專利名稱：：一種新生牛血清的分類生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新生牛血清的分類生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
：目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的牛血清均按照國(guó)標(biāo)規(guī)定內(nèi)容生產(chǎn)。國(guó)標(biāo)對(duì)新生牛血清產(chǎn)品規(guī)定符合如下要求1:新生牛血清根據(jù)出生后時(shí)間的不同(0.5小時(shí)內(nèi)、出生2小時(shí)內(nèi)、出生4小時(shí)內(nèi)、出生14小時(shí)內(nèi))分為頂級(jí)、超級(jí)、特級(jí)和普通4級(jí)；2:規(guī)定蛋白總量為3.5-5.0(W/V')血紅蛋白含量《0.035(W/V),內(nèi)毒素含量《10EU/ml，無(wú)菌試驗(yàn)陰性、支原體陰性和大腸桿菌噬菌體陰性；3:牛腹瀉病毒抗體和口蹄疫抗體陰性；4:并對(duì)血清促進(jìn)BHK細(xì)胞和SP2/0的細(xì)胞生長(zhǎng)的情況做了規(guī)定(詳見表12)。本申請(qǐng)的發(fā)明人在向各畜牧疫苗生產(chǎn)單位供應(yīng)新生牛血清產(chǎn)品的過程中發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)不同的疫苗，需要不同品質(zhì)的新生牛血清。比如豬瘟疫苗使用牛睪丸原代細(xì)胞株、要求牛睪丸原代細(xì)胞生長(zhǎng)良好，牛腹瀉病毒抗體陰性、豬瘟病毒抗體陰性；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)疫苗病毒使用MARC145細(xì)胞株、要求MARC145細(xì)胞生長(zhǎng)良好，豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陰性;偽狂犬疫苗病毒用Vero細(xì)胞株、要求Vero細(xì)胞生長(zhǎng)良好，偽狂犬病毒抗體陰性；細(xì)小疫苗病毒采用ST細(xì)胞株、要求ST細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)小病毒抗體陰性，乙型腦炎疫苗病毒使用BHK細(xì)胞株也要求相應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，抗體陰性等。目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)畜牧業(yè)疫苗有十幾種，理論上應(yīng)該有符合十幾種疫苗生產(chǎn)需要的不同品質(zhì)的新生牛血清產(chǎn)品才能滿足市場(chǎng)要求，而國(guó)標(biāo)只規(guī)定了新生牛出生時(shí)間、蛋白含量、血紅蛋白、微生物學(xué)指標(biāo)以及SP2/0細(xì)胞株、BHK細(xì)胞株生長(zhǎng)的狀況和口蹄疫抗體和牛腹瀉病毒抗體作為產(chǎn)品的優(yōu)劣分類標(biāo)準(zhǔn)，缺乏用途分類標(biāo)準(zhǔn)。雖然可見用A549細(xì)胞做貼壁效率、用SP2/0細(xì)胞做克隆效率來衡量血清質(zhì)量的資料，但是，沒有人采用針對(duì)生產(chǎn)目的不同，選擇不同細(xì)胞譜做細(xì)胞增殖試驗(yàn)或貼壁試驗(yàn)，也未見針對(duì)生產(chǎn)目的對(duì)血清抗體檢測(cè)對(duì)新生牛血清分類的資料和產(chǎn)品。這樣，迫使疫苗生產(chǎn)廠家在生產(chǎn)疫苗前首先運(yùn)行血清篩選程序，造成成本的上升和浪費(fèi)。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種針對(duì)畜牧業(yè)不同疫苗專一用途的新生牛血清的新的分類生產(chǎn)工藝。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種新生牛血清的分類生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟(1)原料新生牛血清的生產(chǎn)采用無(wú)支原體采血法采取新生牛血清，并通過建立檔案，使原料血清具有明確的溯源性，檔案內(nèi)容包括a新生牛血清編號(hào)；b新生牛的隸屬關(guān)系；C出生地；d出生時(shí)間；e取血時(shí)間；f—般情況體重、精神情況，有無(wú)進(jìn)食，有無(wú)腹瀉，體表粘液；g新生牛母親的健康狀況；h母牛疫苗接種史；i母牛病史1年來有無(wú)發(fā)生明顯疾?。籮周圍牛群的疫情發(fā)生情況3年來有無(wú)發(fā)生疫情；k周圍畜牧養(yǎng)殖動(dòng)物3年來的疫情情況。(2)檢驗(yàn)對(duì)上述采取的新生牛血清進(jìn)行蛋白、血紅蛋白、細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)、微生物學(xué)檢測(cè)和抗體檢測(cè)。其中，蛋白、血紅蛋白、細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)均按國(guó)標(biāo)允許方法，采用公知技術(shù)檢測(cè)；微生物學(xué)檢測(cè)包括細(xì)菌、真菌、支原體、大腸桿菌噬菌體(E，ColiC300orK-12)檢測(cè)，均按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)允許方法進(jìn)行。(3)第一次分類相同抗體背景者歸類。(4)合并混勻?qū)⑸鲜隹贵w背景相同的血清在無(wú)菌混合罐中合并混勻。(5)將上述混勻的血清打入終末濾網(wǎng)為0.2P的多級(jí)過濾系統(tǒng)，無(wú)菌罐裝系統(tǒng)罐裝(多級(jí)過濾系統(tǒng)、無(wú)菌灌裝系統(tǒng)均為公知技術(shù)，工廠生產(chǎn)時(shí)的常規(guī)技術(shù))。所述步驟(5)后還包括以下步驟(6)抽樣進(jìn)行細(xì)胞增殖譜檢驗(yàn)和基礎(chǔ)質(zhì)控。所述細(xì)胞增殖譜檢驗(yàn)包括傳代細(xì)胞培養(yǎng)增殖試驗(yàn)和原代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)。所述傳代細(xì)胞培養(yǎng)增殖試驗(yàn)包括MARC145細(xì)胞增殖試驗(yàn)、Vero細(xì)胞增殖試驗(yàn)、ST細(xì)胞增殖試驗(yàn)、PK15細(xì)胞增殖試驗(yàn)和BHK細(xì)胞增殖試驗(yàn)；將能夠連續(xù)傳代6代并細(xì)胞形態(tài)良好、增殖效率高于90%、貼壁效率和克隆效率與對(duì)照血清相當(dāng)作為分類標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行下一步分類。所述原代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)為牛睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)新生牛睪丸進(jìn)行培養(yǎng)，原代牛睪丸細(xì)胞培養(yǎng)16或48h長(zhǎng)成單層作為分類標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行下一步分類。所述基礎(chǔ)質(zhì)控包括微生物學(xué)檢測(cè)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)、pH檢測(cè)、病毒抗體檢測(cè)；對(duì)于細(xì)胞增殖譜檢驗(yàn)。(7)分類根據(jù)上述傳代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果和原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果，結(jié)合抗體檢測(cè)結(jié)果，將血清進(jìn)行總分類。(8)賦予檔案和標(biāo)簽。所述步驟(2)中的抗體檢測(cè)包括牛腹瀉病毒抗體檢測(cè)、口蹄疫抗體檢測(cè)、豬瘟病毒抗體檢測(cè)、乙型腦炎病毒抗體檢測(cè)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒抗體檢測(cè)、偽狂犬病毒抗體檢測(cè)、細(xì)小病毒抗體檢測(cè)和豬流行性腹瀉病毒抗體檢測(cè)。方法采用間接ELISA方法。所述步驟(4)具體為在GMP車間內(nèi)，將裝有原料新生牛血清的采血袋在十萬(wàn)級(jí)條件下浸泡體積比為7278%的乙醇1020min，殺滅容器表面細(xì)菌、支原體等微生物，然后傳遞窗進(jìn)入百級(jí)車間，在百級(jí)條件下晾干并將袋中血清傾入無(wú)菌混合罐中，攪拌混勻。所述步驟(7)中的分類包括以下幾類(D豬瘟疫苗病毒生產(chǎn)專用血清牛睪丸細(xì)胞生長(zhǎng)良好、不含豬瘟病毒抗體和牛腹瀉病毒抗體的血清；②動(dòng)物乙型腦炎病毒疫苗生產(chǎn)專用血清朋K細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含有乙型腦炎病毒抗體的血清；③豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒疫苗生產(chǎn)專用血清MARC145細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒抗體的血清；④口蹄疫病毒疫苗生產(chǎn)專用血清BHK細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含有口蹄疫病毒抗體的血清；偽狂犬疫苗病毒生產(chǎn)專用血清Vero細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含有偽狂犬病毒抗體的血清；細(xì)小疫苗病毒生產(chǎn)專用血清ST、PK15細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含細(xì)小病毒抗體昨血清；⑦豬流行性腹瀉病毒ST細(xì)胞、Vero生長(zhǎng)良好，不含豬流行性腹瀉病毒抗體的血清；⑧圓環(huán)病毒ST細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含有豬流行性腹瀉病毒抗體的血清。所述步驟(8)中的檔案包括(D本批次新生牛血清的混合檔案由哪些新生小牛的血清組成；②每只新生牛血清編號(hào)、新生牛的隸屬關(guān)系、出生地、出生時(shí)間、取血時(shí)間、體重、精神情況、進(jìn)食情況、有無(wú)腹瀉，體表粘液、新生牛母親的健康狀況；母牛疫苗接種史、母牛病史l年來有無(wú)發(fā)生明顯疾?。恢車Ｈ旱囊咔榘l(fā)生情況3年來有無(wú)發(fā)生疫情、周圍畜牧養(yǎng)殖動(dòng)物3年來的疫情情況、細(xì)胞增殖譜、病毒抗體背景。-所述傳代細(xì)胞培養(yǎng)增殖試驗(yàn)具體步驟為先將抽檢血清配制成血清含量為10X的MEM、DMEM培養(yǎng)液備用；然后將培養(yǎng)成單層的瓶?jī)?nèi)細(xì)胞用常規(guī)方法消化，用上述培養(yǎng)基分散傳代6代，'第7代時(shí)做細(xì)胞相對(duì)增值率、細(xì)胞貼壁率和克隆效果試驗(yàn)評(píng)價(jià)血清質(zhì)量。細(xì)胞培養(yǎng)譜包括MARC145(豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗病毒生產(chǎn))、Vero(偽狂犬疫苗病毒生產(chǎn))細(xì)胞、ST細(xì)胞(細(xì)小、豬流行性腹瀉病毒、圓環(huán)疫苗病毒生產(chǎn))、PK15細(xì)胞(細(xì)小疫苗病毒疫苗生產(chǎn))和國(guó)標(biāo)規(guī)定的BHK細(xì)胞(乙型腦炎病毒、口蹄疫病毒)。細(xì)胞相對(duì)增殖率按照細(xì)胞一般傳代比例接種96孔板，37'C±rC、濕潤(rùn)5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，鏡下觀察觀察結(jié)合中性紅染色測(cè)定A540值計(jì)算細(xì)胞增值率，與對(duì)照血清組比較，細(xì)胞相對(duì)增值率>90%者判為合格。細(xì)胞相對(duì)增值率=(試驗(yàn)孔A540均值/對(duì)照血清A540均值)X100%。貼壁效率和相對(duì)貼壁效率將受試血清配置成10%的細(xì)胞培養(yǎng)液體，然后將上述細(xì)胞配置成20個(gè)細(xì)胞/ml，分別接種于采用24孔培養(yǎng)中，每種細(xì)胞接種3孔，37°C±2'C、濕潤(rùn)5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)710d,結(jié)晶紫染色，計(jì)算細(xì)胞克隆，確定貼壁效率和相對(duì)貼壁效率。同時(shí)設(shè)計(jì)用己知血清作為對(duì)照。貼壁效率(％)=(每孔克隆平均數(shù)/每孔接種活細(xì)胞平均數(shù))X00%。相對(duì)貼壁效率=被測(cè)血清貼壁效率/參考血清貼壁效率。克隆效果測(cè)定采用SP2/0細(xì)胞。將SP2/0用RPMI—1640培養(yǎng)液(血清含量10%,用受試血清配置)配置成1.5個(gè)細(xì)胞/100叱，每孔接種IOO叱37。C士2'C、濕潤(rùn)條件、5%二氧化碳培養(yǎng)710d后顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆效率和相對(duì)克隆效率。同時(shí)設(shè)計(jì)用已知血清作為對(duì)照?？寺⌒?(陽(yáng)性孔平均數(shù)/培養(yǎng)孔總數(shù))X100%。相對(duì)克隆效率=待測(cè)血清克隆效率/參考血清克隆效率。以能夠連續(xù)傳代6代并細(xì)胞形態(tài)良好、增殖效率高于9096、貼壁效率和克隆效率與對(duì)照血清相當(dāng)為依據(jù)，標(biāo)注細(xì)胞生長(zhǎng)譜，與抗體譜一起作為確定血清用途的依據(jù)。所述牛睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)具體為將2%碘酒滅菌的新生牛睪丸剝離，置平皿中用磷酸鹽緩沖鹽水洗3次，剪至約11113以下，加0.25y。胰酶37。C消化20min,1000r/min離心5min，棄胰酶，加含受試血清的培養(yǎng)液置37。C靜止培養(yǎng)。分別于16h、48h觀察形成單層情況。原代牛睪丸細(xì)胞于16或48h長(zhǎng)成單層為依據(jù)，進(jìn)行下一步分類。本發(fā)明設(shè)計(jì)了新的新生牛血清的分類平臺(tái)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，增加了兩個(gè)程序多種抗體檢測(cè)分類程序和多種細(xì)胞培養(yǎng)分類程序，每份原料血清首先運(yùn)行抗體檢測(cè)程序、根據(jù)抗體譜進(jìn)行分類合并，抗體背景相同者為一類，然后抗體背景為依據(jù)，再運(yùn)行細(xì)胞增殖譜程序，最后根據(jù)細(xì)胞增殖情況和抗體背景，將血清做用途分類，這樣滿足了生物藥業(yè)生產(chǎn)不同疫苗需求不同血清的需求。多種抗體檢測(cè)分類程序?qū)⒃涎逯鸱葸\(yùn)行抗體檢測(cè)程序，抗體譜包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒抗體、細(xì)小病毒抗體、豬瘟病毒抗體、乙型腦炎病毒抗體、偽狂犬病毒抗體、圓環(huán)病毒抗體和口蹄疫病毒抗體，檢測(cè)方法為間接ELISA法。多種細(xì)胞培養(yǎng)分類程序由于生產(chǎn)疫苗種類的不同，對(duì)抗體背景和細(xì)胞增殖譜的要求各異，因此，首先根據(jù)抗體檢測(cè)結(jié)果、確定血清用途，然后有針對(duì)性地進(jìn)行細(xì)胞增殖譜試驗(yàn)，即在原來國(guó)標(biāo)規(guī)定SP2/0細(xì)胞、BHK細(xì)胞試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)抗體背景，擴(kuò)充牛睪丸原代細(xì)胞、MARC1457細(xì)胞株、Vero細(xì)胞株、ST細(xì)胞株、CH0細(xì)胞株，并在疫苗廠家有特殊要求時(shí)及時(shí)擴(kuò)充細(xì)胞增殖譜。在抗體背景一致、相應(yīng)細(xì)胞增殖良好的條件下，將血清產(chǎn)品確定為某種疫苗專一用途血清。經(jīng)過抗體檢測(cè)和細(xì)胞增殖譜檢驗(yàn)的血清具有抗體背景明確、細(xì)胞生長(zhǎng)良好、分類細(xì)致、具有專一疫苗生產(chǎn)用途的特點(diǎn)，適用于畜牧業(yè)疫苗藥業(yè)。本發(fā)明的工藝生產(chǎn)的牛血清分類明確、用途專一，可以滿足生物藥物廠的生產(chǎn)要求，廠家可以根據(jù)生產(chǎn)疫苗的不同而購(gòu)買不同的專用血清。比如豬瘟病毒疫苗的生產(chǎn)，目前國(guó)內(nèi)畜牧養(yǎng)殖業(yè)豬瘟病毒疫苗的需求極大，但是豬瘟疫苗的生產(chǎn)成本居高不下，主要原因就是市場(chǎng)流通的血清缺乏多種細(xì)胞培養(yǎng)分類程序和多種抗體檢測(cè)程序的支持，不能保障培養(yǎng)出的牛睪丸細(xì)胞每批均處于旺盛生長(zhǎng)狀況，從而使增殖的病毒效價(jià)都能達(dá)到要求效價(jià)，最終產(chǎn)生不合格產(chǎn)品造成浪費(fèi)。只有運(yùn)行牛睪丸細(xì)胞增殖試驗(yàn)作為新生牛血清分類程序，才能保障疫苗廠家每批產(chǎn)品的質(zhì)量，杜絕廢品產(chǎn)生，從而提高生產(chǎn)質(zhì)量、縮短生產(chǎn)周期、降低消耗、減少投入，節(jié)省人力物力，增加產(chǎn)出比。而且即便培養(yǎng)的細(xì)胞處于旺盛狀況，也不能保障生產(chǎn)的疫苗病毒效價(jià)符合要求，因?yàn)樾律Ｑ逯锌赡芎心承┎《究贵w，比如，生產(chǎn)豬瘟疫苗血清不能有豬瘟病毒抗體和牛腹瀉病毒抗體，因?yàn)樵搩煞N病毒親緣關(guān)系密切，其中之一的中和抗體陽(yáng)性都會(huì)對(duì)豬瘟疫苗病毒增殖產(chǎn)生特異性的抑制作用，從而減少了不合格產(chǎn)品。因此除了細(xì)胞增殖試驗(yàn)，抗體檢測(cè)程序的運(yùn)行在血清分類中非常重要。其他疫苗的生產(chǎn)也存在相同道理。因此，將多種細(xì)胞(尤其專用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞)用于增殖試驗(yàn)，以及采用多種病毒抗體檢測(cè)作為分類和質(zhì)控程序生產(chǎn)疫苗專用血清，正是市場(chǎng)之急需，是提高疫苗質(zhì)量，降低消耗、降低成本之良策。具體實(shí)施方式*下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例l:畜牧業(yè)不同疫苗專一用途新生牛血清分類生產(chǎn)，步驟如下1原料新生牛血清新生牛血清來源于50頭新生小牛，編號(hào)200800001~200800050，每份原料新生牛血清分別有待檢小樣5份。2原料新生牛血清的檢測(cè)-2.1微生物學(xué)檢測(cè)2.1.1細(xì)菌檢測(cè)將留樣10份血清多留樣①分別接種肉湯液體培養(yǎng)基2份分別置37'C、25'C培養(yǎng)715d，觀察培養(yǎng)基混濁變化，并涂片做革蘭氏染色，顯微鏡下尋找桿狀或球狀等規(guī)則、類似微生物的形態(tài)。同時(shí)將10份留樣O)接種真菌固體培養(yǎng)，分別置37'C、25'C培養(yǎng)1020d，觀察真菌菌落的生長(zhǎng)情況。結(jié)果空白對(duì)照肉湯培養(yǎng)基澄清透明，染色未觀察到規(guī)則形態(tài)；真菌培養(yǎng)皿未見菌絲體生長(zhǎng)。編號(hào)20080001、20080029、200800042原料血清培養(yǎng)基渾濁，有細(xì)菌污染，剔除。2.1.2支原體檢測(cè)將留樣(D分別穿刺接種牛心浸液半固體培養(yǎng)基(雙份)，分別置37'C和25'C培養(yǎng)20d以上，以云霧狀菌落生長(zhǎng)判斷支原體陽(yáng)性，并涂片做革蘭氏染色，顯微鏡'觀察規(guī)則形態(tài)。結(jié)果空白培養(yǎng)基未見云霧狀菌落生長(zhǎng)，編號(hào)養(yǎng)基20080029、200800042、200800045培養(yǎng)基可見云霧狀菌落生長(zhǎng)，剔除。2.1.3:E.ColiC300(或K-12)噬菌體檢測(cè)將大腸桿菌分別接種肉湯培養(yǎng)基37"C培養(yǎng)16h，660nm測(cè)定0D值，然后將47份原料血清留樣①各100微升，分別接種于.上述細(xì)菌管中，37'C孵育24小時(shí)，再于660nm測(cè)定OD值，0D值有下降1/3則判定為有大腸桿菌噬菌體污染。結(jié)果大腸桿菌培養(yǎng)16小時(shí)，OD值在1.011.78之間，接種血清后繼續(xù)培養(yǎng)0D值均有顯著上升，OD值在1.472.04之間。OD值無(wú)下降，表明所檢血清無(wú)E.ColiC300orK-12噬菌體污染。2.3細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，使用湛江博康海洋生物有限公司檢測(cè)試劑盒。將鱟試劑用無(wú)內(nèi)毒素蒸餾水溶解，然后分別加入稀釋40倍的原料血清留洋②100W與鱟試劑混合，同時(shí)設(shè)有陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，37'C孵育1小時(shí)后通過觀察凝集情況判斷標(biāo)本中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量范圍。結(jié)果，血清標(biāo)本均未發(fā)生凝集，表明血清中的細(xì)菌內(nèi)毒素低于O.125EU/ml(試劑盒檢測(cè)限量為0.125EU/ml)，符合國(guó)標(biāo)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)(國(guó)標(biāo)要求10EU/ml)。2.4血清蛋白含量檢測(cè)使用上海尚誼化工科技有限公司BCA試劑盒。將原料血清留樣②(不包括上述剔除樣品20080001、20080029、200800042、200800045)稀釋50倍后取4y口，加入到96孔板中，再加入200uLBCA工作液，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(4yL生理鹽水加BCA工作液200uL)和標(biāo)準(zhǔn)樣本16號(hào)(標(biāo)1:2mg/mL、標(biāo)2:4mg/mL、標(biāo)3:6rag/mL、標(biāo)4:8mg/mL、標(biāo)5:10mg/mL)，60'C放置20分鐘，測(cè)A570值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣本A570值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表l、圖l。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算、換算47份牛血清標(biāo)本的蛋白含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白含量均在3.624.83之間，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(國(guó)標(biāo)規(guī)定3.5-5.0g%)。2.5血紅蛋白定量檢測(cè)鄰一甲聯(lián)苯胺法(孫玉潔，檢測(cè)血清中血紅蛋白含量的鄰一甲聯(lián)苯胺法的建立，中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2006;19(1):9193)。首先配置鄰一甲聯(lián)苯胺試劑0.2g加入60%冰乙酸中4'C存放。配置血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液分析天平稱取血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(signia產(chǎn)品)l.Og定容于生理鹽水100ml作為母液，然后配置成IO.0、15.0、20.0、30.0mg免的標(biāo)準(zhǔn)品。取上述不同濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品、血清留樣②(不包括上述剔除樣品20080001、20080029、200800042、200800045)各取20ri(各重復(fù)2份)，同時(shí)設(shè)生理鹽水20Hl作為空白對(duì)照，分別向上述溶液中依次加1.Oml鄰-甲聯(lián)苯胺溶液和1%過氧化氨溶液,充分混勻，放置10分鐘，再分別加入10%乙酸溶液10ml,混合均勻，于435nm比色，以空白調(diào)零，讀取各溶液吸光度，計(jì)算各溶液血紅蛋白含量值(血紅蛋白(mg/dl)^測(cè)定管吸光度X10/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20080014、20080008、200800037血紅蛋白含量分別為0.35mg%、0.37mg%、0.39mg%，超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。其余血清均在0.011mg%0.033mg先之間，符合國(guó)標(biāo)要求(國(guó)標(biāo)要求范圍為《0.035mg%)。由于N14、08、37血清血紅蛋白含量輕微超標(biāo)，混入對(duì)血清血紅蛋白含量影響小，因此，不剔除N14、08、37。2.6血清抗體檢測(cè)ELISA方法。檢測(cè)抗體譜包括牛腹瀉病毒、口蹄疫病毒亞一抗體檢測(cè)、口蹄疫病毒O型抗體檢測(cè)、口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)(抗體自然感染則非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性)、細(xì)小病毒抗體、偽狂犬、豬瘟病毒抗體、乙型腦炎病毒抗體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒病毒抗體抗體。其中牛腹瀉病毒抗體、口蹄疫(亞一、0型、非結(jié)構(gòu)蛋白)抗體、細(xì)小病毒抗體、偽狂犬抗體檢測(cè)采用美國(guó)IDEXX公司ELISA試劑盒；豬瘟病毒抗體、乙型腦炎病毒抗體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒抗體抗體采用組裝試劑。2.6.1牛腹瀉病毒、口蹄疫(亞一、O型和口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)試劑盒)、細(xì)小病毒抗體、偽狂犬抗體檢測(cè)采用美國(guó)IDEXX公司試劑盒，按照說明書操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)47份血清口蹄疫疫苗抗體(亞一、0型)均陽(yáng)性，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體(自然感染抗體)陰性，表明動(dòng)物均為疫苗接種獲得抗體，無(wú)自然感染病史。同時(shí)未測(cè)到細(xì)小病毒抗體、'偽狂犬病毒抗體，有12份標(biāo)本血清測(cè)到BVDV抗體。2.6.2豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒、乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒抗體檢測(cè)釆用組裝試劑盒(實(shí)驗(yàn)室常用方法)①試劑盒的組裝材料a酶標(biāo)板采用廣州捷特高結(jié)合力酶標(biāo)板。b抗原豬瘟病毒本科室自制(采用通用豬瘟病毒培養(yǎng)方法)首先將豬瘟病毒接種兔，取其脾臟作為毒種接種于己經(jīng)長(zhǎng)成單層的牛睪丸細(xì)胞上，加維持液35'C、5MC02培養(yǎng)，之后每5日換液一次，收集培養(yǎng)液，紫外線照射滅火后用作檢測(cè)試劑；乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒抗原本科室自制將乙型腦炎病毒、豬流行性腹瀉病毒毒液分別接種于己經(jīng)長(zhǎng)成單層的BHK21和ST細(xì)胞上，加維持液35t:、5%C02培養(yǎng)，35d后細(xì)胞變圓、壞死脫落，此時(shí)收集并凍融3次，5000r/min離心20rain，取上清紫外線照射滅火后用作檢測(cè)試劑；豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原外購(gòu)。c洗板液:為pH7.2的PBS:Na2HP04.12跳2.9g，KCLO.2g，NaCL8g，KH2P040.2g,加蒸餾水至1000ml。d辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗牛IgG、IgM:購(gòu)自ICLlab公司。e顯色液sigma公司產(chǎn)品，為A、B兩液顯色。f終止液..10%H2S04。②包被酶標(biāo)板將豬瘟病毒、乙型腦炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒、細(xì)小病毒、豬流行性腹瀉病毒抗原分別用碳酸緩沖液(Na2C03:1.5gNaHC032.93g加水至1000ml)稀釋，加入酶標(biāo)板中(中國(guó)廣州潔特生物科技有限公司產(chǎn)品)，每孔100微升，4'C、飽和濕度條件下過夜，洗版3次，甩干，加5%人血清白蛋白37'C封閉1小時(shí)，洗版?zhèn)溆?。③抗體檢測(cè)將血清留樣④做1:IO稀釋后分別加入酶標(biāo)板板孔中，同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各3孔，37'C孵育30分鐘，用洗板液洗板3次并甩干，加酶標(biāo)兔抗牛IgG37'C孵育30分鐘后洗板三次并甩干，加顯色液A、B各50微升室溫顯色10分鐘，用終止液20微升終止反應(yīng)后測(cè)定A450nm值。陰性對(duì)照3孔均值低于0.15條件下，試驗(yàn)孔OD值》陰性對(duì)照0D值2.l者判為陽(yáng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IO份血清測(cè)到豬瘟病毒抗體，13份血清側(cè)到乙型腦炎病毒抗體，見表l。表1血清抗體檢測(cè)結(jié)果細(xì)菌陽(yáng)性支原體陽(yáng)性血紅蛋白超標(biāo)牛腹瀉病毒抗體豬瘟陽(yáng)性乙型腦炎病毒抗體200800012008002920080001420080004200800082008000520080029200800042200800008200800062008000920080007200800042200800045200800037200800082008001720080008200800092008002420080010200800172008002520080013200800242008003120080015200800252008003620080022200800312008004720080024200800362008004920080033200800472008005020080035<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>根據(jù)上述抗體檢測(cè)結(jié)果，將血清分類如下a不適合豬瘟疫苗生產(chǎn)血清04、、06、8、9,、17、24、25、31、36、47、48、49、50;但可以作為其它病毒疫苗的生產(chǎn)；b不適合乙型腦炎病毒疫苗生產(chǎn)的血清05、07、08、10、13、15、22、24、33、35、47、48、49,但可以作為其它疫苗的生產(chǎn)；a、b中47、48、49交叉陽(yáng)性，該3份血清不適合做乙腦和豬瘟病毒疫苗的生產(chǎn)；c所有血清不適合口蹄疫疫苗生產(chǎn)；d未測(cè)得豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒、偽狂犬病毒、細(xì)小疫苗病毒、祛流行性腹瀉病毒抗體，因此，所有血清均可作為上述疫苗的生產(chǎn)原料。3歸類合并上述血清微生物學(xué)指標(biāo)、蛋白和血紅蛋白指標(biāo)均在國(guó)標(biāo)規(guī)定范圍，因此，合并歸類主要以抗體檢測(cè)結(jié)果為依據(jù)。3.1歸類第一類:.豬瘟病毒等疫苗生產(chǎn)專用血清不包括豬瘟病毒抗體陽(yáng)性和BVDB抗體陽(yáng)性血清(04、06、8、9、14、17、24、25、29、31、36、37、42、45、47、48、49、50)，不包括乙型腦炎病毒抗體陽(yáng)性血清(05、07、8、10、13、15、22、24、33、35、47、48、49)和已剔除血清Ol、29、42、45血清在內(nèi)的11、12、16、18、19、20、21、23、26、27、28、30:32、34、38、39、40、41、43、44、46號(hào)血清，共21份血清。同時(shí)此類血清也可用于除口蹄疫病毒疫苗之外的多種疫苗的生產(chǎn)；第二類偽狂犬病毒等疫苗專用血清包括05、07、10、13、15、22、33、35、49號(hào)。不能用于乙型腦炎病毒和口蹄疫病毒疫苗的生產(chǎn)之外，也可用于其他病毒疫苗的生產(chǎn)。共9頭第三類乙型腦炎病毒疫苗專用血清包括04、06、9、14、17、25、29、31、36、37、42、45、50號(hào)血清。不能用于豬瘟病毒、口蹄疫疫苗之外、其它病毒可用血清，共13頭第四類豬瘟病毒、乙型腦炎病毒抗體陽(yáng)性和支原體、細(xì)菌污染血清1、8、24、47、48、49。3.2合并混合在GMP車間進(jìn)行。將四類原料血清先后于萬(wàn)級(jí)條件下用72-76M乙醇(V/V)浸泡外包裝20min,殺滅采血袋表面細(xì)菌、支原體等微生物，然后傳遞窗進(jìn)入百級(jí)車間，分別在百級(jí)條件下將袋中血清傾入無(wú)菌混合罐中，攪拌混勻，先后獲得四類混合血清。3.3將四類血清分別送入多級(jí)過濾和無(wú)菌灌裝系統(tǒng)，每瓶450ml裝。4細(xì)胞培養(yǎng)譜檢驗(yàn)分類和常規(guī)質(zhì)量檢測(cè)4.1細(xì)胞培養(yǎng)譜檢測(cè)4.1.1第一類血清細(xì)胞培養(yǎng)譜檢測(cè)抗體檢測(cè)提示，該類血清可用于多種疫苗的生產(chǎn)(不包括口蹄疫病毒疫苗)，因此，需做多種細(xì)胞增殖試驗(yàn)ST細(xì)胞、Vero細(xì)胞、MARC145、BHK細(xì)胞、PK15和牛睪丸細(xì)胞。①細(xì)胞培養(yǎng)液配制將抽檢血清配制成血清含量為20%、10%的MEM，對(duì)照血清選用GIBICO產(chǎn)品，含量為20%、10X的MEM培養(yǎng)液備用。②細(xì)胞增殖譜試驗(yàn)a傳代細(xì)胞培養(yǎng)增殖試驗(yàn)將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的瓶?jī)?nèi)細(xì)胞(ST細(xì)胞、Vero細(xì)胞、MARCM5、BHK和PK15)用0.125%胰酶消化，用無(wú)血清培養(yǎng)液分散，加等倍體積的20M受試血清一MEM(血清終濃度為10%)傳代6代，第7代時(shí)將細(xì)胞計(jì)數(shù)并接種于96孔板內(nèi)，24h鏡下觀察結(jié)合中性紅染色測(cè)定A540值計(jì)算細(xì)胞增值率，相對(duì)細(xì)胞增值率〉90%者判為合格，結(jié)果見表2。表2第一類血清細(xì)胞增殖結(jié)果ST細(xì)胞Vero細(xì)胞醒C145朋K細(xì)胞PK15試驗(yàn)血清(A540)對(duì)照血清(A540)1.71±0.081.63±0.051.86±0.071.89±0.091.48±0.061.55土0.041.74±0.071.67±0.101.53±0.101.61±0.08相對(duì)增殖率(%)105.998.495.5104.295.03從上述增殖試驗(yàn)可以看出，第一類血清能夠支持各細(xì)胞連續(xù)傳代6代，且細(xì)胞形態(tài)良好、24增殖相對(duì)效率超過90%，血清促進(jìn)細(xì)胞增殖效果好。b傳代細(xì)胞貼壁效率和相對(duì)貼壁效率將上述每種細(xì)胞用受試血清一細(xì)胞培養(yǎng)液配置成20個(gè)細(xì)胞/ml，分別接種于采用24孔培養(yǎng)中，每種細(xì)胞接種3孑L，37°C±2'C、濕潤(rùn)5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)7~10d,用結(jié)晶紫染色，計(jì)算著色細(xì)胞克隆，確定貼壁效率和相對(duì)貼壁效率，結(jié)果見表3。貼壁效率(％)=(每孔克隆平均數(shù)/每孔活存的培養(yǎng)細(xì)胞平均數(shù))X100W表3第一類血清貼壁效率觀察ST細(xì)胞Vero細(xì)胞MARC145BHK細(xì)胞PK15試驗(yàn)血清貼壁率(％)80(16/20)70(14/20)75(15/20)85(17/20)75(15/20)13對(duì)照血清貼壁率(％)85(17/20)80(16/20)75(15/20)80(16/20)80(16/20)相對(duì)貼壁率(％)94.1287.510010093.75從上表可以看出，ST、MARC145、BHK、PK15相對(duì)貼壁率均達(dá)到90以上，但Vero相對(duì)貼比率低于90%。c克隆效果測(cè)定采用SP2/0細(xì)胞。將SP2/0用RPMI—1640培養(yǎng)液(血清含量10%，用受試血清配置)配置成1.5個(gè)細(xì)胞/10(^L,每孔接種37°C±2°C、濕潤(rùn)條件、5%二氧化碳培養(yǎng)710d后顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆效率和相對(duì)克隆效率。克隆效率=(陽(yáng)性孔數(shù)/培養(yǎng)孔總數(shù))X100%相對(duì)克隆效率=待測(cè)血清克隆效率/參考血清克隆效率陽(yáng)性對(duì)照血清采用它GIBICO產(chǎn)品血清。結(jié)果見表4_表4第一類血清克隆形成觀察_SP2/0受試血清克隆形成率(％)58.33(14/24)對(duì)照血清克隆形成率(％)64.17(15/24)相對(duì)克隆形成率(％)90.90從上表可以看出，受試血清克隆相對(duì)形成率達(dá)到90%，表明第一類血清具有促進(jìn)懸浮細(xì)胞克隆形成的作用。、d牛睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)將2%碘酒滅菌的新生牛睪丸剝離，置平皿中用磷酸鹽緩沖鹽水洗3次，剪至約ln/以下，加0.256胰酶37。C消化20min，1000r/min離心5min，棄胰酶，'加含受試血清的培養(yǎng)液置37'C靜止培養(yǎng)。分別于16h、48h觀察形成單層情況。原代牛睪丸細(xì)胞于24h長(zhǎng)成單層，表明第一類血清適用于睪丸原代細(xì)胞的培養(yǎng)。從上述增殖試驗(yàn)可以看出，第一類血清促進(jìn)細(xì)胞增殖、貼壁和克隆形成效果好。但是，Vero細(xì)胞相對(duì)貼壁率87.5%,因此不建議用于Vero細(xì)胞培養(yǎng)。綜合抗體檢測(cè)結(jié)果和細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果，第一類血清適合如下疫苗的生產(chǎn)豬瘟病毒疫苗生產(chǎn)；動(dòng)物乙型腦炎病毒疫苗生產(chǎn)；豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒疫苗生產(chǎn)細(xì)小疫苗病毒疫苗生產(chǎn)；豬流行性腹瀉病毒疫苗生產(chǎn)；14細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)提示慎用于以Ve;ro為宿主細(xì)胞的病毒疫苗的生產(chǎn)，例如偽狂犬疫苗病毒生產(chǎn)(Vero貼壁效率低于90%)。4.2.2第二類血清細(xì)胞培養(yǎng)譜檢測(cè)抗體檢測(cè)結(jié)果提示，第二類類血清可用于多種疫苗的生產(chǎn)，不適合口蹄疫、乙型腦炎病毒疫苗的生產(chǎn)，因此，需做多種細(xì)胞增殖試驗(yàn)ST細(xì)胞、-Vero細(xì)胞、MARC145、牛睪丸細(xì)胞。①細(xì)胞培養(yǎng)液配制將抽檢血清配制成血清含量為20%、10X的MEM,陽(yáng)性對(duì)照血請(qǐng)血清-含量為20%、10%的MEM培養(yǎng)液備用。②細(xì)胞增殖譜試驗(yàn)a傳代細(xì)胞培養(yǎng)增殖試驗(yàn)細(xì)胞譜包括ST細(xì)胞、^ro細(xì)胞、MARC145、PK15，試驗(yàn)方法和結(jié)果判斷方法同上。陽(yáng)性對(duì)照血清采用它GIBICO產(chǎn)品血清。結(jié)果見表5表5第二類血清細(xì)胞增殖結(jié)果ST細(xì)胞Vero細(xì)胞MARC145PK15試驗(yàn)血清(A540)1.84±0.061.91±0.071.40±0.081.59±0.11對(duì)照血清(A540)1.83±0.051.89±0.051.61±0.081.54±0.12細(xì)胞增殖率(％)100.5101.186.9103.2從上述增殖試驗(yàn)可以看出，第二類血清能夠支持各細(xì)胞連續(xù)傳代6代，且細(xì)胞形態(tài)良好、24增殖相對(duì)效率超過90%，血清促進(jìn)細(xì)胞增殖效果好。但對(duì)MARC145增殖效果低于90%。b、傳代細(xì)胞貼壁效率和相對(duì)貼壁效率方法和計(jì)算方法按照第一類血清中敘述方法，結(jié)果見表6。表6第二類血清貼壁效率觀察'ST細(xì)胞Vero細(xì)胞MARC145.BHK細(xì)胞PK15試驗(yàn)血清貼壁率(％)80(17/20)70(15/20)75(16/20)85(18/20)75(16/20)對(duì)照血清貼壁率(％)85(16/20).80(16/20)75(18/20)80(17/20)80(17/20)相對(duì)貼壁率(％)10093.7588.8910094.12從上表可以看出，ST、Vero、MARC145、BHK、PK15相對(duì)貼壁率均達(dá)到90%以上。c'克隆效果測(cè)定采用SP2/0細(xì)胞。方法和計(jì)算方法按照第一類血清中敘述方法。結(jié)果見表7。_表7第二類血清克隆形成觀察_SP2/0受瑪血清克隆形成率(％)62.5(15/24)對(duì)照血清克隆形成率(％)62.5(15/24)相對(duì)克隆形成率a)100從相對(duì)克隆形成率分析，第二類細(xì)胞具有促進(jìn)懸浮細(xì)胞增殖、克隆形成的作用。d牛睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)操作方法和判斷同上。原代牛睪丸細(xì)胞于24h長(zhǎng)成單層，表明第二類血清適用于睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)。從上述增殖試驗(yàn)可以看出，第一類血清促進(jìn)細(xì)胞增殖、貼壁和克隆形成效果好。但是，MARC145增殖率低于90%,因此不建議用于MARC145細(xì)胞培養(yǎng)。綜和抗體檢測(cè)結(jié)果和細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果，第二類血清適合如下疫苗的生產(chǎn)豬瘟病毒疫苗生產(chǎn)；偽狂犬疫苗病毒生產(chǎn)；細(xì)小疫苗病毒疫苗生產(chǎn)；豬流行性腹瀉病毒疫苗生產(chǎn)。慎用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗的生產(chǎn)。4.2.3第三類血清細(xì)胞培養(yǎng)譜檢測(cè)第三類血清細(xì)胞培養(yǎng)譜檢測(cè)抗體檢測(cè)結(jié)果提示，可用于多種疫苗的生產(chǎn)，不適合不包括口蹄疫、豬瘟病毒疫苗的生產(chǎn)，因此，需做多種細(xì)胞增殖試驗(yàn)ST細(xì)胞、Vero細(xì)胞、MARC145和BHK細(xì)胞。①細(xì)胞培養(yǎng)液配制將抽檢血清配制成血清含量為20%、10X的MEM，陽(yáng)性對(duì)照血清血清含量為20%、10%的MEM培養(yǎng)液備用。②細(xì)胞增殖譜試驗(yàn).細(xì)胞譜包括ST、Vero、MARC145和PK15細(xì)胞，試驗(yàn)方法和結(jié)果判斷方法同上。陽(yáng)性對(duì)照血清釆用它GIBIC0產(chǎn)品血清。結(jié)果見表8。表8:第三類血清細(xì)胞增殖結(jié)果ST細(xì)胞Vero細(xì)胞MARC145PK15BHK試驗(yàn)血清(A540)2.14±0.101.93±0.082.19±0.101.84±0.121.97±0.10對(duì)照血清(A540)2.17±0.122.05±0.092.04±0.111.87±0.131.78±0.07細(xì)胞增殖率(％)98.694.1107.398.39110.7.從上述增殖試驗(yàn)可以看出，第三類血清能夠支持各細(xì)胞連續(xù)傳代6代，且細(xì)胞形態(tài)良好、1624增殖相對(duì)效率超過90%，血清促進(jìn)細(xì)胞增殖效果好。b傳代細(xì)胞貼壁效率和相對(duì)貼壁效率方法和計(jì)算方法按照第一類血清中敘述方法，結(jié)果見表9。表9第三類血清貼壁效率觀察ST細(xì)胞Vero細(xì)胞MARC145PK15BHK試驗(yàn)血清貼壁率(％)對(duì)照血清貼壁率(％)相對(duì)貼壁率(%)80(16/20)80(16/20)75(7/20)75(15/20)85(17/20)85(17/20)80(16/20)75(15/20〉80(16/20)85(17/20)94.12100113.3393.75100從上表可以看出，ST、Vero、MARC145、PK15、BHK相對(duì)貼壁率均達(dá)到90以上。c克隆效果測(cè)定采用SP2/0細(xì)胞。方法和計(jì)算方法按照第一類血清中敘述方法。結(jié)果見表10。表10第三類血清克隆形成觀察SP2/0受試血清克隆形成率(％)對(duì)照血清克隆形成率(％)相對(duì)克隆形成率(％)50.0(12/24)62.5(15/24)80從相對(duì)克隆形成率分析，第三類細(xì)胞具有促進(jìn)懸浮細(xì)胞增殖、克隆形成的作用，效果不如對(duì)照血清。從上述增殖試驗(yàn)可以看出，第三類血清促進(jìn)細(xì)胞增殖、貼壁和克隆形成效果好，判為合格。綜合抗體檢測(cè)結(jié)果和細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果，第二類血清適合如下疫苗的生產(chǎn)乙型腦炎病毒疫苗生產(chǎn)；偽狂犬疫苗病毒生產(chǎn)；細(xì)小疫苗病毒疫苗生產(chǎn)；第四類豬瘟病毒、乙型腦炎病毒抗體陽(yáng)性8、24、47、48、49。因量少，故待同類血清足夠分組后做相應(yīng)處理。4.2常規(guī)指控檢測(cè)包括裝量檢驗(yàn)、微生物學(xué)檢測(cè)(包括細(xì)菌、真菌、支原體、大腸桿菌噬菌體)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)、蛋白含量檢測(cè)、血紅蛋白含量檢測(cè)。.檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血清裝量合格，微生物學(xué)檢測(cè)和生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表ll:表.ll:微生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)和生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果血清批次細(xì)菌檢測(cè)真菌檢測(cè)支原體檢測(cè)噬菌體檢測(cè)內(nèi)毒素檢測(cè)蛋白含量血紅蛋白含呈第一類(-)(-)(-)(-)<0.125EU/ml4.2g%0.027mg%第二類(-)(-)(-)(-)<0.125EU/ml4.0g%0.029mg%第三類(-)(-)(-)(-)<0.125EU/m4.5g%0.030mg%第四類(-)(-)(-)(-)<0.125EU/ml4.7g%0.029mg%第五類(-)(—)(-)(—)<0.125EU/ml4.7g%0.026mg%5賦予標(biāo)簽、檔案、出廠。5.1第一類血清1)標(biāo)簽*畜牧業(yè)疫苗生產(chǎn)專用血清專用于豬瘟病毒疫苗生產(chǎn)、動(dòng)物乙型腦炎病毒疫苗生產(chǎn)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒疫苗生產(chǎn)、細(xì)小疫苗病毒疫苗生產(chǎn)、豬流行性腹瀉病毒疫苗生產(chǎn)。慎用于以Vero細(xì)胞為宿主的疫苗生產(chǎn)(例偽狂犬病毒)。*450ml裝/瓶*存放條件和存放時(shí)間-2(TC存放3年*注意事項(xiàng)血清如有混濁不能使用*生產(chǎn)日期2008.11.15。*合格證號(hào)2008.11.15*生產(chǎn)廠家地址山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所*網(wǎng)址www.microbiology-sd.cn*E—mai1:menghyky@yahoo.com.en*聯(lián)系電話053卜82919701*質(zhì)檢員號(hào):Ol2)第一類血清檔案a新生牛血清編號(hào)11、12、16、18、19、20、21、23、26、27、28、30、32、34、38、39、40、41、43、44、46號(hào)血清，共21份血清組成。b新生牛的隸屬關(guān)系濟(jì)南佳寶乳業(yè)有限公司C出生地濟(jì)南佳寶乳業(yè)有限公司長(zhǎng)青乳牛養(yǎng)殖基地d出生時(shí)間2008年3-12月e取血時(shí)間出生后2小時(shí)以內(nèi)f一般情況體重70100kg，精神狀況良好，無(wú)進(jìn)食，無(wú)腹瀉，體表布滿粘液；g新生牛母親的健康狀況健康h母牛疫苗接種史l年內(nèi)接種過布氏桿菌菌苗、口蹄疫疫苗i母牛病史l年來有無(wú)發(fā)生明顯疾病j周圍牛群的疫情發(fā)生情況3年來有無(wú)發(fā)生疫情k周圍畜牧養(yǎng)殖動(dòng)物3年來未發(fā)生明顯疫情l抗體背景口蹄疫病毒亞一、O型陽(yáng)性，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性；豬瘟病毒抗體、牛腹瀉病毒抗體、細(xì)小病毒抗體、乙型腦炎病毒抗體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體、豬流行性腹瀉病毒抗體陰性。m細(xì)胞增殖譜ST細(xì)胞、MARC145、BHK細(xì)胞、PK15貼壁、增殖良好，SP20細(xì)胞克隆形成良好，牛睪丸細(xì)胞原代生長(zhǎng)良好。Vero細(xì)胞相對(duì)增值率低于90%。5.2第二類血清1)第二類血清標(biāo)簽畜牧業(yè)疫苗生產(chǎn)專用血清專用于豬瘟病毒疫苗生產(chǎn)、偽狂犬病毒疫苗生產(chǎn)、細(xì)小疫苗病毒疫苗生產(chǎn)、豬流行性腹瀉病毒疫苗生產(chǎn)。不適合用于乙型腦炎病毒疫苗、口蹄疫疫苗的生產(chǎn)，慎用于以MARC145細(xì)胞為宿主的疫苗生產(chǎn)(例如豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗的生產(chǎn))。*450ml裝/瓶存放條件和存放時(shí)間-2(TC存放3年*注意事項(xiàng)血清如有混濁不能使用*生產(chǎn)日期2008.11.18。*合格證號(hào)2008.11.18。*生產(chǎn)廠家地址山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所*網(wǎng)址www.microbiology_sd.cn參E-mail:menghyky@yahoo.com.cn*聯(lián)系電話0531-82919701*質(zhì)檢員號(hào)Ol2)賦予檔案a新生牛血清編號(hào)05、07、10、13、15、22、33、35、49號(hào)，共9份血清組成。b新生牛的隸屬關(guān)系濟(jì)南佳寶乳業(yè)有限公司.'C出生地濟(jì)南佳寶乳業(yè)有限公司長(zhǎng)青乳牛養(yǎng)殖基地d出生時(shí)間2008年3~12月e取血時(shí)間出生后2小時(shí)以內(nèi)f一般情況體重70100kg，精神狀況良好，無(wú)進(jìn)食，無(wú)腹瀉，體表布滿粘液；g新生牛母親的健康狀況健康h母牛疫苗接種史1年內(nèi)接種過布氏桿菌菌苗、口蹄疫疫苗i母牛病史1年來有無(wú)發(fā)生明顯疾病j周圍牛群的疫情發(fā)生情況3年來有無(wú)發(fā)生疫情k周圍畜牧養(yǎng)殖動(dòng)物3年來的疫情情況l抗體檔案口蹄疫病毒亞一、O型陽(yáng)性，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性；乙型腦炎病毒抗體陽(yáng)性；豬瘟病毒抗體、牛腹瀉病毒抗體、細(xì)小病毒抗體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體、豬流行性腹瀉病毒抗體陰性。-ra細(xì)胞增殖譜ST、Vero細(xì)胞增殖、貼壁良好，牛睪丸原代細(xì)胞生長(zhǎng)良好。MARC145細(xì)胞增殖率低于90%。5.3第三類血清1)標(biāo)簽*畜牧業(yè)疫苗生產(chǎn)專用血清.專用于偽狂犬病毒疫苗生產(chǎn)、動(dòng)物乙型腦炎病毒疫苗生產(chǎn)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病毒疫苗生產(chǎn)、細(xì)小疫苗病毒疫苗生產(chǎn)、豬流行性腹瀉病毒疫苗生產(chǎn)。不用于豬瘟病毒疫苗、口蹄疫病毒疫苗的生產(chǎn)。慎用于以Vero細(xì)胞為宿主的疫苗生產(chǎn)。9450ml裝/瓶*存放條件和存放時(shí)間-2(TC存放3年，4'C存放1個(gè)月*注意事項(xiàng)血清如有混濁不能使用*生產(chǎn)日期2008.11.18*合格證號(hào)2008.11.18*生產(chǎn)廠家地址山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所網(wǎng)址www.microbiology-sd.cnE-mail:menghyky@yahoo.com.cn*聯(lián)系電話0531-82919701質(zhì)檢員號(hào)Ol2)賦予檔案a新生牛血清編號(hào)04、06、9、14、17、25、29、31、36、37、42、45、50號(hào)血清，共13份血清組成。b新生牛的隸屬關(guān)系濟(jì)南佳寶乳業(yè)有限公司c出生地濟(jì)南佳寶乳業(yè)有限公司長(zhǎng)青乳牛養(yǎng)殖基地d出生時(shí)間2008年3~12月e取血時(shí)間出生后2小時(shí)以內(nèi)f一般情況體重、精神情況，有無(wú)進(jìn)食，有無(wú)腹瀉，體表粘液；7C)100kg。g新生牛母親的健康狀況健康h母牛疫苗接種史l年內(nèi)接種過布氏桿菌菌苗、口蹄疫疫苗。i母牛病史l年來有無(wú)發(fā)生明顯疾?。籮周圍牛群的疫情發(fā)生情況3年來有無(wú)發(fā)生疫情；k周圍畜牧養(yǎng)殖動(dòng)物3年來的疫情情況。l抗體檔案口蹄疫病毒亞一、0型陽(yáng)性，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性；豬瘟病毒抗體陽(yáng)性；乙型腦炎病毒抗體、細(xì)小病毒抗體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體、豬流行性腹瀉病毒抗體陰性。m細(xì)胞增殖譜ST、Vero細(xì)胞增殖、貼壁良好。MARC145細(xì)胞增殖率低于90%。附表12為國(guó)家現(xiàn)有新生牛血清的質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。表12:產(chǎn)品質(zhì)量、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>權(quán)利要求1.一種新生牛血清的分類生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟(1)原料新生牛血清的生產(chǎn)采用無(wú)支原體采血法采取新生牛血清；(2)檢驗(yàn)對(duì)上述采取的新生牛血清進(jìn)行蛋白、血紅蛋白、細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)、微生物學(xué)檢測(cè)和抗體檢測(cè)；(3)第一次分類將相同抗體背景者歸類；(4)合并混勻?qū)⑸鲜隹贵w背景相同的血清在無(wú)菌混合罐中合并混勻；(5)將上述混勻的血清打入終末濾網(wǎng)為0.3μ的多級(jí)過濾系統(tǒng)，無(wú)菌罐裝系統(tǒng)罐裝。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新生牛血清的分類生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟(5)后還包括以下步驟(6)抽樣進(jìn)行細(xì)胞增殖譜檢驗(yàn)和基礎(chǔ)質(zhì)控；所述細(xì)胞增殖譜檢驗(yàn)包括傳代細(xì)胞培養(yǎng)增殖試驗(yàn)和原代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)；所述傳代細(xì)胞培養(yǎng)增殖試驗(yàn)包括MARC145細(xì)胞增殖試驗(yàn)、Vero細(xì)胞增殖試驗(yàn)、ST細(xì)胞增殖試驗(yàn)、PK15細(xì)胞增殖試驗(yàn)和BHK細(xì)胞增殖試驗(yàn)?zāi)軌蜻B續(xù)傳代6代并細(xì)胞形態(tài)良好、增殖效率高于90%、貼壁效率和克隆效率與對(duì)照血清相當(dāng)者，進(jìn)行下一步分類；所述原代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)為牛睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)新生牛睪丸進(jìn)行培養(yǎng)，原代牛睪丸細(xì)胞培養(yǎng)16或48h長(zhǎng)成單層者，進(jìn)行下一步分類；所述基礎(chǔ)質(zhì)控包括微生物學(xué)檢測(cè)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)、pH檢測(cè)、病毒抗體檢測(cè)；對(duì)于細(xì)胞增殖譜檢驗(yàn)；(7)分類根據(jù)上述傳代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果和原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果，結(jié)合抗體檢測(cè)結(jié)果，將血清進(jìn)行總分類；-(8)賦予檔案和標(biāo)簽。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新生牛血清的分類生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(2)中的抗體檢測(cè)包括牛腹瀉病毒抗體檢測(cè)、口蹄疫抗體檢測(cè)、豬瘟病毒抗體檢測(cè)、乙型腦炎病毒抗體檢測(cè)、PRRSV病毒抗體檢測(cè)、偽狂犬病毒抗體檢測(cè)、細(xì)小病毒抗體檢測(cè)和豬流行性腹瀉病毒抗體檢測(cè)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新生牛血清的分類生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(4)具體為在GMP車間內(nèi)，將裝有原料新生牛血清的采血袋在十萬(wàn)級(jí)條件下浸泡體積比為72~78%的乙醇1020min，殺滅容器表面細(xì)菌、支原體等微生物，然后傳遞窗進(jìn)入百級(jí)車間，在百級(jí)條件下晾干并將袋中血清傾入無(wú)菌混合罐中，攪拌混勻。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新生牛血清的分類生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(7)中的分類包括以下幾類①豬瘟疫苗病毒生產(chǎn)專用血清牛睪丸細(xì)胞生長(zhǎng)良好、不含豬瘟病毒抗體和BVDV抗體的血清；②動(dòng)物乙型腦炎病毒疫苗生產(chǎn)專用血清BHK細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含有乙型腦炎病毒抗體的血清；③豬PRRSV病毒疫苗生產(chǎn)專用血清MARC145細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含有PRRSV病毒抗體的血清；④口蹄疫病毒疫苗生產(chǎn)專用血清BHK細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含有口蹄疫病毒抗體的血清；⑤偽狂犬疫苗病毒生產(chǎn)專用血清Vero細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含有偽狂犬病毒抗體的血清；細(xì)小疫苗病毒生產(chǎn)專用血清ST、PK15細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含細(xì)小病毒抗體的血清；⑦豬流行性腹瀉病毒ST細(xì)胞、Vero生長(zhǎng)良好，不含豬流行性腹瀉病毒抗體的血清；(D圓環(huán)病毒:ST細(xì)胞生長(zhǎng)良好，不含有豬流行性腹瀉病毒抗體的血清。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新生牛血清的分類生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟(8)中的檔案包括①本批次新生牛血清的混合檔案由哪些新生小牛的血清組成；②每只新生牛血清編號(hào)、新生牛的隸屬關(guān)系、出生地、出生時(shí)間、取血時(shí)間、體重、精神情況、進(jìn)食情況、有無(wú)腹瀉，體表粘液、新生牛母親的健康狀況；母牛疫苗接種史、母牛病史.*l年來有^發(fā)生明顯疾??；周圍牛群的疫情發(fā)生情況3年來有無(wú)發(fā)生疫情、周圍畜牧養(yǎng)殖動(dòng)物3年來的疫情情況、細(xì)胞增殖譜、病毒抗體背景。全文摘要本發(fā)明公開了一種新生牛血清的分類生產(chǎn)工藝，采取新生牛血清后，對(duì)其進(jìn)行蛋白、血紅蛋白、細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)、微生物學(xué)檢測(cè)和抗體檢測(cè)，然后將相同抗體背景者歸類合并，然后進(jìn)行細(xì)胞增殖譜檢驗(yàn)和基礎(chǔ)質(zhì)控；所述細(xì)胞增殖譜檢驗(yàn)包括傳代細(xì)胞培養(yǎng)增殖試驗(yàn)和原代細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)。最后根據(jù)細(xì)胞增殖情況和抗體背景，將血清做用途分類。本發(fā)明的工藝生產(chǎn)的牛血清分類明確、用途專一，滿足了生物藥業(yè)生產(chǎn)不同疫苗需求不同血清的需求，提高了疫苗質(zhì)量，降低了生產(chǎn)成本。文檔編號(hào)A61K35/16GK101474208SQ20081023834公開日2009年7月8日申請(qǐng)日期2008年12月15日優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日發(fā)明者紅孟,宋楠楠,岳盈盈,鵬李,李志會(huì),溫曉燕申請(qǐng)人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所