用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片的制作方法
【專(zhuān)利摘要】用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片屬于微流控技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片。本發(fā)明可完成多種腫瘤細(xì)胞的同時(shí)在線篩選實(shí)驗(yàn)，可實(shí)現(xiàn)接種16種腫瘤細(xì)胞；還可實(shí)現(xiàn)多種藥物的同時(shí)在線篩選，可完成8種抗腫瘤藥物的同時(shí)在線篩選。其包括芯片體，芯片體包括三層，第一PDMS薄膜層、第二PDMS薄膜層和玻璃底層，三部分從上至下依次經(jīng)不可逆的等離子鍵合形成復(fù)合式一體結(jié)構(gòu)。芯片體集成有四個(gè)結(jié)構(gòu)相同的模塊和一個(gè)廢液口，每個(gè)模塊集成有四列細(xì)胞培養(yǎng)通道、流體通道、一個(gè)細(xì)胞注入口、兩個(gè)藥物注入口、六個(gè)微閥，每列細(xì)胞培養(yǎng)通道下方還設(shè)有一與之連通的彎曲管道，所述彎曲管道頂端還設(shè)有一出口。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于微流控技術(shù)領(lǐng)域，具體地是涉及用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]藥物篩選是新藥研究的最初過(guò)程和關(guān)鍵步驟，是發(fā)現(xiàn)新藥的必經(jīng)之路。然而傳統(tǒng)的96孔板技術(shù)應(yīng)用在中藥新藥研發(fā)中時(shí)，因其消耗試劑量大、人工操作繁瑣、人為實(shí)驗(yàn)誤差大等缺點(diǎn)造成新藥研發(fā)周期長(zhǎng)、成本高、后期失敗風(fēng)險(xiǎn)高等瓶頸問(wèn)題，這在很大程度上限制了現(xiàn)代藥物的篩選與開(kāi)發(fā)。目前，微全分析系統(tǒng)(miniaturizedtotal analysis systems,μTAS)概念的提出，憑借其高通量、高靈敏性、高效性的優(yōu)勢(shì)在最近的十幾年里，被廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)、疾病診斷與治療、藥物合成與篩選等領(lǐng)域，成為21世紀(jì)最為熱門(mén)的前沿技術(shù)，并已成為藥物篩選的主要技術(shù)手段之一?？梢钥闯觯幬锖Y選技術(shù)的微型化、自動(dòng)化和低成本化是未來(lái)發(fā)展的必然趨勢(shì)。
[0003]微流控芯片(Microfluidics)是一種以芯片為操作平臺(tái)，以分析化學(xué)為理論基礎(chǔ)，以微機(jī)電加工技術(shù)為依托，以微管道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征，將常規(guī)化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米的芯片上的多學(xué)科交叉技術(shù)。若將微流控芯片的新原理、新技術(shù)、新方法等技術(shù)優(yōu)勢(shì)應(yīng)用于新藥篩選的相關(guān)研究中，一定會(huì)推動(dòng)我國(guó)新藥研發(fā)關(guān)鍵技術(shù)的原始創(chuàng)新和集成應(yīng)用，并大幅度提高藥物篩選效率，縮減動(dòng)物試驗(yàn)的需求，最終為臨床中藥物的合理用藥提供必要的前期基礎(chǔ)。
[0004]由于微流控芯片系統(tǒng)在細(xì)胞水平藥物篩選中的多種獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如微流控芯片操作所需的細(xì)胞量很少，適合來(lái)源稀缺但又十分重要的細(xì)胞研究;再如芯片的多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，形成了相對(duì)獨(dú)立、封閉的環(huán)境;這與體內(nèi)環(huán)境類(lèi)似，可以精確控制溫度、成分等因素，從而高度模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，使其更接近人體內(nèi)部的微環(huán)境。而且還可以將藥物的合成分離富集、細(xì)胞培養(yǎng)、藥物刺激、藥效實(shí)時(shí)檢測(cè)等多步工序集成在單片的微系統(tǒng)中；通過(guò)設(shè)計(jì)有不同功能的芯片來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞施加藥物刺激，并配合自動(dòng)化的檢測(cè)裝置，采集藥物與細(xì)胞相互作用的信號(hào)，收集數(shù)據(jù)，用以分析藥物的作用，最后進(jìn)行篩選并得到篩選結(jié)果?？梢赃@么說(shuō)，微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)，克服了傳統(tǒng)中藥復(fù)方藥物篩選的局限性，為中藥復(fù)方及候選新藥研發(fā)帶來(lái)新的希望。
[0005]目前，將微流控芯片技術(shù)用于細(xì)胞研究和藥物篩選等方面已有不少報(bào)道，如Ye等人在文南犬(Ye N, Qin J, Shi ff, et al.Cell-based high content screening usingan integrated microfluidic device[J].Lab on A Chip, 2007, 7(12):1696-704.)中構(gòu)建了一種集成化細(xì)胞水平的藥物篩選微流控芯片，實(shí)現(xiàn)了肝癌細(xì)胞多種參數(shù)測(cè)量的高內(nèi)涵篩選。但就目前的技術(shù)發(fā)展來(lái)說(shuō)，一種芯片實(shí)現(xiàn)多種功能的篩選依然是藥物高通量篩選的瓶頸，成為一大難題而長(zhǎng)期無(wú)法突破。因此，如何簡(jiǎn)易高效地進(jìn)行高通量藥物篩選及藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性的篩選仍是亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片。其可完成多種腫瘤細(xì)胞的同時(shí)在線篩選實(shí)驗(yàn)，最多可以實(shí)現(xiàn)16列細(xì)胞培養(yǎng)通道中接種16種不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞;還可實(shí)現(xiàn)多種藥物的同時(shí)在線篩選，最多可完成8種抗腫瘤藥物的同時(shí)在線篩選。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片，包括芯片體，所述芯片體包括三層，由上至下依次為，第一PDMS薄膜層、第二PDMS薄膜層和為細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)提供平臺(tái)的玻璃底層，其特征在于三部分從上至下依次經(jīng)不可逆的等離子鍵合形成復(fù)合式一體結(jié)構(gòu)；
所述芯片體集成有四個(gè)結(jié)構(gòu)相同的模塊和一個(gè)廢液口，所述四個(gè)模塊分別與該廢液口相連;每個(gè)模塊集成有四列細(xì)胞培養(yǎng)通道、流體通道、一個(gè)細(xì)胞注入口、兩個(gè)藥物注入口、六個(gè)微閥，其中有兩個(gè)微閥為液閥、四個(gè)微閥為氣閥，每列細(xì)胞培養(yǎng)通道下方還設(shè)有一與之連通的彎曲管道，所述彎曲管道頂端還設(shè)有一出口 ；
所述的四列細(xì)胞培養(yǎng)通道為:第一細(xì)胞培養(yǎng)通道、第二細(xì)胞培養(yǎng)通道、第三細(xì)胞培養(yǎng)通道和第四細(xì)胞培養(yǎng)通道。
[0008]所述的藥物注入口為:第一藥物注入口和第二藥物注入口。
[0009]所述的四個(gè)氣閥，兩兩一組，分為第一組氣閥，第二組氣閥，每組氣閥又分為第一氣閥、第二氣閥。
[0010]所述的兩個(gè)液閥為:第一液閥和第二液閥。
[0011]所述氣閥包括氣閥橢圓形結(jié)構(gòu)、氣體入口及氣閥通道;所述氣閥通道一端與橢圓形結(jié)構(gòu)相連通，另一端與氣體入口相連通。
[0012]所述液閥包括液閥橢圓形結(jié)構(gòu)、液體入口及液閥通道;所述液閥通道與橢圓形結(jié)構(gòu)及液體入口相連通。
[0013]所述的每列細(xì)胞培養(yǎng)通道上都等距離地設(shè)置有四個(gè)尺寸相同的復(fù)孔結(jié)構(gòu)，第一細(xì)胞培養(yǎng)通道與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道頂端相連并通過(guò)流體通道分別與第一藥物注入口及細(xì)胞注入口相連通;第三細(xì)胞培養(yǎng)通道與第四細(xì)胞培養(yǎng)通道頂端相連并通過(guò)流體通道分別與第二藥物注入口及細(xì)胞注入口相連通。
[0014]所述的氣閥及液閥集成在第一PDMS薄膜層上。
[0015]所述的第二PDMS薄膜層為流體通道層，所述細(xì)胞培養(yǎng)通道、細(xì)胞注入口、藥物注入口、彎曲管道、出口、廢液口及流體通道均集成在第二PDMS薄膜層上。
[0016]第一PDMS薄膜層上的所述氣閥的橢圓形結(jié)構(gòu)與第二 PDMS薄膜層的一細(xì)胞培養(yǎng)通道縱向相交，從氣體入口注入充氣，通過(guò)氣閥通道在橢圓形結(jié)構(gòu)處產(chǎn)生向下的壓力，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)通道加壓，進(jìn)而控制流體在第二 PDMS薄膜層的細(xì)胞培養(yǎng)通道上的流通。
[0017]所述第一PDMS薄膜層上的第一液閥的液閥通道為U型結(jié)構(gòu)，第一液閥的橢圓形結(jié)構(gòu)分別與第二 TOMS薄膜層上的流體通道及彎曲管道縱向相交，從液體入口注入液體，通過(guò)液閥通道在橢圓形結(jié)構(gòu)處產(chǎn)生向下的壓力，對(duì)流體通道及彎曲管道加壓;進(jìn)而來(lái)控制流體在第二 PDMS薄膜層上的流體通道、彎曲通道內(nèi)的流通;第二液閥的液閥通道為一字型，分別在橢圓形結(jié)構(gòu)處與第二 PDMS薄膜層上的四列細(xì)胞培養(yǎng)通道縱向相交，從液體入口注入液體，在橢圓形結(jié)構(gòu)處產(chǎn)生向下的壓力，進(jìn)而控制流體在第二PDMS薄膜層上的細(xì)胞培養(yǎng)通道上的流通。
[0018]所述的縱向相交并不是真實(shí)相交，而是說(shuō)位置上處于相交位置，第一PDMS薄膜層與第二 PDMS薄膜層在任何地方都是不連通的。
[0019]氣閥與氣閥間的開(kāi)啟、關(guān)閉以及交替閉合，完成多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選;在所述的每個(gè)模塊上，第一組氣閥的第一氣閥、第二氣閥與第二組氣閥的第二氣閥均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第二組氣閥的第一氣閥未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口接種第一種腫瘤細(xì)胞;第一組氣閥的第一氣閥、第二氣閥與第二組氣閥的第一氣閥均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第二組氣閥的第二氣閥未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口接種第二種腫瘤細(xì)胞;第二組氣閥的第一氣閥、第二氣閥與第一組氣閥的第一氣閥均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第一組氣閥的第二氣閥未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口接種第三種腫瘤細(xì)胞;第二組氣閥的第一氣閥、第二氣閥與第一組氣閥的第二氣閥均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第一組氣閥的第一氣閥未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口接種第四種腫瘤細(xì)胞;最多可實(shí)現(xiàn)16種腫瘤細(xì)胞同時(shí)接種在同一塊芯片上。其次，將每個(gè)模塊的第二液閥關(guān)閉，此時(shí)第二液閥為無(wú)液壓狀態(tài);關(guān)閉所有的氣閥，所有氣閥均處于無(wú)氣壓關(guān)閉狀態(tài);打開(kāi)第一液閥，在液體入口注入液體，使其處于加壓狀態(tài);從細(xì)胞注入口注入同一種藥物進(jìn)行藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性的在線篩選。
[0020]氣閥配合液閥的開(kāi)啟或關(guān)閉，完成多種藥物同時(shí)在線篩選;所有氣閥均處于無(wú)氣壓關(guān)閉狀態(tài)時(shí)，分別打開(kāi)各液閥組的第一液閥，此時(shí)第一液閥為有液壓狀態(tài);關(guān)閉各液閥組的第二液閥，此時(shí)第二液閥為無(wú)液壓狀態(tài);從細(xì)胞注入口注入同一種腫瘤細(xì)胞，待腫瘤細(xì)胞接種完畢至細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞注入口以及與彎曲通道相連的出口用玻璃柱堵住，關(guān)閉所有的液閥，在各藥物注入口處分別通過(guò)精密注射栗實(shí)時(shí)灌注8種同一濃度的不同類(lèi)藥物，且流動(dòng)給藥，所有的廢液統(tǒng)一有廢液口匯集統(tǒng)一處理，完成最多8種藥物的同時(shí)在線篩選。
[0021]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述氣閥橢圓形結(jié)構(gòu)的橫截面為橢圓形，長(zhǎng)、短軸尺寸為1.0 X0.3 mm，高為40?60 μπι;所述氣閥的閥通道寬度為0.05?0.15mm。
[0022]作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述液閥橢圓形結(jié)構(gòu)的橫截面為橢圓形，長(zhǎng)、短軸尺寸為1.0 X0.4 mm，高為40?60 μπι，所述液閥的閥通道寬度為0.05?0.15mm;經(jīng)過(guò)前期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，液閥的液壓至少是流體通道橫截面積的2倍才起到液壓的作用，本發(fā)明之所以采用橢圓形結(jié)構(gòu)符合流體力學(xué)特性，避免死體積，壓力均衡。
[0023]作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述復(fù)孔結(jié)構(gòu)為橢圓形，橢圓形長(zhǎng)、短軸尺寸為1.0 X 1.3 mm，高為40?60 μπι;該橢圓形根據(jù)流體力學(xué)性質(zhì)計(jì)算出，更適用于細(xì)胞在微流體狀態(tài)下的生長(zhǎng)。
[0024]作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述細(xì)胞培養(yǎng)通道的間的間距為2.06mm。
[0025]作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述的彎曲管道寬度為0.15mm;以防止液體倒流。
[0026]作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述的流體通道的寬度為0.20mm。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明有益效果。
[0028]本發(fā)明所提供的一種用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的微流控芯片，通過(guò)調(diào)控所述微閥的開(kāi)關(guān)與閉合，氣閥與氣閥間的開(kāi)啟、關(guān)閉以及交替閉合從而實(shí)現(xiàn)單種或多種細(xì)胞在芯片中的接種及培養(yǎng)，同時(shí)給予藥物等刺激可快捷的完成多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選實(shí)驗(yàn)，可以實(shí)現(xiàn)16列細(xì)胞培養(yǎng)通道中接種16種不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞的同時(shí)在線篩選實(shí)驗(yàn)，完成藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性的初步遴選。
[0029]另一方面，所述氣閥配合所述液閥的開(kāi)啟或關(guān)閉使用，可以實(shí)現(xiàn)所有的細(xì)胞培養(yǎng)腔接種同一種腫瘤細(xì)胞，并最多可實(shí)現(xiàn)8種抗腫瘤類(lèi)藥物的同時(shí)在線篩選。與傳統(tǒng)96孔板工藝相比，精密注射栗在細(xì)胞可承受的剪切力條件下以0.2 pL.min-1的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)灌注，作用48 h后的藥液或者培養(yǎng)液的消耗量還不足10 uL，用量是傳統(tǒng)96孔板技術(shù)的百分之一；此外，采用熒光染色技術(shù)較快捷，染色后20 min后便可以顯微鏡下觀測(cè)，而傳統(tǒng)的96孔板技術(shù)藥物作用后還需加入MTT溶液進(jìn)行37°C孵育4 h，吸走上清液后再加入DMSO試劑搖床上混合10 min，本發(fā)明大大節(jié)約了時(shí)間，并減少了多次繁瑣操作產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)誤差，總而言之，具有高效快速的實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)。
[0030]本發(fā)明所述的共同的廢液出處，統(tǒng)一收集。不僅擺脫了傳統(tǒng)手動(dòng)單一接口的繁瑣操作，而且降低了細(xì)胞被污染的可能性，提高了實(shí)驗(yàn)的成功率。
[0031]本發(fā)明所述的細(xì)胞培養(yǎng)通道上的復(fù)孔結(jié)構(gòu)傳統(tǒng)上多為圓形結(jié)構(gòu)，本發(fā)明采用橢圓形結(jié)構(gòu)，其一，相同直徑的橢圓形比圓形結(jié)構(gòu)面積大，能夠加大細(xì)胞的數(shù)量，提高樣本量使得統(tǒng)計(jì)更有意義;其二，橢圓形結(jié)構(gòu)更加符合流體力學(xué)特點(diǎn)，能夠克服圓形區(qū)域存在的流體分布不均勻、細(xì)胞受力不均勻?qū)е碌慕o藥時(shí)間不一致的問(wèn)題。
[0032]本發(fā)明具有操作靈活簡(jiǎn)單、易于集成、實(shí)驗(yàn)成功率高、結(jié)果穩(wěn)定、制作成本低及多功能等特點(diǎn)，具有較高的潛在生物學(xué)研究?jī)r(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。避免了傳統(tǒng)96孔板的繁瑣操作，可以為基于微流控芯片的實(shí)驗(yàn)提供較好的技術(shù)支撐，有望為以后抑制腫瘤細(xì)胞類(lèi)藥物的高通量篩選奠定一定的前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并且為抗腫瘤類(lèi)新藥開(kāi)發(fā)與利用提供一個(gè)嶄新的平臺(tái)ο
【附圖說(shuō)明】
[0033]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明保護(hù)范圍不僅局限于以下內(nèi)容的表述。
[0034]圖1本發(fā)明微流控芯片整體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0035]圖2肺腫瘤細(xì)胞A549在實(shí)驗(yàn)中的生長(zhǎng)狀態(tài)圖。
[0036]圖3液閥檢測(cè)圖。
[0037]圖1中，A為第一液閥、B為第二液閥、a為第一組的第一氣閥、al為第一組的第二氣閥、bl為第二組的第一氣閥、b為第二組的第二氣閥、O為廢液口、I為細(xì)胞注入口、①為第一藥物注入口、②為第二藥物注入口。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0039]如圖1所示，微流控芯片，從上至下依次包括:第一PDMS薄膜層、第二 PDMS薄膜層和玻璃底層，三部分依次經(jīng)不可逆的等離子鍵合形成復(fù)合式一體結(jié)構(gòu)。
[0040]所述第一PDMS薄膜層上集成24個(gè)微閥，其中有氣閥16個(gè)，液閥8個(gè);所述氣閥兩兩一組配合使用，共8組，每組包括兩個(gè)氣閥，分別為第一組的第一氣閥a，第一組的第二氣閥al，第二組的第一氣閥bl，第二組的第二氣閥b;所述液閥兩兩一組配合使用，共四組，每組包括兩個(gè)液閥;第一液閥A和第二液閥B。
[0041]所述第二PDMS薄膜層為流體通道層，所述第二 PDMS薄膜層上集成有四個(gè)結(jié)構(gòu)相同的模塊和一個(gè)廢液口 O，四個(gè)模塊共用一個(gè)廢液口 O;每個(gè)模塊集成有四列細(xì)胞培養(yǎng)通道、一個(gè)細(xì)胞注入口 I和兩個(gè)藥物注入口 ；細(xì)胞注入口 I和藥物注入口設(shè)置在模塊上、細(xì)胞培養(yǎng)單元的上方;藥物注入口位于細(xì)胞注入口 I兩側(cè);每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)通道上都等距離地設(shè)置有四個(gè)尺寸相同的復(fù)孔結(jié)構(gòu);所述復(fù)孔結(jié)構(gòu)為橢圓形，替代了傳統(tǒng)的圓形結(jié)構(gòu);每列細(xì)胞培養(yǎng)通道下方還設(shè)有一與之連通的彎曲管道，所述彎曲管道頂端還設(shè)有一出口；第一列細(xì)胞培養(yǎng)通道和第二列細(xì)胞培養(yǎng)通道共用第一藥物注入口①，第三列細(xì)胞培養(yǎng)通道和第四列細(xì)胞通道共用第二藥物注入口②;四列細(xì)胞培養(yǎng)通道共用一個(gè)細(xì)胞注入口 I;前兩列細(xì)胞培養(yǎng)通道頂端相連后再分別與第一藥物注入口①及細(xì)胞注入口 I相連;后兩列細(xì)胞培養(yǎng)通道頂端相連后再分別與第二藥物注入口②及細(xì)胞注入口 I相連。
[0042]所述第一PDMS薄膜層上的氣閥的橢圓形結(jié)構(gòu)與第二 PDMS薄膜層的一細(xì)胞培養(yǎng)通道縱向相交，所述氣閥通過(guò)氣體入口進(jìn)行充氣，在橢圓形結(jié)構(gòu)處產(chǎn)生壓力對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)通道加壓，進(jìn)而控制流體在第二 PDMS薄膜層的細(xì)胞培養(yǎng)通道上的流通。
[0043]所述第一PDMS薄膜層上的第一液閥的液閥通道為U型結(jié)構(gòu)，第一液閥的橢圓形結(jié)構(gòu)分別與第二 TOMS薄膜層上的流體通道及彎曲通道縱向相交，從液體入口注入液體，產(chǎn)生液壓，進(jìn)而來(lái)控制流體在第二 PDMS薄膜層上的流體通道、彎曲通道內(nèi)的流通;第二液閥的液閥通道為一字型，分別在橢圓形結(jié)構(gòu)處與第二 PDMS薄膜層上的四列細(xì)胞培養(yǎng)通道縱向相交，從液體入口注入液體，產(chǎn)生向下壓力，進(jìn)而控制流體在第二 PDMS薄膜層上的細(xì)胞培養(yǎng)通道上的流通。
[0044]這里需指出的是，所述的縱向相交并不是真實(shí)相交，而是說(shuō)位置上處于相交位置，第一 TOMS薄膜層與第二 PDMS薄膜層在任何地方都是不連通的。所述第一 TOMS薄膜層、第二PDMS薄膜層和玻璃底層，三部分依次經(jīng)不可逆的等離子鍵合形成復(fù)合式一體結(jié)構(gòu)。
[0045]氣閥與氣閥間的開(kāi)啟、關(guān)閉以及交替閉合，完成多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選;在所述的每個(gè)模塊上，第一組氣閥的第一氣閥a、第二氣閥al與第二組氣閥的第二氣閥b均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第二組氣閥的第一氣閥bl未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口 I接種第一種腫瘤細(xì)胞;第一組氣閥的第一氣閥a、第二氣閥al與第二組氣閥的第一氣閥bl均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第二組氣閥的第二氣閥b未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口 I接種第二種腫瘤細(xì)胞;第二組氣閥的第一氣閥bl、第二氣閥b與第一組氣閥的第一氣閥a均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第一組氣閥的第二氣閥al未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口 I接種第三種腫瘤細(xì)胞;第二組氣閥的第一氣閥bl、第二氣閥b與第一組氣閥的第二氣閥al均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第一組氣閥的第一氣閥a未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口 I接種第四種腫瘤細(xì)胞;最多可實(shí)現(xiàn)16種腫瘤細(xì)胞同時(shí)接種在同一塊芯片上。其次，將每個(gè)模塊的第二液閥B以及所有的氣閥均處于關(guān)閉狀態(tài)，打開(kāi)第一液閥A，從細(xì)胞注入口 I注入同一種藥物進(jìn)行藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性的在線篩選，其余三個(gè)模塊同理。
[0046]氣閥配合液閥的開(kāi)啟或關(guān)閉，完成多種藥物同時(shí)在線篩選;所有氣閥均處于無(wú)氣壓關(guān)閉狀態(tài)時(shí)，分別打開(kāi)各液閥組的第一液閥A，此時(shí)第一液閥A為有液壓狀態(tài);關(guān)閉各液閥組的第二液閥B，此時(shí)第二液閥B為無(wú)液壓狀態(tài);從細(xì)胞注入口 I注入同一種腫瘤細(xì)胞，待腫瘤細(xì)胞接種完畢至細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞注入口 I以及細(xì)胞培養(yǎng)通道下方的出口用玻璃柱堵住，關(guān)閉所有的液閥組，在各藥物注入口處分別通過(guò)精密注射栗實(shí)時(shí)灌注8種同一濃度的不同類(lèi)藥物，所有的廢液統(tǒng)一有廢液口 O匯集統(tǒng)一處理，完成最多8種藥物的同時(shí)在線篩選。
[0047]實(shí)施例子I。
[0048]材料與儀器。
[0049]SU-8 2075負(fù)性光刻膠；Sylgardl84型聚二甲基硅氧烷(PDMS);固化劑(美國(guó)DowCorning公司);JKG-2A型光刻機(jī)(上海學(xué)澤光學(xué)機(jī)械有限公司);HPDC-32G_2型等離子清洗機(jī)(美國(guó)Harrick Plasma公司)；勾膠機(jī)(SC-1B型，北京創(chuàng)世威納科技有限公司)；真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；精密注射栗(LSP04-1A，保定蘭格公司);Nikon ECLIPSETI倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。
[0050]實(shí)驗(yàn)流程。
[0051 ]本實(shí)驗(yàn)所用的微流控芯片有本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)與制作，芯片為三層不可逆鍵合而成。用進(jìn)樣針將濃度為lmg/mL的鼠尾膠原I通入到各細(xì)胞培養(yǎng)通道，于37°C加熱平臺(tái)中烘干備用，使膠原蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域。放冷后將芯片置于紫外燈下照射30分鐘除菌，然后以一定密度的肺腫瘤細(xì)胞A549懸液灌流入培養(yǎng)通道，待細(xì)胞貼壁后，用注射栗以0.2 yL/min的流速將完全培養(yǎng)基通入到細(xì)胞培養(yǎng)通道中，待細(xì)胞匯合成單層時(shí)(其細(xì)胞狀態(tài)如圖2所示)，用荊芥含藥培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藥物刺激24 h后，用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染，使用Nikon eclipse Ti倒置熒光顯微鏡對(duì)芯片進(jìn)行拍照處理，結(jié)果證明荊芥提取物對(duì)于肺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用。
[0052]實(shí)施例子2。
[0053]材料與儀器。
[0054]紅色食用色素染料(Sigma公司)；綠色食用色素染料(Sigma公司)；精密注射栗(LSP04-1A，保定蘭格公司)。
[0055]實(shí)驗(yàn)流程。
[0056]為了驗(yàn)證液閥控制系統(tǒng)對(duì)芯片的開(kāi)關(guān)性能，我們將本發(fā)明的芯片與液閥控制系統(tǒng)系統(tǒng)連接，通過(guò)控制液閥的長(zhǎng)時(shí)間閉合，觀察液閥對(duì)周?chē)ǖ乐腥芤旱挠绊懠耙洪y的回彈開(kāi)啟性能，同時(shí)判斷液閥對(duì)兩側(cè)通道中溶液的長(zhǎng)時(shí)間隔離作用效果。
[0057]將精密注射栗通過(guò)聚四氟乙烯管與芯片相連接，液閥通道中通入綠色食用色素染料，流體通道中通入綠色食用色素染料，將液閥加壓后關(guān)閉，每12 h拍照觀察微閥的閉合狀態(tài)，48 h后將液閥重新開(kāi)啟觀察其回彈開(kāi)啟性能。
[0058]結(jié)果顯示:液閥適用性良好，液閥重新回彈性能良好，結(jié)果如圖3所示，可用于后期實(shí)驗(yàn)研究。
[0059]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較具體詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明應(yīng)用范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片，包括芯片體，所述芯片體包括三層，由上至下依次為，第一PDMS薄膜層、第二PMDS薄膜層和為細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)提供平臺(tái)的玻璃底層，其特征在于三部分從上至下依次經(jīng)不可逆的等離子鍵合形成復(fù)合式一體結(jié)構(gòu)； 所述芯片體集成有四個(gè)結(jié)構(gòu)相同的模塊和一個(gè)廢液口，所述四個(gè)模塊分別與該廢液口相連;每個(gè)模塊集成有四列細(xì)胞培養(yǎng)通道、流體通道、一個(gè)細(xì)胞注入口、兩個(gè)藥物注入口、六個(gè)微閥，其中有兩個(gè)微閥為液閥、四個(gè)微閥為氣閥，每列細(xì)胞培養(yǎng)通道下方還設(shè)有一與之連通的彎曲管道，所述彎曲管道頂端還設(shè)有一出口 ； 所述的四列細(xì)胞培養(yǎng)通道為:第一細(xì)胞培養(yǎng)通道、第二細(xì)胞培養(yǎng)通道、第三細(xì)胞培養(yǎng)通道和第四細(xì)胞培養(yǎng)通道； 所述的藥物注入口為:第一藥物注入口和第二藥物注入口 ； 所述的四個(gè)氣閥，兩兩一組，分為第一組氣閥，第二組氣閥，每組氣閥又分為第一氣閥、第二氣閥； 所述的兩個(gè)液閥為:第一液閥和第二液閥； 所述氣閥包括氣閥橢圓形結(jié)構(gòu)、氣體入口及氣閥通道;所述氣閥通道一端與橢圓形結(jié)構(gòu)相連通，另一端與氣體入口相連通； 所述液閥包括液閥橢圓形結(jié)構(gòu)、液體入口及液閥通道;所述液閥通道與橢圓形結(jié)構(gòu)及液體入口相連通； 所述的每列細(xì)胞培養(yǎng)通道上都等距離地設(shè)置有四個(gè)尺寸相同的復(fù)孔結(jié)構(gòu)，第一細(xì)胞培養(yǎng)通道與第二細(xì)胞培養(yǎng)通道頂端相連并通過(guò)流體通道分別與第一藥物注入口及細(xì)胞注入口相連通;第三細(xì)胞培養(yǎng)通道與第四細(xì)胞培養(yǎng)通道頂端相連并通過(guò)流體通道分別與第二藥物注入口及細(xì)胞注入口相連通； 第一 PDMS薄膜層上的所述氣閥的橢圓形結(jié)構(gòu)與第二 PDMS薄膜層的一細(xì)胞培養(yǎng)通道縱向相交，從氣體入口注入充氣，通過(guò)氣閥通道在橢圓形結(jié)構(gòu)處產(chǎn)生向下的壓力，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)通道加壓，進(jìn)而控制流體在第二 PDMS薄膜層的細(xì)胞培養(yǎng)通道上的流通； 所述第一PDMS薄膜層上的第一液閥的液閥通道為U型結(jié)構(gòu)，第一液閥的橢圓形結(jié)構(gòu)分別與第二 TOMS薄膜層上的流體通道及彎曲管道縱向相交，從液體入口注入液體，通過(guò)液閥通道在橢圓形結(jié)構(gòu)處產(chǎn)生向下的壓力，對(duì)流體通道及彎曲管道加壓;進(jìn)而來(lái)控制流體在第二PDMS薄膜層上的流體通道、彎曲通道內(nèi)的流通;第二液閥的液閥通道為一字型，分別在橢圓形結(jié)構(gòu)處與第二 PDMS薄膜層上的四列細(xì)胞培養(yǎng)通道縱向相交，從液體入口注入液體，在橢圓形結(jié)構(gòu)處產(chǎn)生向下的壓力，進(jìn)而控制流體在第二 PDMS薄膜層上的細(xì)胞培養(yǎng)通道上的流通。2.—種利用權(quán)利要求1所述的用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片完成多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的方法，在所述的每個(gè)模塊上，第一組氣閥的第一氣閥、第二氣閥與第二組氣閥的第二氣閥均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第二組氣閥的第一氣閥未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口接種第一種腫瘤細(xì)胞;第一組氣閥的第一氣閥、第二氣閥與第二組氣閥的第一氣閥均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第二組氣閥的第二氣閥未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口接種第二種腫瘤細(xì)胞;第二組氣閥的第一氣閥、第二氣閥與第一組氣閥的第一氣閥均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第一組氣閥的第二氣閥未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口接種第三種腫瘤細(xì)胞;第二組氣閥的第一氣閥、第二氣閥與第一組氣閥的第二氣閥均充氣加壓時(shí)，壓緊各自所在的細(xì)胞培養(yǎng)通道，阻止流體從中通過(guò)，第一組氣閥的第一氣閥未充氣，使得該列細(xì)胞培養(yǎng)通道為打開(kāi)狀態(tài)，此時(shí)從細(xì)胞注入口接種第四種腫瘤細(xì)胞;最多可實(shí)現(xiàn)16種腫瘤細(xì)胞同時(shí)接種在同一塊芯片上;其次，將每個(gè)模塊的第二液閥關(guān)閉，(此時(shí)第二液閥為無(wú)液壓狀態(tài));關(guān)閉所有的氣閥，所有氣閥均處于無(wú)氣壓關(guān)閉狀態(tài);打開(kāi)第一液閥，在液體入口注入液體，使其處于加壓狀態(tài);從細(xì)胞注入口注入同一種藥物進(jìn)行藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性的在線篩選。3.—種利用權(quán)利要求1所述的用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片完成多種藥物同時(shí)在線篩選的方法，令所有氣閥均處于無(wú)氣壓關(guān)閉狀態(tài)，分別打開(kāi)各液閥組的第一液閥，(此時(shí)第一液閥為有液壓狀態(tài))；關(guān)閉各液閥組的第二液閥，(此時(shí)第二液閥為無(wú)液壓狀態(tài))；從細(xì)胞注入口注入同一種腫瘤細(xì)胞，待腫瘤細(xì)胞接種完畢至細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞注入口以及出口用玻璃柱堵住，關(guān)閉所有的液閥，在各藥物注入口處分別通過(guò)精密注射栗實(shí)時(shí)灌注8種同一濃度的不同類(lèi)藥物，且流動(dòng)給藥，所有的廢液統(tǒng)一有廢液口匯集統(tǒng)一處理，完成最多8種藥物的同時(shí)在線篩選。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片，其特征在于:所述氣閥橢圓形結(jié)構(gòu)的橫截面為橢圓形，長(zhǎng)、短軸尺寸為1.0 X0.3,高為40?60 ；所述氣閥的閥通道寬度為0.05?0.15。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片，其特征在于:所述液閥橢圓形結(jié)構(gòu)的橫截面為橢圓形，長(zhǎng)、短軸尺寸為1.0 X0.4，高為40?60，所述液閥的閥通道寬度為0.05-0.15。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)孔結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述復(fù)孔結(jié)構(gòu)為橢圓形，其長(zhǎng)、短軸尺寸為1.0 X 1.3 mm，高為40?60 um。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)通道，其特征在于:所述每列細(xì)胞培養(yǎng)通道的間距為2.06 mmD8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多種腫瘤細(xì)胞同時(shí)在線篩選的多功能集成微流控芯片，其特征在于:所述彎曲通道寬度為0.15mm，所述的流體通道的寬度為0.20_。
【文檔編號(hào)】C12M3/00GK105838603SQ201610310363
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】孟憲生, 樊佳新, 包永睿, 王帥, 李天嬌
【申請(qǐng)人】遼寧中醫(yī)藥大學(xué)