
Lys Phe Asn Lys
Ser Val Leu
Tyr Lys Cys
Lys 205
Pro
Thr 190
Val
Arg 175 Val
Trp 160 Glu
Leu
Ser AsnLys Ala 210 Gin Pro 225
Met Thr
Pro Ser
Asn Tyr
Leu Tyr 290 Val Phe 305
Gin Lys
L>eu Pro
Arg Glu
Lys Asn
Asp lie 260 Lys Thr 275
Ser Lys Ser Cys Ser Leu
Ala
Pro
Gin 245 Ala
Thr
Leu
Ser
Ser 325
Pro
Gin 230 Val
Val
Pro
Thr
Val 310 Leu
lie 215
Val
Ser
Glu
Pro
Val 295 Met
Ser
Arg Val 1
Leu Lys
Pro Arg
Gly Asn
50 Tyr Ser 65
His Lys Val Thr
Ala
Ser
Glu
35
Ser
Leu
Val
Lys
Gly
20
Ala
Gin
Ser
Tyr
Ser 100
5
Thr
Lys
Glu
Ser
Ala
85
Phe
Ala
Val
Ser
Thr
70
Cys
Asn
Ser
Gin
Val 55
ILeu
Glu
Glu
Tyr
Leu
Trp
Val 280 Asp
His
Pro
Lys
Thr
Thr
Glu 265 Leu
Lys
Glu
Gly
Thr
Leu
Cys 250 Ser
Asp
Ser
Ala
Lys 330
lie
Pro 235 Leu
Asn
Ser
Arg
Leu 315
Ser 220 Pro
Val
Gly
Asp
Trp 300 His
Lys
Ser
!Lys
Gin
Gly 285 Gin
Asn
Ala
Arg
Gly
Pro 270 Ser
Gin
His
〈210〉 5 <211> 106 〈212〉 PRT
<213〉 K邵pa chain constant 〈400〉 5
Ala Pro Ser Val
Val
Trp
40
Thr
Thr
Val
Gly
Val
25
Lys
Glu
Leu
Thr
Glu 105
Phe 10 Cys
Val
Gin
Ser
His 90
Cys
Leu Leu Asn Asn 30
Asp Asn Ala Leu 45
Asp Ser Lys Asp 60
Lys Ala Asp Tyr 75
Gin Gly Leu Ser
<210> 6
〈211〉 231
〈212〉 PRT
〈213〉 Gammal chain
〈400〉 6
Gly Pro Gly Cys Asp 1 5 Glu Leu Leu Gly Gly 20
Asp Thr Leu Met lie
Fc Lys Pro Ser
Lys Gly
Glu Glu 240 Phe Tyr 255
Glu Asn
Phe Phe
Gly Asn
Tyr Thr 320
region amino acid sequence Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp
Glu Gin 15
Phe Tyr
Gin Ser
Ser Thr
Glu Lys
80 Ser Pro 95
region amino acid sequence
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 10
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 25 30 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
Ala Pro 15
Pro Lys Val Val35
Asp Val Ser His Glu 50
Gly Val Glu Val His 65
Asn Ser Thr Tyr Arg 85
Trp Leu Asn Gly Lys 100
Pro Ala Pro lie Glu 115
Glu Pro Gin Val Tyr 130
Asn Gin Val Ser Leu 145
lie Ala Val Glu Trp 165
Thr Thr Pro Pro Val 180
Lys Leu Thr Val Asp 195
Cys Ser Val Met His 210
Leu Ser !>eu Ser Pro 225
〈210> 7 〈211> 936 〈212〉 腿 〈213〉 VEGFRIg-L DNA sequence <400〉 7
tccgg已ggtagacctttcgtagtga犯tccccga已a(bǔ)ttatacacatgact60
g犯gg犯ggg3gctcgtcattccctgccgg gttacgtcacctaacatcactgttacttta120
3a3a^gtttccacttgacactttgatccctgatggaaa已cgcataatctg180
aagggcttc3tgcaacgtacggcttctgacctgtgaagca240
3C3gtc3atgggcatttgtatatctcacacatcg3c3a^ccaatacaatc300
atagatgtccaccacgccca gtcaaattacttELg3ggCC3360
ctcaattgtactgctaccactcccttgaacacgagagttcaa3tgacctggagttaccct420
ataagsgagcttccgta3ggcgacgaattgacca^gc^ttxccatgcc480
aacatattctacagtgttcttactattgac540
8LCt"tgtCg"tgt犯ggagtggaaatctgttaacacctcagtgcatatatat600
gcccgggcactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccstctgat660
gagcagttgsaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgsataacttctatcccaga720
ta^gtggaaggtggataacgccctccaatcgggt^ctcccagg卿gt780
gtcacagagcggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgsgc840
^agc3g3ctcaaagtctacgcctgcg犯gtcacccatcagggcctgagc900
Asp
Asn
70
Val
Glu
Lys
Thr
Thr 150 Glu
Leu
Lys
Glu
Gly 230
Pro
55
Ala
Val
Tyr
Thr
Leu 135 Cys
Ser
Asp
Ser
Ala 215 Lys
40 Glu
Lys
Ser
Lys
lie 120 Pro
Leu
Asn
Ser
Arg 200 Leu
Val Lys
Thr Lys
Val Leu
90 Cys Lys 105
Ser Lys
Pro Ser
Val Lys
Gly Gin 170 Asp Gly 185
Trp Gin
Phe
Pro
75
Thr
Val
Ala
Arg
Gly 155 Pro
Ser Gin His Asn His
Asn
60
Arg
Val
Ser
Lys
Glu 140 Phe
Glu
Phe
Gly
Tyr 220
45 Trp
Glu
Leu
Asn
Gly 125 Glu
Tyr
Asn
Phe
Asn 205 Thr
Tyr
Glu
His
Lys 110 Gin
Met
Pro
Asn
Leu 190 Val
Gin
Val
Gin
Gin
95
Ala
Pro
Thr
Ser
Tyr 175
Tyr
Phe Lys
Asp
Tyr
80
Asp
Leu
Arg
Lys
Asp 160 Lys
Ser
Ser
Sertcgcccgtca ca3agsgctt caacagggga gagtgt 〈210〉 8 <211〉 312 〈212〉 PRT
<213> VEGFRI g_L Amino acid sequence 簡> 8 Ser Gly Gly
936
1
lie
Ser
lie
lie
65
Thr
Thr
Leu
Leu
Lys 145 Asn
Lys
Val
Ala
Ser 225 Glu
Ser
Leu
Val
His
Pro
Pro
50
Ser
Val
Asn
Leu
Asn 130 Arg
lie
Gly
Asn
Ala 210 Gly
Ala
Gin
Ser
Tyr 290
Met
Asn
35
Asp
Asn
Asn
Thr
Arg 115 Thr
Ala
Phe
Leu
Thr 195 Pro
Thr
Lys
Glu
Ser 275 Ala
Arg
Thr
20
lie
Gly
Ala
Gly
lie 100 Gly
Arg
Ser
Tyr
Tyr 180 Ser
Ser
Ala
Val
Ser 260 Thr
Cys
Pro 5
Glu
Thr
Lys
Thr
His
85
lie
His
Val
Val
Ser 165 Thr
Val
Val
Ser
Gin 245 Val
Leu
Glu
Phe
Gly
Val
Arg
Tyr
70
Leu
Asp
Thr
Gin
Arg 150 Val
Cys
His
Phe
Val 230 Trp
Thr
Thr
Val
Val
Arg
Thr
lie
55
Lys
Tyr
Val
Leu
Met 135 Arg
Leu
Arg
lie
lie 215 Val
Lys
Glu
Leu
Thr 295
Glu
Glu
Leu
40
lie
Glu
Lys
Gin
Val 120 Thr
Arg
Thr
Val
Tyr 200 Phe
Cys
Val
Gin
Ser 280 His
Met Tyr Ser Glu lie Pro Glu lie
10 15 Leu Val lie Pro Cys Arg Val Thr 25 30 Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu 45
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe lie 60
lie Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala
75 80 Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gin
90 95 lie Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys 105 110 Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro 125
Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn 140
lie Asp Gin Ser Asn Ser His Ala 155 160 lie Asp Lys Met Gin Asn Lys Asp
170 175 Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser 185 190 Asp Lys Ala Gly Pro Gly Thr Val 205
Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys 220
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 235 240 Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn
250 255 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 265 270 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 285
Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 300
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys305 310
<210〉 9
<211> 1602
<212〉 腿
<213> VEGFRIg-H DNA sequence:
<400> 9
3gtgactactccatgacccccccgaccttg犯catcacggcgtcatcgac60
accggtgacagcctgtccatctcctgcaggggacagcaccccctcgagtgggcttggcca120
ggagctcaggaggcgccagccaccggagac肌ggac3gcg鄉(xiāng)3C3Cgggggtggtgcga180
gcacagacgccaggccctactgcaaggtgttgctgctgca cgaggtacat240
gCC犯Cg3C3C3ggC3gCt3cgtctgctactacasgtacatcaaggcacgcatcgagggc300
acc3Cggccgccagctcctacgtgttcgtgagcagccatt360
cctgacacgctcttggtcaagCC3tgtgggtgccctgtctggtgtccatc420
cccggcctcaStgtC3CgCtgcgctcgcaaagctcggtgctgtggcc柳cgggcaggsg■
gtggtgtgggatgaccggcggggcatgctcgtgtccsicgcCELCtgCtgCSLcgatgccctg540
tacctgcagtgCg3g￡LCC￡lCctgggg卿ccaggacttcctttccaaccccttcctggtg600
cacEitcacaggcgctagcacca^gggccc3tcggtcttccccctggcaccctcctccaag660
agcacctctgggggC3C3gCggccctgggctgcctggtcaaggsctacttccccgaaccg720
gtgscggtgtcgtgg犯ctcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtc780
ctacagtcctCgLggSLCtctaCtCCCtCSLgCagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttg840
ggcacccag3cctacatctgcsacgtg犯tgC^C3CC犯ggtgg3C卿900
卿gttgagcccaaatcttgcacacatgcccaccgtgccc960
ctcctggggggsccgtcagtcttcctcttcCCCCC33肌Cccaaggacaccctcatgatc1020
tcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtgg3Cgtg3gCC3Cg犯g3ccctgaggtc1080
ggtacgtggacggcgtggetggtgcataatggccgcgggag1140
a_C￡LgC3cgtaccgtgtggtcagcgtcctceiccgtcctgcaCC3gg3Ctgg1200
ctg犯tggcagtg③ggtcccctcccagcccccatcgag1260
aaaaccat ct鄉(xiāng)gc叫ccccgagaaccaccctgccccca1320
tcccggg鄉(xiāng)agatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaa aggcttctat1380
cccagcgacatcgccgtggaaatgggcagccggagaacaa1440
acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctstagcaagctcaccgtggac1500
ggC3gC鄉(xiāng)ggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatg3ggctctgcac1560
犯ccsctac3cgc卿卿gcctctccctgtccccgggta1602
<210〉 10 〈211〉 534 <212〉 PRT
〈213> VEGFRI g-H Amino acid sequence 〈400〉 10
Ser Asp Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn lie Thr Glu Glu Ser
15 10 15
His Val lie Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser lie Ser Cys Arg Gly Gin
20 25 30
His Pro Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gin Glu Ala Pro Ala Thr
35 40 45
Gly Asp Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu GlyThr
65
Ala
Arg
Phe
Lys
Val 145 Val
His
Phe
Gly
Gly 225 Val
Phe
Val
Val
Lys 305 Leu
Thr
Val
Val
Ser 385 Leu
50 Asp
Asn
lie
Glu
Asp 130 Thr
Val
Asp
Leu
Pro 210 Thr
Thr
Pro
Thr
Asn 290 Ser
Leu
Leu
Ser
Glu 370 Thr
Asn
Ala
Asp
Glu
Gin 115 Ala
Leu
Trp
Ala
Ser 195 Ser
Ala
Val
Ala
Val 275 His
Cys
Gly
Met
His 355 Val
Tyr
Gly
Arg
Thr
Gly 100
Pro
Met
Arg
Asp
Leu 180 Asn
Val
Ala
Ser
Val 260 Pro
Lys
Asp
Gly
lie 340 Glu
His
Arg
Lys
Pro
Gly
85
Thr
Phe
Trp
Ser
Asp 165 Tyr
Pro
Phe
L>eu
Trp 245 Leu
Ser
Pro
Lys
Pro 325 Ser
Asp
Asn
Val
Glu 405
Tyr 70
Ser
Thr
lie
Val
Gin 150 Arg
Leu
Phe
Pro
Gly 230 Asn
Gin
Ser
Ser
Thr 310
Ser
Arg
Pro
Ala
Val 390 Tyr
55 Cys
Tyr
Ala
Asn
Pro 135
Ser
Arg
Gin
Leu
Leu 215 Cys
Ser
Ser
Ser
Asn 295 His
Val
Thr
Glu
Lys 375 Ser
Lys
Lys
Val
Ala
Lys 120 Cys
Ser
Gly
Cys
Val 200 Ala
Leu
Gly
Ser
Leu 280 Thr
Thr
Phe
Pro
Val 360 Thr
Val
Cys
Val
Cys
Ser 105 Pro
Leu
Val
Met
Glu 185 His
Pro
Val
Ala
Gly 265 Gly
Lys
Cys
Leu
Glu 345 Lys
Lys
Leu
Lys
Leu
Tyr 90
Ser
Asp
Val
Leu
Leu 170 Thr
lie
Ser
Lys
Leu 250 Leu
Thr
Val
Pro
Phe 330 Val
Phe
Pro
Thr
Val 410
L>eu
75
Tyr
Tyr
Thr
Ser
Trp 155
Val
Thr
Thr
Ser
Asp 235 Thr
Tyr
Gin
Asp
Pro 315 Pro
Thr
Asn
Arg
Val 395 Ser
60 Leu
Lys
Val
Leu
lie 140 Pro
Ser
Trp
Gly
Lys 220 Tyr
Ser
Ser
Thr
Lys 300 Cys
Pro
Cys
Trp
Glu 380 Leu
Asn
His
Tyr
Phe
Leu 125 Pro
Asp
Thr
Gly
Ala 205 Ser
Phe
Gly
Leu
Tyr 285
Arg
Pro
Lys
Val
Tyr 365 Glu
His
Lys
Glu
lie
Val 110
Val
Gly
Gly
Pro
Asp 190 Ser
Thr
Pro
Val
Ser 270 lie
Val
Ala
Pro
Val 350 Val
Gin
Gin
Ala
Val
Lys
95
Arg
Asn
Leu
Gin
Leu 175 Gin
Thr
Ser
Glu
His 255 Ser
Cys
Glu
Pro
Lys 335 Val
Asp
Tyr
Asp
Leu 415
His
80
Ala
Asp
Arg
Asn
Glu 160 Leu
Asp
Lys
Gly
Pro 240 Thr
Val
Asn
Pro
Glu 320 Asp
Asp
Gly
Asn
Trp 400 ProAla Pro
Pro Gin
Gin Val 450 Ala Val 465
Thr Pro
lie
Val 435 Ser
Glu 420 Tyr
Thr Leu
Leu Thr Cys
Glu Trp Glu
Pro Val
Leu Thr Val
Ser Val
Met 515 Ser
Asp 500 His
Pro
Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 425 430 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
440 445 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 455 柳 Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 475 480 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
490 495 Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
505 510 Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 520 525
Leu 485 Lys
Glu
Gly
Ser 470 Asp
Ser
Ala
Lys
Ser Leu 530 〈210〉 11 〈211> 1926 <212〉 DNA
〈213〉 VEGFRFc DNA sequence 〈400〉 11 agtgactact accggtgsca ggagctcagg gactgcgagg gccaacgaca accacggccg cctgacacgc cccggcctca gtggtgtggg tacctgcagt cacatcacag 3ta_c3C3tga actgttactt tggg織gta acctgtgaag accaatacaa catactcttg tggagttacc aattcccatg 犯aggacttt gtgcatatat tgcccaccgt aaacccaagg gtgagccEicg
ccatgacccccccgaccttgaacatcacggcgtcatcgac60
gcctgtccatctcctgcaggggacagceiccccctcgagtgggcttggcca120
鄉(xiāng)cgccagccaccggagac犯gg3C3gCg鄉(xiāng)3C3Cgggggtggtgcga180
gca^gscgccaggccctactgca鄉(xiāng)tgttgctgctgcacgaggteicat240
caggcagctacgtctgctactC6LaggCaCgcatcgagggc300
ccagctcctacgtgttcgtgagagwtttgagcagccattcatc犯caag360
tcttggtcaagccstgtgggtgccctgtctggtgtxcatx420
已tgtcacgctgcgctcgcaaagctcggtgctgtggcc卿CgggC鄉(xiāng)3g480
atgaccggcggggcatgctcgtgtccacgccactgctgcacgatgccctg540
gcgagaccacctgggg卿ccaggacttcctttccaaccccttcctggtg600
gctccgg鄉(xiāng)tagacctttcgtag卿tgtccccgaaatt660
ctg卿g鄉(xiāng)ggagctcgtcattccctgccgggUscgtc720
t^a犯3gtttccacttgacactttgatccCtgatgg3￡L33cgcat犯tc780
gaaagggcttcatcatatcaagggcttctg840
caacagtcaatgggcatttgt3taagac犯actatctcacacatcgacaa900
tcatagatgtcca^at犯gc3C3CC3CgCCcagtcaaattacttag3ggc960
tcctcaattgtactgctaccactcccttgaacacga^gttc犯3tg已cc1020
a犯t犯gagagcttccgtaaggcg冗gaattgaccet犯gc1080
ctacagtgttcttactattg1140
atacttgtcgtgt鄉(xiāng)gagtggaccatcattca^atctgt1200
aggcccgggcg3gCCC犯3tcttgtgacaa1260
gcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttcccccca1320
acaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggac1380
6L6Lg8LCCCtg3ggtc肌gttctgg已cggcgt卿ggtgcat1440caaagccgcgtaca^cagc3cgtaccgtgtggtcagcgtc1500
ctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc犯ggagtggtctccaac1560
aaagccctcccagcccccatcgagaa^cca^tctcc犯3gccaaagggcagccccgsgaa1620
ccacaggtgtacaccctgcccccatctcgggagg卿tg3ggtcagcctg1680
acctgcctggtc^sggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg已gagcaatggg1740
cagccgg卿acaactacaagaccacgcctcccgtgctgg已ctccgacggctccttcttc1800
ctctatagcaagctcaccgtgg3C3卿gC鄉(xiāng)tggcsgc鄉(xiāng)gg犯cgtcttctcatgc1860
tccgtgatgcatgaggctctgc3ca^ccactacacgcagaag已gcctctxcctgtccccg1920
ggtaaa1926
〈210〉 12
〈211〉 642
〈212〉 PRT
〈213〉 VEGFRFc Amino acid sequence
Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn lie Thr Glu Glu Ser
5 10 15
Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser lie Ser Cys Arg Gly Gin 20 25 30
Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gin Glu Ala Pro Ala Thr
40 45 Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly
55 60 Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His 70 75 80
Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr lie Lys Ala
85 90 95
Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp 100 105 110
Pro Phe lie Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg
120 125 Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser lie Pro Gly Leu Asn
135 140 Arg Ser Gin Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gin Glu 150 155 160
Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu
165 170 175
Leu Tyr Leu Gin Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gin Asp 180 185 190
Asn Pro Phe Leu Val His lie Thr Gly Ser Gly Gly Arg
200 205 Glu Met Tyr Ser Glu lie Pro Glu lie lie His Met Thr
215 220 Glu Leu Val lie Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn lieThr Val
Lys Arg
Thr Tyr
His Leu 2卯 lie Asp 305
His Thr
Val Gin
Val Arg
Ser Veil 370 Thr Cys 385
Val His
Lys Thr
Pro Ser
Ser Arg 450 Asp Pro 465
Asn Ala
Val Val
Glu Tyr
Lys Thr 530 Thr Leu 545
Thr Cys Glu Ser Leu Asp
Thr
lie
Lys 275 Tyr
Val
Leu
Met
Arg 355 Leu
Arg
lie
His
Val 435 Thr
Glu
Lys
Ser
Lys 515 lie
Pro
Leu
Asn
Ser
Leu
lie 260 Glu
Lys
Gin
Val
Thr 340 Arg
Thr
Val
Tyr
Thr 420 Phe
Pro
Val
Thr
Val 500 Cys
Ser
Pro
Val
Gly 580 Asp
Lys 245 Trp
lie
Thr
lie
Leu 325 Trp
lie
lie
Arg
Asp 405 Cys
Leu
Glu
Lys
Lys 485 Leu
Lys
Lys
Ser
Lys 565 Gin
Gly
Lys
Asp
Gly
Asn
Ser 310 Asn
Ser
Asp
Asp
Ser 390 Lys
Pro
Phe
Val
Phe 470 Pro
Thr
Val
Ala
Arg 550 Gly
Pro
Ser
Phe
Ser
ILeu
Tyr 295 Thr
Cys
Tyr
Gin
Lys 375 Gly
Ala
Pro
Pro
Thr 455 Asn
Arg
Val
Ser
Lys 535 Glu
Pro
Arg
Leu 280 Leu
Pro
Thr
Pro
Ser 360 Met
Pro
Gly
Cys
Pro 440 Cys
Trp
Glu
Leu
Asn 520 Gly
Glu
Leu
Lys 265 Thr
Thr
Arg
Ala
Asp 345 Asn
Gin
Ser
Pro
Pro 425 Lys
Val
Tyr
Glu
His 505 Lys
Gin
Met
Asp 250 Gly
Cys
His
Pro
Thr 330 Glu
Ser
Asn
Phe
Gly 410 Ala
Pro
Val
Val
Gin 490 Gin
Ala
Pro
Thr
Phe Tyr Pro Ser 570
Glu Asn Asn Tyr 585
Phe Phe Leu Tyr
Thr
Phe
Giu
Arg
Val 315 Thr
Lys
His
Lys
Lys 395 Glu
Pro
Lys
Val
Asp 475 Tyr
Asp
Leu
Arg
Lys 555 Asp
Lys
Ser
Leu
lie
Ala
Gin 300 Lys
Pro
Asn
Ala
Asp 380 Ser
Pro
Glu
Asp
Asp 460 Gly
Asn
Trp
Pro
Glu 540 Asn
lie
Thr
Lys
lie Pro Asp Gly 255
lie Ser Asn Ala 270
Thr Val Asn Gly 285
Thr Asn Thr lie
Leu Leu Arg Gly 320
Leu Asn Thr Arg 335
Lys Arg Ala Ser 350
Asn lie Phe Tyr 365
Lys Gly Leu Tyr
Val
Lys
Leu
Thr 445 Val
Val
Ser
Leu
Ala 525 Pro
Asn
Ser
Leu 430 Leu
Ser
Glu
Thr
Asn 510 Pro
Gin
Thr
Cys 415 Gly
Met
His
Val
Tyr 495 Gly
lie
Val
Ser 400 Asp
Gly
lie
Glu
His 480 Arg
Lys
Glu
Tyr
Gin Val Ser Leu 560
Ala Val Glu Trp 575
Thr Pro Pro Val 590
Leu Thr Val Asp595 600 605
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
610 615 620
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 625 630 635 640
Gly Lys <210> 13 〈211> 936 <212> 飄
<213〉 VEGFRIg-LM DNA sequence <400> 13
tCCgg3ggt3gacctttcgtagtgaaatccccgaaattat60
g犯gg犯gggagctcgtcattccctgccgggttacgtcacctaacatcactgttacttta120
cacttgacactttgatccctg3tgg犯a^cgcatsatctg180
MgggCttC3tcatatcaaatgcaacgtacggcttctgacctgtga^gcs240
3C3gtC犯tgggC3tttgt3t^ga^ca^ctatctcacac8tCg3C犯3Ccaatacaatc300
alagatgtcc3CC3CgCCC3gtcaaattactta^gaggccatactcttgtc360
ctcaattgtactgctaccactcccttg朋c3cgag3gttc犯3tg3CCtgg3gttaccct420
ttCCgt￡lg￡lggacctgattgttcccatgcc480
aacatattctacagtgttcttactattgaca^犯tgcagaaggactttat540
acttgtcgtgta鄉(xiāng)agtggElCCELtC8LttCaaatctgttaacEicctcgig1:600
gcccgggcactgtggctgcaccatctgtcttcatxttcccgccatctgat660
gagcagttgatgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccaga720
g3ggcca犯gggtggat獄gccctxcaatcgggtaactccc已gg卿gt780
gtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagc840
a犯gcagsctcaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagc900
tcgcccgtceiC￡L￡L￡Lg3gCttgsgtgt936
〈210〉 14 〈211〉 312 〈212> PRT
<213> VEGFRIg-UI柳ino acid sequence <400〉 14
Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu lie Pro Glu lie
15 10 15
lie His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val lie Pro Cys Arg Val Thr
20 25 30
Ser Pro Asn lie Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu
35 40 45
lie Pro Asp Gly Lys Arg lie lie Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe lie
50 55 60
lie Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu lie Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala 65 70 75 80
Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gin
85 90 95
Thr Asn Thr lie lie Asp Val Gin lie Ser Thr Pro Arg Pro Val LysLeu Leu
Leu Asn 130 Lys Arg 145
Asn lie
Lys Gly
Val Asn
Ala Ala 210 Ser Gly 225
Glu Ala
Ser Gin
Leu Ser
Val Tyr 290 Lys Ser 305
Arg 115 Thr
Ala
Phe
Leu
Thr 195 Pro
Thr
Lys
Glu
Ser 275 Ala
Phe
100 Gly
Arg
Ser
Tyr
Tyr 180 Ser
Ser
Ala
Val
Ser 260 Thr
Cys
Asn
His
Val
Val
Ser 165 Thr
Val
Val
Ser
Gin 245 Val
Leu
Glu
Arg
Thr
Gin
Glu 150 Val
Cys
His
Phe
Val 230 Trp
Thr
Thr
Val
Gly 310
Leu
Met 135 Asp
Leu
Arg
lie
lie 215
Val
Lys
Glu
Leu
Thr 295 Glu
Val 120 Thr
Leu
Thr
Val
Tyr 200 Phe
Cys
Val
Gin
Ser 280 His
Cys
105 Leu
Trp
lie
lie
Arg 185 Asp
Pro
Leu
Asp
Asp 265 Lys
Gin
Asn
Ser
Asp
Asp 170
Ser
Lys
Pro
Ceu
Asn 250 Ser
Ala
Gly
Cys
Tyr
Gin 155 Lys
Gly
Ala
Ser
Asn 235 Ala
Lys
Asp
Leu
Thr
Pro 140
Ser
Met
Pro
Gly
Asp 220 Asn
L>eu
Asp
Tyr
Ser 300
Ala 125 Asp
110 Thr
Glu
Thr Lys
Pro Asn
Asn Ser His Ala 160
Gin Asn Lys Asp 175
Ser Phe L>ys Ser 190
Pro Gly Thr Val 205
Glu Gin Leu Lys
Phe Tyr Pro Arg 240
Gin Ser Gly Asn 255
Ser Thr Tyr Ser 270
Glu Lys His Lys 285
Ser Pro Val Thr
權(quán)利要求
1.一種可溶性雙功能VEGFR融合受體，為包含VEGFR1和VEGFR3在內(nèi)的融合蛋白，既能與VEGF和VEGF-B結(jié)合，還能與VEGF-C或VEGF-D相結(jié)合。
2. 權(quán)利要求1所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體，為VEGFRIg，其輕鏈的氨基 酸序列為SEQ ID N0:8所示，重鏈的氨基酸序列為SEQ ID N0:10所示。
3. 權(quán)利要求2所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體VEGFRIg的突變體，為 VEGFRIgM，其輕鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO: 14所示，重鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO: 10所示。
4. 權(quán)利要求1所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體，為VEGFRFc，其特征在于為 兩條相同的多肽鏈通過二硫鍵結(jié)合，其中多肽鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO: 12 所示。
5. —種分離的核酸分子，編碼權(quán)利要求1-4任一所述的可溶性雙功能VEGFR融 合受體。
6. —種分離的核酸分子，編碼權(quán)利要求2所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體 VEGFRIg，其中編碼輕鏈的核苷酸序列為SEQ ID N0:7，編碼重鏈的核苷酸序列 為SEQ ID NO:9。
7. —種分離的核酸分子，編碼權(quán)利要求3所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體 VEGFRIg的突變體VEGFRIgM,其中編碼輕鏈的核苷酸序列為SEQ ID N0:13，編 碼重鏈的核苷酸序列為SEQ ID N0:9。
8. —祌分離的核酸分子，編碼權(quán)利要求4所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體 VEGFRFc中的多肽鏈，具有SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。
9. 一種載體，含有權(quán)利要求5、 6、 7、 8任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，其中載體可以為pDRl， pcDNA3. 1 (O ， pc認(rèn)A3. VZE0(+) ， pDHFR之---。
10. 權(quán)利要求9所述的載體，為pcDNA3. 1 ( + )或pcDNA3. 1/ZE0(+)。
11. 一種宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求9所述的載體，為真核細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，為哺乳動物細(xì)胞。
13. 權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，為CH0細(xì)胞。
14. 一種制備權(quán)利要求1-4任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體的方法，該 方法包括a) 在表達(dá)條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求11-13任一所述的宿主細(xì)胞，表達(dá)雙功能融合受體，b) 分離或純化所述的雙功能融合受體。
15. —種組合物，含有權(quán)利要求1-4任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體和 藥學(xué)上可接受的載體。
16. 權(quán)利要求1-4任一所述的可溶性雙功能VEGFR融合受體在制備抗腫瘤藥物中 的用途。
17. 權(quán)利要求15所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
18. 權(quán)利要求16、 17任一所述的用途，還包括和其它的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可溶性VEGFR雙功能融合受體、其制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明公開了可溶性VEGFR雙功能融合受體VEGFRFc、VEGFRIg和VEGFRIg的突變體VEGFRIg及這些雙功能融合受體的制備方法，這些雙功能融合受體即能與VEGF和VEGF-B結(jié)合，還能與VEGF-C或VEGF-D相結(jié)合，可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號C07K19/00GK101575379SQ20081004335
公開日2009年11月11日 申請日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者盛 侯, 庚 寇, 張大鵬, 李博華, 皓 王, 郭亞軍, 錢衛(wèi)珠 申請人:上海中信國健藥業(yè)有限公司;上海國健生物技術(shù)研究院