專利名稱：：高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新生牛血清的生產(chǎn)工藝，尤其是涉及一種高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
：目前，通常情況下大規(guī)模生產(chǎn)的新生牛新血清在通過連續(xù)三道100nm過濾后，經(jīng)噬斑法檢測(cè)噬菌體陽(yáng)性率超過90%。為保證生物制品的安全性，這些感染了噬菌體的新生牛血清需要經(jīng)過一定劑量的伽馬射線輻照，輻照后可使噬菌體陽(yáng)性血清轉(zhuǎn)陰，但同時(shí)由于輻照對(duì)各種生長(zhǎng)因子、激素類均有不同程度的影響，隨之影響了其在細(xì)胞培養(yǎng)中的效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種合理簡(jiǎn)單、細(xì)胞培養(yǎng)效果良好的高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝，其特征在于，該生產(chǎn)工藝包括以下步驟將新生牛血清通過10000道爾頓超濾膜，再通過切向超濾法將血清分為超濾液部分和濃縮液部分，將濃縮液部分通過伽馬射線輻照后和超濾液部分合并，合并后重新過濾，得到高融合率無噬菌體新生牛血清。所述的切向超濾法是溶液在壓力推動(dòng)下，流經(jīng)膜表面，小于膜孔的溶劑及小分子量的生長(zhǎng)因子、激素透過超濾膜，成為超濾液，比膜孔大的溶質(zhì)及溶質(zhì)集團(tuán)白蛋白、球蛋白、各種牛病毒、噬菌體、大部分熱源質(zhì)等被截留，隨水流排出，成為濃縮液。所述的切向超濾法為動(dòng)態(tài)過濾，分離是在流動(dòng)狀態(tài)下完成的，溶質(zhì)僅在膜表面有限沉積，超濾速率衰減到一定程度而趨于平衡，且通過清洗可以恢復(fù)。所述的超濾液部分包含各種小分子量的生長(zhǎng)因子、激素等。所述的濃縮液部分包含大分子量的白蛋白、球蛋白、各種牛病毒、噬菌體、大部分熱源質(zhì)以及少量生長(zhǎng)因子、激素。所述的伽馬射線輻照的劑量為824KGy。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝合理簡(jiǎn)單，避免了小分子量的生長(zhǎng)因子、激素類在殺滅噬菌體、病毒過程時(shí)的輻照環(huán)節(jié)，最大程度地保留了新生牛血清原有的品質(zhì)，得到的新生牛血清在保證質(zhì)量前提下大大提高細(xì)胞培養(yǎng)效果。圖1為本發(fā)明高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝流程圖；圖2為SP2/0細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。具體實(shí)施例方式下面對(duì)照附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例11.材料1.1SP2/0細(xì)胞由上海細(xì)胞庫(kù)提供，牛腎原代細(xì)胞自采1.2新生牛血清上海依科賽批號(hào)0612211.3DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基由GIBCO公司提供1.4伽瑪射線輻照由中國(guó)科學(xué)院上海輻照中心提供1.5過濾及超濾系統(tǒng)由美國(guó)millipore公司提供2.方法2.1新生牛血清處理試驗(yàn)組如圖1所示，將已知噬菌體陽(yáng)性的新生牛血清(061221)25000萬毫升通過10000分子量膜超濾分成21000ml濾過液和3500ml濃縮液，分別無菌分裝至包裝瓶?jī)?nèi)，將3500ml濃縮液進(jìn)行伽馬射線輻照，劑量為20KGy，將輻照后的濃縮液與濾過液合并后無菌過濾；對(duì)照組將已知噬菌體陽(yáng)性的新生牛血清(061221)25000萬毫升進(jìn)行伽馬射線輻照，劑量為8KGy。2.2新生牛血清理化指標(biāo)檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組及原批號(hào)按照中國(guó)藥典2005版的小牛血清質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)。2.2.1蛋白含量測(cè)定方法用Lowry法2.2.2無菌檢査方法按2005版中國(guó)藥典附錄XIIA2.2.3細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定方法按2005版中國(guó)藥典附錄XHE凝膠限量試驗(yàn)2.2.4牛腹瀉病毒檢測(cè)方法培養(yǎng)法牛腎原代細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種等量供試品，37t:培養(yǎng)57天觀察細(xì)胞病變，同時(shí)設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照。2.2.5血紅蛋白含量測(cè)定方法用氰化高鐵法2.2.6大腸桿菌噬菌體檢測(cè)方法采用噬斑法和增值法2.2.7支原體試驗(yàn)方法采用培養(yǎng)法和DNA染色法2.3新生牛血清促細(xì)胞生長(zhǎng)檢查2.3.1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法取供試品，按10%濃度配制細(xì)胞培養(yǎng)液，按每ml含104的細(xì)胞濃度接種細(xì)胞，每天計(jì)數(shù)活細(xì)胞，連續(xù)觀察一周，并繪制生長(zhǎng)曲線。2.3.2細(xì)胞培增時(shí)間的測(cè)定方法按生長(zhǎng)曲線計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間，取細(xì)胞峰值前一天的細(xì)胞計(jì)數(shù)(Y)、接種細(xì)胞數(shù)(X)及生長(zhǎng)時(shí)間(T)計(jì)算倍增時(shí)間^T/A(A=log2Y/X)2.3.3克隆率的測(cè)定方法按有限稀釋法將細(xì)胞稀釋，并按每孔1個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37'C、5%二氧化碳培養(yǎng)一周后計(jì)算克隆率克隆率A/B(A為細(xì)胞生長(zhǎng)陽(yáng)性孔數(shù)，B為接種細(xì)胞的總孔數(shù))3.結(jié)果3.1新生牛血清理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注上表中g(shù)。/。為g/100ml。3.2促細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果3.2.1SP2/0細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖2所示，SP2/0細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，圖中橫軸單位為天，豎軸單位為(xlO'個(gè)/ml)。3.2.2促SP2/0細(xì)胞生長(zhǎng)檢査結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例2參見圖1所示，一種高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝，該生產(chǎn)工藝包括以下步驟將新生牛血清通過10000道爾頓超濾膜，再通過切向超濾法將血清分為超濾液部分和濃縮液部分，超濾液部分包含各種小分子量的生長(zhǎng)因子、激素等，濃縮液部分包含大分子量的白蛋白、球蛋白、各種牛病毒、噬菌體、大部分熱源質(zhì)以及少量生長(zhǎng)因子、激素，將濃縮液部分通過伽馬射線輻照(劑量為824KGy)后和超濾液部分合并，合并后重新過濾，得到高融合率無噬菌體新生牛血清。超濾是以壓力為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)之一，是以大分子與小分子分離為目的，膜孔徑在20—1000A。之間。切向超濾法是溶液在壓力推動(dòng)下，流經(jīng)膜表面，小于膜孔的溶劑及小分子量的生長(zhǎng)因子、激素透過超濾膜，成為超濾液，比膜孔大的溶質(zhì)及溶質(zhì)集團(tuán)白蛋白、球蛋白、各種牛病毒、噬菌體、大部分熱源質(zhì)等被截留，隨水流排出，成為濃縮液，切向超濾法為動(dòng)態(tài)過濾，分離是在流動(dòng)狀態(tài)下完成的，溶質(zhì)僅在膜表面有限沉積，超濾速率衰減到一定程度而趨于平衡，且通過清洗可以恢復(fù)。權(quán)利要求1.高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝，其特征在于，該生產(chǎn)工藝包括以下步驟將新生牛血清通過10000道爾頓超濾膜，再通過切向超濾法將血清分為超濾液部分和濃縮液部分，將濃縮液部分通過伽馬射線輻照后和超濾液部分合并，合并后重新過濾，得到高融合率無噬菌體新生牛血清。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的切向超濾法是溶液在壓力推動(dòng)下，流經(jīng)膜表面，小于膜孔的溶劑及小分子量的生長(zhǎng)因子、激素透過超濾膜，成為超濾液，比膜孔大的溶質(zhì)及溶質(zhì)集團(tuán)白蛋白、球蛋白、各種牛病毒、噬菌體、大部分熱源質(zhì)等被截留，隨水流排出，成為濃縮液。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的切向超濾法為動(dòng)態(tài)過濾，分離是在流動(dòng)狀態(tài)下完成的，溶質(zhì)僅在膜表面有限沉積，超濾速率衰減到一定程度而趨于平衡，且通過清洗可以恢復(fù)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的超濾液部分包含各種小分子量的生長(zhǎng)因子、激素等。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的濃縮液部分包含大分子量的白蛋白、球蛋白、各種牛病毒、噬菌體、大部分熱源質(zhì)以及少量生長(zhǎng)因子、激素。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的伽馬射線輻照的劑量為824KGy。全文摘要本發(fā)明涉及一種高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝，該生產(chǎn)工藝包括以下步驟將新生牛血清通過10000道爾頓超濾膜，再通過切向超濾法將血清分為超濾液部分和濃縮液部分，超濾液部分包含各種小分子量的生長(zhǎng)因子、激素，濃縮液部分包含大分子量的各種牛病毒、噬菌體、大部分熱源質(zhì)等，將濃縮液部分通過伽馬射線輻照后和超濾液部分合并，合并后重新過濾，得到高融合率無噬菌體新生牛血清。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的高融合率無噬菌體新生牛血清的生產(chǎn)工藝合理簡(jiǎn)單，避免了小分子量的生長(zhǎng)因子、激素類在殺滅噬菌體、病毒過程時(shí)的輻照環(huán)節(jié)，最大程度地保留了新生牛血清原有的品質(zhì)，得到的新生牛血清在保證質(zhì)量前提下大大提高細(xì)胞培養(yǎng)效果。文檔編號(hào)C07K1/00GK101497649SQ20081003335公開日2009年8月5日申請(qǐng)日期2008年1月31日優(yōu)先權(quán)日2008年1月31日發(fā)明者褚震宇申請(qǐng)人:上海依科賽生物制品有限公司