專利名稱：：在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有抗肺瘤活性的抗人Dlk-l抗體，尤其是在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-l抗體。另外本發(fā)明涉及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤和該抗體的用途。
背景技術(shù)：
：人Dlk-l(delta-like1homolog(Drosophila);沐l同源物(果蠅)；以下也稱為"hDlk-l")是全長為383個氨基酸殘基的單次跨膜型的l型膜蛋白，其在細胞外區(qū)域具有6個EGF樣基序。其細胞外區(qū)域與Notch/Delta/Serrate家族顯示出同源性。hDlk陽1基因作為在GRP(gastrinreleasingpeptide,胃泌素釋》文肽)應(yīng)答性的肺小細胞癌來源的細胞抹中表達的分子(非專利文獻l)或作為抑制前脂肪細胞分化的因子被克隆(非專利文獻2)。hDlk-1由于與作為細胞分化控制因子的Notch受體的配體5的氨基酸序列具有同源性，通常用DLK1這樣的基因標識來命名，此外，雖然具有Pref-l(非專利文獻2)、pG2(非專利文獻3)、SCP-1(非專利文獻4)和ZOG(非專利文獻5)多個基因標識，但它們基本是同一分子。而且，hDlk-l的細胞外區(qū)域的細胞膜附近一皮一種尚未鑒定的蛋白酶切斷，并分泌到血液中。游離hDlk-l(hDlk-l細胞外區(qū)域)與225~262個氨基酸殘基的被稱為FA-1(Fetalantigen-l,胎兒抗原-1)(非專利文獻6)的糖蛋白質(zhì)是同一分子。hDlk-l基因及其基因產(chǎn)物在未分化的增殖能力高的胚胎細胞中顯示出高表達。尤其是，在胚胎肝臟、胚胎腎臟、胚胎骨骼肌、胚胎腦等中顯示出高表達，但出生后，在大部分組織中體組織中，表達局限于腎上腺、胎盤、垂體中(專利文獻l、非專利文獻2)。而且，即-使在成體組織中，在被認為是未分化的干細胞和前體細胞的細胞中也發(fā)現(xiàn)了hDlk-l的表達。例如，hDlk-l在成體肝臟中未分化的具有多向分化潛力(multilineagepotential)的肝卵圓細胞(非專利文獻7、8)、骨/軟骨/脂肪細胞的干細胞即間充質(zhì)干細胞(非專利文獻9)中的表達已有報道，這提示其與這些組織干細胞的性質(zhì)、例如未分化能力的維持等相關(guān)。hDlk-l的這種局限于胎兒期的細胞和干細胞中表達的模式，以及具有EGF樣基序的基因/基因產(chǎn)物的家族(Notch受體,Notch配體(5，Jagged，serrate)等)一般通過EGF樣基序介導的細胞間相互作用來控制細胞的增殖和分化，由此#是示hD1k-1也具有這種功能。事實上，已知隨著脂肪前體細胞的分化而表達降低，而且若在脂肪前體細胞中強制表達hDlk-l基因，則脂肪分化被抑制(非專利文獻2)。但是，目前，與hDlk-l相互作用的分子(配體)的詳細情況尚不清楚。另一方面，據(jù)才艮道hDlk-l基因及其基因產(chǎn)物在各種癌和肺瘤中也以高頻率表達。迄今為止，作為已確認其表達的癌的種類，在實體癌中，已知有神經(jīng)內(nèi)分泌肺瘤、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、l型神經(jīng)纖維瘤病、小細胞肺癌、肝癌、腎癌和卵巢癌(專利文獻l、2和非專利文獻1、3、10、11、12、13、14),在血癌中，已知有骨髓增生異常綜合征(專利文獻3和非專利文獻15、16)和急性髓系白血病(非專利文獻16)。據(jù)才艮道如果在紅白血病細胞4朱(erythroleukemia)K562細胞中導入hDlk-l基因，則細胞增殖受到促進(非專利文獻16)，同樣，如果在成膠質(zhì)細胞瘤細胞中導入hDlk-l基因，不僅細胞增殖一皮促進，而且細胞的接觸抑制也喪失，獲得錨著非依存性的8(anchorage-dependent)細月包增殖能力，這4是示hDlk-l與致癌之間的關(guān)聯(lián)性(非專利文獻17)。<專利文獻>專利文獻l:WO2005/052156專利文獻2:WO02/081625專利文獻3:日本特開2001-269174號<非專利文獻〉非專利文獻l:Laborda,J.etal.,J.Biol.Chem.,vo1.268(6),p.3817-3820(1993)非專利文獻2:Smas,C.M.etal.,Cell,vol.73(4)，p.725-734(1993)非專利文獻3:Helman,L.J.etal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.84，p.2336-2339(1987)非專利文獻4:Maruyama,K.etal.，Unpublished,GenebankaccessionnumberD16847(1993)非專利文獻5:Haider,S.K.etal"Endocrinology,vol.139，p.3316-3328(1998)非專利文獻6:Fay，T.N.etal.,Eur.J.Obstet.Gynecol.Reprod.Biol"vol.29，p.73-85(1988)非專利文獻7:Tanimizu,N.etal.,GeneExpressionPatterns,vol.5,p.209-218(2004)非專利文獻8:Jensen,CH.etal.,Am.J.Pathol.,vo1.164(4)，p.1347-1359(2004)非專利文獻9:Abdallah，B.M.etal.,J.BoneMiner.Res.，vol.19(5),p.841-852(2004)非專利文獻10:Jensen,C.H.etal"Br.J.Dermatol"vol.140(6)，p.1054-1059(1999)非專利文獻ll:Jensen,C.H.etal.，TumourBiol"vol.20(5)，p.256-262(1999)非專利文獻12:Yin,D.etal.，Int.J.Oncol"vol.24(4)，p.1011-1015(2004)非專利文獻13:Yin,D.etal.，Oncogene,vol.25(13)，p.1852-1861(2006)非專利文獻14:Fukuzawa,R.etal.,J.Clin.Pathol.,vol.58，p.145-150(2006)非專利文獻15:Miyazato，A.etal.,Blood,vol.98,p.422-427(2001)非專利文獻16:Sakajiri，S.etal.，Leukemia,vol.19(8),p.1404-1410(2005)非專利文獻17:Yin,D.etal"Oncogene,vol.25(13)，p.1852-1861(2006)
發(fā)明內(nèi)容如上所述，在正常組織中，hDlk-l的表達局限于胎兒期的細胞或干細胞；癌組織中，hDlk-l則在各種肺瘤中高頻率表達，并且hDlk-l是細胞膜蛋白/分泌蛋白，由此認為hDlk-l在各種胂瘤的治療等中是好的靶標。并認為以該hDlk-l為草巴標時，抗hDlk-l抗體是有用的。因此，本發(fā)明要解決的問題在于提供具有抗肺瘤活性的抗人Dlk-l抗體，尤其是在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-l單克隆抗體。而且，還在于提供產(chǎn)生該抗體的雜交瘤、該抗體與藥劑的復合體、腫瘤的診斷用或治療用藥物組合物、腫瘤的檢測方法、肺瘤的檢測用或診斷用試劑盒。本發(fā)明人為了解決上述問題進行了積極的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10了與人Dlk-l特異性反應(yīng)的抗體(尤其是抗人Dlk-l單克隆抗體)，其具有抗腫瘤活性；以及該抗體與各種藥劑的復合體(免疫結(jié)合物(immunoconjugate)),并確認了它們在體內(nèi)具有抗肺瘤活性。而且，還發(fā)現(xiàn)這些抗體和復合體對于肺瘤的治療、診斷和才全測有用，乂人而完成本發(fā)明。即，本
發(fā)明內(nèi)容如下。(1)在體內(nèi)具有抗肺瘤活性的抗人Dlk-l的抗體。上述腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳&i癌、人肝癌和人神經(jīng)母細l包瘤構(gòu)成的組中的至少l種。在上述(1)的抗體中，抗腫瘤活性例如可以例舉腫瘤血管生成抑制活性。上述(l)所述的抗體，例如，可以例舉多克隆抗體和單克隆抗體。上述(1)所述的抗體，例如，可以例舉H鏈V區(qū)域的CDR1~3的氨基酸序列依次分別為序列號30~32所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的CDR1~3的氨基酸序列依次分別為序列號33~35所示的氨基酸序列。作為本發(fā)明的抗體，可以例舉雜交瘤所產(chǎn)生的抗體、基因重組抗體等。所謂雜交瘤，是指使通過對人以外的哺乳動物免疫抗原而獲得的B細胞和骨髓瘤細胞進行細胞融合而獲得的、產(chǎn)生具有所希望的抗原特異性的抗體的細胞。作為基因重組抗體，包括嵌合抗體(人源化嵌合抗體)、人化抗體、人抗體或它們的抗體片段等通過基因重組制備的抗體。基因重組抗體中，具有單克隆抗體的特征、抗原性低、血中半衰期延長的抗體優(yōu)選作為治療藥。其中，'作為嵌合抗體，例如，可以例舉H鏈V區(qū)域的氨基酸序列由序列號23所示的氨基酸序ii列構(gòu)成，L鏈V區(qū)域的氨基酸序列由序列號25所示的氨基酸序列構(gòu)成。(2)由保藏號為FERMBP-10707的雜交瘤產(chǎn)生的抗人Dlk-l的單克隆抗體。(3)由保藏號為FERMBP-10899的雜交瘤產(chǎn)生的抗人Dlk-l的單克隆抗體。(4)由保藏號為FERMBP-10900的雜交瘤產(chǎn)生的抗人Dlk-l的單克隆抗體。上述(l)~(4)中所述的抗體，例如，可以例舉與序列號2所示的人Dlk-l的氨基酸序列中的第26位~第85位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域、第92位~第167位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域、或第131位~第244位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域中的至少一部分結(jié)合(識別該部分)的抗體。(5)作為上述(1)~(4)中所述的抗體，例如，可以例舉與由保藏號為FERMBP畫10707、FERMBP-10899或FERMBP-10900的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體所結(jié)合(識別)的部位(例如表位)結(jié)合的抗體。(6)來源于上述(1)~(5)中任意一項所述的抗體的抗體片段。上述(6)所述的抗體片段，可以例舉例如含有序列號3032所示的氨基酸序列的抗體片段，具體而言可以例舉含有序列號23所示的氨基酸序列的抗體片段。上述(6)所述的抗體片段，例如，可以例舉含有序列號33~35所示的氨基酸序列的抗體片段，具體而言可以例舉含有序列號25所示的氨基酸序列的抗體片段。(7)產(chǎn)生上述(1)所述的抗體的雜交瘤。(8)保藏號為FERMBP-10707的產(chǎn)生抗人Dlk-l的單克隆抗體的雜交瘤。(9)保藏號為FERMBP-10899的產(chǎn)生抗人Dlk-l的單克隆抗體的雜交瘤。(10)保藏號為FERMBP-10900的產(chǎn)生抗人Dlk-l的單克隆抗體的雜交瘤。(11)含有上述(1)~(5)中任意一項所述的抗體和具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的化合物的抗體-藥劑復合體。(12)含有上述(6)所述的抗體片段和具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的化合物的抗體片段-藥劑復合體。在上述(11)和(12)所述的復合體中，腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。在上述(11)和(12)所述的復合體中，抗腫瘤活性例如可以例舉肺瘤血管生成抑制活性。(13)含有選自于由上述(1)~(5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復合體構(gòu)成的組中的至少l種的藥物組合物。上述(13)所述的組合物例如可以例舉用于腫瘤的治療的組合物，作為肺瘤的治療，例如，可以例舉抑制腫瘤血管生成。而且，該組合物可以例舉例如沒有體重減少的副作用的組合物。上述(13)所述的組合物可以例舉例如用于肺瘤的i貪斷的組合物。在上述(13)所述的組合物中，肺瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。(14)含有選自于由上述(1)~(5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復合體構(gòu)成的組中的至少l種的肝瘤治療劑。上述(14)所述的治療劑，例如，可以例舉沒有體重減少的副作用的治療劑。在上述(14)所述的治療劑中，腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。(15)含有選自于由上述(1)~(5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復合體構(gòu)成的組中的至少l種的胂瘤血管生成抑制劑。上述(15)所述的抑制劑，例如，可以例舉沒有體重減少的副作用的抑制劑。上述(15)所述的抑制劑中，腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。(16)含有選自于由上述(1)~(5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復合體構(gòu)成的組中的至少l種的紳瘤診斷劑。上述(16)所述的診斷劑中，腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。(17)—種腫瘤的檢測方法，其特征在于，使選自于由上述(1)~(5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復合體構(gòu)成的組中的至少l種與從生物體采集的試樣反應(yīng)，檢測反應(yīng)的抗體的信號。上述腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細月包瘤構(gòu)成的組中的至少l種。(18)—種腫瘤的診斷和/或治療方法，其包括向患者給予14選自于由上述(l)~(5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復合體構(gòu)成的組中的至少l種，或給予上述(13)的藥物組合物。上述肺瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。作為上述(18)的方法，例如，可以例舉通過阻礙或抑制肺瘤的血管生成而進^f于腫瘤治療的方法。(19)腫瘤的診斷用和/或治療用的上述(1)~(5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段、或上述(11)或(12)所述的復合體。上述腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。(20)上述(1)~(5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段、或上述(11)或(12)所述的復合體在制備用于診斷和/或治療腫瘤的藥物中的用途。上述肺瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。(21)含有選自于由上述(1)~(5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復合體構(gòu)成的組中的至少l種的腫瘤的檢測用、i貪斷用或治療用試劑盒。上述肺瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。圖l是表示在使用表達hDlk-l的肝癌細胞林(Huh-7-hDlk細胞)的異種移植治療(XenograftTreatment)模型中，給予公知15的(WO2005/052156)抗hDlk-l單克隆抗體3個克隆(1C1、4C4、31C4)時的結(jié)果的圖。各抗體在第l天(Day1)、第4天(Day4)、第7天(Day7)和第10天(Day10)共計4次(箭頭)進行腹腔內(nèi)給藥。A:大鼠IgG(對照組)()，lCl(o)B:大鼠IgG(對照組)()，4C4(q)C:大鼠IgG(對照組)()，31C4(o)在AC中，各組的個體數(shù)用N表示，各測定值(腫瘤體積)用平均值士標準誤差表示。這些實驗至少進行3次獨立的實驗。任意一個情況下，對于在棵小鼠皮下建立的肝癌都看不到抗腫瘤活性。圖2是在使用Huh-7-hDlk細胞的異種移植治療模型中，評價新抗hDlk-l單克隆抗體克隆DI-2-14(小鼠IgGl)的抗腫瘤活性的圖。A:經(jīng)時表示對照組(小鼠IgG)和DI-2-14給藥組的腫瘤生長(平均值士標準誤差)。箭頭表示給予抗體(20mg/kg體重，腹腔內(nèi)纟合藥)。*P<0.01(通過Student，st才全-驗)B:A的試驗中，把第14天(Dayl4)(實驗最后一天)時各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。各圖上所示的數(shù)值為平均值士標準誤差。*P<0.01(通過Student，st4全一驗)C:表示在獨立的其它實驗中評價DI-2-14的抗肺瘤活性的結(jié)果。*P<0.01(通過Student，st檢驗)圖3是在使用Huh-7-hDlk細胞的異種移植治療模型中，評價A:克隆2-13(大鼠IgG2b)、B:克隆BA-1-3D(小鼠lgG2a)、C:克隆DI-6(小鼠IgGl)、D:克隆M3-1(小鼠IgGl)的抗腫瘤活性的圖。腫瘤體積用平均值±標準誤差表示，星號表示差異顯著性檢驗(*P<0.01,**P<0.05,通過Student，st檢驗)的結(jié)果。圖4是表示抗hDlk-l單克隆抗體(克隆2-13)在釆用表達hDlk-l的大腸癌細胞林(SW480-hDlk纟田胞)的異種移植治療模型中的抗肺瘤活性的圖。將'SW480-hDlk細胞移植到棵小鼠皮下，建立大腸癌組織。在箭頭指示的時間點進行腹腔內(nèi)給予抗體(20mg/kg體重)。腫瘤體積用平均值士標準誤差表示(*P<0.01,**P<0.05,通過Student'st檢驗)。圖5是表示使用HEK293-hDlk細胞通過流式細胞術(shù)進行的抗hDlk-l單克隆抗體反應(yīng)性的圖。各圖上所示的編號表示克隆編號。涂黑的部分是同種型對照抗體。黑線是抗hDlk-l單克隆抗體o圖6是表示釆用Huh-7-hDlk細l包通過流式細月包術(shù)進行的抗hDlk-l單克隆抗體的反應(yīng)性的圖。各圖上所示的編號表示克隆編號。涂黑的部分是同種型對照抗體。黑線是抗hDlk-l單克隆抗體。圖7是為分析抗hDlk-l單克隆抗體所識別的表位而制備的缺失了各EGF樣基序的突變體的示意圖。圖8是表示克隆DI-2-14的表位分析的結(jié)果的圖。A:在COS-7細胞中通過脂質(zhì)體瞬時導入所述hDlk-l基因的突變體基因，24~72小時后進行FACS分析的圖(左小鼠IgGl、右DI-2-14)。設(shè)門部分表示克隆DI-2-14所識別的各突變體表達細力包。B:是用陽性對照(抗hDlk-l多克隆抗體)和克隆DI-2-14對表達EGF(1-2)的COS-7細胞的涂片標本進行免疫染色的照片。染成茶褐色的部分表示EGF(1-2)的表達。圖9是表示克隆DI-6、BA-1-30和2-13的表位分析的結(jié)果的圖。A:是在COS-7細胞中通過脂質(zhì)體瞬時導入所述hDlk-l基因的突變體基因，24~72小時后進行FACS分析的圖。設(shè)門部分表示各克隆識別的各突變體表達細胞。B:是用克隆DI-6、BA-1-3D和2-13對表達EGF(1-2)的COS-7細胞的涂片標本進行免疫染色的照片。箭頭表示的染成茶褐色的部分表示EGF(1-2)的表達。圖IO是表示克隆M3-1通過FACS進行表位分析的結(jié)果的圖。在COS-7細胞中通過脂質(zhì)體瞬時導入所述hDlk-l基因的突變體基因，2472小時后進行FACS分析的圖。設(shè)門部分表示克隆DI-2-14所識別的各突變體表達細胞。圖ll是表示抗hDlk-l單克隆抗體結(jié)合抗原后的內(nèi)化活性的分析結(jié)果的圖。A:使HEK293-hDlk細胞與抗hDlk-l單克隆抗體(克隆M3-l、Ml-290和M3-4)反應(yīng)(4°C,20分鐘)，用PBS清洗2次后，于37。C進行圖中所述時間的孵育。然后，使之與PE標記抗小鼠IgG反應(yīng)，進行FACS分析。數(shù)值用相對值表示，所述相對值為以不孵育時(0分鐘)的平均螢光強度作為100%時的相對值。B:是表示使FITC標記的克隆M3-1(FITC-M3-1)與HEK293-hDlk細胞反應(yīng)(4°C,20分鐘)，用PBS清洗2次后，于37°C下孵育120分鐘時的平均螢光強度的變化的圖。黑柱表示像A那樣，使未標記的M3-1與細胞反應(yīng)后，于37。C下孵育120分鐘，與PE標記的抗小鼠IgG反應(yīng)時的平均螢光強度的變化。圖12是表示羅丹明標記的抗hD1k-1單克隆抗體結(jié)合抗原后的內(nèi)化活性的分析結(jié)果的圖。A:是使HEK-293-hDlk細胞與羅丹明標記-M3-118(Rho-M3-l)反應(yīng)(4°C，20分鐘)，用PBS清洗2次后，立即制備涂片標本，用螢光顯微鏡觀察Rho-M3-l的定位的照片。橙色所示的部分表示Rho-M3-l的定位，觀察到在細胞膜中定位。B~E:是使Rho-M3國l(B)、Rho-DI曙l(C)、Rho-Ml-290(D)和Rho-M3-4(E)與HEK293-hDlk細胞反應(yīng)，用PBS清洗2次后，于37。C下孵育15分鐘后，制備涂片標本，用螢光顯微鏡觀察各克隆的定位的照片。觀察到識別相同表位(EGF4-6)的Rho-M3-1和Rho-DI-1均進入到細胞內(nèi)，以點狀定位的樣子。圖13是表示結(jié)合了皂草素(Saporin)的抗hDlk-l單克隆抗體對于Huh-7-hDlk細胞和SK-N-F1細胞的細胞損傷活性的圖。A:是表示對照(小鼠IgG-皂草素(IgG-SAP))和M3-l-SAP對Huh-7-hDlk細胞的效果的圖?？v軸用相對值表示，所述相對值為以未添加時的細胞的存活率為100%時的相對值(N=3，平均值±標準偏差)。B:是表示對照(IgG-SAP)、M3-l-SAP和Ml-290-SAP對SK-N-F1細胞的效果的圖。圖14是表示Huh-7-hDlk細胞的異種移植模型中，給予小鼠IgG(20mg/kg體重)、M3-1-SAP(5mg/kg體重)和Ml-290-SAP(5mg/kg體重)時的、A:給藥后的各小鼠的體重變化、B:小鼠存活率的圖。值用平均值士標準偏差表示。箭頭表示給予抗體時間。圖15是表示Huh-7-hDlk細胞的異種移植模型中，腹腔內(nèi)給予小鼠IgG(參；N=8)和M3-1-SAP(o:N二8)時的腫瘤生長抑制效果的圖。箭頭表示給予抗體時間。值用平均值士標準偏差表示。P〈0.01,**P<0.05,通過Student，st檢驗)。圖16是表示Huh-7-hDlk細胞的異種移植模型中，腫瘤內(nèi)給予A和B即小鼠IgG(N=5)和M3-1國SAP(o:N=5)(40|ig)時的腫瘤生長抑制效果(A)和體重變化(B)的圖和腹腔內(nèi)給予C和D即PBS(，N=4)和順鉑(Cisplatin)(o:N=4)(5mg/kg體重)時的腫瘤生長抑制效果(C)和體重變化(D)的圖。在任意一張圖中，箭頭均表示給予抗體時間，值用平均值土標準偏差表示(*P<0.01,**P<0.05，通過Student，st檢驗)。圖17是表示用抗hDlk-l抗體對人大腸癌組織陣列(Cybrdi公司制、CC05-01-001)進行免疫染色時的代表例的照片。茶褐色部分表示用抗hDlk-l抗體染色的癌組織。hDlk-1陰性是指如No.48的切片(69歲男性，腺癌，階段III)所示，完全沒有觀察到染色的區(qū)域的切片。No.l9(55歲女性，腺癌，階段II)顯示出非常強的染色性，將顯示出與No.19同等的染色性的切片作為hDlk-l強陽性。另外，將No.25(75歲男性，腺癌，階段II)所示那樣的、可明確地確認為hDlk-l陽性但染色性弱的切片作為hDlk國l弱陽性。圖18是表示用抗hDlk-l抗體對人乳l^癌組織陣歹'J(Cybrdi公司制、CC08-02-002)進行免疫染色時的代表例的照片。茶褐色部分表示用抗hDlk-l抗體染色的癌組織。照片上面部分是組織陣列中所含的正常乳腺組織被抗hDlk-l抗體染色時的照片。左No.07(68歲女性，正常乳管；hDlk-l陰性)、右No.01(43歲女性，正常乳腺小葉；hDlk-l弱陽性)。箭頭表示hDlk-l弱陽性的部位。照片下面部分表示浸潤性導管癌患者的照片。左No.08(45歲女性，階段II;hDlk-l陰性)，中央No.56(28歲女性，階段II;hDlk-l弱陽性)，右No.20(59歲女性，階段II;hDlk-l強陽性)。圖19是表示在Huh-7-dlk細胞異種移植治療模型中，克隆DI-2-14的用量依賴性抗肺瘤活性的圖。20圖20是表示在SK-N-F1細胞異種移植治療才莫型中，克隆DI-2-14的用量依賴性的抗腫瘤活性的圖。A:表示開始給予抗體以后的肺瘤生長。肺瘤體積用平均值土標準誤差表示(*P<0.01,"P<0.05,通過Student'st檢驗)。B:是表示給予抗體后第23天(Day23)時摘出的癌組織的重量的圖。圖21是表示克隆DI-2-14H鏈(重鏈)可變區(qū)(VH)的cDNA堿基序列(序列號22)和推定氨基酸序列(序列號23)的圖。信號肽用西文斜體字表示。畫了雙下劃線的谷氨酸(E)表示成熟肽的N末端氨基酸殘基。CDR序列(下劃線)按照Kabat等人(SequencesofProteinsofImmunologicalInterests,Fifthedition,NIHPublicationNo.91-3242，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,1991)的定義?？寺I畫2-14VH的CDR1~3的氨基酸序列依次分別示于序列號30~32。圖22是表示克隆DI-2-14L鏈(輕鏈)可變區(qū)(VL)的cDNA堿基序列(序列號24)和推定氨基酸序列(序歹']號25)的圖。信號肽用西文斜體字表示。畫了雙下劃線的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸殘基。CDR序歹'J(下劃線)按照Kabat等人(1991;上述)的定義?？寺I-2-14VL的CDR1~3的氨基酸序列依次分別示于序列號33~35。圖23是表示克隆DI-2-14VH基因的堿基序列(序列號26)和氨基酸序列(序歹'J號27)的圖。5，末端添加了Spel位點，3，末端添加了HindIII位點(分別添加了下劃線。)。用西文斜體字文字表示的堿基序列表示相當于內(nèi)含子的序列。圖24是表示克隆DI-2-14VL基因的堿基序列(序列號28)和氨基酸序列(序歹'J號29)的圖。在5，末端添加了NheI位點，在3，末端添加了EcoRI位點(分別添加了下劃線。)。用西文斜體字文字表示的堿基序列表示相當于內(nèi)含子的序列。圖25是嵌合DI-2-14基因表達載體(pChDI-2-14)的概略圖。該載體從Sail位點起順時針地包括由人巨細胞病毒主要即刻早期動子(humancytomegalovirus(CMV)majorimmediateearlypromoter)和用于抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄開始的增強子起始的重鏈翻譯單元。接著CMV區(qū)域的是VH外顯子、人W重鏈恒定區(qū)(夾著內(nèi)含子地包含CH1、鉸鏈區(qū)域、CH2和CH3的外顯子)的基因序列和CH3，接著是mRNA加工的聚A位點。重鏈基因序列后存在由CMV啟動子和增強子起始的輕鏈翻譯單元，接著是與VL外顯子和在上游有內(nèi)含子部分的人k鏈恒定區(qū)的外顯子(CL)以及k基因的聚A信號。該輕鏈基因后接SV40早期啟動子、大腸桿菌來源的黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶()基因(xanthineguaninephosphoribosyltransferase(gpOgene)和含有SV40的聚A位點的片段。最后，該質(zhì)粒具有含有細菌的復制起點和P-內(nèi)酰胺酶基因的pUC19質(zhì)粒的一部分。圖26是小鼠DI-2-14和嵌合DI-2-14(ChDI-2-14)的用SDS-PAGE展開后并經(jīng)CBB染色的圖。MW表示分子大小標準參照物，箭頭分別表示條帶的分子量(kD)。圖27是表示利用純化FA-1(hDlk-1細胞外區(qū)域)的固相ELISA的、DI-2-14和ChDI-2-14的抗原結(jié)合活性的圖。o表示小鼠IgGl抗體(克隆DI-2-14),*表示嵌合抗體(ChDI-2-14)。圖28是表示使用HEK293-hDlk細胞，通過流式細胞術(shù)進行的DI-2-14和ChDI-2-14的反應(yīng)性的圖。涂黑的圖是同種型對照抗體，黑線(白色空心)圖分別是DI-2-14和ChDI-2-14。圖29是用流式細胞術(shù)分析人肝癌細胞林中細胞表面Dlk-1的表達的圖。藍色線表示小鼠IgGl,紅色線表示抗人Dlk-1抗體，表示將各細胞染色時的圖。圖30是用流式細胞術(shù)分析人乳腺癌細胞林中的細胞表面Dlk-l的表達的圖。藍色線表示小鼠IgGl,紅色線表示抗人Dlk-l抗體，表示將各細胞染色時的圖。圖31是用流式細胞術(shù)分析人白血病細胞林中的細胞表面Dlk-l的表達的圖。藍色線表示小鼠IgGl，紅色線表示抗人Dlk-l抗體，表示將各細胞染色時的圖。圖32是表示Huh-7-dlk細胞異種移植治療模型中的摘出的癌組織中的Flk-1/VEGF-R2的免疫組化染色的圖。A:是分別用抗小鼠Flk-1/VEGF-R2抗體對取自(摘自)小鼠IgG給藥組(對照組)和克隆DI-2-14給藥組的癌組織的新鮮冷凍切片進行免疫染色的照片(物鏡200倍)。照片中，箭頭狀的標記(▲)示出的區(qū)域表示Flk-1/VEGF-R2陽性的肺瘤血管內(nèi)皮細月包。B:是用抗小鼠Flk-1/VEGF-R2抗體對從IgG給藥組(2個個體)和DI-2-14給藥組(4個個體)分別采集的新鮮冷凍切片進行免疫染色，在各個切片中，對于物鏡200倍下8~13個視場(IgG給藥組共21個視場、DI-2-14給藥組共35個詳見場)，對Flk-1/VEGF-R2陽性的腫瘤血管內(nèi)皮細胞計數(shù)，表示每l個視場的細胞數(shù)的圖(*P<0.01,通過Student'st檢驗)。圖33是表示Huh-7-dlk細胞異種移植治療模型中摘出的癌組織中的Flk-1/VEGF-R2的基因表達的圖。A:從IgG給藥組(N=7)和DI-2-14給藥組(N=7)分別摘出肺瘤后，用Trizol試劑提取RNA,然后合成第1鏈cDNA,分別使用各第1鏈cDNA作為模板，通過PCR法(30個循環(huán))確認小鼠Flk-1/VEGF-R2(mFlk國l)和小鼠/人GAPDH(GAPDH)的基因表達的電泳圖像的圖。下圖是用NIHimage定量mFlk-l和GAPDH的PCR擴增產(chǎn)物的條帶并以比例(mFlk-l/GAPDH)23表示的圖。B:是除了通過PCR法進行35個循環(huán)的擴增反應(yīng)以外，與A同樣情況的圖。具體實施例方式以下，對本發(fā)明進行詳細地說明。本發(fā)明的范圍不局限于這些說明，在不損害本發(fā)明的主要內(nèi)容的范圍內(nèi)可以在以下的例示的基礎(chǔ)上適當變更而實施。而且，本說明書包括作為本申請優(yōu)先斥又主張的基礎(chǔ)的日本特愿2006-305355號說明書的全部內(nèi)容。而且，本說明書中引用的所有的出版物，例如現(xiàn)有技術(shù)文獻和7>開7>報、專利公報以及其它的專利文獻作為參照并入本說明書。1.本發(fā)明的概要如前所述，人Dlk-l(delta-like1homolog(果蠅);hDlk-l)是全長為383個氨基酸殘基的單次跨膜型的1型膜蛋白質(zhì)，其在細胞外區(qū)域具有6個EGF樣基序。而且，已知hDlk-l基因及其基因產(chǎn)物在各種癌和肺瘤細胞中以高頻率表達。一^t殳來"^兌，由于難以制得在體內(nèi)顯示抗腫瘤活性的抗體，因此即使制備抗hDlk-l單克隆抗體，大多在體外具有抗腫瘤活性，但在體內(nèi)并不顯示出相同活性。而且，由于針對hDlk-l的癌細胞的增殖等功能的區(qū)域、hDlk-l的配體(或受體)和細胞內(nèi)信號傳遞途徑等尚不清楚，縮小靶點來有效地進行抗體制備也基本是不可能的。這種狀況下，本發(fā)明中，通過從多個克隆中進行篩選，成功地獲得了在體內(nèi)具有抗肺瘤活性的克隆。首先，本發(fā)明人通過使用公知的抗hDlk-l抗體的免疫組織化學，在迄今為止確認了hDlk-l的表達的前述癌和腫瘤細胞以外，還新發(fā)現(xiàn)了hDlk-l在大腸癌和乳腺癌中也表達。然后，本發(fā)明人以制備可以在個體水平上使得表達hD1k-1的癌細月包死亡或可以抑制腫瘤生長的抗hD1k-1抗體，即在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗hDlk-l抗體作為目的，重新制備了約100個克隆的抗hDlk-l單克隆抗體。而且，就這些克隆，將各種癌細胞株移植到棵小鼠皮下，用這樣建立的荷瘤小鼠進行體內(nèi)的藥效(抗腫瘤作用)評價。其結(jié)果是，成功地獲得了多個顯示出顯著的腫瘤生長抑制活性的克隆(克隆名DI-2-14、2-13、BA國1-3D、DI-6、M3匿l)。而且，本發(fā)明人在上述抗hDlk-l抗體中發(fā)現(xiàn)了在向表達hDlk-l的細胞內(nèi)的移動能力(內(nèi)化活性)方面優(yōu)異的抗體，制備出含有這種抗體和具有抗腫瘤活性和細胞殺傷活性的化合物的抗體-藥劑復合體。該復合體，作為所謂的免疫結(jié)合物，其對目標肺瘤細胞內(nèi)的藥物送達能力優(yōu)異。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用具有上述抗腫瘤活性的抗hDlk-l抗體和抗體-藥劑復合體，對于各種腫瘤的治療或腫瘤的診斷和檢測有用。2.抗hDlk-l抗體的制作(1)抗原的制備hDlk-l的氨基酸序列(序列號2)的信息，例如在NCBI(GenBank)的網(wǎng)站(http:〃www.ncbi.nlm.nih,gov/)上以"登錄號NP—003827"公布。而且，編碼hDlk-l的氨基酸序列的堿基序列(序列號l)的信息在同一網(wǎng)站上以"登錄號NM—003836"公布。作為抗原，可以使用含有hDlk-l的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的多肽或肽(也簡稱為肽)，可優(yōu)選使用含有hDlk-l的細胞外區(qū)域(FA-1)的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部)的肽。hDlk-l的細胞外區(qū)域為如前所述的含有6個25EGF樣基序(EGF-1~EGF-6)的區(qū)域，為含有序列號2所示的氨基酸序列中的第26位~第244位的氨基酸的區(qū)域，優(yōu)選為序列號2所示的氨基酸序列中的"第24位"至"第248~285位"的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域(約225~262個氨基酸殘基)。其中，就作為抗原使用的肽來說，上述"氨基酸序列的至少一部分"的長度沒有特別限定，例如優(yōu)選含有6個EGF樣基序中的1個或2個以上的區(qū)域。更優(yōu)選例如含有EGF-1和EGF-2的區(qū)域(即序列號2所示的氨基酸序列中的第26位~第85位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域)、含有EGF-3和EGF-4的區(qū)域(即序列號2所示的氨基酸序列中的第92位~第167位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域)、和含有EGF-4、EGF-5和EGF-6的區(qū)域(即序列號2所示的氨基酸序列中的第131位~第244位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域)。作為抗原的肽的制作方法可以是化學合成，也可以通過采用大腸桿菌等的基因工程法合成，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。進行肽的化學合成時，可以通過肽合成的公知方法進行合成。而且，其合成也可以使用固相合成法和液相合成法中的任意一種。還可以使用市售的肽合成裝置(例如，島津制作所制PSSM-8等)。在用基因工程學方式合成肽時，首先設(shè)計并合成編碼該肽的DNA。該設(shè)計和合成例如可以使用以含有全長hDlk-l基因的載體等作為模板，使用設(shè)計為可以合成所希望的DNA區(qū)域的引物，通過PCR法進行。然后，通過將上述DNA連接到適當?shù)妮d體上而獲得蛋白質(zhì)表達用重組載體，將該重組載體導入宿主中并使得目的基因可以表達，由此獲得轉(zhuǎn)化子(SambrookJ.etal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)。使用可以在宿主微生物中自我增殖的噬菌體或質(zhì)粒作為載體。而且還可以使用動物病毒、昆蟲病毒載體。重組載體的制作可如下進行，即用適當?shù)南拗菩悦盖袛嗉兓腄NA,插入適當?shù)妮d體DNA的限制性酶位點等中而與載體連接。作為轉(zhuǎn)化時使用的宿主，只要是可以表達目的基因的宿主即可，沒有特別的限定。例如，可以例舉細菌(大腸桿菌、枯草桿菌等)、酵母、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)、昆蟲細胞或昆蟲。還可以使用山羊等哺乳動物作為宿主。向宿主導入重組載體的方法是7>知的。然后，培養(yǎng)前述轉(zhuǎn)化子，從其培養(yǎng)物中收集作為抗原使用的肽。"培養(yǎng)物，，是指(a)培養(yǎng)上清、(b)培養(yǎng)細胞或者培養(yǎng)菌體或其破石爭物中的任意一種。培養(yǎng)后，目的肽在菌體內(nèi)或細胞內(nèi)產(chǎn)生時，通過破碎菌體或細胞來提取肽。而且，目的肽在菌體外或細胞外產(chǎn)生時，直接使用培養(yǎng)液或通過離心分離等除去菌體或細胞。然后，可以通過單獨使用可以在肽的分離純化中使用的一般的生物化學方法，例如硫酸銨沉淀、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等或?qū)⑦@些方法組合使用，來分離純化目的肽。本發(fā)明中，還可以使用無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，通過體外翻譯獲得作為抗原的肽。此時，可以使用以RNA作為模板的方法和以DNA作為模板的方法(轉(zhuǎn)錄/翻譯)這2種方法。作為無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，可以使用市售的系統(tǒng)，例如ExpresswayTM系統(tǒng)(Invitrogen公司)、PURESYSTEM(注冊商標；postgenome研究所)、TNT系統(tǒng)(注冊商標；Promega公司)等。如上所述獲得的肽還可以結(jié)合到適當?shù)妮d體蛋白質(zhì)，例如牛血清白蛋白(BSA)、鑰孔血藍蛋白(Keyholelimpethemocyanin，KLH)、人曱狀腺球蛋白、雞"球蛋白等。另外，抗原可以是在hDlk-l的氨基酸序列(序列號2)或前述的序列的部分序列中缺失、置換或添加了l個或多個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的肽。例如，還可以使用hDlk-l的氨基酸序列或其部分序列中缺失l個或多個(優(yōu)選l個或多個(例如l個~10個，更優(yōu)選l個~5個))氨基酸，l或多個(優(yōu)選l個或多個(例如l個~IO個，更優(yōu)選l個~5個))氨基酸被其它氨基酸置換，或添加了l個或多個(優(yōu)選l個或多個(例如l個~IO個，更優(yōu)選l個5個))其它氨基酸的氨基酸序列所構(gòu)成的肽。本發(fā)明中，作為用于導入于細胞等的基因，可以例舉編碼hDlk-l蛋白質(zhì)或其部分片段的基因、或編碼其突變型的蛋白質(zhì)或片段的基因。作為這種基因，例如可以使用具有序列號l所示的堿基序列或其部分序列的基因。而且，作為用于導入于細胞等的基因，還可以使用與序列號l所示的堿基序列互補的序列在嚴緊條件下雜交，且編碼具有hDlk-1活性的蛋白質(zhì)的石威基序列或其部分序列。"嚴緊條件"是指雜交后清洗時的條件，緩沖液的鹽(鈉)濃度為10~500mM，溫度為42。C~72°C,優(yōu)選上述鹽濃度為50~300mM，溫度為55~68。C的條^f牛。為了在基因中導入突變，可以通過Kunkel法或帶缺口的雙鏈體(Gappedduplex)法等公知方法進行，例如使用利用定點突變法的突變導入用試劑盒GeneTailorSite-DirectedMutagenesisSystem(Invitrogen乂i^司制)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan-SuperExpressKm等TAKARABICV^司制)來進行。(2)多克隆抗體的制作將制備的抗原給予到用于免疫的哺乳動物。哺乳動物沒有特別限定，例如可以例舉大鼠、小鼠和兔等，其中優(yōu)選小鼠。每一只動物的抗原給藥量，可以根據(jù)佐劑的有無適當設(shè)定。作為佐劑，可以例舉弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、氫氧化鋁佐劑等。免疫主要可以通過注入到靜脈內(nèi)、腳掌、皮下、腹腔內(nèi)等來進行。而且，免疫的間隔沒有特別限定，以數(shù)天至數(shù)周的間隔優(yōu)選l周的間隔進行l(wèi)~10次、優(yōu)選2~3次免疫。然后，在最后的免疫日起3~7天后，通過酶免疫測定法(ELISA或EIA)或i丈射性免疫測定法(RIA)等測定抗體效價，可以在出現(xiàn)所希望的抗體效價之日采血，獲得抗血清。在上述抗體的提取方法中，在需要純化抗體時，可以通過適當選擇或組合硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等公知方法來進行純化。然后，通過ELISA法等測定抗血清中的多克隆抗體的反應(yīng)性。(3)單克隆抗體的制作(3-1)抗體產(chǎn)生細胞的提取本發(fā)明的抗hDlk-l抗體并沒有限制，但優(yōu)選為單克隆抗體。將制備的抗原給予用于免疫的哺乳動物，例如大鼠、小鼠和兔等。每只動物的抗原給藥量可以根據(jù)有無佐劑適當設(shè)定。佐劑與上述同樣。免疫方法也與前述同樣。而且，在最后的免疫日起160天后，優(yōu)選為114天后，提取抗體產(chǎn)生細胞。作為抗體產(chǎn)生細胞，可以例舉脾細胞、淋巴結(jié)細胞和外周血細胞等，其中優(yōu)選淋巴結(jié)細胞和脾臟細胞。(3-2)細胞融合為了獲得雜交瘤(抗體產(chǎn)生細胞株)，進行抗體產(chǎn)生細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合。作為與抗體產(chǎn)生細胞融合的骨髓瘤細胞，可以使用小鼠等動物的一般可以獲得的已建立的細胞林。作為使用的細胞抹，優(yōu)選具有藥劑選擇性，具有未融合的狀態(tài)下在HAT選擇培養(yǎng)基(含有次黃。票呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷)中無法生存而只有在與抗體產(chǎn)生細胞融合的狀態(tài)下可以生存的性質(zhì)的細胞抹。作為骨髓瘤細胞，例如可以例舉P3國X63-Ag8.653、P3國X63-Ag8(X63)、P3國X63-Ag8,Ul(P3U1)、P3/NS1/1隱Ag4畫l(NS1)和Sp2/0-Ag14(Sp2/0)等小鼠骨髓瘤細胞林。骨髓瘤細然后，使骨髓瘤細胞與抗體產(chǎn)生細胞進行細胞融合。細胞融合時，在不含血清的DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基等動物細胞用培養(yǎng)基中，混合lxl06~lxi(^個/mL的抗體產(chǎn)生細胞和2xl05~2xl(^個/mL的骨髓瘤細胞。抗體產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞的細胞比(抗體產(chǎn)生細胞骨髓瘤細胞)沒有限制，但通常優(yōu)選為l:1~10:1，更優(yōu)選為3:1。然后，在細胞融合促進劑的存在下進行融合反應(yīng)。作為細胞融合促進劑，例如可以使用平均分子量為1000~6000道爾頓(D)的聚乙二醇等。而且，還可以使用利用電刺激(例如電穿孔)的市售的細胞融合裝置，使抗體產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞融合。(3-3)雜交瘤的挑選和克隆從細胞融合處理后的細胞中挑選出目的雜交瘤。作為該方法，將細胞懸浮液用例如含有胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基等適當稀釋后，接種于微板上，在各孔中加入選擇培養(yǎng)基，以后適當更換選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。其結(jié)果是，在選擇培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)后，可以將14天前后開始生長的細胞作為雜交瘤。然后，在逐步增殖的雜交瘤的培養(yǎng)上清中，篩選是否存在與hDlk-l反應(yīng)的抗體。雜交瘤的篩選可以按照通常的方法，沒有特別限制。例如，可以采集已長出雜交瘤的孔中所含的培養(yǎng)上清的一部分，通過ELISA、EIA和RIA等進行篩選。融合細胞的克隆可以通過有限稀釋法等進行。通過流式細胞術(shù)等判斷與hDlk-l顯示出強反應(yīng)性的抗體，選擇產(chǎn)生該抗體的雜交瘤，建立克隆。(3-4)單克隆抗體的提取作為培養(yǎng)已建立的雜交瘤并從獲得的培養(yǎng)物中提取單克隆抗體的方法，可以采取通常的細胞培養(yǎng)法或腹水形成法等。"培養(yǎng)"是指在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中使雜交瘤生長，或如下使雜交瘤在動物的腹腔內(nèi)增殖。細胞培養(yǎng)法中，可以在含有10。/。胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基等動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，在通常的培養(yǎng)條件(例如37。C,5%(202濃度)下培養(yǎng)雜交瘤714天，從其培養(yǎng)上清中獲得抗體。腹水形成法的情況下，在與骨髓瘤細胞來源的哺乳動物同種系動物的腹腔內(nèi)給予約1x107個雜交瘤，使雜交瘤大量增殖。并且，優(yōu)選在2~3周后提取腹水。在上述抗體的才是取方法中，在需要純化抗體時，可以通過適當選擇或組合硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等公知方法來進行純化。(3-5)具有抗腫瘤活性的克隆的挑選本發(fā)明的抗hDlk-l抗體是在體內(nèi)具有抗肺瘤活性的抗體。這里，"抗腫瘤活性"是指使腫瘤細胞(癌細胞)死亡的活性或抑制肺瘤生長的活性。本發(fā)明中，作為抗肺瘤活性，例如可優(yōu)選例舉腫瘤血管生成抑制活性。而且，作為本發(fā)明的抗體可以發(fā)揮抗肺瘤活性的人腫瘤(胂瘤細胞)的種類，可以例舉已確認hDlk-l的表達的前述^^知的人腫瘤(具體而言，實體癌有神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、l型神經(jīng)纖維瘤病、小細胞肺癌、肝癌、腎癌和卯巢癌等，血癌有骨髓發(fā)育異常綜合征和急性髓系白血病等。)和本發(fā)明人新確認hDlk-l的表達的人大腸癌和人乳腺癌。其中尤其可優(yōu)選例舉大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤中的l種或2種以上。體內(nèi)的抗肺瘤活性的確認，例如可以使用在小鼠的皮下移植了所希望的肺瘤細胞的荷瘤小鼠，通過對該小鼠給予前述獲得的抗體來進行。此時，抗體的給藥可以在腫瘤細胞的移植后立即進行(預(yù)防才莫型)，也可以在確認移tiJ中瘤達到預(yù)定體積之后進行(治療模型)。給藥方法并沒有限制，例如可以3天1次，以20mg/kg體重進行腹腔內(nèi)給藥。預(yù)防模型的情況下，可以通過肺瘤形成頻率和腫瘤體積評價抗腫瘤活性的有無和水平。治療模型的情況下，可以根據(jù)腫瘤體積評價抗腫瘤活性的有無和水平。本發(fā)明中，作為在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗hDlk-l抗體，例如可以優(yōu)選例舉由保藏號為FERMBP-10707的雜交瘤產(chǎn)生的抗hDlk-l單克隆抗體(克隆名M3-l),由保藏號為FERMBP-10899的雜交瘤產(chǎn)生的抗hDlk-l單克隆抗體(克隆名DI-2-14)和由保藏號為FERMBP-10900的雜交瘤產(chǎn)生的抗hDlk-l單克隆抗體(克隆名DI-6)等。而且，克隆名DI-2-14的抗hDlk-l單克隆抗體作為在體內(nèi)具有高抗腫瘤活性的抗體是優(yōu)選的。其中，保藏號為FERMBP-10707的雜交瘤命名為"Mouse-Mousehybridoma:M3-l，,，于2006年10月18曰保藏，保藏號為FERMBP-10899的雜交瘤命名為"Mouse-MousehybridomaDI畫2國14",于2007年8月21日保藏，保藏號為FERMBP-10900的雜交瘤稱、為"Mouse-MousehybridomaDI國6，,于2007年8月21日保藏，均保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)。另夕卜，作為本發(fā)明的抗hDlk-l抗體，例如可優(yōu)選例舉H鏈V區(qū)域的CDR1~3的氨基酸序列依次分別為序列號30~32所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的CDR1~3的氨基酸序列依次分別為序列號33~35所示的氨基酸序列的抗體。作為上述H鏈V區(qū)域，例如，優(yōu)選序列號23所示的氨基酸序列構(gòu)成的區(qū)域，作為上述L鏈V區(qū)域，例如，優(yōu)選序列號25所示的氨基酸序列構(gòu)成的區(qū)域。而且，作為本發(fā)明的抗hDlk-l抗體，例如還可優(yōu)選列舉與由保藏號為FERMBP-10707、FERMBP-10899、或FERMBP-10900的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體所結(jié)合(識別)的部位(例如表位)結(jié)合的抗hDlk-l抗體。(3-6)抗hDlk-l抗體的表位本發(fā)明的抗hDlk-l抗體的表位(抗原決定簇)只要是抗原h(huán)Dlk-l的至少一部分即可，并沒有限制，例如，優(yōu)選為序列號l所示的hDlk-l的氨基酸序列中的第26位~第85位的氨基酸所構(gòu)成的區(qū)域(含有hDlk-l的EGF-l~EGF-2的區(qū)域)、第92位~第167位的氨基酸所構(gòu)成的區(qū)域(含有hDlk-l的EGF-3~EGF-4的區(qū)域)、或第131位~第244位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域(含有hDlk-l的EGF-4EGF-6的區(qū)域)中的至少一部分。其中更為優(yōu)選含有hDlk畫l的EGF國4~EGF-6的區(qū)域和含有EGF-4~EGF國6的區(qū)域，尤其優(yōu)選含有第92位~第120位的氨基酸所構(gòu)成的區(qū)域(含有hDlk-l的EGF-3的區(qū)域)。識別該區(qū)域(與該區(qū)域結(jié)合)的抗hDlk-l抗體，例如，對肺瘤細胞內(nèi)的內(nèi)化活性高，在后述的免疫結(jié)合物等用途中極為有用。(4)基因重組抗體和抗體片段(4-1)基因重組抗體作為本發(fā)明的抗hDlk-l抗體的優(yōu)選方式之一，可以例舉基因重組抗體。作為基因重組抗體，沒有限制，^f旦例如可以例舉嵌合抗體、人源化抗體和人抗體等。嵌合抗體(即人源化嵌合抗體)是小鼠源抗體的可變區(qū)連接到(接合)人來源的恒定區(qū)的抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.ii，6851-6855，(1984)等)，在制作嵌合體時，為了獲得這樣連結(jié)的抗體，可以通過基因重組技術(shù)容易地構(gòu)建。其中，作為小鼠源抗體的可變區(qū)，H鏈V區(qū)域例如優(yōu)選序列號23所示的氨基酸序列構(gòu)成的區(qū)域，L鏈V區(qū)域例如優(yōu)選序列號25所示的氨基酸序列構(gòu)成的區(qū)域。在制作人源化抗體時，通過從小鼠抗體的可變區(qū)將互補性決定區(qū)(CDR)移植到人可變區(qū)，框架區(qū)(FR)為人來源，CDR由小鼠來源的CDR構(gòu)成，制備重構(gòu)的可變區(qū)(即CDR移植(CDRgrafting))。然后，將這些人源化的重構(gòu)的人可變區(qū)與人恒定區(qū)連結(jié)。這種人源化抗體的制作方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參照Nature,狙，522-525(1986);J.Mol.Biol.，斑，901-917(1987);QueenCetal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989);日本特表平4-502408號公報(日本特許第2828340號公才艮；Queen等人)等)。其中，作為可以在本發(fā)明的人源化抗hDlk-l抗體中使用的小鼠來源的CDR序歹'J,沒有限制，例如，作為H《連V區(qū)域的CDR1~3，可例舉優(yōu)選(依次分別)序列號30~32所示的氨基酸序列，作為L鏈V區(qū)域的CDR1~3,可以優(yōu)選例舉(依次分別)序列號33~35所示的氨基酸序列。人抗體(完全人抗體)，一般是V區(qū)域的抗原結(jié)合部位即高變區(qū)(HyperVariableregion),V區(qū)域的其它部分和恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)具有與人的抗體相同的結(jié)構(gòu)。但是，高變部位也可以來源于其它動物。制作人抗體的技術(shù)也是公知的，已建立了通過基因工程學的手法來制作人共通的基因序列的方法。人抗體例如可以通過使用含有具有人抗體的H鏈和L鏈基因的人染色體片段的人抗體產(chǎn)生小鼠的方法(參照Tomizuka，K.etal.,NatureGenetics,(1977)16，133-143;K腦iwa，Y.et.al.，Nuc.AcidsRes.，(1998)26，3447-3448;Yoshida，H.et.al.,AnimalCellTechnology:BasicandAppliedAspects,(1999)10，69-73(Kitagawa,Y.，Matuda,T.andlijima,S.eds.)，KluwerAcademicPublishers;Tomizuka，K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(2000)97,722-727等)和荻得從人抗體文庫4兆選的噬菌體展示來源的人4元體的方法(參照Wormstone，I.M.et.al，InvestigativeOphthalmology&VisualScience.,(2002)43(7)，2301-8;Carmen,S.et.al.，BriefingsinFunctionalGenomicsandProteomics,(2002)1(2),189-203;Siriwardena，D.et.al"Opthalmology，(2002)109(3)，427-431等)而獲得。上述嵌合抗體、人源化抗體和人抗體，優(yōu)選為抗體Fc區(qū)域中的N-糖苷鍵復合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的N-乙酰葡糖胺不與巖藻糖結(jié)合的糖鏈，具體而言可以例舉在抗體分子的Fc區(qū)域中具有該巖藻糖的l位不與N-糖苷鍵復合型糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位發(fā)生a結(jié)合的糖鏈的基因重組抗體分子所構(gòu)成的抗體。如果是這種抗體，則可以^f吏ADCC活性極大提高。而且，前述的多克隆抗體和單克隆抗體同樣優(yōu)選這一點(抗體Fc區(qū)域中N-糖苷鍵復合型糖鏈的特征)。(4-2)抗體片段本發(fā)明的抗hDlk-l抗體的片段也包含于本發(fā)明的抗體中。其中，本發(fā)明的抗體片段與本發(fā)明的抗hDlk-l抗體一樣，具有與hDlk-l結(jié)合的活性，在體內(nèi)具有抗肺瘤活性。作為該抗體的片段，是指抗hDlk-l多克隆抗體或抗hDlk-l單克隆抗體的一部分的區(qū)域(即，來源于本發(fā)明的抗hDlk-l抗體的抗體片|史)，例如，可以例舉Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv(抗體可變區(qū))、單鏈抗體(H鏈、L鏈、H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域等)、scFv、雙抗體(diabody)(scFv二聚物)、dsFv(二硫化物穩(wěn)定化V區(qū)域)和至少一部分含有互補性決定區(qū)(complementaritydeterminingregion:CDR)的狀等。Fab是用蛋白質(zhì)分解酶中的木瓜蛋白酶處理抗體分子而獲得的片段中，H鏈的N末端側(cè)約一半和L鏈全體通過二硫鍵結(jié)合的、分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。而且，還可以通過將編碼抗體的Fab的DNA插入于原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，通過將該載體導入到原核生物或真核生物而使之表達，制造Fab。F(ab，)2是用蛋白質(zhì)分解酶中的胃蛋白酶處理抗體分子而獲得的片段中，F(xiàn)ab通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵結(jié)合的稍大的、分子量約為IO萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。而且，還可以通過后述的使Fab形成橫u醚鍵或二硫鍵進行制作。Fab，是切斷上述F(ab，)2的鉸鏈區(qū)的二硫鍵的、分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。而且，還可以通過將編碼抗體的Fab，片段的DNA插入于原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，通過將該載體導入于原核生物或真核生物而使之表達，制造Fab'。scFv是將l條H鏈V區(qū)域(VH)和1條L鏈V區(qū)域(VL)用適當?shù)碾倪B接子(P)連結(jié)的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。scFv可以如下制備，即，獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將該DNA插入再將該表達雙抗體是scFv二聚化形成的抗體片段，其為具有二價的抗原結(jié)合活性的抗體片段。二價的抗原結(jié)合活性可以是相同的，也可以是其中一方為不同的抗原結(jié)合活性。雙抗體可以如下制備，即，通過獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA,構(gòu)建編碼scFv的DNA并使P的氨基酸序列的長度達到8個殘基以下，將該DNAdsFv是指使VH和VL中的各l個氨基酸殘基被換成半胱氨酸殘基的多肽通過該半胱氨酸殘基間的二硫4建結(jié)合形成的抗體。被換成半胱氨酸殘基的氨基酸殘基可以按照Reiter等人公開的方法(ProteinEngineering,7,697-704,1994),基于4元體的立體結(jié)構(gòu)預(yù)測進行選4奪。dsFv可以如下制備通過獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA,構(gòu)建編碼dsFv的DNA,將該DNA插入到原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，再將該表達載體含有CDR的肽包含VH或VL的CDR(CDR1~3)中的至少1個以上區(qū)域而構(gòu)成。含有多個CDR的肽可以如下制備通過直接或適當?shù)碾倪B接子結(jié)合。含有CDR的肽可以通過構(gòu)建編碼抗體的VH和VL的CDR的DNA,將該DNA導入于原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，再將該表達載體導入于原核生物或真核生物中使之表達而進行制造。而且，含有CDR的肽還可以通過Fmoc法(藥曱氧羰基法)和tBoc法(；敘丁氧羰基法)等化學合成法來制造。作為本發(fā)明的抗體片段，可以是以原有的形狀含有N-糖苷鍵復合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的N-乙酰葡糖胺不與巖藻糖結(jié)合的糖鏈的抗體Fc區(qū)域的一部分或全部的抗體片段，而且，也可以是上述抗體片段與N-糖苷鍵復合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖不與巖藻糖結(jié)合的糖鏈的抗體Fc區(qū)域的一部分或全部的融合蛋白質(zhì)。這種抗體片段可以極大地提高ADCC活性，因而優(yōu)選。作為本發(fā)明的抗體片段的具體例子并沒有限制，但可以例舉例如至少部分中含有序列號30~32所示的氨基酸序列(H鏈V區(qū)域的CDR13)的片段，具體而言，可以例舉含有序列號23所示的氨基酸序列(H鏈V區(qū)域)的片段。另外，作為該抗體片段，可以例舉至少部分中含有序列號33~35(L鏈V區(qū)域的CDR1-3)所示的氨基酸序列的片段，具體而言可以例舉含有序列號25所示的氨基酸序列(L鏈V區(qū)域)的片段。以下本說明書中的說明中，上述抗體片段也包含于本發(fā)明的抗hDlk-l抗體中。3.抗體-藥劑復合體的制作作為使用上述本發(fā)明的抗hDlk-l抗體的免疫結(jié)合物等，可以提供含有該抗體和具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活'l"生的化合物的抗體-藥劑復合體。予以說明，在預(yù)先分別制備該抗體分子和具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的化合物之后，將它們復合化而獲得的物質(zhì)一般被稱為免疫結(jié)合物。而且，通過使用基因重組技術(shù)，將具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的化合物中的蛋白質(zhì)毒素在基因上與抗體基因連接，作為l個蛋白質(zhì)(融合蛋白質(zhì))表達而獲得的物質(zhì)一般被稱為免疫毒素。作為具有抗腫瘤活性的化合物，例如，可以例舉阿霉素(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)、絲裂霉素(mitomycin)C、AuristatinE等。作為具有細胞殺傷活性的化合物，例如，可以例舉皂草素、篦麻毒素、綠膿桿菌外毒素、白喉毒素等，其中優(yōu)選使用皂草素和綠膿桿菌外毒素。作為抗體-藥劑復合體的制作方法并沒有限制，例如，可以例舉通過二硫鍵或腙鍵將抗體與藥劑偶聯(lián)的方法等。上述本發(fā)明的抗hDlk-l抗體在對表達hDlk-l的目標腫瘤細胞內(nèi)的內(nèi)化活性方面優(yōu)異。因此，通過預(yù)先使具有抗肺瘤活性和/或細胞殺傷活性的化合物復合化，可以使這些化合物直接且高選擇地作用于腫瘤細胞。本發(fā)明的抗體-藥劑復合體在向目標肺瘤細胞傳送藥劑的能力上極為優(yōu)異。而且，對細力包內(nèi)的內(nèi)化活性可以如下評1介，即，通過用羅丹明等對抗體進行螢光標記，用螢光顯微鏡等觀察向細胞內(nèi)的進入舉動和抗體的定位性。另外本發(fā)明中，還可以提供在抗體-藥劑復合體中，使用前述抗體片段代替抗體的抗體片段-藥劑復合體?？贵w片段-藥劑以下，本說明書的說明中，抗體片段-藥劑復合體也包含于本發(fā)明的抗體-藥劑復合體中。4.藥物組合物本發(fā)明的抗hDlk-l抗體和抗體-藥劑復合體作為包含于藥物組合物中的有效成分是有用的。該藥物組合物作為腫瘤的治療用和/或i貪斷用的藥物組合物是有用的。尤其是，由于本發(fā)明的抗hDlk-l抗體和含有該抗體的抗體-藥劑復合體具有腫瘤血管生成抑制活性的抗腫瘤活性，因此優(yōu)選在肺瘤的治療用中使用。即，本發(fā)明的抗hDlk-l抗體和抗體-藥劑復合體作為包含于腫瘤治療劑、腫瘤血管生成抑制劑和肺瘤診斷劑中的有效成分是有用的。本發(fā)明的藥物組合物含有本發(fā)明的抗hDlk-l抗體和/或抗體-藥劑復合體作為有效成分，而且優(yōu)選以包括藥學上允許的載體的藥物組合物的形態(tài)提供。作為本發(fā)明的藥物組合物的適用對象疾病(腫瘤)，可以例舉確認了表達hDlk-l的前述公知的人肺瘤和本發(fā)明人新確認的表達hDlk-l的人大腸癌和人乳腺癌。其中，尤其優(yōu)選例舉大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)細胞瘤中的l種或2種以上。這些疾病可以是單獨的，也可以是2種以上并發(fā)。所謂"藥學上允許的載體"，可以例舉賦形劑、稀釋劑、增量劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖劑、乳化劑、芳香劑、著色劑、甜味劑、粘稠劑、矯味劑、增溶劑或其它添加劑等。通過使用l種以上這種載體，可以制備注射劑、液劑、膠嚢劑、懸浮劑、乳劑或糖漿劑等形態(tài)的藥物組合物。這些藥物組合物可以經(jīng)口或非經(jīng)口給藥。作為用于非經(jīng)口纟合藥的其它形態(tài)，包括含有1種以上的活性物質(zhì)的通過常規(guī)方法制備的注射劑等。注射劑的情況中，可以通過溶解或懸浮于生理鹽水或市售的注射用蒸餾水等藥學上允許的載體中來制造。尤其是，對生物體內(nèi)給予本發(fā)明的抗hDlk-l抗體來源的抗體片段(其中尤其是低分子的物質(zhì))時，在其基礎(chǔ)上還可以使用膠體分散系。膠體分散系可期待具有提高化合物(抗體片段)在生物體內(nèi)穩(wěn)定性的效果和將化合物高效輸送到特定的內(nèi)臟器官、組織或細胞的效果。膠體分散系只要為通常使用的即可，沒有限制，可以例舉聚乙二醇、高分子復合體、高分子凝集體、納米膠嚢、微球體、珠子和水包油系的乳化劑、膠束、混合膠束和以包含脂質(zhì)體在內(nèi)的脂質(zhì)為基礎(chǔ)的分散系，優(yōu)選為具有將化合物高效輸送到特定臟器、組織或細胞的效果的多個脂質(zhì)體、人工膜的小嚢泡(Manninoetal.，Biotechniques,1988,6，682;BlumeandCevc，Biochem.etBiophys.Acta,1990,1029,91;Lappalainenetal.，AntiviralRes.,1994,23,119;ChonnandCullis，CurrentOp.Biotech.,1995,6，698)。本發(fā)明的藥物組合物的給藥量根據(jù)患者的年齡、性別、體重和癥狀、治療效果、給藥方法、處理時間或藥物組合物所含的本發(fā)明的抗hD1k-1抗體和抗體-藥劑復合體的種類等而不同。通常，成人每人每次可以在600jig到6000mg的范圍內(nèi)給予，但并不限于此范圍。例如通過注射劑給予時，對人患者l次的給藥中，每lkg體重可以平均l天以l次~數(shù)次給予100pg100mg的量。作為給予的形態(tài)，可以例舉I爭J^內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、月幾肉內(nèi)注射或腹腔內(nèi)注射等，優(yōu)選為靜脈內(nèi)注射。而且，注射劑根據(jù)情況還可以調(diào)制成非水性的稀釋劑(例如聚乙二醇、橄欖油等植物油、乙醇等醇類等)、懸浮劑或乳濁劑。這種注射劑的無菌化可以通過過濾器進行過濾殺菌、配合殺菌劑等來進行。注射劑可以制備成使用時調(diào)制的形態(tài)。即，可以通過冷凍干燥法等制成無菌的固體組合物，在使用前溶解于無菌的注射用蒸餾水或其它溶劑中再^f吏用。另外，本發(fā)明還提供用于制造治療和/或診斷肺瘤的藥物(藥劑)的前述本發(fā)明的抗hDlk-l抗體和/或抗體-藥劑復合體的應(yīng)用。而且，本發(fā)明還提供治療和/或診斷肺瘤用的前述本發(fā)明的抗hDlk-l抗體和/或抗體-藥劑復合體。此外，本發(fā)明還提供腫瘤的治療和/或診斷方法，其特征在于其使用前述本發(fā)明的抗hDlk-l抗體和/或抗體-藥劑復合體(即給予患者)，而且還提供前述本發(fā)明的抗hDlk-l抗體和/或抗體-藥劑復合體在用于治療和/或診斷肺瘤中的應(yīng)用。5.腫瘤的^r測方法本發(fā)明的腫瘤檢測方法的特征在于，使前述本發(fā)明的抗hDlk-l抗體與從生物體采集的試樣(以下稱生物體試樣)反應(yīng)，檢測反應(yīng)的抗體的信號的方法。如前所述，由于確認了hDlk-l在各種肺瘤細胞中特異性表達，hDlk-l,尤其是游離hDlk-l(hDlk-l的細胞外區(qū)域部分)可以作為各種肺瘤靶標來使用。其中，優(yōu)選作為人大腸癌、人乳腺癌和人肝癌的靶標來使用。因此，可以通過使本發(fā)明的抗hDlk-l抗體與生物體試樣反應(yīng)，檢測反應(yīng)的抗體的信號來檢測肺瘤。獲得的抗體的信號成為生物體試樣中的抗原量(即hDlk-l量或游離hDlk-l量)的指標。使用本發(fā)明的抗體的腫瘤的檢測，首先，使作為試樣的從被驗者中提取的生物體試樣，例如作為檢查對象的組織片或血液等與本發(fā)明的抗體通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合。然后，通過基于結(jié)合的抗體量的測定結(jié)果，通過測定生物體試樣中的目的抗原量而進行。該測定可以按照公知的免疫學測定法進行，例如，可以使用免疫沉淀法、免疫凝集法、標記免疫測定法、免疫比濁法、westernblot法、流式細胞術(shù)法等。標記免疫測定法中，抗體的信號除了以用標記抗體直接檢測的標記量表示之外，還可以以已知濃度或已知抗體效價的抗體作為標準液相對地表示。即，可以通過測定計測定標準液和試才羊，以標準液的值作為基準，相對地表示生物體試樣中的抗體信號。作為標記免疫測定法，例如可以例舉ELISA法、EI法、RIA法、螢光免疫測定法(FIA)、化學發(fā)光免疫測定法(Luminescenceimmunoassay)等。其中尤其是，ELISA法由于簡便和高靈敏度而優(yōu)選。本發(fā)明中，可以將通過上述檢測方法獲得的檢測結(jié)果作為指標來評價或診斷腫瘤的狀態(tài)。例如，檢測結(jié)果超過預(yù)定的基準值時判斷為肺瘤陽性，在預(yù)定的基準值以下時判斷為肺瘤陰性，為陽性時，判斷為有發(fā)生任意一種肺瘤的可能性，可以評價胂瘤的狀態(tài)。這里，所謂腫瘤的狀態(tài)是指是否患有肺瘤或其進行程度，可以例舉腫瘤發(fā)癥的有無、進行度、惡性程度、轉(zhuǎn)移的有無和復發(fā)的有無等。在上述評〗介時，作為肺瘤的狀態(tài)，可以選4奪1個，也可以組合選擇多個。腫瘤的有無的評價，可以基于所獲得的檢測結(jié)果，通過以預(yù)定的基準值作為界限，判斷是否患有胂瘤來進行。腫瘤的惡性程度是表示癌進行到何種程度的指標，也可以基于檢測結(jié)果，對病期(Stage)分類再進行評價，或分類為早期癌或晚期癌再進行評價。例如，還可以將檢測結(jié)果作為指標，評價為早期癌或晚期癌。腫瘤的轉(zhuǎn)移，可以通過以檢測結(jié)果作為指標，根據(jù)在從原發(fā)瘤的位置離開的部位是否出現(xiàn)新生物來評價。復發(fā)，可以根據(jù)在間歇期或緩解后檢測結(jié)果是否再次超過預(yù)定的基準值來評價。6.腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒本發(fā)明的抗hDlk-l抗體可以以腫瘤的一企測用或診斷用試劑盒的形態(tài)提供。本發(fā)明的試劑盒含有抗體，此外還可以含有標記物質(zhì)、或抗體或固定該標記物的固定化試劑等。所謂抗體的標記物質(zhì)是指用酶、放射性同位素、螢光化合物和化學發(fā)光化合物等標記的物質(zhì)。本發(fā)明的試劑盒除了上述構(gòu)成要素之外，還可以含有用于實施本發(fā)明的檢測的其它試劑，例如標記物為酶標記物時，可以含有酶底物(顯色性底物等)、酶底物溶解液、酶反應(yīng)停止液、或試樣用稀釋液等。而且，還可以含有各種緩沖液、無菌水、各種細胞培養(yǎng)容器、各種反應(yīng)容器(Eppendorf管等)、封閉劑(牛血清白蛋白(BSA)、脫脂乳、山羊血清等血清成分)、清洗劑、表面活性劑、各種板、疊氮化鈉等防腐劑和實驗操作手冊(說明書)等。本發(fā)明的試劑盒可有效用于進行上述本發(fā)明的檢測方法，其有用性極高。以下，通過例舉實施例對本發(fā)明進行更具體的說明，但本發(fā)明并不限于此?！矊嵤├?〕<材-牛和方法>1.細月包才朱HEK-293-hDlk細胞、7E2-C-hDlk細胞和Huh-7-hDlk細胞使用按WO2005/052156中所述而制作的細胞林。另夕卜，人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-F1細月包/人美國標準生物品收藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC;目錄號No.CRL2142)獲得。SW480-hDlk細胞是通過在人大腸癌來源的纟田胞抹SW480(獲得來源東京大學分子細胞生物學研究所功能形成)中導入含有全長hDlk-l基因的表達載體pcDNA-hdlk-Flag(參照WO2005/052156),進行抗生素G418(遺傳霉素(geneticin),GIBCOBRL)選擇后，建立穩(wěn)定表達hDlk-l的細胞林而獲得。2.抗hDlk-l多克隆抗體的制作在構(gòu)建hDlk-l的細胞外區(qū)域(FA-1)表達載體時，設(shè)計并合成以下引物。正向(F)引物5，-cgcgtccgcaaccagaagccc-3，(序歹寸號3)反向(R)引凈勿5，畫ctcgaggtgctccggctgctgcaccggc畫3，(序歹'J此時，在R引物上添加XhoI限制性酶切序列。使用這些引物，以hDlk-l的cDNA作為模板，按以下的反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件進行PCR反應(yīng)?！斗磻?yīng)液組成》號4)模板DNA:10xPCR緩沖液:l|iL2.5mMdNTP:TaqDNA聚合酶F引物(10pM):R引物(10|iM):l[iL滅菌水:_37、L合計50fiL反應(yīng)條件以"熱變性/解離95°C(60秒)—退火55°C(60秒)—合成、伸長72°C(60秒)"為1個循環(huán)，共計35個循環(huán)。將獲得的hDlk-l的細胞外區(qū)域(人FA1)的cDNA克隆于pCRII載體(Invitrogen)中(pCRII-hFAl)。用測序儀確認克隆的人FAl的cDNA。從pCRII-hFAl中切出含有人FA1cDNA的EcoRI/XhoI片段，插入到pcDNA4/Myc-His載體(Invitrogen)的EcoRI/XhoI位點(pcDNA4-hFAl)。在該表達載體中在C末端側(cè)添加Myc標簽和His標簽序列，人FAl作為與Myc標簽和His標簽的融合蛋白質(zhì)表達。以融合蛋白質(zhì)作為抗原，通過常規(guī)方法，對兔進行免疫，制作抗hDlk-l多克隆抗體。3.hDlk-l基因的EGF樣基序缺失突變體的制作為了用于抗hDlk-l單克隆抗體的表位分析，如下制作hDlk-l基因的EGF樣基序缺失突變體。首先，制作用于通過PCR法擴增該區(qū)域的引物。制作的各引物序列示于下表l。此時，在F引物上添加NotI限制性酶切序列，在R引物中添加XbaI限制性酶切序列。但是，在用于擴增EGF(4-6)和EGF(5-6)的區(qū)域的R引物上不添加Xbal限制性酶切序列。而且，表l中的構(gòu)建體欄中，例如"EGF(1-4)，，的記載是指存在于hDlk-l的FA-1區(qū)域中的6個EGF樣基序(EGF-1~EGF-6)中由EGF-1到EGF-4的連續(xù)區(qū)域。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>※每個上部分為F引物，下部分為R引物使用上述各引物的PCR,按以下的反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件進行?！斗磻?yīng)液組成》模板DNA:lfiL10xPCR緩沖液5pL2.5mMdNTP:4jiLTaqDNA聚合酶0.5|iLF引物(10pM):1jiLR引物(10|iM):lpL滅菌水:_37.5pL合計50pL反應(yīng)條件以"熱變性/解離95°C(60秒)4退火55°C(60秒)—合成、伸長72°C(60秒)"為l個循環(huán)，共計35個循環(huán)。通過PCR法擴增的各片段用TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆到pCRII載體(Invitrogen)中，確認i咸基序列。然后，獲得用NotI/XbaI切斷的片段，將該片段亞克隆到pME18S國CFHX-FXYDTM的NotI/XbaI位點。而且，pME18S-CFHX-FXYDTM是被設(shè)計成所表達的目的蛋白質(zhì)在N末端上具有人CD8a(GenBank登錄號No.NM—001768)的信號序列和His標簽序列的表達載體(獲得來源東京大學分子細胞生物學研究所功能形成)。4.抗hDlk-l單克隆抗體的制作(1)細胞免疫、蛋白質(zhì)抗原免疫以表達hDlk-l的細胞抹(HEK-293-hDlk細胞、7E2-C-hDlk細胞)和用上述方法制備的hDlk-l的FA-l區(qū)域(以下稱hFA-l)作為抗原。將lxl()7個細胞的表達hDlk-l的纟田胞4朱、20(ig的hFA-l蛋白質(zhì)分別與免疫輔助劑(弗氏完全佐劑和光純藥工業(yè))或TiterMaxGold(Funakoshi才朱式會S土)才要l:l'混合，調(diào)制乳法液，注射到6周齡的大鼠(Wister)、小鼠(C57/BL6、Balb/c)的兩腳掌(初次免疫)。從初次免疫起3天后和10天后進行加強免疫，在最終免疫的次日，取出兩膝窩的淋巴結(jié)，制備淋巴細胞。加強免疫時，細胞免疫時使用5x106個細胞的經(jīng)PBS懸浮的細胞懸浮液，蛋白質(zhì)抗原的情況下使用5(ag的PBS溶液。最終免疫的次日，取出兩膝窩的淋巴結(jié)，制備淋巴細胞。而且，在加強免疫時以經(jīng)PBS懸浮的細胞懸浮液作為抗原。制備的淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞抹(P3-X63-Ag8.653)按3:l的比例混合，用聚乙二醇法進行細胞融合。在96孔平底培養(yǎng)板中使用含有HAT(氨基蝶呤、次黃"票呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)的選擇培養(yǎng)基，用5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)10天14天，通過細胞ELISA(后述)對逐漸增殖的雜交瘤的培養(yǎng)上清進行一次篩選，使用HEK-293細胞通過FACS分析進行2次篩選。然后，通過有限稀釋法制作產(chǎn)生抗hDlk-l單克隆抗體的雜交瘤克隆。(2)DNA免疫同樣，以制作抗hDlk-l單克隆抗體為目的，通過使用DNA免疫法這樣的方法，制作識別hDlk-l的立體結(jié)構(gòu)，且抑制其生物生理活性的特異性單克隆抗體。DNA免疫法，由于導入的整合到表達載體中的hDlk-l基因在小鼠體內(nèi)表達，因此可以以維持本來的立體結(jié)構(gòu)和翻譯后的各種修飾(例如糖鏈修飾和二硫橋等)的形態(tài)遞呈抗原，因此嘗試了以往以變性蛋白質(zhì)和合成肽作為免疫源時難以制作的可識別hD1k-1原本的立體結(jié)構(gòu)，且抑制其生物生理活性的特異性單克隆抗體的制作。將hDlk-l的全長cDNA整合到添加了標簽的哺乳動物表達載體中。在免疫實施前使用哺乳細胞來驗證構(gòu)建的基因構(gòu)建體是否如設(shè)計的那樣在細胞表面表達。即，將構(gòu)建的基因構(gòu)建體瞬間性表達導入于哺乳細胞中。導入的哺乳細胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，用于FCM分析。FCM分析時，在加入了導入基因的培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)溶液中，添加與上述導入基因上所帶的標簽相應(yīng)的抗體，靜置30分鐘。然后，在溶液中添加特異性識別標簽的經(jīng)螢光標記的二抗，靜置30分鐘后用于FCM分析中。證明了本發(fā)明中構(gòu)建的基因構(gòu)建體在細胞表面上表達。為了開發(fā)識別hDlk-l的立體結(jié)構(gòu)且抑制其生物生理活性的抗hDlk-l單克隆抗體，將前述所構(gòu)建的各種基因構(gòu)建體通過各種基因?qū)敕?肌肉注射、電穿孔、基因槍)單獨或混合地導入于免疫動物中(實施約2~3個月)。在從免疫后的動物中提取的血清分析中使用上述HEK293-hDlk細胞。在加入了HEK293-hDlk細胞的培養(yǎng)溶液中加入從上述的導入基因的免疫動物中提取的血清，靜置30分鐘。然后，在溶液中添加特異性識別免疫動物的免疫球蛋白的經(jīng)螢光標記的二抗，靜置30分鐘后用于FCM分析。解剖產(chǎn)生識別HEK293-hDlk細胞的強特異抗體的動物，按照常規(guī)方法分離B細胞，并制作抗hDlk-l單克隆抗體。5.抗體純化在預(yù)先(7天前)給予了2,6，10,14-四甲基十五烷(姥鮫烷)的BALB/c棵小鼠的腹腔內(nèi)給予3x106個用上述方法制作的雜交瘤的克隆，提取2周后的腹水。從該腹水中通過辛酸沉淀、用蛋白質(zhì)G柱(HiTrapproteinG;GEhealthcarebioscience)進行親和純化，獲得各雜交瘤克隆所產(chǎn)生的抗hDlk-l單克隆抗體。以后的分析中使用這種純化的抗hDlk-l單克隆抗體來實施。6.4元體的才示i己為了對制作的抗hDlk-l單克隆抗體按照表位進行分類、或進行內(nèi)化活性的評價，對抗體進4亍標記。該抗體的生物素標記使用ECLProteinBiotinylationmodule(GEhealthcarebioscience,RPN2202)進行。羅丹明標記使用EZ-LabelTM羅丹明蛋白質(zhì)標記試劑盒(RhodamineProteinLabelingkit，PIERCE,53002),FITC標記使用EZ-LabelTM熒光素異硫氰酸酉旨(FITC)蛋白質(zhì)才示i己i式劑盒(FluoresceinIsothiocyanateProteinLabelingkit，PIERCE,53004)，按照各試劑盒附帶的才喿作指南進行。7.纟田胞ELISA在用明膠包被的96孔培養(yǎng)板(Corning)上以7.5"03個細胞/孔接種上述7E2-C(hdlk)抹，于37。C培養(yǎng)2天。用冰冷PBS清洗后，用4%多聚甲醛溶液固定，用0.2%Triton-X-100(商品名)溶液處理，制成細胞ELISA用板。之后，按照常規(guī)方法進行ELISA法。具體如下所示。首先，在室溫下用P/。BSA-PBS溶液進行2小時封閉。然后，加入雜交瘤上清，于室溫下反應(yīng)l小時后，用0.1。/。Tween20(商品名)-PBS溶液清洗3次。用0.1。/。Tween20-PBS溶液將生物素化抗大鼠IgG(VectorLaboratory)稀釋100倍，作為二抗使用。于室溫下反應(yīng)l小時后，用0.1。/。Tween20-PBS溶液清洗3次。再將用0.1%Tween20-PBS溶液稀釋1OOO倍的辣才艮過氧化物酶-鏈霉親和素(HRP;VectorLaboratory)在室溫下反應(yīng)l小時，用0.1。/oTween20-PBS溶液清洗3次。添加TMB(3,3，，5,5，-四曱基聯(lián)苯胺SIGMA)底物溶液進行顯色反應(yīng)，加入1M硫酸使反應(yīng)停止。用酵才示4義(microplatereader)Model550(Bio-Rad)測定吸光度。8.FACS分析通過胰蛋白酶處理將細胞從培養(yǎng)亞剝離，制備出細胞懸浮液(細胞密度5xl(^個細胞/mL)。使0.5pg抗人Dlk單克隆抗體和100^iL細胞懸浮液于4。C反應(yīng)30分鐘。用PBS清洗后，使之與PE標記抗小鼠IgG或PE標記抗大鼠IgG(均為BDPharmingen)(0.5^g)反應(yīng)(4°C,30分鐘)后，用FACSCalibur(BectonDickinson)分析。9.通過ELISA法計算解離常數(shù)(Kd值)制作的抗hDlk-l單克隆抗體的抗原親和性(Kd值)，通過采用ELISA的方法計算(Djavadi-OhanianceL.eta"1996),InAntibodyEngineering,Chapter4，pp77-97.IRLPress,Oxford)。具體而言，在96孔培養(yǎng)板(Corning)中添加純化的重組hFA-l蛋白質(zhì)(lpg/mL)將抗原固定化(室溫，l小時)。然后，用PBS清洗3次，加入2%脫脂乳(PBS溶液)進行封閉(室溫，l小時)。用PBS清洗2次后，在上述ELISA板中添加預(yù)先混合抗原溶液(純化hFA-l蛋白質(zhì)；50,25,12.5,6.25,3.125nM)和抗hDlk-l單克隆抗體的各克隆(0.5nM)并使之平衡化的抗原-抗體復合體，并使之反應(yīng)(室溫，l小時)。用PBS清洗3次后，使之與用封閉液稀釋的HRP標記抗小鼠IgG(最終濃度lpg/mL)或HRP標記抗大鼠IgG(最終濃度l(ig/mL)(均為GEhealthcarebioscience)反應(yīng)(室溫,l小時)。10.抗人Dlk-l單克隆抗體的表位分析將制作的約100種抗hD1k-1單克隆抗體根據(jù)所識別的表位進行分類。將前述表達載體hdlk-EGF(1-3)/pMEl8S-CFHX、hdlk-EGF(3-4VpMEl8S-CFHX、hdlk-EGF(4-6)/pMEl8S-CFHX分別對COS-7細胞進行基因?qū)搿；驅(qū)胫蟮?472小時后，通過胰蛋白酶處理將細胞從培養(yǎng)亞剝離，通過FACS分析就各抗體克隆識別hDlk-1的哪個EGF樣基序進行研究。11.免疫組化染色法人癌組織陣列(Cybrdi公司，大腸癌組織陣列Lot:CC05-01-001,乳腺癌組織陣列Lot:CC08-02-002)在脫石蠟處理后，在10mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)中，用高壓滅菌器(121°C,5分)實施抗原活化處理，用于采用抗hDlk-l多克隆抗體的染色。以DAB(3,3，-二氨基聯(lián)苯胺)作為底物進行顯色反應(yīng)后，通過蘇木精進行核染色作為對比染色。具體如下述方式進行。通過中性福爾馬林進行固定和石蠟包埋的切片經(jīng)脫石蠟處理后，在10mM檸檬酸鈉溶液中用高壓滅菌器(121°C,5分)實施抗原活化處理。然后，用在甲醇中按終濃度為0.3%加入了雙氧水的溶液，在室溫下處理20分鐘，除去內(nèi)源性的過氧化物酶活性。用PBS在室溫下進行2次各5分鐘的清洗，用BlockAce試劑(大日本制藥抹式會社)進行30分鐘封閉，對組織中的非特異性結(jié)合部位進行封閉操作。然后，與用稀釋成l/10的BlockAce試劑稀釋的抗hDlk-l多克隆抗體(終濃度0.5^ig/mL)在室溫下反應(yīng)1小時，用PBS進行3次各5分鐘的清洗，然后，于用稀釋成1/10的BlockAce試劑稀釋到100倍的生物素化抗兔IgG抗體在室溫下反應(yīng)l小時。用PBS進行3次各5分鐘的清洗后，按說明書所述，混合ABC試劑盒的試劑，制作ABC復合物，使其在室溫下反應(yīng)30分鐘。用PBS進行3次各5分鐘的清洗后，通過過氧化物酶底物(0.02%DAB(3，3，-二氨基聯(lián)苯胺)、0.03%雙氧水、50mMTris-HClpH7.5)進行顯色。確認顯色后，用水清洗10分鐘，用邁耶斯蘇木精(Meyer'shematoxylin)溶液(和光純藥工業(yè))對核進行染色，然后用醇脫水，用二甲苯透明，用EntellanNew(MerckJapan)封片。12.荷瘤小鼠的制作和抗hDlk-l單克隆抗體的藥效評價(1)預(yù)防模型通過胰蛋白酶處理來剝離表達hDlk-1的肝癌細胞抹(Huh-7-hDlk)，用PBS調(diào)制出6x107個細胞/mL的細胞懸浮液，在冰上與等量的Matrigel(BDPharmingen)混合。在6周齡的雌性棵小鼠(Balb/c、nu/nu)的右脅腹的皮下用26G的注射器注射100^iL(3><106個細胞)。在癌細胞移植當天，將小鼠分組，開始給予抗體(20mg/kg體重，腹腔內(nèi)給藥)。之后，按3天1次的間隔進行同樣的給藥。根據(jù)肺瘤形成頻率和腫瘤體積評價抗腫瘤活性。肺瘤體積的測量采用以下計算式。腫瘤體積(mm3)=(短徑)2x(長徑)x兀/6(2)治療模型通過胰蛋白酶處理來剝離表達hDlk-l的肝癌細胞才朱(Huh-7-hDlk)和表達hDlk-l的大腸癌細胞林(SW480-hDlk),用PBS調(diào)制出6xl0710xl()7個細胞/mL的細胞懸浮液，在冰上與等量的Matrigel(BDPharmingen)混合。在6周齡的雌性棵小鼠(Balb/c、nu/nu)的右脅腹的皮下用26G的注射器注射100pL(3xl06~5xl()6個細胞)。自癌細胞移植起IO~14天后，將腫瘤體積生長到50~150mm3(平均值約為100mm3)的小鼠分組，將分組的當天作為第l天(Day1),開始給予抗體?？贵w按3天1次的間隔進行腹腔內(nèi)給藥(20mg/kg體重)。通過測量胂瘤體積評價抗肝瘤活性。差異顯著性檢驗用Student，s-t檢驗(Student'st檢驗)進行，將P〈0.05以下者在統(tǒng)計學上判斷為顯著。13.抗hDlk-l單克隆抗體的內(nèi)化活性的評價hDlk-l單克隆抗體與抗原結(jié)合后，通過內(nèi)吞作用進入到細胞內(nèi)的內(nèi)化活性依賴于抗體所識別的表位。因此，進行制作的抗hDlk-l單克隆抗體的內(nèi)化活性的評價。通過FACS分析進行的評價方法通過FACS分析和用螢光顯微鏡進行的觀察來評價。通過FACS分析進行的內(nèi)化活性的評價用以下方法進行。在HEK-293畫hdlk細胞(2乂105個纟田胞)中添加抗hDlk畫l單克隆抗體(0.5[ig)并使之反應(yīng)(4°C,20分鐘)，用PBS清洗2次后，懸浮于DMEM培養(yǎng)基中，于37。C培養(yǎng)(60分鐘、90分鐘、120分鐘、240分鐘)，促進細胞表面上的抗原-抗體復合體的內(nèi)化。然后，通過離心(1000rpm,5分鐘)回收細胞后，使之與PE標記抗小鼠(或大鼠IgG)(0.5fig)反應(yīng)(4°C，20分)后，用FACSCalibur(BectonDickinson)分析。另外，用同樣的方法-使FITC標記的抗hDlk-l單克隆抗體與HEK-293-hdlk細胞反應(yīng)，用PBS清洗2次后，懸浮于DMEM培養(yǎng)基中，于37。C將育(120分鐘)后，用FACSCalibur(BectonDickinson)分析。然后，在HEK-293-hdlk細胞(2"05個細胞)中添加羅丹明標記的抗hDlk-l單克隆抗體(0.5pg)并使之反應(yīng)(4°C,20分)，用PBS清洗2次后，懸浮于DMEM培養(yǎng)基中，于37。C孵育(15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘)后，用Cytospin(Shandon)制作涂片標本(800rpm,3分鐘)，用封片溶液(mountingsolution)封片后(VectorLaboratory)，用螢光顯微鏡(Nikon;ECLIPSEE800)觀察抗原-抗體復合體的定位。14.采用抗hDlk-l單克隆抗體制作免疫結(jié)合物53制作結(jié)合抗原后內(nèi)化活性高的抗hDlk-1單克隆抗體克隆M3-1(小鼠IgGl)與植物性蛋白質(zhì)毒素皂草素的免疫結(jié)合物、和作為比較對照的克隆Ml-290(小鼠IgG2b)與植物性蛋白質(zhì)毒素皂草素的免疫結(jié)合物(AdvancedTargetingSystem公司,SanDiego)。15.使用抗hDlk-l單克隆抗體評價免疫結(jié)合物的藥效通過胰蛋白酶處理從培養(yǎng)皿剝離細胞，在加入了10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中制備lxl()S細胞/mL的細胞懸浮液。在膠原包被的96孔平底板上以1><104/孔接種，培養(yǎng)23小時，使細胞附著。然后，添加各種免疫結(jié)合物，即小鼠IgG-皂草素(IgG-SAP)、M3-l-皂草素(M3-1-SAP)和Ml-290-皂草素(Ml-290-SAP)。分另'J以O(shè).l、1、10、100、1000ng/mL添力口。i咅養(yǎng)4872小時后，用MTT法測定吸光度。體內(nèi)的抗腫瘤活性的評價通過采用上述Huh-7-hDlk細胞的荷瘤小鼠來進行評價。16.MTT法向在96孔板中培養(yǎng)的細胞中添加TetraColorOne(生化學工業(yè))，在5%C02培養(yǎng)箱中使之反應(yīng)3~4小時。用酶標儀(microplatereader)直接測定反應(yīng)后的96孔板在波長490nm(對照波長655nm)的吸光度。<結(jié)果〉1.人肝癌細胞異種移植(預(yù)防模型)中，公知的抗hDlk-l單克隆抗體(1C1、4C4、31C4)的腫瘤生長抑制活性的研究hDlk-l在各種癌細胞的細胞表面表達，而且一旦使hDlk-l基因在人肝癌細胞抹中穩(wěn)定表達，則移植到棵小鼠皮下時，肺瘤生長速度顯著受到促進(參照WO2005/052156),由此認為抗hDlk-l抗體作為癌治療用藥物是有用的。由于hDlk-l本身的基因序列/氨基酸序列是公知的，因此原理上來說以合肽或純化蛋白質(zhì)作為免疫源，通過公知的方法是能夠獲得抗hDlk-l的單克隆抗體的。然而，實際上，是否能制作顯示癌治療藥的活性，即在個體水平上(體內(nèi))顯示抗胂瘤活性的抗體，一般來說，由于抗原的種類、表達量、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等原因大多并不清楚。正如所知道的那樣，在可以說有數(shù)萬種之多的單克隆抗體中，作為肺瘤(癌)所代表的疾病的治療藥而上市的^又有20種左右，大部分抗體在個體水平上不顯示藥效。公知的抗hDlk-l單克隆抗體(克隆1C1、4C4、31C4)至少在補體存在下使人肝癌細胞死亡是〃>知的(參照WO2005/052156)。然而，在體內(nèi)的藥效并不清楚。首先，將表達hDlk-l的肝癌細胞株(Huh-7-hDlk)移植到棵小鼠皮下，在移植的同時開始給予抗體，來研究公知的3個克隆在體內(nèi)的抗肺瘤活性即腫瘤細胞在棵小鼠皮下的存活和對肺瘤生長的效果。如下表2所示，在細胞移植的同時開始給予抗體，在第14天(Dayl4)時，在對照組(給予大鼠IgG)中，IO只中的所有個體都形成了腫瘤(平均腫瘤體積382.0士74.8mm3)。另一方面，抗hDlk-l單克隆抗體給藥組的肺瘤形成率在lCl給藥組中為40%,在4C4給藥組和31C4給藥組中為30。/。，肺瘤形成率明顯降低。在第21天(Day21)時，在1C1給藥組中為70%,在4C4給藥組和31C4給藥組中為50。/。，通過給予抗體，肺瘤形成均受到抑制。形成的胂瘤的體積的平均值方面，抗體給藥組顯示出比對照組低的值，但統(tǒng)計學上看不出差異顯著性。表2給藥組N(個體數(shù))胂瘤形成率月中瘤體積(mm3)第14天大鼠'IgG10化0%(10/10)382.0±74,81C1440%(4/10)656.2±241.214C4330%(3/10)77.1±30.031C4340%(3/10〉156.5±55.8第18天大鼠'IgG10，00%(節(jié)0)979.2±152.71C1660%(6/10)646.7±280.84C4550%(5/10)371.7±118.231C4550%(5/10)474.5±163.1第21天大鼠IgG10100%(10/10)1464.4±207.6化l770%(7/10)899.25±308.44C4550%(5/10)653.5±212.831C4550%(5/10)770.1±216.1,82.人肝癌細胞異種移植(治療模型)中，公知的抗hDlk-l單克隆抗體(1C1、4C4、31C4)的腫瘤生長抑制活性的研究為了使抗hDlk-l單克隆抗體作為癌治療抗體發(fā)揮藥效，對于已建立的肺瘤組織發(fā)揮抗腫瘤活性是非常重要的。而且，在上述預(yù)防模型中，通過比較腫瘤形成率，可以一定程度上推測抗體的抗胂瘤活性，但個體間的偏差大，無法準確評價抗腫瘤活性。因此，接著，將Huh-7-hDlk細胞移植到棵小鼠皮下，在平均腫瘤體積生長到100mn^的階段開始給予抗體，通過該治療模型進行藥效評價。如圖1所示，在治療模型中，分別以20mg/kg體重的用量3天進行1次1C1(大鼠IgGl)(圖1的A)、4C4(大鼠IgG2a)(圖1的B)和31C4(大鼠IgG2a)(圖1的C)的腹腔內(nèi)給藥，研究對腫瘤生長的效果。但是，所有克隆都沒有顯示出顯著的腫瘤生長抑制活性。563.在人肝癌細胞異種移植(治療模型)中，新的抗hDlk-l單克隆抗體的體內(nèi)抗胂瘤活性研究以hDlk-l作為靶標的癌治療用抗體，在異種移植治療模型中，必須使表達hDlk-l的腫瘤組織特異性死亡，或顯示出抑制腫瘤的生長的活性。同樣用Huh-7-hDlk細胞的異種移植治療才莫型來評價本發(fā)明中新制作的抗hDlk-l單克隆抗體(約100克隆)。新制作的約100克隆中，大部分克隆與公知的3個克隆一樣，在治療模型中未顯示出藥效，但其中也獲得了顯示出顯著的腫瘤生長抑制活性的克隆，即克隆DI-2-14、2-13、BA-1-3D、DI-6和M3-1。在克隆DI-2-14(小鼠IgGl)給藥組中，給予抗體后，所有的個體中(N=8)肺瘤生長都受到抑制，在給藥開始后第14天(Day14)時，對照組(N=8)的腫瘤體積為907.7士142.8mm3,相對于此，克隆DI-2-14給藥組中為175.5士46.5mm3(P<0.01,通過Student，st檢驗)(圖2A)。以開始給予抗體時的腫瘤體積為1.0時，對照組第14天(Day14)的腫瘤體積為9.24，與之相對克隆DI-2-14給藥組第14天(Day14)的腫瘤體積為1.85。對照組摘出的腫瘤重量為0.58士0.07(g),與此相對克隆DI-2-14給藥組摘出的月中瘤重量為0.15士0.04(g)(P<0.01,通過Student，st檢驗)(圖2B)。如圖2C中所示，通過給予克隆DI-2-14所產(chǎn)生的抗胂瘤活性在獨立的其它試驗中也能再現(xiàn)，同樣，在腫瘤體積的平均值達到100mm3(對照組103.8±1lmm3(N=7),DI國2-14給藥組101.4土9.5mm3(N=8))的階段，開始給予抗體。在給藥開始后第14天(Day14),對照組的肺瘤體積為733.37士244.86mm3,與之相對在克隆DI-2-14給藥組中為148.83士32.65mm3(P<0.01,通過Student'st檢驗)。在克隆2-13(大鼠IgG2b)給藥組(N=10)中，雖然不完全，但在統(tǒng)計學上腫瘤生長速度顯著受到抑制，在給藥開始后第14天(Day14)時，對照組(N=10)的腫瘤體積為1580.2士179.4mm3,與之相對，克隆2-13給藥組為832.9±131.8mm3(P<0.01,通過Student'st才全驗)，顯示出約50%的抑制(圖3A)。同樣，對照組(N=8)的腫瘤體積為907.7土142.8mm3,與此相對，克隆BA-1-3D(小鼠lgG2a)給藥組(N=8)和克隆DI-6(小鼠IgGl)給藥組(N=8)分別為380.8士54.4mm3(圖3B)和321.0士59.6mm3(圖3C)，胂瘤生長均受到顯著的抑制(P<0.01,通過Student'st檢驗)。而且，在克隆M3-1(小鼠IgGl)給藥組(N=8)中，腫瘤生長速度受到顯著抑制，在給藥開始后第14天(Day14)時，對照組(N=7)的腫瘤體積為1123.8±249.1mm3,與此相對，克隆M3-l給藥組為457.0土123.75mm3(P<0.05,通過Student，st檢驗)(參照圖3D、表3)。另外，上述克隆中，產(chǎn)生克隆M3-1的雜交瘤被稱為"小鼠國小鼠雜交瘤(Mouse-Mousehybridoma):M3-l，,，于2006年10月18日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)(保藏號FE腹BP-10707)。同樣，產(chǎn)生克隆DI-2-14的雜交瘤被稱為"小鼠-小鼠雜交瘤(Mouse-Mousehybridoma):M3畫l",于2007年8月21曰保藏于同一中心(保藏號FERMBP-10899)。產(chǎn)生克隆DI-6的雜交瘤被稱為"小鼠-小鼠雜交瘤(Mouse-Mousehybridoma):M3-l，，，于2007年8月21日保藏于同一中心(保藏號FERMBP-10900)。表3組N(個體數(shù).)肝瘤體積(mm3)生長率(倍)胂瘤重量(g)小鼠lgG8907.7±142.89.420.58±0.07(對照)D卜2-148*175.5±46.51.85*0.15±0.04DI-68*321.0±59.63.41**0.37±006BA+3D8*380.8±54.44.06*0.34±0.06小鼠:igG71123.8±249.19.61n.e..(對照)M3-18"457.0土123.754.1n.e..大鼠lgG101580.2±179.414.5n.e..(對照)2—1310*832.9±131.87.5n.e..4.人大腸癌細胞異種移植(治療模型)中，抗腫瘤活性的研咒與使用上述人肝癌細胞異種移植治療模型時一樣，研究克隆2-13在人大腸癌細胞4朱(SW480-hDlk)的異種移植治療模型中的抗肺瘤活性(圖4)。在克隆2-13給藥組中，與對照組(大鼠IgG給藥組)比較，腫瘤生長受到顯著抑制，在第16天(Day16)時，大鼠IgG給藥組(N=7)的月中瘤體積為877.27±176.82mm3(以纟合藥開始日作為1.0時，為5.01),與此相對，克隆2-13給藥組(N=8)為452.71土54.97mm3(以給藥開始日作為1.0時，為2.87)(P<0.05,通過Student，st檢驗)(圖4)。根據(jù)以上結(jié)果可知，抗hDlk-l單克隆抗體不僅對于肝癌細胞，對于大腸癌細胞也顯示出了在體內(nèi)顯著的胖瘤生長抑制活性。5.抗hDlk-l單克隆抗體(克隆DI-2-14、2-13、BA-1-3D、DI-6和M3-1)的抗原結(jié)合活性(使用HEK-293-hDlk細胞進行FACS分析和利用ELISA進行解離常數(shù)的計算)對于在人癌細胞異種移植模型中顯示出顯著抗腫瘤活性的抗hDlk-l單克隆抗體，使用HEK-293-hDlk細胞(圖5)和Huh-7-hDlk細胞(圖6)對上述抗體與抗原h(huán)Dlk-l的親和性進行FACS分析，結(jié)果顯示任一克隆均識別所有的細胞抹，識別hDlk-l的立體結(jié)構(gòu)。盡管沒有顯示出數(shù)據(jù)，但任一克隆均不識另'J不表達hDlk畫1的HEK293細月包和Huh-7細月包。然后，通過上述ELISA法計算這些克隆與抗原的親和性(解離常數(shù))。其結(jié)果是，各個克隆的Kd值分別為克隆DI-2-14為9.26x10-9(M),克隆M3-l為6.28xl(T9(M)，克隆BA-1-3D為32.2xl(T9(M),克隆DI-6為lO.lxl(T9(M)。就克隆2-13而言，與純化的重組hFA-l的親和性不高，無法通過上述方法計算出Kd值。6.抗hDlk-l單克隆抗體的表位分析接著，進行抗hDlk-l單克隆抗體的表位分析。將hDlk(EGF1-2)畫pME-CHFX、hDlk(EGF1-3)-pME-CHFX、hDlk(EGF3-4)-pME畫CHFX、hDlk(EGF4-6)-pME18-CHFX和hDlk(EGF5-6)-pMElS-CHFX的各個表達載體(圖7)導入于COS-7細胞，通過FACS分析和細胞離心涂片(Cytospin)標本的免疫染色，對各抗hDlk-l單克隆抗體識別包含存在于hDlk-l的FA-l區(qū)域(細胞外區(qū)域)的6個EGF樣基序的區(qū)域中的哪個部位進行研究。通過FACS分析和免疫染色，克隆DI-2-14識別EGF(1-3)和EGF(3-4),完全不識別EGF(1-2)、EGF(4-6)和EGF(5陽6)(圖8)。這表示克隆DI-2-14識別的表位是包括hDlk-l的第3位的EGF樣基序(EGF-3)到第4位的EGF樣基序(EGF-4)的區(qū)域(hDlk-l的第92位~第167位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域)，大概是EGF-3(hDlk-l的第92位~第120位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域)。據(jù)報道，小鼠中，IgG的同種型中，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)方面，IgG2a和IgG2b強，IgGl的活性低(參照Kipps，TJ.etal.,1985)。由于克隆DI-2-14的同種型是小鼠IgGl,這表明克隆DI-2-14的極強的腫瘤生長抑制活性與其說是ADCC活性等由效應(yīng)細胞介導的癌細胞殺傷效應(yīng)，不如說是通過抑制hDlk-1的功能來發(fā)揮抗腫瘤活性，這表示hDlk-1的包括EGF-3和EGF-4的區(qū)域，尤其是EGF-3在hDlk-l的功能中是特別重要的結(jié)構(gòu)域。而且，克隆2-13、DI-6和BA-1-3D識別EGF(1-2)和EGF(1-3),完全不識別EGF(3-4)和EGF(4-6)(圖9)。這表明這3個克隆識別的表位是hDlk-l的包括從第1位的EGF樣基序(EGF-1)到第2位的EGF樣基序(EGF-2)的區(qū)域(hDlk-l的第26位~第85位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域)，這表明hDlk-l的包括EGF-1和EGF-2的區(qū)域在hDlk-1的功能中是特別重要的結(jié)構(gòu)域。此外，克隆M3-1識別EGF(1-4)和EGF(4-6),但不識別EGF(l國2)、EGF(1-3)和EGF(3隱4)(圖10)。這表明克隆M3-1識別的表位是hDlk-l的包括從第4位的EGF樣基序(EGF-4)到第6位的EGF樣基序(EGF-6)的區(qū)域(hDlk-l的第131位~第244位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域)，這表明hDlk-l的包括EGF-4、EGF-5和EGF-6的區(qū)域在hDlk-l的功能中是特別重要的結(jié)構(gòu)域。7.抗hDlk-l單克隆抗體的內(nèi)化活性制作的抗hD1k-1單克隆抗體的各克隆按照識別的表位進行分類，對屬于分成的各組的克隆，研究其識別抗原后的內(nèi)化活性。就識別EGF(1-2)的克隆Ml-290,識別EGF(4-6)的M3-1和識別EGF(5-6)的克隆M3-4來說，各抗體與HEK293-hDlk細胞反應(yīng)后，于37。C孵育，然后使之與PE標記抗小鼠抗體反應(yīng)。如圖IIA所示，以不進行孵育時的勞光強度作為100%的情況下，克隆M3-1的熒光強度以與其它克隆相比顯著快的速度減少，且該減少依賴于孵育時間。該結(jié)果表明，這是因為抗原-抗體反應(yīng)后，由于時間依賴性的進入到細胞內(nèi)，細胞表面上的抗原-抗體復合體減少。而且，各孵育時間后的螢光強度如下。60分鐘；M3國l:38.7%,Ml醫(yī)290:52.1%,M3-4:74.1%90分鐘；M3-l:36.9%,Ml-290:47.1%,M3-4:71.15%120分鐘；M3-l:28.1%，Ml-290:36.3%,M3-4:57.3%240分4中；M3-l:12.2%,Ml-290:31.2%，M3-4:41.4%確認了孵育時平均螢光強度減少的主要原因并非是孵育期間與抗原結(jié)合的抗hDlk-l單克隆抗體從該抗原剝離。直接用FITC標記克隆M3-1，同樣使之與HEK293-hDlk細胞反應(yīng)，用PBS清洗后，于37。C孵育120分鐘，然后，進行FACS分析，將孵育120分鐘后的螢光強度與剛反應(yīng)后的熒光強度進行比較。其結(jié)果是，兩者間沒有顯著差異(不孵育100%,孵育120分鐘后110.9%)(圖11B)。然后，使羅丹明標記的抗體與HEK293-hDlk細胞反應(yīng)，PBS清洗后，同樣于37。C孵育。然后，用細胞離心涂片器制作涂片標本，用螢光顯微鏡觀察螢光標記抗體的定位。其結(jié)果如圖12所示，在不孵育的情況下觀察到了其在細胞膜的定位。然而，通過于37。C孵育，識別EGF(4-6)的克隆M3-1和DI-1，通過僅僅15分鐘的孵育，就因內(nèi)吞作用吸收到細胞內(nèi)，進入到嚢泡中，觀察到點狀的細胞內(nèi)定位。另一方面，克隆Ml-290和M3-4盡管觀察到點狀的定位，但大部分定位于細胞膜上(圖12)。根據(jù)以上結(jié)果，克隆M3-1等識別EGF(4-6)的抗體，與識62別其它結(jié)構(gòu)域的抗體相比，識別抗原后的內(nèi)化活性顯著較高。因此，由于通過卩吏克隆M3-l等抗hDlk-l抗體與抗癌劑或細胞毒素結(jié)合而復合體化的免疫結(jié)合物快速進入到靶標細胞內(nèi)，因此被認為抗癌劑或細胞毒素的藥理效果高，且副作用少。8.抗hDlk-l單克隆抗體免疫結(jié)合物的殺傷效應(yīng)分別制作使皂草素結(jié)合于內(nèi)化活性高的克隆M3-1和作為比較對照的克隆Ml-290上而成的免疫結(jié)合物(M3-1-SAP,Ml-290-SAP),對使用抗hDlk-l單克隆抗體的免疫結(jié)合物的導彈療法(missiletherapy)的有用性進行藥效評價。M3-1-SAP和M1-290-SAP在不表達hDlk-1的HEK293細胞中均沒有顯示出毒性。然后，添加于表達hDlk-1的Huh7-hDlk纟田胞和SK-N-F1細胞(內(nèi)在地表達hDlk-l的神經(jīng)母細胞瘤)中并進行培養(yǎng)，結(jié)果對照(小鼠IgG-SAP)在任一細胞中都幾乎不顯示殺傷效應(yīng)。但是，在培養(yǎng)液中添加M3-1-SAP并進行培養(yǎng)的情況下，細胞被殺傷且殺傷依賴于濃度，如果濃度為lpg/mL,則Huh-7-hDlk細胞存活率為23.3±1.35%(N=3),SK國N誦F1細胞存活率為9.38±2.1%(N=3),顯示出強殺傷效應(yīng)(圖13)。比較M3-l-SAP和Ml-290-SAP對于SK-N-Fl細胞(內(nèi)在地表達hDlk-l的神經(jīng)母細胞瘤)的殺傷效應(yīng)，結(jié)果如圖13B所示，兩者的活性幾乎相同(圖13B)。9.抗hDlk-l單克隆抗體免疫結(jié)合物的體內(nèi)腫瘤生長抑制活性通過Huh-7-hDlk細胞的異種移植模型，對M3-1-SAP作為免疫結(jié)合物的有用性、即給予小鼠個體時的抗腫瘤活性和副作用進行評價。使用Ml-290-SAP作為比較對照?？鼓[瘤活性的評價與前述一樣按肺瘤體積進行，副作用的研究通過給藥后的體重變化和致死率進行。小鼠IgG給藥組(N=8)在整個試驗期間(14天)沒有發(fā)現(xiàn)體重的增減，但M3-1-SAP(5mg/kg體重，腹腔內(nèi)給藥)給藥組(N=8)和Ml-290-SAP(5mg/kg體重，腹腔內(nèi)給藥)給藥組(N=8)在免疫結(jié)合物給藥開始后第4天(Day4),觀察到體重減少("M3國1國SAP"為第l天21.2±1.36(g),Day4:18.5±1.44(g);"Ml-290-SAP"為第l天21.13±0.81(g),第4天17.9±0.85(g))。尤其是，內(nèi)化活性不高的Ml-290-SAP的毒性強，8個個體中，在第4天(Day4)有2個個體死亡，在第5天(Day5)剩余的6個個體死亡，因此結(jié)果為自給藥開始起5天內(nèi)所有個體死亡(圖14B)。另一方面，發(fā)現(xiàn)M3-1-SAP給藥組所有個體生存，體重也在第8天(Day8)以后恢復。如圖15所示，M3-1-SAP給藥組的腫瘤生長受到強烈抑制，在第14天(Day14)，對照組腫瘤體積(給藥為第1天和第4天的2次)為1123.8士245.65mm3，于此相對，M3-1畫SAP給藥組腫瘤體積(給藥為第l天和第4天的2次)為415.8士105.1mm3(P<0.05，Student'st檢驗)。進而，為了確認M3-1-SAP的抗腫瘤活性，在腫瘤部位局部給予M3-1國SAP(lmg/mLM3-1畫SAP，40(iL/月中瘤)。M3-1-SAP和對照IgG的給藥在達到預(yù)定的平均腫瘤體積(對照組144.98士6.1mm3(N=5),M3畫1-SAP組145.87±21.26mm3(N=5))之時和給藥開始后第4天(Day4)共進行2次，觀察腫瘤體積的生長。其結(jié)果如圖17的A所示，M3-1-SAP給藥組至第7天(Day7)大體上完全抑制了肺瘤的生長(對照組584.02±137.07mm3，M3國l-SAPii:148.67士38.0mm3,P<0.01,通過Student'st沖全馬全)，64在第14天(Day14)時，對照組為2038.66±333.17mm3,與此相對，M3-1-SAP給藥組為575.75±216.61mm3(P<0.05,通過Student'st檢驗)，顯示出極強的抗腫瘤活性。如圖16的B所示，在肺瘤內(nèi)給予M3-1-SAP時，在第4天(Day4)的第2次給藥以后，發(fā)現(xiàn)體重稍有減少，但所有個體生存，第9天(Day9)以后體重逐漸恢復，在第10天(Day10)完全恢復到給藥前的狀態(tài)。另一方面，如圖16的C所示，在給予現(xiàn)有的抗癌劑順鉑(Cisplatin)(抗惡性腫瘤劑RandaInj,;日本化藥林式會社)時，以5mg/kg的給藥量，腫瘤生長幾乎完全被抑制(在第16天對照纟且(PBS纟且)1085.36士286.30mm3,刊頁^白纟且77.28±15.20mm3，P<0.01，通過Student，st檢驗)，而如圖16D所示，觀察到順鉑給藥組體重隨時間顯著減少，在第16天(Day16)時，對照組的體重為20.58士0.53g，相對于此，順賴給藥組體重為13.24士1.83g(P<0.01,通過Student，st檢驗)，觀察到極強的副作用(體重減少)。以上結(jié)果顯示，內(nèi)化活性高的克隆M3-1(識別EGF(4-6)的抗體)作為免疫結(jié)合物使用時，與其它克隆相比，副作用少且抗肺瘤活性高。10.人大腸癌組織、乳腺癌組織中的hDlk-l的表達hDlk-l以往據(jù)凈艮道在實體癌中，神經(jīng)內(nèi)分泌肺瘤、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、l型神經(jīng)纖維瘤病、小細胞肺癌、肝癌、腎癌和卵巢癌中表達，在血癌中，據(jù)報道在骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病中表達。為了研究hDlk-l在上述以外的癌癥種類中的表達，用抗hDlk-l抗體對市售的人癌組織陣列進行免疫染色來進行研究。大腸癌中hDlk-l的陽性率，使用大腸癌組織陣列(Cybrdi公司，lotNo.CC05-01-001)。圖17中示出了代表性的染色照片，研究了70個試樣的大腸癌組織，結(jié)果在43個腺癌(Adenocarcinoma)試樣中12個試樣(27.9%)呈現(xiàn)強陽性，19個試樣(44.2%)呈現(xiàn)弱陽性，在所有43個腺癌試樣中31個試樣(72.1%)為hDlk-l陽性(參照表4)。另夕卜，相同組織陣列中的11個乳頭狀腺癌(PapilllaryAdenocaricinoma)試樣中，6個試樣(54.5%)顯示hDlk-l強陽性(參照表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>乳腺癌中的hDlk-1的陽性率使用乳腺癌組織陣列(Cybrdi公司，lotNo.CC08-02-002)。本組織陣列由采自53個試樣中的總計63個切片構(gòu)成，其中17個試樣(17個切片)為浸潤性導管癌(Infiltratingductcarcinoma)、2個試樣(2個切片)為導管內(nèi)癌(Intraductalcarcinoma)、34個試樣(44個切片)由正常組織或膠原纖維等非癌組織構(gòu)成。盡管也存在hDlk-l在正常的乳腺組織中也呈現(xiàn)弱陽性的試樣(圖18),但染色性非常弱，另一方面，在17個浸潤性導管癌試樣中，5個試樣(29%)呈現(xiàn)強陽性。(參照圖18,表5)。表5_<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>階段III0_J_0_合計845導管內(nèi)癌(2個試樣)hDlk-l強陽性(1)、hDlk-l陰性(1)^正常乳腺膠原纖維等(34):hDlk-l陰性(24)、hDlk-l弱陽性(10)可知除了以往^^知的表達hDlk-l的癌癥種類之外，大腸癌和乳腺癌中，兩者都有約30o/。強烈表達hDlk-l。如上述實施例中所示，抗hDlk-l單克隆抗體不僅在肝癌細胞的異種移植中，在大腸癌細胞的異種移植模型中也呈現(xiàn)抗腫瘤活性，因此不僅對于肝癌，對于大腸癌也為有效的治療藥。同樣，也是以乳腺癌和其它表達hDlk-l的癌細胞作為靶標的有效的治療藥?！矊嵤├?〕1.小鼠抗人Dlk-l抗體(克隆DI-2-14)在表達人Dlk-l的肝癌細胞林(Huh-7-Dlk細胞)異種移植治療模型中的、用量依賴性的抗腫瘤活性<目的〉如實施例1所述，作為抗人Dlk-l單克隆抗體的克隆DI-2-14(小鼠IgGl)在人肝癌細胞林(Huh-7-hDlk細胞)的異種移植治療模型中，以20mg/kg體重的給藥量，顯示出極高的抗腫瘤活性。因此，為了進一步^^證克隆DI-2-14的抗腫瘤活性，進行用量依賴性的抗肺瘤活性的評價。<方法>除了改變抗體的給藥量之外，與實施例1同樣進行抗腫瘤活性的評價。<結(jié)果〉如圖19所示，胂瘤的生長受到給予克隆DI-2-14的抑制，且所述抑制為用量依賴性的；在給予抗體后的第8天(Day8)，對照組(N=9)的腫瘤體積為782.1士124.4mm3，相對于此，DI國2畫14(1mg/kg)纟會藥纟且(N二9)為522.76士107.9mm3，DI國2畫1467(2mg/kg)纟會藥組(N=9)為309.2士58.9mm3，DI-2-14(5mg/kg)給藥組(N=9)為285.8±38.2mm3。2.小鼠抗人Dlk-l抗體(克隆DI-2-14)在人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-F1細胞異種移植治療模型中的抗腫瘤活性<目的〉如實施例1中所述，5種抗人Dlk-1單克隆抗體在人肝癌細胞林(Huh-7-hDlk細胞)異種移植治療才莫型中，顯示出抗腫瘤活性，對其中顯示出特別強的抗肺瘤活性的克隆DI-2-14(小鼠IgGl)在人神經(jīng)母細胞瘤(SK-N-F1細胞)的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性進行評價。Huh-7-hDlk細胞為在Huh-7細胞中穩(wěn)定表達外源性的人Dlk-1基因的細胞抹，與之相對，SK-N-F1細胞是內(nèi)源性的在細胞表面表達Dlk-1的細胞抹。因此，在SK-N-F1細胞抹的異種移植治療模型中，給予克隆DI-2-14而產(chǎn)生抗腫瘤活性則表示抗人Dlk-1單克隆抗體對人神經(jīng)母細胞瘤出現(xiàn)藥效，同時，也可以說抗人Dlk-1單克隆抗體(尤其是克隆DI-2-14)對于在細胞表面表達Dlk-1的各種癌細胞有效(顯示出藥效)。<方法〉通過胰蛋白酶處理來剝離內(nèi)源性的在細胞表面上表達hDlk-1的人神經(jīng)母細胞瘤(SK-N-F1細胞，ATCC目錄號CRL2142)，用PBS制備出6x107個細胞/mL的細胞懸浮液，在冰上混合等量的Matrigel(BDPharmingen)。在6周齡的雌性重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(NOD-scid)的右脅腹的皮下用26G的注射器注射lOOjuL(3xl()6個細胞)。自癌細胞移植起10~14天后，將腫瘤體積生長到50~150mm3(平均約100mm3)的小鼠分組，以分組的當天作為第1天(Day1),開始給予抗體(克隆DI-2-14)。抗體按3天1次的間隔通過腹腔內(nèi)給藥進行給)。與實施例1一樣，通過測量腫瘤體積來評價抗腫瘤活性。而且，在實驗最后一天，通過解剖摘出肺瘤，測量肺瘤重量并進行評價。差異顯著性檢驗用Student'st片全-驗進行，將P<0.05以下判斷為統(tǒng)計學上具有顯著性。<結(jié)果〉如圖20A所示，克隆DI-2-14(小鼠IgGl)給藥組與對照組(N=7)相比，5mg/kg纟會藥組(N=8)和20mg/kg纟合藥組(N=7)腫瘤生長均顯著受到抑制，尤其是20mg/kg給藥組(N=7)，其從給藥開始后的次日到實驗結(jié)束時的第23天(Day23),與當天標準的肺瘤體積相比，統(tǒng)計學上顯著小(P<0.01,通過Student'st檢驗)。在給藥開始后第23天(Day23),對照組的腫瘤體積為527.8士48.9mm3,與之相對，克隆DI-2國14(5mg/kg體重)給藥組為333.8±6.8mm3(P<0.01,通過Student'st檢驗)，克隆DI-2-14(20mg/kg體重)給藥組為233.0士16.4mm3(P<0.01,通過Student'st一全-險)，確認了克隆DI-2-14的抗肺瘤活性為用量依賴性(DI國2-14(5mg/kg)和DI-2-14(20mg/kg),Day23，P<0.01,通過Student'st檢驗)。對照組摘出的腫瘤重量為0.07±0.04(g),與之相對，克隆DI-2-14(5mg/kg體重)給藥組摘出的肺瘤重量為0.03±0.009(g)(P<0.05,通過Student'st檢驗)，克隆DI-2-14(20mg/kg體重)給藥組摘出的月中瘤重量為0.02±0.005(g)(P<0.05,通過Student'st枱、驗)。與腫瘤體積一樣，克隆DI-2-14的5mg/kg給藥組和20mg/kg給藥組的腫瘤重量的差異存在顯著性(P<0.05,通過Student'st檢驗)，確認了抗腫瘤活性為用量依賴性的(圖20B)。693.小鼠抗人Dlk-l抗體(克隆DI-2-14)的抗體基因的可變區(qū)序列的確定和嵌合DI-2-14表達載體的構(gòu)建產(chǎn)生小鼠抗人Dlk-l單克隆抗體的雜交瘤在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、7.5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用TRIzol試劑(Invitrogen)從3><106個雜交瘤中一是取總RNA之后，用GeneRacer試劑盒(Invitrogen)按照試劑盒附帶的方法，使用寡dT引物(oligodT)合成cDNA。以上述合成后的cDNA作為模板，使用PCR法克隆出編碼克隆DI-2-14(小鼠IgGl)的H鏈和L鏈的可變區(qū)(VH、VL)的基因。此時，5，-引物使用GeneRacer試劑盒所附帶的引物。另一方面，3'-引物使用具有與小鼠恒定區(qū)互補的序列的片段作為VH擴增用3，-引物，使用具有與小鼠k恒定區(qū)互補的序列的片段作為VL擴增用3'-引物。5'-引物(F引物)5，-cgactggagcacgaggacactga-3，(序歹'J號15)3'-引物(R引物)VH:5，-gccagtggatagacagatgg-3，(序歹'J號16)VL:5,畫gatggatacagttggtgcagc國3，(序歹'J號17)使用上述各引物的PCR，按以下的反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件進行。《反應(yīng)液組成》模板cDNA:1.5|iL10xThermalAcePCR緩沖液5jiL2mMdNTP:5pLThermalAce聚合酶0.5pLF引物(10,):3pLR引物(10[iM):1.5fxL滅菌水:_33.5"合計50[xL《反應(yīng)條件》以"熱變性/解離94°C(10秒)—退火55。C(10秒)—合成、伸長72°C(60秒)"為1個循環(huán)，共計35個循環(huán)。將合成的VH和VL的cDNA亞克隆到pCR4Blunt-TOPO載體(Invitrogen)中，確定堿基序列。解讀多個VH克隆和VL克隆的堿基序列，判斷出小鼠H鏈和L鏈的可變區(qū)中典型的堿基序列。圖21和圖22中示出了DI-2-14的VH和VL的共有cDNA堿基序列以及推測出的氨基酸序列。然后，在VH和VL的編碼區(qū)域中添加來自于各自相應(yīng)的小鼠生殖細胞系列JH和Jk序列的提供剪切的信號，再在兩端添加用于插入于動物細胞表達載體的適當?shù)南拗菩悦肝稽c。將這樣制作的具有作為外顯子的功能的VH(圖23)和VL(圖24)基因插入于含有人yl鏈和k《連的恒定區(qū)的動物細胞表達載體(圖25)中，制作出小鼠-人嵌合抗體(DI-2-14IgGl/k)表達載體(pChDI-2-14)。4.ChDI-2-14抗體蛋白質(zhì)的純化將建立的產(chǎn)生ChDI-2-14抗體的穩(wěn)定NS0細胞4朱在無血清培養(yǎng)基(HybridomaSFM，Invitrogen)中馴化后，回收用無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的培養(yǎng)液，用蛋白A柱(GEhealthcare)按照常規(guī)方法進行抗體純化。圖26中示出了用SDS-PAGE展開小鼠DI-2-14抗體和純化的ChDI-2-14抗體后，用CBB染色的圖。在還原條件下，均檢測到約50kD的H鏈和約25kD的L鏈，確認了產(chǎn)生了ChDI-2-14抗體蛋白質(zhì)。5.嵌合DI-2-14抗體(ChDI-2-14)的抗原親和性通過釆用ELISA的方法研究純化的ChDI-2-14蛋白質(zhì)的抗原親和性。ELISA與實施例1同樣地使用將純化重組hFA-l蛋白質(zhì)(0.5~lpg/mL)固定化的ELISA板進行。具體而言，用清洗緩沖液清洗ELISA板3次后，用封閉液在室溫下封閉1小時(或4。C下過夜)，用清洗緩沖液清洗2次后，添加用ELISA緩沖液制成稀釋系列的小鼠DI-2-14抗體和ChDI-2-14抗體使之反應(yīng)(4。C下過夜)。用清洗緩沖液清洗3次后，使之與用封閉液稀釋的HRP標記抗小鼠IgG(最終濃度lng/mL)或HRP標記抗人IgG(最終濃度lfig/mL)(均為GEhealthcarebioscience)反應(yīng)。其結(jié)果是，小鼠DI-2-14和ChDI-2-14的反應(yīng)曲線幾乎重疊，EC50均為10ng/mL以下(圖27)。而且，使用HEK293-hDlk細胞，通過流式細胞術(shù)分析對于在活細胞的細胞表面表達的Dlk-1蛋白質(zhì)的結(jié)合活性，其結(jié)果與ELISA的結(jié)果一樣，ChDI-2-14顯示出與小鼠DI-2-14同等的抗原結(jié)合能力(圖28)。根據(jù)以上結(jié)果，嵌合DI-2-14抗體(ChDI-2-14)維持與小鼠DI-2-14抗體幾乎同等的抗原親和性，因此制作的嵌合DI-2-14抗體保持了小鼠DI-2-14抗體所具有的體內(nèi)的強抗腫瘤活性，這表明其是對在細胞表面上表達Dlk-1的癌有效的治療用抗體、診斷用或者檢測用抗體。6.人肝癌、乳腺癌和白血病細胞4朱中，細胞表面Dlk-1的表達(FACS)為了更詳細地研究Dlk-1在人癌細胞中的表達，使用抗人Dlk-1抗體，通過流式細胞術(shù)分析肝癌細胞4朱(7個細胞抹)、乳腺癌細胞抹(10個細胞林)和急性髓系白血病(AML)細胞抹(7個細胞抹)。使用的細胞抹如下述列舉，使用從匕二一7yf^工y只振興事業(yè)団、ATCC(AmericanTypeCultureCollection,美國標準生物品收藏中心)、ECACC(EuropeanCollectionofCellCultures,歐洲生物制品收藏中心)、DSMZ(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures,德、國孩i生4勿和細月包i咅養(yǎng)物保藏中心)獲得的細胞抹。HL-60(ATCC)、NB國4(DSMZ)、MV國4-11(ATCC)、KG-1(ATCC)、KG-la(ATCC)、TF腳1(ATCC)、CMK-11-5(匕工一7y廿一工y7振興事業(yè)団)、HepG2(匕二一7乂步一工y7振興事業(yè)団)、C3A/HepG2(ATCC)、Huh-7(t:二一^y寸^工y7振興事業(yè)団)、OCUG-l(匕二一7乂甘,工y7振興事業(yè)団)、HLE(匕工一7乂f,工乂7振興事業(yè)団)、HLF(匕工一^y廿一工y只振興事業(yè)団)、SK-HEP-1(ATCC)、HCC1143(ATCC)、JIMT-1(DSMZ)、ZR國75畫1(ATCC)、MDA-MB-415(ATCC)、BT549(ATCC)、BT-474(ATCC)、MDA-MB-231(ATCC)、DU4475(ATCC)、T47D(ATCC)、MDA國MB國468(ATCC)在肝癌細胞才朱中，使用的7種細胞^f朱都確認了細胞表面Dlk-l的表達(圖29)。在乳腺癌細胞林中，使用的10種細胞抹中，確認了在HCC1143細胞和JIMT-1細胞中強表達(圖30)，在其它8種細胞抹中雖然弱但也確認了細胞表面Dlk-l的表達(圖30)。在AML細胞抹中，7種細胞林中，在CMK-ll-5細胞、TF-1細胞、MV-4-ll細胞和NB-4細胞這4種細胞林中確認了細胞表面Dlk-l的表達(圖31)?！矊嵤├?〕DI-2-14抗體(小鼠抗人Dlk-l單克隆抗體，克隆DI-2-14)的體內(nèi)血管生成抑制效果<方法〉(1)免疫組化染色在Huh-7-hdlk細胞的荷瘤小鼠中，從小鼠IgG》會藥組(對照組2個個體)、DI-2-14給藥組的小鼠(4個個體)中分別摘出癌組織，用O.C.T混合物(Tissue-Tek)包埋后，制作新鮮冷凍切片(7fim),用2.5。/。戊二醛/PBS在室溫下固定15分鐘，用0.5%曲拉通(Triton)X-100/PBS在室溫下固定3分鐘，用PBS室溫下進行3次各5分鐘的清洗。然后，用在曱醇中按終濃度為0.3%加入雙氧水而形成的溶液，于室溫下處理5分鐘，除去內(nèi)源性的過氧化物酶活性。然后，按PBS、0.1%Tween/PBS、0.02%Tween/PBS的順序，分別在室溫下各進4亍5分鐘清洗，按照M.O.M.tmImmunodetectionKit(VECTOR)的實驗方案，用M.O.M.tm小鼠ig封閉試劑(M.O.M.tmmouseIgBlockingReagent)封閉組織中的非特異性結(jié)合部位進行封閉操作，用PBS于室溫下進行2次各2分鐘的清洗。用M.O.M.tm稀幹液于室溫下反應(yīng)5分鐘。由于形成的Huh-7-hdlk細月包來源的腫瘤內(nèi)肺瘤血管是來源于小鼠的血管內(nèi)皮細胞，因此，接著在室溫下與使用M.O.M.小鼠Ig封閉試劑稀釋的抗小鼠Flk-1/VEGF-R2抗體(終濃度2pg/ml)反應(yīng)30分鐘，用PBS于室溫下進行2次各2分鐘的清洗，然后，在室溫下使經(jīng)M.O.M.Diluent稀釋至100倍的生物素化抗大鼠IgG抗體反應(yīng)10分鐘。用PBS進行2次各2分鐘的清洗后，按照11.免疫組化染色法進行。(2)RT-PCR本實施例中所述的RT-PCR是指分別進行由提取的RNA合成cDNA,以及以該cDNA為模板進行PCR。在Huh-7-hdlk細胞的荷瘤小鼠中，從小鼠IgG給藥組(對照組7個個體)、DI-2-14給藥組的小鼠(7個個體)中分別摘出癌組織，用Trizol試劑(Invitrogen)提耳又RNA。接著，使用第1鏈cDNA合成試劑盒(lst畫StrandcDNASynthesisKit)(GEhealthcare),按照該試劑盒附帶的實驗方案，合成第l鏈cDNA。以合成的第1鏈cDNA作為模板，對于小鼠IgG給藥組(對照組7個個體)、DI-2-14給藥組的小鼠(7個個體)摘出的癌組織，通過PCR法分析作為腫瘤血管內(nèi)皮細胞標記的小鼠Flk-1/VEGF國R2(Genbank登錄號No.X70842)的基因表達。PCR引物使用下述引物(PCR擴增產(chǎn)物為336bp)。F引4勿5，-ctt-tac-tct畫ccc畫cag國tta-ca-3，(序歹'J號18)R引4勿5，-ctt國tct畫att國gtc-aag-gtg畫ct-3，(序歹'J號19)采用上述引物的PCR,按以下的反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件進行《反應(yīng)液組成》模板DNA:10xPCR緩沖液2.5mMdNTP:TaqDNA聚合酶F引物(IO一)R引物(IO一)滅菌水:_0.5]li:L合計50|iL《反應(yīng)條件》95°C(3分鐘)的變性后，以"熱變性/解離95。C(60秒)—退火55°C(60秒)—合成、伸長72°C(60秒)"作為1個循環(huán)，共計35個循環(huán)。另夕卜，作為內(nèi)部對照，使用GAPDH(人GAPDH:NM—002046;小鼠GAPDH:NM—008084,NM—001001303,XM—001003314,XM—988853,XM990238)。擴增GAPDH的PCR引物^f吏用下述引物(PCR擴增產(chǎn)物為452bp)。這些引物在以人GAPDH或小鼠GAPDH作為模板的情況下均可以擴增。F引4勿5，-acc-aca-gtc-cat-gcc國atc國ac-3，(序歹ll號20)R引物5'-tcc-acc-acc-ctg畫ttg國ctg畫ta畫3，(序列號21)另外，PCR的反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件與擴增上述的Flk-1/VEGF-R2時一樣。PCR產(chǎn)物的定量首先，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳展開后，用溴化乙錠染色。然后，用掃描儀讀取拍攝的電泳圖像，用NIHImage進行PCR產(chǎn)物的定量，按Flk-1/GAPDH的比例制圖。<結(jié)果〉如圖32所示，對每個IgG給藥組(20mg/kg體重)(2個個體)和DI-2-14給藥組(20mg/kg體重)(4個個體)各組的8~13個視場(物鏡x200),通過用蘇木精進行的核染色確認了核，并且數(shù)出Flk-1/VEGF-R2陽性的肺瘤血管內(nèi)皮細胞的數(shù)目(IgG給藥組共25個一見場，DI-2-14給藥組共35#見場)，計算每1個視場的腫瘤血管細胞數(shù)，IgG給藥組中為112.0±63.6(Flk-1陽性細胞數(shù)/視場)，相對的，DI-2-14給藥組中為36.3±2.2(Flk-1陽性細胞數(shù)/視場)，腫瘤血管細胞數(shù)顯著減少(P<0.01),這表示肺瘤血管生成由于給予DI-2-14而受到抑制。而且，在另外的實驗中，相同的Huh-7-hDlk-l細胞的荷瘤小鼠，從IgG給藥組(20mg/kg體重，N=7)和DI-2-14給藥組(20mg/kg體重，N=7)的小鼠中，通過RT-PCR半定量地分析各自形成的肺瘤中作為腫瘤血管內(nèi)皮細胞的特異性標記基因的Flk-1/VEGF-R2的基因表達，如圖33所示，DI-2-14給藥組的肺瘤中Flk-1/VEGF-R2的基因表達降低，其結(jié)果表示胂瘤血管生成由于給予DI-2-14而受到抑制。<考察〉已知在癌的形成中，肺瘤血管生成是必需的，已知抗VEGF抗體(阿瓦斯汀(Avastin))是以腫瘤血管生成抑制為主要作用才幾理的癌治療抗體。迄今為止，就Dlk-l和抗Dlk-l抗體而言，對于血管生成和血管生成抑制活性并沒有公開的公知信息。而且，就Dlk-l的功能而言，迄今為止，已經(jīng)有對于脂肪細胞的分化控制和由于Dlk-l基因的穩(wěn)定導入而導致的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和白血病細胞中的增殖促進的才艮告，基于已知的^知信息，不可能預(yù)見抗Dlk-l抗體(DI-2-14)具有腫瘤血管生成抑制活性。本實施例公開了DI-2-14抗體體內(nèi)的抗腫瘤活性的至少一個作用機理。產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，可以提供具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-l抗體，尤其是在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-l單克隆抗體。而且本發(fā)明還可以提供產(chǎn)生該抗體的雜交瘤、該抗體和各種藥劑的復合體、腫瘤的診斷用或治療用藥物組合物、腫瘤的檢測方法、肺瘤的檢測用途或診斷用試劑盒。序列表自由文本序列號3合成DNA序列號4合成DNA序列號5合成DNA序列號6合成DNA序列號7合成DNA序列號8合成DNA序列號9合成DNA序列號10:合成DNA77序列號11合成DNA序列號12合成DNA序列號13:合成DNA序列號14合成DNA序列號15合成DNA序列號16合成DNA序列號17合成DNA序列號18合成DNA序列號19:合成DNA序歹'J號20'合成DNA序列號21合成DNA序列號26重組DNA序列號27合成構(gòu)建體(重組蛋白質(zhì))序列號28重組DNA序列號29合成構(gòu)建體(重組蛋白質(zhì))權(quán)利要求1.一種在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1的抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的抗體，其中，抗肺瘤活性為肺瘤血管生成抑制活性。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中，抗體為單克隆抗體。4.根據(jù)權(quán)利要求l~3中任意一項所述的抗體，其中，肺瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。5.根據(jù)權(quán)利要求l~4中任意一項所述的抗體，其中，抗體的H鏈V區(qū)域的CDR1~3的氨基酸序列分別依次為序列號3032所示的氨基酸序列。6.根據(jù)權(quán)利要求l~5中任意一項所述的抗體，其中，抗體的L鏈V區(qū)域的CDR1~3的氨基酸序列分別依次為序列號33~35所示的氨基酸序列。7.根據(jù)權(quán)利要求l~6中任意一項所述的抗體，其中，抗體是基因重組抗體。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體，其中，基因重組抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人化抗體。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體，其中，嵌合抗體的H鏈V區(qū)域的氨基酸序列由序列號29所示的氨基酸序列構(gòu)成，L鏈V區(qū)域的氨基酸序列由序列號36所示的氨基酸序列構(gòu)成。10.—種抗人Dlk-l的單克隆抗體，其由保藏號為FERMBP-10707的雜交瘤產(chǎn)生。11.一種抗人Dlk-l的單克隆抗體，其由保藏號為FERMBP-10899的雜交瘤產(chǎn)生。12.—種抗人Dlk-l的單克隆抗體，其由保藏號為FERMBP-10900的雜交瘤產(chǎn)生。13.根據(jù)權(quán)利要求l~12中任意一項所述的抗體，其與保藏號為FERMBP-10707、FERMBP-10899或FERMBP-10900的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的部位結(jié)合。14.根據(jù)權(quán)利要求l~13中任意一項所述的抗體，其與序列號2所示的人Dlk-l的氨基酸序列中的第26位~第85位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域、第92位~第167位的氨基酸所構(gòu)成的區(qū)域、或第131位~第244位的氨基酸所構(gòu)成的區(qū)域中的至少一部分結(jié)合。15.—種來源于4又利要求1~14中任意一項所述的抗體的抗體片段。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體片段，其含有序列號3032所示的氨基酸序列。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體片段，其含有序列號29所示的氨基酸序列。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體片段，其含有序列號33~35所示的氨基酸序列。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗體片段，其含有序列號36所示的氨基酸序列。20.—種產(chǎn)生權(quán)利要求l~14中任意一項所述的抗體的雜交瘤。21.—種保藏號為FERMBP-10707的、產(chǎn)生抗人Dlk-l的單克隆抗體的雜交瘤。22.—種保藏號為FERMBP-10899的、產(chǎn)生抗人Dlk-l的單克隆抗體的雜交瘤。23.—種保藏號為FERMBP-10900的、產(chǎn)生抗人Dlk-l的單克隆抗體的雜交瘤。24.—種抗體-藥劑復合體，其含有權(quán)利要求l~14中任意一項所述的抗體和具有抗腫瘤活性和/或細胞殺傷活性的化合物。25.—種抗體片段-藥劑復合體，其含有權(quán)利要求1519中任意一項所述的抗體片段和具有抗胂瘤活性和/或細胞殺傷活性的化合物。26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的復合體，其中，抗腫瘤活性為腫瘤血管生成抑制活性。27.根據(jù)權(quán)利要求24~26中任意一項所述的復合體，其中，腫瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。28.—種藥物組合物，其含有選自于由權(quán)利要求l~14中任意一項所述的抗體、片又利要求15~19中任意一項所述的抗體片段和權(quán)利要求2427中任意一項所述的復合體構(gòu)成的組中的至少1種。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其用于腫瘤的治療。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，所述肺瘤的治療為抑制腫瘤血管生成。31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的組合物，其沒有體重減少的副作用。32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其用于腫瘤的診斷。33.根據(jù)權(quán)利要求2832中任意一項所述的組合物，其中，肺瘤選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。34.—種肺瘤治療劑，其含有選自于由權(quán)利要求l~14中任意一項所述的抗體、斥又利要求15~19中任意一項所述的抗體片段和權(quán)利要求2427中任意一項所述的復合體構(gòu)成的組中的至少1種。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的治療劑，其沒有體重減少的副作用。36.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的治療劑，其中，肺瘤為選自于人大腸癌、人乳&泉癌、人肝癌和人神經(jīng)母細力包瘤構(gòu)成的組中的至少1種。37.—種肺瘤血管生成抑制劑，其含有選自于由權(quán)利要求1~14中任意一項所述的抗體、4又利要求15~19中任意一項所述的抗體片段和權(quán)利要求24~27中任意一項所述的復合體構(gòu)成的組中的至少l種。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的抑制劑，其沒有體重減少的副作用。39.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的抑制劑，其中，腫瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。40.—種腫瘤診斷劑，其含有選自于由權(quán)利要求l~14中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求15~19中任意一項所述的抗體片段和權(quán)利要求24~27中任意一項所述的復合體構(gòu)成的組中的至少l種。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的診斷劑，其中，腫瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少1種。42.—種肺瘤的^r測方法，其特4正在于，4吏選自于由^L利要求l~14中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求15~19中任意一項所述的抗體片段和權(quán)利要求24~27中任意一項所述的復合體構(gòu)成的組中的至少l種與從生物體采集的試樣反應(yīng)，檢測反應(yīng)的抗體和/或抗體片段的信號。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中，腫瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。44.一種腫瘤的治療用、診斷用或4全測用試劑盒，其含有選自于由權(quán)利要求l~14中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求15~19中任意一項所述的抗體片段和權(quán)利要求24~27中任意一項所述的復合體構(gòu)成的組中的至少l種。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中，腫瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細胞瘤構(gòu)成的組中的至少l種。全文摘要本發(fā)明提供與hDlk-1特異性反應(yīng)且在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗體(抗hDlk-1抗體)、該抗體的片段、產(chǎn)生該抗體的雜交瘤、該抗體或抗體片段與藥劑的復合體、含有該抗體等的藥物組合物、腫瘤治療劑、腫瘤血管生成抑制劑、腫瘤診斷劑、腫瘤的檢測方法以及腫瘤的檢測用和/或診斷用試劑盒等。文檔編號C07K16/18GK101631802SQ200780041789公開日2010年1月20日申請日期2007年11月12日優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日發(fā)明者中村康司,田島理惠申請人:株式會社立富泰克