專(zhuān)利名稱(chēng)：：包含免疫球蛋白鉸鏈區(qū)和Fc效應(yīng)子功能改變了的Fc區(qū)的結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及免疫學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體的說(shuō)，本文提供包含一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白4交鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域被修飾，以改變結(jié)合蛋白對(duì)關(guān)聯(lián)(cognate)受體(例如Fc受體)的結(jié)合親和力和/或特異性，和/或賦予該鉸鏈區(qū)和/或恒定區(qū)一種或多種新的結(jié)合特異性，這些新的結(jié)合特異性是相應(yīng)的未修飾結(jié)合蛋白所不具有的(例如對(duì)與未修飾結(jié)合蛋白所特異性結(jié)合的關(guān)聯(lián)受體不同的Fc受體的親和力)。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合蛋白包括例如經(jīng)修飾的抗體、抗體片段、重組結(jié)合蛋白和分子工程改造的(molecularlyengineered)結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白融合蛋白，包括小模塊免疫藥物產(chǎn)品(smallmodularimmunopharmaceuticalproducts,SMIPT，品)在內(nèi)。相關(guān)領(lǐng)域的描述免疫球蛋白是由兩條相同的輕鏈多肽和兩條相同的重鏈多肽通過(guò)鏈間二硫鍵連接成大分子復(fù)合物而構(gòu)成的多聚蛋白質(zhì)(H2L。。鏈間二碗鍵將同一多肽鏈的不同區(qū)域連接起來(lái)，導(dǎo)致環(huán)的形成，環(huán)連同相鄰的氨基酸一起構(gòu)成免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。在氨基末端部分，每個(gè)輕鏈和每個(gè)重鏈都具有單個(gè)可變區(qū)，在該區(qū)的氨基酸組成上，不同的抗體顯示出極大的不同。輕鏈可變區(qū)VL與重鏈可變區(qū)VH發(fā)生締合，形成免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)FV。輕鏈具有單個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(CH1),而重鏈具有幾個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。IgG類(lèi)、IgA類(lèi)和IgD類(lèi)具有三個(gè)重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，分別稱(chēng)為CH1、CH2和CH3;而IgM類(lèi)和IgE類(lèi)具有四個(gè)重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，分別稱(chēng)為CH1、CH2、CH3和CH4。在HarlowaW"Eds""Antibodies:ALaboratoryManual,"Chapter14(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,1988)中和在Lo，Ed.,"AntibodyEngineering:MethodsandProtocols,"Part1(HumanaPress,Totowa，NewJersey,2004)中，對(duì)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了綜述。免疫球蛋白的重鏈可分成三個(gè)功能區(qū)域:Fd區(qū)、4交鏈區(qū)和Fc區(qū)(可結(jié)晶片段)。Fd區(qū)包含Vh結(jié)枸域和CHI結(jié)構(gòu)域，它與輕鏈組合在一起形成Fab,即抗原結(jié)合片段。Fc片段負(fù)責(zé)免疫球蛋白效應(yīng)子功能，這種功能包括例如補(bǔ)體固定和與效應(yīng)細(xì)胞關(guān)聯(lián)Fc受體的結(jié)合。鉸鏈區(qū)存在于IgG類(lèi)、IgA類(lèi)和IgD類(lèi)免疫球蛋白，能起到柔性間隔區(qū)的作用，讓Fab部分在與Fc區(qū)相對(duì)的空間中自由移動(dòng)。與恒定區(qū)形成對(duì)比的是，4史鏈結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)多樣，不同的免疫球蛋白類(lèi)別和亞類(lèi)在鉸鏈的序列和長(zhǎng)度上各不相同。根據(jù)晶體學(xué)研究，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)按結(jié)構(gòu)和功能還可進(jìn)一步細(xì)分成以下三個(gè)區(qū)域上4史鏈、核心和下4交鏈。Shin"a/.,/wmw"o/c^c^iev&m雄:87(1992)。上鉸鏈包括從CH1的羧基末端到鉸鏈中限制運(yùn)動(dòng)的第一個(gè)殘基的那些氨基酸，該第一個(gè)殘基通常是在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵的第一個(gè)半胱氨酸殘基。上鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度關(guān)系到抗體的區(qū)段柔性(segmentalflexibility),核心鉸鏈區(qū)含有重鏈間二硫鍵。下鉸鏈區(qū)連接CH2結(jié)構(gòu)域的氨基末端且包括CH2結(jié)構(gòu)域中的殘基。同上文獻(xiàn)。人IgG，的核心鉸鏈區(qū)含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，該序列當(dāng)通過(guò)二硫鍵形成而發(fā)生二聚化時(shí)，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生據(jù)認(rèn)為起到支點(diǎn)(pivot)作用的環(huán)狀八肽，從而賦予柔性。免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽序列的結(jié)構(gòu)和柔性所允許的構(gòu)象變化，會(huì)影響抗體Fc部分的效應(yīng)子功能。與Fc區(qū)有關(guān)的三種主要類(lèi)別的效應(yīng)子功能包括(l)經(jīng)典的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的激活，(2)與效應(yīng)細(xì)胞的相互作用和(3)免疫球蛋白的區(qū)室化。不同的人IgG亞類(lèi)在固定補(bǔ)體或者激活和擴(kuò)大補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的步驟的相對(duì)效能上不盡相同(參見(jiàn)例如Kirschfmk，/mmw"o/.iev.巡:177(2001);Chakrabortia/"Ce〃S一a/12:607(2000);Kohlefa/.，M/.im卿"o/.，93(1999);MarshCwmQp/w.aa—to/.g:557(1999)和Speth"a/.，附'e"^7/".『oc/erac/^.iii:378(1999))。補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)據(jù)認(rèn)為是清除特定的靶細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制。一般來(lái)說(shuō)，IgGt和IgG3能最有效地固定補(bǔ)體，IgG2不夠有效，而IgG4不能激活補(bǔ)體。補(bǔ)體激活是通過(guò)級(jí)聯(lián)中第一個(gè)組分Cl的亞單位Clq與抗原-抗體復(fù)合物的結(jié)合引發(fā)的。盡管Clq的結(jié)合位點(diǎn)位于抗體的CH2結(jié)構(gòu)域中，但鉸鏈區(qū)會(huì)影響抗體激活級(jí)聯(lián)的能力。例如，缺乏鉸鏈區(qū)的重組免疫球蛋白不能夠激活補(bǔ)體。Shin"a/.,(1992)，出處同上。沒(méi)有鉸鏈區(qū)所賦予的柔性，結(jié)合抗原的抗體Fab部分可能不能夠采取為允許Clq結(jié)合CH2所需的構(gòu)象(參見(jiàn)同上文獻(xiàn))。鉸鏈長(zhǎng)度和區(qū)段柔性與補(bǔ)體激活的關(guān)系有限。因此，具有改變了的、如同IgG4鉸鏈區(qū)一樣剛硬的鉸鏈區(qū)的人IgG3分子，在激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)方面保持有效。鉸鏈區(qū)還可含有一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)包括多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型不同的碳水化合物連接位點(diǎn)。例如，IgAi在鉸鏈區(qū)的17氨基酸區(qū)段當(dāng)中含有五個(gè)糖基化位點(diǎn)，從而賦予鉸鏈區(qū)多肽對(duì)腸蛋白酶的超?？剐?，這被認(rèn)為是分泌性免疫球蛋白的有利性質(zhì)。鉸鏈區(qū)的不存在或者功能性鉸鏈區(qū)的缺乏，也會(huì)影響某些人免疫球蛋白結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體的能力。免疫球蛋白與Fc受體的結(jié)合能促進(jìn)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC),ADCC據(jù)推測(cè)是清除腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制。人IgGFc受體(FcR)家族分成三類(lèi)FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRI11(CD16)，前一類(lèi)能夠以高親和力結(jié)合IgG，后兩類(lèi)是低親和力受體。人IgAFc受體是FcaR(CD89)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，CH2結(jié)構(gòu)域的鉸鏈近側(cè)區(qū)域(hingeproximalregion)中的殘基，對(duì)于免疫球蛋白與各自Fc受體的每一個(gè)之間的相互作用的特異性是重要的。這一點(diǎn)得到以下觀察結(jié)果的支持缺乏鉸鏈區(qū)的IgG,骨髓瘤蛋白和重組IgG3嵌合抗體不能夠結(jié)合FcyRI，很可能是因?yàn)榕cCH2結(jié)構(gòu)域的可接近性降低所致。ShinWa/.,/"few./mww"o/.，77,178-79(1993)。Ingmar"a/.,"人IgGFc受體,"/wAev./wmw打o/.j^:29-55(1997)及Ravetch和Bolland,"IgGFc受體，，，iev./mmwm/.1^:275-90(2001)中對(duì)Fcy-受體作了全面的綜述。另參見(jiàn)Getahun"a/.，《//wmw"o/.172:5269-5276(2004)。FcyRI(CD64)在巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞上表達(dá)，在吞噬作用、呼吸爆發(fā)、細(xì)胞因子刺激和樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。FqRI的表達(dá)由GM-CSF和y-干擾素(y-IFN)上調(diào)和由白細(xì)胞介素-4(IL-4)下調(diào)。當(dāng)所有的激活性受體被剔除(knockout)時(shí)，小鼠免于發(fā)生免疫復(fù)合物介導(dǎo)的炎癥。同樣，當(dāng)FOyRI^l剔除時(shí)，小鼠受到一定的保護(hù)。已鑒定出三種形式的FcyRII(CD32)，即FcyRIIa、FcyRHb和FcyRIIc。FcyRHa在多形核白細(xì)胞(PMN)、巨噬細(xì)胞、樹(shù)狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞上表達(dá)。FqRIIa在吞噬作用、呼吸爆發(fā)和細(xì)胞因子刺激中起作用。FcyRIIa的表達(dá)受GM-CSF和y-IFN上調(diào)和被IL-4降低。當(dāng)所有的激活性受體被剔除時(shí)，小鼠免于發(fā)生免疫復(fù)合物介導(dǎo)的炎癥。FcYRIIa以高親和力結(jié)合c-反應(yīng)性蛋白(CRP)多晶型體H131，以低親和力結(jié)合CRP多晶型體R131。多晶型現(xiàn)象在一般人群中的分布大約為50:50R131,伴有對(duì)感染和狼瘡腎炎的易感性增加。FqIIb在B細(xì)胞、PMN、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞上表達(dá)。FtyyIIb能抑制基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)所介導(dǎo)的應(yīng)答；因此，這是一種抑制性受體。FcyRIIc的表達(dá)受靜脈免疫球蛋白(IVIG)和IL-4上調(diào)和被y-IFN降低。當(dāng)濾泡樹(shù)突細(xì)胞(FDC)剔除了CD32時(shí)，F(xiàn)cyRIIb剔除的小鼠顯示出抗體應(yīng)答和對(duì)自身免疫疾病的易感性增加，B細(xì)胞回憶應(yīng)答(recallresponse)減少。FcyRIIc在NK細(xì)胞上表達(dá)，但對(duì)它的功能和表達(dá)調(diào)節(jié)知之甚少。已鑒定出兩種形式的FcyRIII(CD16),即FcyR!IIa和FcyRinb。FcYRHIa在自然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和血小板上表達(dá)。這個(gè)受體參與吞噬作用、呼吸爆發(fā)、細(xì)胞因子刺激、血小板聚集和脫粒以及NK介導(dǎo)的ADCC。FcyRIII的表達(dá)受C5a、TGF(3和，IFN上調(diào)，受IL-4下調(diào)。當(dāng)所有的激活性受體被剔除時(shí)，小鼠免于發(fā)生免疫復(fù)合物介導(dǎo)的炎癥。Fc7RIIIa是多晶型體，其中F176最為常見(jiàn)，V-176較少見(jiàn)。F-176以較小的親合力(avidity)結(jié)合IgG,與紅斑狼齊有關(guān)。FcyRIIIb是PMN上表達(dá)的GPI連接受體。FcYRIIIb的遺傳缺陷是存在的，但沒(méi)有或普遍認(rèn)可的表型。FcYlIIbNA1/NA2多晶型現(xiàn)象在同種免疫(isoimmune)嗜中性白細(xì)胞減少癥中是重要的。單克隆抗體技術(shù)和遺傳工程方法已導(dǎo)致人類(lèi)疾病診斷和治療用的免疫球蛋白分子得到快速開(kāi)發(fā)。蛋白質(zhì)工程已被用來(lái)改進(jìn)抗體對(duì)其關(guān)聯(lián)抗原的親和力，減少與所給予的重組多肽的免疫原性有關(guān)的問(wèn)題和改變抗體效應(yīng)子功能。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)適于進(jìn)行重組工程改造，因?yàn)榭乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域和賦予效應(yīng)子功能的結(jié)構(gòu)域可在免疫球蛋白各類(lèi)另'J(辨如IgG、IgA和IgE)和各亞類(lèi)(例如IgGt、IgG2、IgG3和IgG4等)之間交換。另外，已構(gòu)建出更小的免疫球蛋白分子來(lái)克服與完全免疫球蛋白療法有關(guān)的問(wèn)題。例如，單鏈免疫球蛋白可變區(qū)片段多肽(scFv)包含通過(guò)短接頭肽與免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域連接的免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)i或。HustonWAto/.Jcad5W.f/&4，監(jiān):5879-83(1988)。由于scFv分子的尺寸小，它們顯示出非?？焖俚膹难獫{和組織的清除，且與完整的免疫球蛋白相比能夠更有效地滲入到組織中。參見(jiàn)，例如Jain,C""ceri饑^:814s-819s(1990)?？闺狭鰏cFv與相應(yīng)的嵌合抗體相比，顯示出向腫瘤的滲入更快速，遍布肺瘤團(tuán)(tumoriimass)的分布更均勻。Yokotada/.，Ca"cer2:3402-08(1992)。將scFv與另一分子如毒素進(jìn)行融合，是利用scFv的特異性抗原結(jié)合活性和小尺寸來(lái)將毒素遞送到輩巴組織中。Chaudary"a/.，A^w"339:394(1989)和Batra"a/"Mo/.Ce〃.所o/.U:2200(1991)。盡管scFv分子給血清療法帶來(lái)優(yōu)點(diǎn)，這一治療方法還存在幾個(gè)缺點(diǎn)。雖然scFv的快速清除可降低在正常細(xì)胞中的毒性作用，但這種快速清除可能會(huì)阻礙最小有效劑量(minimumeffectivedose)向靶組織的遞送。要制備出足夠量的scFv來(lái)給予患者，這是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性工作，因?yàn)閟cFv表達(dá)和分離上的困難會(huì)對(duì)收率造成不利影響。在表達(dá)過(guò)程中，scFv分子缺乏穩(wěn)定性，往往會(huì)因?yàn)椴煌肿拥目勺儏^(qū)的配對(duì)而發(fā)生聚集。此外，scFv分子在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中的生產(chǎn)水平低下，這限制了有效制備治療用scFv分子的潛在可能。Davisefa/.，《/5Zo/.C/zem.巡:薩0-18(1990)和Traunecker"a/.,￡MWJ.邊:3655-59(1991)。已探索了改進(jìn)生產(chǎn)的策略，包括向可變區(qū)加入糖基化位點(diǎn)。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,888,773和Joste/a/"J所o/.Ozew.巡:26267-73(1994)。使用scFV進(jìn)行治療的另一個(gè)缺點(diǎn)是缺乏效應(yīng)子功能。缺乏細(xì)胞溶解功能、ADCC和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)(這些通常與免疫球蛋白恒定區(qū)有關(guān))的scFv，可能不能有效地治療疾病。盡管scFv技術(shù)的發(fā)展幾乎在二十年前就開(kāi)始了，但目前還沒(méi)有scFv產(chǎn)品4皮批準(zhǔn)用于治療。因此，將毒素與scFv綴合或融合已成為提供強(qiáng)效的抗原特異性分子的另選策略，但是用這種綴合物或嵌合體進(jìn)行投藥往往受到起源于這種制品的毒素部分的過(guò)量和/或非特異性毒性的限制。毒性作用可包括肝臟酶的超生理范圍的升高和血管滲漏綜合征以及其他不需要的作用。另外，免疫毒素本身在給予宿主后具有高度免疫原性，宿主所產(chǎn)生的抗免疫毒素抗體限制了它對(duì)個(gè)體反復(fù)進(jìn)行醫(yī)療性治療的潛在有用性。免疫球蛋白恒定區(qū)相關(guān)效應(yīng)子功能在疾病治療中的好處促進(jìn)了融合蛋白的開(kāi)發(fā)，在所述融合蛋白當(dāng)中存在免疫球蛋白恒定區(qū)多肽序列，而抗體可變區(qū)被非免疫球蛋白序列代替。例如，將CD4這種被HIV識(shí)別的T細(xì)胞表面蛋白與免疫球蛋白Fc效應(yīng)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行重組融合。參見(jiàn)Sensel"a/"Cfem./mww"o/.129-158(1997)。這種分子的IL-2-IgG,融合蛋白能實(shí)現(xiàn)攜帶IL-2受體的細(xì)胞的補(bǔ)體介導(dǎo)裂解。參見(jiàn)同上文獻(xiàn)。使用免疫球蛋白恒定區(qū)來(lái)構(gòu)建這些和其他的融合蛋白，也可賦予改進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)特性。對(duì)于這樣的改進(jìn)的免疫球蛋白衍生結(jié)合蛋白，本領(lǐng)域還存在著未得到滿(mǎn)足的需求，在所述結(jié)合蛋白當(dāng)中，鉸鏈結(jié)構(gòu)域和/或Fc結(jié)構(gòu)域被修飾，以改變一種或多種效應(yīng)子功能，如改變Fc受體結(jié)合親和力和/或特異性(和相關(guān)的ADCC)、結(jié)合蛋白體內(nèi)半壽期和/或補(bǔ)體固定。發(fā)明概迷本發(fā)明通過(guò)提供諸如以下的結(jié)合蛋白來(lái)解決這些和其他相關(guān)的需求，這種結(jié)合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白恒定區(qū)鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，其中該一個(gè)或多個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)域和/或恒定區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域和/或CH3結(jié)構(gòu)域被修飾，以改變一種或多種的結(jié)合蛋白Fc效應(yīng)子功能。本文示例性舉出的是這樣的結(jié)合蛋白，其中免疫球蛋白4交鏈和/或Fc區(qū)被修飾，以實(shí)現(xiàn)對(duì)關(guān)聯(lián)受體(例如Fc受體)的結(jié)合親和力和/或特異性的改變，和/或賦予該Fc區(qū)一種或多種新的結(jié)合特異性，這些新的結(jié)合特異性是相應(yīng)的未修飾結(jié)合蛋白所不具有的(例如對(duì)一種或多種與未修飾結(jié)合蛋白所特異性結(jié)合的關(guān)聯(lián)受體不同的Fc受體的親和力)。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合蛋白包括例如經(jīng)修飾的抗體、抗體片段、重組結(jié)合蛋白和分子工程改造的結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白融合蛋白，包括小模塊免疫藥物產(chǎn)品(SMIPTM產(chǎn)品)在內(nèi)，在這些結(jié)合蛋白當(dāng)中，免疫球蛋白鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)氨基,列被改變。在某些實(shí)施方案中，本文所公開(kāi)的修飾結(jié)合蛋白在負(fù)責(zé)受體結(jié)合親和力和/或特異性的4交鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的變化。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合蛋白，特別是包含一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白被修飾，使得它能以改變了的(即增加了的或降低了的)結(jié)合親和力和/或特異性結(jié)合一種或多種免疫球蛋白特異性Fc受體。本文示例性舉出的是包含一個(gè)或多個(gè)IgG免疫球蛋白重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白被修飾，使得它能以改變了的(即增加了的或降低了的)結(jié)合親和力和/或特異性結(jié)合一種或多種以下IgG免疫球蛋白特異性Fc受體Fc丫RI(CD64);FcyRII(CD32),包括FcyRIIa、FcyRIIb和FcyRIIc在內(nèi)；和/或FcyRIII(CD16),包括FcYRHIa和FcYRIIIb在內(nèi)。這一類(lèi)型的結(jié)合蛋白包括例如這樣的結(jié)合蛋白，其中負(fù)責(zé)FcY-受體結(jié)合的區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)角和/或環(huán)結(jié)構(gòu)中的一級(jí)氨基酸序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入和/或缺失。這種變化包括但不限于在這樣的氨基酸片段(aminoacids)中間和/或近鄰插入和/或缺失一個(gè)或多個(gè)M酸，該氨基酸片段(aminoacids)當(dāng)結(jié)合關(guān)聯(lián)Fc受體時(shí)，會(huì)與一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白特異性Fc受體當(dāng)中的氨基酸發(fā)生直接接觸，所述免疫球蛋白特異性Fc受體包括FcyRI(CD64)、FcyWI(CD32)和/或FcyRIII(CD16)。本發(fā)明這些方面的具體實(shí)施方案包括這樣的結(jié)合蛋白，其包含一個(gè)或多個(gè)IgGCH2結(jié)構(gòu)域，其中該CH2結(jié)構(gòu)域是IgG!和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域。一些這類(lèi)實(shí)施方案提供了這樣的結(jié)合蛋白，其在IgGi和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域的鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)L-L-G-G-P當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或氨基酸插入。本文具體示例性舉出的是這樣的結(jié)合蛋白，其在以下鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)當(dāng)中"*"所示的位置處包含單個(gè)氨基酸的單一插入。因此，本文提供包含經(jīng)修飾的鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)L-L-*-G-G-P、L-L-G-*-G-P和L-L-G-G-*-P的結(jié)合蛋白。本文還提供這樣的結(jié)合蛋白，其在鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)L-L-*-G-G-P、L-L-G-、G-P和L-L-G-G-*-P當(dāng)中"*"所示的位置處包含兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的單一插入。因此，在這些實(shí)施方案當(dāng)中，"*"表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。通常，適用于產(chǎn)生具有這種經(jīng)修飾的4交鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合蛋白的氨基酸選自Ala、Gly、Ile、Leu和VaI。其他這類(lèi)實(shí)施方案提供這樣的結(jié)合蛋白，其包含一個(gè)或多個(gè)IgGCH2結(jié)構(gòu)域，其中該CH2結(jié)構(gòu)域是IgG,、IgG2和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域。一些這類(lèi)實(shí)施方案提供了這樣的結(jié)合蛋白，其在IgG、IgG2和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域的BC環(huán)結(jié)構(gòu)D-V-S-H-E當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或氨基酸插入。本文具體示例性舉出的是這樣的結(jié)合蛋白，其在以下BC環(huán)結(jié)構(gòu)當(dāng)中"*，，所示的位置處包含單個(gè)氨基酸的單一插入。因此，本文提供包含經(jīng)修飾的BC環(huán)結(jié)構(gòu)D-V-*-S-H-E和D_V_S-*-H-E的結(jié)合蛋白。本文還提供這樣的結(jié)合蛋白，其在BC環(huán)結(jié)構(gòu)D-V-、S-H-E和D-V-S-、H-E當(dāng)中"*"所示的位置處包含兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的單一插入。因此，在這些實(shí)施方案當(dāng)中，"*"表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。通常，適用于產(chǎn)生具有這種經(jīng)修飾的BC環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合蛋白的氨基酸選自Ala、Gly、Ile、Leu和Val。另外其他這類(lèi)實(shí)施方案提供這樣的結(jié)合蛋白，其包含一個(gè)或多個(gè)IgGCH2結(jié)構(gòu)域，其中該CH2結(jié)構(gòu)域是IgA和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域。一些這類(lèi)實(shí)施方案提供了這樣的結(jié)合蛋白，其在CH2結(jié)構(gòu)域的FG環(huán)結(jié)構(gòu)A-L-P-A-P-I當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或M酸插入。本文具體示例性舉出的是這樣的結(jié)合蛋白，其在以下FG環(huán)結(jié)構(gòu)當(dāng)中"*，，所示的位置處包含單個(gè)氛基酸的單一插入。因此，本文提供包含經(jīng)修飾的FG環(huán)結(jié)構(gòu)A-L-*-P-A-P-I、A-L-P-*-A-P-I和A-L-P-A-*-P-I的結(jié)合蛋白。本文還提供這樣的結(jié)合蛋白，其在FG環(huán)結(jié)構(gòu)A-L-*-P-A-P-I、A-L-P-*-A-P-I和A-L-P-A-*-P-I當(dāng)中"*，，所示的位置處包含兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的單一插入。因此，在這些實(shí)施方案當(dāng)中，"*"表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。通常，適用于產(chǎn)生具有這種經(jīng)修飾的FG環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合蛋白的氨基酸選自Ala、Gly、Ile、Leu和Val。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合蛋白，特別是包含一個(gè)或多個(gè)重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白在該一個(gè)或多個(gè)重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)修飾，其中該修飾包括插入一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化序列和/或一個(gè)或多個(gè)O-連接糖基化序列，該糖基化序列足以實(shí)現(xiàn)在插入位置處的N-連接和/或O-連接糖基化，從而改變(即提高或降低)結(jié)合蛋白與一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白特異性Fc受體的結(jié)合親和力和/或特異性。這類(lèi)結(jié)合蛋白包括例如在一級(jí)氨基f^列中這樣的位置處包含變化的結(jié)合蛋白，該位置處在負(fù)責(zé)未修飾結(jié)合蛋白的糖基化的區(qū)域、結(jié)構(gòu)域和/或環(huán)結(jié)構(gòu)的近側(cè)和/或遠(yuǎn)側(cè)。本文示例性舉出的是這樣的結(jié)合蛋白，其包含一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，其中該結(jié)合蛋白在該一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)修飾，其中該修飾包括插入一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化序列和/或一個(gè)或多個(gè)O-連接糖基化序列，該糖基化序列足以實(shí)現(xiàn)在插入位置處的N-連接和/或0-連接糖基化,從而改變(即提高或降低)結(jié)合蛋白與一種或多種以下IgG免疫球蛋白特異性受體的結(jié)合親和力和/或特異性FcyRI(CD64);FcyRII(CD32)，包括FcyRIIa、FcyRIIb和FcyRIIc在內(nèi)；和/或FcyRIII(CD16)，包括FcYRffla和FcYRIIIb在內(nèi)，所述改變是相比于包含一個(gè)或多個(gè)未修飾的IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)結(jié)合蛋白而"f"。本發(fā)明這些方面的具體實(shí)施方案包括這樣的結(jié)合蛋白，其包含一個(gè)或多個(gè)IgG鉸一隨結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)IgGCH2結(jié)構(gòu)域和/或一個(gè)或多個(gè)IgGCH3結(jié)構(gòu)域，其中該鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域是IgG鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，IgG2鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，IgG3鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域和/或IgG^吏鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域。一些這類(lèi)實(shí)施方案提供了包含這樣的插入的結(jié)合蛋白，該插入是在相應(yīng)的天然IgG免疫球蛋白鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中的N-連接和/或0-連接糖基化位點(diǎn)的近側(cè)(proximal)和/或遠(yuǎn)側(cè)(dista1),插入一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化序列N-X-(S/T)(其中X為任何氨基酸)和/或一個(gè)或多個(gè)O-連接糖基化序列X-P-X-X(其中至少一個(gè)X為T(mén))、T-X-X-X(其中至少一個(gè)X為T(mén))、X-X-T-X(其中至少一個(gè)X為R或K)和/或S-X-X-X(其中至少一個(gè)X為S))。在這些實(shí)施方案的某些方面當(dāng)中，結(jié)合蛋白顯示出改變了的(即提高了的或降低了的)FcyR結(jié)合親和力和/或特異性。本文示例性舉出的是這樣的實(shí)施方案，其中結(jié)合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)IgG鉸鏈結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)IgGCH2結(jié)構(gòu)域和/或一個(gè)或多個(gè)IgGCH3結(jié)構(gòu)域，且其中結(jié)合蛋白還包含一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化序列N-X-(S/T)(其中X為任何氨基酸)的插入。例如，本發(fā)明提供包含這樣的插入的結(jié)合蛋白，該插入是在接近一個(gè)或多個(gè)IgGpIgG2、IgG3和/或IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的DE環(huán)當(dāng)中的天然N-S-T序列處，插入一個(gè)或多個(gè)N-X-(S/T)序列。在這些實(shí)施方案的某些方面當(dāng)中，結(jié)合蛋白顯示出改變了的(即提高了的或降低了的)FcYR結(jié)合親和力和/或特異性。在具體的這類(lèi)實(shí)施方案當(dāng)中，一個(gè)或多個(gè)IgG"IgG2、IgG3和/或IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的DE環(huán)當(dāng)中的N-連接糖基化序列包含氨基酸序列N-S-T，并被插入到距天然N-S-T序列的氨基末端和/或羧基末端0-100個(gè)氨基酸的近鄰(adjacent)或當(dāng)中，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z被修飾成(AAa)-N-S-T-(AAb)-N-S-T-(AAC)，其中AAa、AAb和AAe每一個(gè)獨(dú)立地從1-100個(gè)氨基酸指定。在具體的這類(lèi)實(shí)施方案當(dāng)中，一個(gè)或多個(gè)IgGpIgG2、IgG3和/或IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的DE環(huán)當(dāng)中的N-連接糖基化序列包含氨基酸序列N-S-T,并被插入到天然N-S-T序列的近鄰，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z被修飾成17X匿N(xiāo)-S-T-Z-N-S-T-Z,其中X和Z獨(dú)立選自Tyr(Y)和Phe(F)。在另選的這類(lèi)實(shí)施方案當(dāng)中，插入在一個(gè)或多個(gè)IgGpIgG2、IgG3和/或IgG4CH3結(jié)構(gòu)域的BC環(huán)當(dāng)中的N-連接糖基化序列包含氨基酸序列N-S-T,并被插入到天然N-S-T序列的遠(yuǎn)側(cè)，使得天然氨基酸序列Y-P-S-D-I-A被修飾成Y-P-N-S-T-D-I-A和Y-N-S-T-P-S-D-I-A。在還進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供結(jié)合蛋白，特別是包含第一免疫球蛋白類(lèi)別(即IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的一個(gè)或多個(gè)重鏈4交鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白在第一免疫球蛋白類(lèi)別的一個(gè)或多個(gè)重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的一級(jí)氨基酸序列中被修飾(即氨基酸替代(replacement)和/或氨基酸插入)，以產(chǎn)生能夠結(jié)合與第一免疫球蛋白類(lèi)別不同的第二免疫球蛋白類(lèi)別的一個(gè)或多個(gè)關(guān)聯(lián)Fc受體的結(jié)合蛋白。這種變化包括例如用第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)環(huán)或其氨基酸和/或肽部分來(lái)替代和/或重塑(remodeling)第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)環(huán)或其氨基酸和/或肽部分，其中第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)這樣的氨基酸，這些氨基酸能形成第二免疫球蛋白特異性Fc受體的結(jié)合序列的至少一部分。根據(jù)本發(fā)明這些方面的結(jié)合蛋白除了能夠特異性結(jié)合FcyRI、FcyRH和/或FcyRIII外，還能夠特異性結(jié)合FcaR。本文示例性舉出的是包含一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白被修飾成能結(jié)合一個(gè)或多個(gè)非IgG免疫球蛋白特異性Fc受體，包括但不限于IgA免疫球蛋白特異性受體FcaR(CD89)。這類(lèi)結(jié)合蛋白包括例如這樣的結(jié)合蛋白，其在一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的一級(jí)氨基酸序列中包含變化(即氨基酸替代和/或氨基酸插入)，以產(chǎn)生能夠結(jié)合非IgG免疫球蛋白特異性Fc受體如結(jié)合Fca受體的氨基酸序列。在某些這類(lèi)實(shí)施方案當(dāng)中提供的是包含一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白被修飾成能結(jié)合IgA免疫球蛋白特異性受體FcaR(CD89)。這類(lèi)示例性結(jié)合蛋白18在IgGCH3FG環(huán)當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換(substitution)和/或在lgGCH3CD環(huán)當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換。例如，一種這類(lèi)示例性結(jié)合蛋白包含這樣的替代，該替代是用包含氨基酸序列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgACH3FG環(huán)或其相應(yīng)部分替代包含氨基斷列C-S畫(huà)V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q的IgGCH3FG環(huán)或其相應(yīng)部分。另一種示例性結(jié)合蛋白包含這樣的替代，該替代是用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgACH3CD環(huán)或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgGCH3CD環(huán)或其部分。又一種這類(lèi)示例性結(jié)合蛋白包含這樣的替代，該替代是用包含氨基酸序列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgACH3FG環(huán)或其相應(yīng)部分替代包含氨基齊^列C-S-V腸M-H-E-A畫(huà)L-H-N-H-Y畫(huà)T-Q的IgGCH3FG環(huán)或其部分，和用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgACH3CD環(huán)或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgGCH3CD環(huán)或其部分。任何上述結(jié)合蛋白實(shí)施方案可進(jìn)一步包含這樣的置換，該置換是用氨基酸Leu置換IgG重鏈CH3氨基酸Met(在序列K-D-T-L-M-I-S-R-T當(dāng)中CH3氨基酸位置28)，使得該結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含M酸序列K-D-T-L-L-I-S-R-T?；蛘呋蛄硗猓魏紊鲜鼋Y(jié)合蛋白實(shí)施方案可進(jìn)一步包含這樣的置換，該置換是用氨基酸Arg置換IgG重鏈CH3氨基酸Glu(在序列D-I-A-V-E-W-E-S-N當(dāng)中CH3氨基酸位置157)，使得該結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含氨基酸序列D-I-A-V-R-W-E-S-N。本發(fā)明的這些和其他方面在參閱以下詳細(xì)說(shuō)明和附圖后將變得顯而易見(jiàn)。本文無(wú)論在上文或下文中引用到的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)，都通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。附圖和序列標(biāo)識(shí)符的簡(jiǎn)述圖1顯示IgG結(jié)構(gòu)域與IgACH2結(jié)構(gòu)域的比對(duì)。圖2顯示野生型IgGCH2-CH3區(qū)域與這個(gè)區(qū)域的三個(gè)示例性修飾的比對(duì)，所述修飾適合于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合蛋白。圖3顯示IgAl、IgA2、IgM、IgG2、IgG2、IgG2、IgG2和IgE的CH2和CH2區(qū)域與相應(yīng)的免疫球蛋白環(huán)的比對(duì)。(見(jiàn)Herrefa/.，胸群堅(jiān):614-620(2003》。SEQIDNO:1是人IgA,鉸鏈區(qū)的氨基酸序列(VPSTPPTPSPSTPPTPSPS)。SEQIDNO:2是人IgA!CH2區(qū)的氨基酸序列KTPLTATLSKS)。SEQIDNO:3是人IgAiCH3區(qū)的氨基酸序列SEQIDNO:4是人IgA2鉸鏈區(qū)的氨基財(cái)列(VPPPPP)。SEQIDNO:5是人IgA2CH2區(qū)的氨基酸序列KTPLTANITKS)。SEQIDNO:6是人IgA2CH3區(qū)的氨基酸序列SEQIDNO:7是人IgD鉸鏈區(qū)的氨基酸序列KEKEEQEERETKTP)。SEQIDNO:8是人IgDCH2區(qū)的氨基酸序列TCTLNHPSLPPQRLMALREP)。SEQIDNO:9是人IgDCH3區(qū)的氨基酸序列HEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK)。SEQIDNO:10是人IgECH2區(qū)的氨基酸序列VTYQGHTFEDSTKKCA)。SEQIDNO:11是人IgECH3區(qū)的氨基酸序列THPHLPRALMRSTTKTS)。SEQIDNO:12是人IgECH4區(qū)的氨基酸序列HEAASPSQTVQRAVSVNPGK)。SEQIDNO:13是人(EPKSCDKTHTCPPCP)。SEQIDNO:14是人IgGi鉸鏈區(qū)的氨基酸序列igGicm區(qū)的氨基酸序列(APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNKCKVSNKALPAP正KTISKAK)。SEQIDNO:15是人IgG!CH3區(qū)的氨基酸序列21ALHNHYTQKSLSLSPGK)。SEQIDNO:16是人IgG2鉸鏈區(qū)的氨基酸序列(ERKCCVECPPCP)。SEQIDNO:17是人IgG2CH2區(qū)的氨基酸序列KCKVSNKGLPAPIEKTISKTK)。SEQIDNO:18是人IgG2CH3區(qū)的氨基酸序列EALHNHYTQKSLSLSPGK)。SEQIDNO:19是人IgG3鉸鏈區(qū)的氨基酸序列EPKSCDTPPPCPRCP)。SEQIDNO:20是人IgG3CH2區(qū)的氨基酸序列KCKVSNKALPAP正KTISKTK)。SEQIDNO:21是人IgG3CH3區(qū)的氨基酸序列ALHNRFTQKSLSLSPGK)。SEQIDNO:22是人IgG4鉸鏈區(qū)的氨基酸序列(ESKYGPPCPSCP)。SEQIDNO:23是人IgG4CH2區(qū)的氨基酸序列KCKVSNKGLPSS正KTISKAK)cSEQIDNO:24是人IgG4CH3區(qū)的氨基酸序列ALHNHYTQKSLSLSLGK)。SEQIDNO:25是人IgMCH2區(qū)的氨基酸序列TCRVDHRGLTFQQNASSMCVP)。SEQIDNO:26是人IgMCH3區(qū)的氨基酸序列GEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPK)。SEQIDNO:27是人IgMCH4區(qū)的氨基酸序列SEQIDNO:28是本文稱(chēng)為Bci-IForward的寡核苷酸引物的核苷酉吏序歹寸(ttcttctgateaggagcccaaat)。SEQIDNO:29是本文稱(chēng)為Sac-IIReverse的寡核苷酸引物的核苷酸序列(GCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGG)。SEQIDNO:30是本文稱(chēng)為L(zhǎng)iblA一Fl的寡核苷酸引物的核苷^歹寸(ttcttctgateaggagcccaaatettctgacaaaacteacacatetoeaccgtgcccag)。SEQIDNO:31是本文稱(chēng)為L(zhǎng)iblA_F2的寡核苷酸引物的核苷酸序歹寸(gggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatetcccgga)。SEQIDNO:32是本文稱(chēng)為L(zhǎng)iblA一F3的寡核苷酸引物的核苷酸序歹寸(tgtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcg)。SEQIDNO:33是本文稱(chēng)為L(zhǎng)iMA—Rl的寡核香酸引物的核普酸序列(AGAGGAAGACTGACGGTCCACCNWNCAAGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGAGATGTGT)。SEQIDNO:34是本文稱(chēng)為L(zhǎng)iblA一R2的寡核普酸引物的核普酸GGGTCCGGGAGATCATGAGGGTGT)。SEQIDNO:35是本文稱(chēng)為L(zhǎng)iblA_R3的寡核苷酸引物的核苷酸序列(GCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTATGCACCTCCACGCCGTCCACGTACCAGTTGA)。SEQIDNO:36是本文稱(chēng)為L(zhǎng)iblB一F2的寡核芬酸引物的核苷酸序歹寸(wggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatetcccgga)。SEQIDNO:37是本文稱(chēng)為L(zhǎng)iblB—Rl的寡核普酸引物的核香酸序列(AGAGGAAGACTGACGGTCCNWNACCCAAGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGAGATGTGT)。SEQIDNO:38是本文稱(chēng)為L(zhǎng)iblC—F2的寡核苷酸引物的核苷^歹寸(gnwnccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatetcccgga)。SEQIDNO:39是本文稱(chēng)為L(zhǎng)iblC一Rl的寡核苷酸引物的核苷酸序列(AGAGGAAGACTGACGG麗NTCCACCCAAGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGAGATGTGT)。SEQIDNO:40是本文稱(chēng)為L(zhǎng)ib2A一F2的寡核苷酸引物的核苷酸序歹寸(gecgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatetcccggaccc)。SEQIDNO:41是本文稱(chēng)為L(zhǎng)ib2A一F3的寡核苷酸引物的核苷斷歹寸(tgtggacgtgnwnagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggaeggcg)。SEQIDNO:42是本文稱(chēng)為L(zhǎng)ib2A_Rl的寡核苦酸引物的核普酸序歹'J(GGAAGAGGAAGACTGACGGTCCACCCAAGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGAGATGTGT)。SEQIDNO:43是本文稱(chēng)為L(zhǎng)ib2A一R2的寡核苷酸引物的核普酸CAGGGGTCCGGGAGATCATGAGG)。SEQIDNO:44是本文稱(chēng)為L(zhǎng)ib2B—F3的寡核苷酸引物的核苷酸序歹寸(tgtggacgtgagcnwncacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggaeggcg)。SEQIDNO:45是本文稱(chēng)為L(zhǎng)ib2B—R2的寡核苦酸引物的核苦酸序列(CGTGNWNGCTCACGTCCACCACCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGGGAGATCATGAGGG)。SEQIDNO:46是本文稱(chēng)為lib3A-F的寡核普酸引物的核苷酸序列(gtctecaacaaagecnwnetcccageccccatc)。SEQIDNO:47是本文稱(chēng)為lib3A-R的寡核苷酸引物的核苷酸序SEQIDNO:48是本文稱(chēng)為L(zhǎng)ib3B-F的寡核苷酸引物的核苷^歹'J(cccaacaaagecetcnwnccageccccategag)。SEQIDNO:49是本文稱(chēng)為L(zhǎng)ib3B-R的寡核苦酸引物的核苷,SEQIDNO:50是本文稱(chēng)為L(zhǎng)ib3C-F的寡核苷酸引物的核苷酸序歹寸(cacaaagecetcccanwngeccccategagaaaac)。SEQIDNO:51是本文稱(chēng)為L(zhǎng)ib3C-R的寡核苷酸引物的核苷酸序SEQIDNO:52是本文稱(chēng)為Fl—verl的寡核苷酸引物的核苷酸序歹'J(cagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagetgaccaagaaccagg)。SEQIDNO:53是本文稱(chēng)為F2_verl的寡核苷酸引物的核苷酸序列(agettctatccaagegacategccgtgcgttgggagageaatgggcaggagctgccg)。SEQIDNO:54是本文稱(chēng)為F3一verl的寡核苦酸引物的核苷^列(ccccgtgetggaetccgaeggetccttcttcctetacagcaagetcaccgtggaSEQIDNO:55是本文稱(chēng)為F4-_verl的寡核普酸引物的核香酸序歹ll(gettctcctgcatggtgatgcatgaggetctgccactegcctteacgcagaagagcc)。SEQIDNO:56是本文稱(chēng)為Rl_verl的寡核苦酸引物的核苷酸序列(tgcttggatagaagectttgaccaggcaggteaggctgacctggttcttggteagct)。SEQIDNO:57是本文稱(chēng)為R2—verl的寡核苷酸引物的核苷酸序列(cgagtccagcacgggaggcgtggtcttgtagttgttetceggcagetcctgcccatt)。SEQIDNO:58是本文稱(chēng)為R3—verl的寡核苷酸引物的核苷酸序歹'J(cccatgcaggagaagacgttcccctgctgccacctgetcttgtecacggtgagettg)。SEQIDNO:59是本文稱(chēng)為R4—verl的寡核苷酸引物的核苷酸序歹'J(cgctataatetagatcatttacccggagacagggagaggetcttctgcgtgaagg)。SEQIDNO:60是本文稱(chēng)為short-F的寡核苷酸引物的核苷,列(cagaaccacaggtgtacaccctgccc》SEQIDNO:61是本文稱(chēng)為short-R的寡核苷酸引物的核苷酸序列(cctataatetagateatttacc)。SEQIDNO:62是本文稱(chēng)為F4—ver2的寡核苷酸引物的核苷^列(gtcttctectgcatggtgggccacgaggccctgccgctggccttcacacagaagacca)。SEQIDNO:63是本文稱(chēng)為R4一ver2的寡核苷酸引物的核苷酸序歹ll(cgctataatetagatcatttacccgccaageggtegatggtcttctgtgtgaagg)。26SEQIDNO:64是本文稱(chēng)為F2一ver3的寡核苷酸引物的核苷酸序列(aggcttetatecaagcgacatcgccgttegctggetgcaggggtcacaggagetgecc)。SEQIDNO:65是本文稱(chēng)為R2—ver3的寡核苷酸引物的核苷酸序列(cgagtccagcacgggaggcgtggtcttgtacttetcgcggggcagetcctgtgaccc)。發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明提供包含一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白恒定區(qū)鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該一個(gè)或多個(gè)鉸鏈區(qū)和/或恒定區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域和/或CH3結(jié)構(gòu)域^L修飾，以改變?cè)摻Y(jié)合蛋白的一個(gè)或多個(gè)Fc效應(yīng)子功能。本文示例性舉出的是這樣的結(jié)合蛋白，其中免疫球蛋白鉸鏈Fc區(qū)被修飾，以實(shí)現(xiàn)對(duì)關(guān)聯(lián)受體(例如Fc受體)的結(jié)合親和力和/或特異性的改變，和/或賦予該Fc區(qū)一種或多種新的結(jié)合特異性，這些新的結(jié)合特異性是相應(yīng)的未〗奮飾結(jié)合蛋白所不具有的(例如對(duì)一種或多種與未修飾結(jié)合蛋白所特異性結(jié)合的關(guān)聯(lián)受體不同的Fc受體的親和力)。具體的說(shuō)，本文公開(kāi)的經(jīng)修飾結(jié)合蛋白包括以下(1)包含這樣的插入的結(jié)合蛋白，該插入是在免疫球蛋白鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其中該免疫球蛋白顯示出改變了的(即提高了的或降低了的)對(duì)一種或多種以下受體的結(jié)合親和力和/或特異性FcyRI(CD64);FcyRII(CD32)，包括FcyRIIa、FcyRIIb和FcyRIIc在內(nèi)；和/或FcyRIII(CD16),包括Fc丫RIIIa和Fc丫RIIIb在內(nèi)；(2)包含這樣的插入的結(jié)合蛋白，該插入是在相應(yīng)的天然免疫球蛋白Fc區(qū)中的N-連接和/或O-連接糖基化位點(diǎn)的近側(cè)和/或遠(yuǎn)側(cè)，插入一個(gè)或多個(gè)N-連接和/或O-連接糖基化序列(例如一個(gè)或多個(gè)N-連接N-X-(S/T)糖基化序列和/或一個(gè)或多個(gè)O-連接X(jué)-P-X-X(其中至少一27個(gè)X為T(mén))、T-X-X-X(其中至少一個(gè)X為T(mén))、X-X-T-X(其中至少一個(gè)X為R或K)和S-X-X-X(其中至少一個(gè)X為S)),其中該結(jié)合蛋白顯示出改變了的(即提高了的或降低了的)FcyR結(jié)合親和力和/或特異性；和(3)包含這樣的插入和/或替代的結(jié)合蛋白，該插入和/或替代是在IgG免疫球蛋白CH2區(qū)和/或CH3區(qū)當(dāng)中插入和/或替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其中該氨基酸插入和/或替代包含一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)于IgA免疫球蛋白CH2區(qū)和/或CH3區(qū)的氨基酸，其中IgA免疫球蛋白CH2區(qū)和/或CH3區(qū)的該一個(gè)或多個(gè)氨基酸參與IgA免疫球蛋白與其關(guān)聯(lián)Fca受體的特異性結(jié)合，且其中該經(jīng)修飾的結(jié)合蛋白能夠特異性結(jié)合FcaR。本發(fā)明這些實(shí)施方案的每一個(gè)在下文中都有更詳細(xì)的描述。本發(fā)明的實(shí)施要采用到落入技術(shù)人員技能范圍內(nèi)的免疫學(xué)、分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)常規(guī)方法，除非另有指明。許多這些方法出于說(shuō)明的目的在下文中進(jìn)行描述。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的闡述。參見(jiàn)例^口Sambrook，""MolecularCloning:ALaboratoryManual"(2ndEdition,1989);"DNACloning:APracticalApproach,vol.I&II"(D.Glover,ed);"OligonucleotideSynthesis"(N.Gait,<1984);"NucleicAcidHybridization"(B.Hames和S.Higgins，e血，1985);Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning"(1984);Ausubel"<a/.，"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(NewYork,JohnWileyandSons,1987);Bonifacinoda/.，"CurrentProtocolsinCellBiology"(NewYork,JohnWiley&Sons,1999);Coligana/""CurrentProtocolsinImmunology"(NewYork,JohnWiley&Sons,1999);Harlow和Lane<3丄aZorato^yMawwa/ColdSpringHarborLaboratory(1988);.k乂及Lo,Ed.，"AntibodyEngineering:MethodsandProtocols,"Part1(HumanaPress,Totowa,NewJersey,2004)。產(chǎn)生兩類(lèi)突變的技術(shù)是本々頁(yè)i或7^知的。例如，特異性突變可4吏用如Sambrook""/.，"ProtocolsinMolecularBiology,"(出處同上)中所述的位點(diǎn)特異性誘變來(lái)引入。特定區(qū)域中的隨機(jī)突變可使用例如Gulick和Fahl，TVoc.Ato/.JcadOSL4，22:8140-8144(1995)中所述的強(qiáng)制進(jìn)化來(lái)引入。定義本文所用的術(shù)語(yǔ)"結(jié)合蛋白"是指包含一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。"結(jié)合蛋白"包括且最優(yōu)選是免疫球蛋白如抗體或其生物或功能等同物，包括它們的部分、片段、前體形式、衍生物、變體和遺傳工程改造形式，包括用化學(xué)物質(zhì)和/或放射性同位素等進(jìn)行標(biāo)記。"結(jié)合蛋白"包括但不限于"免疫球蛋白"、"抗體"、"單克隆抗體"、"嵌合抗體"、"人源化抗體"和"小模塊免疫藥物產(chǎn)品(即SMIP頂產(chǎn)品)，其中免疫球蛋白鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列被改變。在某些實(shí)施方案當(dāng)中，本文所公開(kāi)的經(jīng)修飾結(jié)合蛋白在負(fù)責(zé)受體結(jié)合親和力和/或特異性的鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的改變。術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白，，和"抗體"廣義地包括所有類(lèi)別和亞類(lèi)的抗體，包括IgM、IgD、IgG"IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgAi和IgA2在內(nèi)。術(shù)語(yǔ)"抗體，，包括本文所用的"單克隆抗體"，是指從基本上均勻的抗體的群體獲得的抗體，所述基本上均勻的抗體即是指，構(gòu)成該群體的各單個(gè)抗體除了基本上不會(huì)影響抗體結(jié)合特異性、親和力和/或活性的自然突變之外是相同的。"單克隆抗體"包招Y旦不限于非人單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體和完全人單克隆抗體以及它們的生物或抗原結(jié)合片段和/或部分。本文所用的術(shù)語(yǔ)"嵌合抗體"是指包含這樣的重鏈和輕鏈的單克隆抗體分子，在重鏈和輕鏈中非人抗體可變結(jié)構(gòu)域與人恒定結(jié)構(gòu)域發(fā)生可操作地融合(operablyflised)。嵌合抗體與親本的完全非人單克隆抗體相比顯示出減低的免疫原性。本文所用的術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"是指這樣的單克隆抗體，其包含一個(gè)或多個(gè)非人互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、人可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)(FR)和人重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(如IgG,、IgG2、IgG3和IgG4重鏈恒定結(jié)構(gòu)域)和人輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(如IgLambda和IgKappa輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"意指包括這樣的人單克隆抗體(受方抗體(recipientantibody)),其中受方的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來(lái)自非人物種(如小鼠、大鼠或兔等的供方抗體(donorantibody))的具有所需特異性、親和力和容量(capacity)的CDR的殘基所替代。在一些情況中，人抗體的可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架殘基被相應(yīng)的非人殘基所替代。人源化抗體還可包含既不存在于受方抗體也不存在于所輸入的CDR序列或構(gòu)架序列的殘基。使非人抗體人源化的方法是本領(lǐng)域公知的。通常，人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)從非人來(lái)源《1入到其中的M酸殘基。人源化可以這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)將CDRs嫁接到人支撐性(supporting)FR中，然后與適當(dāng)?shù)娜丝贵w恒定結(jié)構(gòu)域融合。參見(jiàn)Jones"a/.,A^wre2!i:522-525(1986);Riechmann"a/.，iVafwe巡:323-327(1988);和Verhoeyenefa/"Sc/認(rèn)e塑:1534-1536(l訴8)。本文所用的術(shù)語(yǔ)"完全人抗體，，是指除了包含人構(gòu)架和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)的免疫球蛋白。這種抗體可用多種本領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。例如，噬菌體展示方法已有描述，按該方法，人抗體片段的重組文庫(kù)祐濃示在嗟菌體上。參見(jiàn)McCafferty"a/.,Atoww348:552-554(1990);Hoogenboom和Winter,/Mo/.所o/.222:381(1991);和Marksefa/.，丄Mo/.5!'o/.巡:581(1991)?；蛘?，"完全人抗體，，還可在這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中制備，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包含人免疫球蛋白抗體庫(kù)(immunoglobulinrepertoire)和用以實(shí)現(xiàn)基因重排和免疫球蛋白裝配的機(jī)制(machinery)。使用雜交瘤技術(shù)，可生產(chǎn)和選擇出具有所需特異性的抗原特異性完全人抗體。一種示例性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)是Green"/.，7V^we差^""2:13-21(1"4)所描述的XenoMouse⑧品系。該XenoMouse⑧品系經(jīng)遺傳工程法引入了這樣的酵母人工染色體(YACs)，它含有人重鏈基因座和kappa輕鏈基因座的分別245kb和190kb的種系構(gòu)形片段(germlineconfigurationfragment),這些片段含有核心可變區(qū)序列和恒定區(qū)序列。含有人Ig的YACs在抗體的重排和表達(dá)方面與小鼠系統(tǒng)是相容的，能夠置換不活化的小鼠Ig基因。更近一^R時(shí)間，Mendez等人描述了將大約80%的人抗體庫(kù)(antibodyrepertoire)作為人重鏈基因座和kappa輕鏈基因座的兆堿基種系構(gòu)形YAC片段來(lái)引入。iVafwe差西"cs11:146-156(1997)。適合于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的完全人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)，還在以下專(zhuān)利和文章中有描述美國(guó)專(zhuān)利6,150,584;5，545，807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016以及Jakobavits,De"viev.21:33-42(1998);Marks"傷0/Tec/2"0/0gy邊:779-783(1992);Lonberg"a/"iV^wre巡:856-859(1994);Morrison,7V"/w"巡:812畫(huà)13(1994);Fishwildda/"脂,5/她c/wo/ogyM:845-51(1996);Neuberger，7Vaft^e萬(wàn)/otec/z"o/ogy14:826(1996);和Lonberg和Huszar，/Weni/mww"o/,U:65-93(1995)。(minilod)",籍此通過(guò)并入Ig基因座的各個(gè)基因片^:來(lái)模擬外源Ig基因座。因此，將一個(gè)或多個(gè)Vh基因、一個(gè)或多個(gè)Dh基因、一個(gè)或多個(gè)Jh基因、mu恒定區(qū)和第二恒定區(qū)(通常是gamma恒定區(qū))形成為構(gòu)建物以供插入到動(dòng)物中。這個(gè)方法在以下專(zhuān)利和文章中有描述Surani等人的美國(guó)專(zhuān)利5,545,807(MedicalResearchCouncil)及Lonberg和Kay的美國(guó)專(zhuān)利5,545,806和5,625，825(GenPharmInternational,Inc.)以及Taylor"a/"她鹿"o"a//畫(huà)w"o/ogy6:579-591(1994);Chenda/.，/"ter打ariowaZ/wwwwo/ogy5:647-656(1993);Tuaillon"/.，fVoc.iVa".」ca<i.巡:3720-3724(1993);Tuaillon"a/"J!/mww"o/.Ji4:6453掘5(1995);Choi"a/.油詢(xún)G認(rèn)^y4:117-123(1993);Lonberga/.，iV加we巡:856-859(1994);和TaylorTVwc/eZcjc^fei"逃:6287-6295(1992)。人抗體能避免某些與具有小鼠或大鼠可變區(qū)和/或恒定區(qū)的抗體有關(guān)的問(wèn)題。這種小鼠或大鼠衍生的序列的存在會(huì)導(dǎo)致抗體被快速清除，或者會(huì)導(dǎo)致患者產(chǎn)生對(duì)該抗體的免疫反應(yīng)。因此，完全人抗體的使用在慢性和復(fù)發(fā)性人類(lèi)疾病的治療方面可提供極大的優(yōu)點(diǎn)，所述人類(lèi)疾病例如炎癥，自身免疫性和癌癥，需要反復(fù)給予抗體來(lái)治療。本文所用的術(shù)語(yǔ)"小模塊免疫藥物產(chǎn)品"(SMIPTM產(chǎn)品)是指具有比單克隆抗體和重組抗體增強(qiáng)的藥物特性的高度模塊化化合物類(lèi)別。SMIP產(chǎn)品包含這樣的單一多肽鏈，其包括基于例如抗體可變結(jié)構(gòu)域的耙標(biāo)特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與之組合的可變FC區(qū)，該可變FC區(qū)使得可以特異性募集所需類(lèi)別的效應(yīng)細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞)和/或募集補(bǔ)體介導(dǎo)的殺滅作用。取決于所選的靶標(biāo)和鉸鏈區(qū)，SMIP產(chǎn)品能通過(guò)細(xì)胞表面受體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本文所用的稱(chēng)為"小模塊免疫藥物產(chǎn)品"或"SMIPTM產(chǎn)品"的基因工程化融合蛋白，是如共同擁有的美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)說(shuō)明書(shū)2003/133939、2003/0118592和2005/0136049及共同擁有的國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)說(shuō)明書(shū)WO02/056910、WO2005/037989和WO2005/017148中所描述，每個(gè)這些專(zhuān)利公開(kāi)說(shuō)明書(shū)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合蛋白被修飾以改變它們的效應(yīng)子功能，使得它們能以提高了的或降低了的親和力和/或特異性結(jié)合(a)—種或多種關(guān)聯(lián)Fc受體和/或(b)—種或多種非關(guān)聯(lián)Fc受體。結(jié)合蛋白如果以可檢測(cè)的水平(在例如ELISA測(cè)定當(dāng)中)與靶關(guān)聯(lián)受體發(fā)生反應(yīng)，但在類(lèi)似的條件下與無(wú)關(guān)的多肽不發(fā)生可檢測(cè)的反應(yīng)，則它就能夠"特異性結(jié)合"關(guān)聯(lián)或非關(guān)聯(lián)受體。在這個(gè)情形中所用的"特異性結(jié)合"通常是指抗體Fc區(qū)與抗體Fc區(qū)的特異性受體之間出現(xiàn)的那類(lèi)非共價(jià)相互作用。"特異性結(jié)合，，相互作用的強(qiáng)度或親和力可用相互作用的解離常數(shù)(Kd)來(lái)表示，其中Kd越小代表親和力越大。結(jié)合特性可用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行定量。一種這樣的方法需要測(cè)量靶標(biāo)特異性結(jié)合蛋白/Fc受體復(fù)合物形成(即締合)和解離的速度，其中這些速度取決于復(fù)合物各方的濃度、相互作用的親和力，和取決于對(duì)締合和解離這兩個(gè)方向32的速度有同等影響的幾何參數(shù)。因此，通過(guò)對(duì)濃度及締合和解離的實(shí)際速度進(jìn)行計(jì)算，可確定"締合速度常數(shù)"(Kon)和"解離速度常數(shù)"(Koff)。K。ff/K。n比使得可以消除所有與親和力不相關(guān)的參數(shù)，因此等于解離常數(shù)Kd。主要參見(jiàn)Davies""/"j朋wa/i^v.5/oc/ze附.^:439-473(1990)。本文所謂的"特異性結(jié)合"是指結(jié)合蛋白以至少10-6-10—9M、更通常至少10:10力M的解離常數(shù)結(jié)合靶標(biāo)Fc受體、蛋白質(zhì)和/或其他分子。在本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中用到的單數(shù)形式的名詞包含復(fù)數(shù)指代含義，除非上下文清楚表明并非如此。免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)構(gòu)本發(fā)明的結(jié)合蛋白包含來(lái)自一個(gè)或多個(gè)選自IgM、IgD、IgGpIgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgAi和IgA2的免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的可操作組合(inoperablecombination)'示例性的結(jié)合蛋白包含選自IgG!、IgG2、IgG3和IgG4的IgG免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域。如本文所詳細(xì)公開(kāi)，本發(fā)明的結(jié)合蛋白是由原本天然的免疫J求蛋白鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域插入、缺失和/或替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸而在氨基酸序列上發(fā)生改變得來(lái)的。免疫球蛋白鉸鏈、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在下表1中給出，該表由InternationalImMunoGeneTicsInformationSystem(國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)，IMGT)所提供的序列改編而成，這些序列可公開(kāi)獲自例如http:〃imgt.cines.fr/，在本文中以SEQIDNO1-27給出。表1人免疫球蛋白的一級(jí)氨基酸序列Fc區(qū)鉸鏈和CH結(jié)構(gòu)域<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>EDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP正KTISKTKCH321(G)QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESSGQPENNYHHPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGMFSCSV顧EALHNRFTQKSLSLSPGKIgG4鉸鏈22(E)SKYGPPCPSCPCH223(A)PEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQF麗YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKCH324(G)QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYT(3KSLSLSLGKCH225(V)IAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLT1KESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQ0NASSMCVPCH326(D)QDTAIRWAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKCH427(G)VALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQ麗QRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEE麗TGETYTCWAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYHVSLVMSDTAGTCY免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽天然出現(xiàn)在IgG、IgA和IgD類(lèi)免疫球蛋白中。IgG,、IgG2、IgG3和IgG4之間的主要結(jié)構(gòu)差異是鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度。在免疫球蛋白重鏈中，野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽位于CH1區(qū)和CH2區(qū)之間，含有負(fù)責(zé)形成鏈內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基。本領(lǐng)域公知，盡管各免疫球蛋白氨基酸序列存在著極大的總體差異，但免疫球蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)卻顯示高度的序列保守性，特別是免疫球蛋白多肽鏈的一些部分，尤其是在半胱氨酸殘基的出現(xiàn)方面，這些半胱氨酸殘基憑借它們的巰基基團(tuán)，提供與其他可利用的巰基基團(tuán)形成二硫鍵的潛力。因此，在本發(fā)明的情形中，野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽包括那些以一個(gè)或多個(gè)高度保守半胱氨酸殘基為特色的多肽。野生型人IgGi鉸鏈區(qū)多肽序列包含三個(gè)非相鄰半胱氨酸殘基，沿著鉸鏈區(qū)序列從多肽N末端到C末端，分別稱(chēng)為野生型鉸鏈區(qū)的第一半胱氨酸、野生型鉸鏈區(qū)的第二半胱氨酸和野生型鉸鏈區(qū)的第三半胱氨酸。免疫球蛋白IgA、IgD和IgG的Fc區(qū)包含單一CH2結(jié)構(gòu)域和單一CH3結(jié)構(gòu)域，而IgE和IgM的Fc區(qū)包含單一CH2結(jié)構(gòu)域、單一35CH3結(jié)構(gòu)域和單一CH4結(jié)構(gòu)域。雖然四個(gè)亞類(lèi)的IgGFc區(qū)(即IgG^IgG2、IgG3和IgG4)之間的同一性百分?jǐn)?shù)超過(guò)95。/。，但這些區(qū)域具有顯著不同的FcyR結(jié)合特異性(參見(jiàn)下表2)。表2各IgG免疫球蛋白亞類(lèi)之間的相對(duì)人Fcy受體識(shí)別特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>在某些實(shí)施方案當(dāng)中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠進(jìn)行抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)、補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性和/或補(bǔ)體固定。本發(fā)明提供了這方面的出乎意料的優(yōu)點(diǎn)，即盡管本文所述的結(jié)合蛋白對(duì)一種或多種關(guān)聯(lián)和/或非關(guān)聯(lián)受體結(jié)合親和力和/或特異性有任何的改變，但它們?nèi)员３纸閷?dǎo)ADCC和/或CDC和/或補(bǔ)體固定的能力。對(duì)編碼抗體恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的序列的操作，在Morrison和Oi的美國(guó)專(zhuān)利6,218,149中提到。改變IgG基agG-based)免疫球蛋白Fcy-受體結(jié)合親和力和/或特異性的氨基酸插入突變?cè)谝粋€(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合蛋白，特別是包含一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白被修飾，使得它能以改變了的(即增加了的或降低了的)結(jié)合親和力和/或特異性結(jié)合一種或多種免疫球蛋白特異性Fc受體。本文所提供的結(jié)合蛋白還包括其中恒定區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的那些結(jié)合蛋白。在一個(gè)方面，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被插入到以下序列中一個(gè)或多個(gè)直接接觸受體的氨基酸序列、一個(gè)或多個(gè)處在直接接觸受體的氨基酸序列的近鄰的氨基酸序列、一個(gè)或多個(gè)處在直接接觸受體的氨基酸序列的遠(yuǎn)側(cè)的氨基酸序列，或者這些序列的各種組合。所插入的氨基酸殘基可在免疫球蛋白三維結(jié)構(gòu)中引入局部或全面的構(gòu)象變化，這個(gè)變化會(huì)改變對(duì)關(guān)聯(lián)受體的結(jié)合親和力和/或特異性。在某些實(shí)施方案當(dāng)中，所插入的氨基酸殘基包含這樣的氨基酸序列，它與發(fā)生結(jié)合時(shí)直接接觸關(guān)聯(lián)受體的結(jié)合蛋白的鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中現(xiàn)有的氨基酸序列相同。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，將一個(gè)或多個(gè)直接接觸受體的氨基酸序列相對(duì)于"野生型"受體結(jié)合氨基酸序列的位置成串聯(lián)放置(positionedintandem)。在這個(gè)情形中所用的"野生型"是指將要引入變化的結(jié)合蛋白的氨基酸序列或者編碼該結(jié)合蛋白的多核苦酸的核苷酸序列。在另一個(gè)方面，結(jié)合蛋白包括一個(gè)或多個(gè)插入的與野生型受體結(jié)合序列相同的受體結(jié)合序列，該插入的受體結(jié)合序列是在這樣的位點(diǎn)虧1入結(jié)合蛋白的恒定區(qū)，該位點(diǎn)處于野生型受體結(jié)合序列的遠(yuǎn)側(cè)且在同一條鏈上，和/或該位點(diǎn)在結(jié)合蛋白中的野生型受體結(jié)合序列所不處在的鏈上，或者這兩種位點(diǎn)。不管氨基酸插入的確切性質(zhì)(precisenature)和序列i口4可，3口Sambrooketal.，"ProtocolsinMolecularBiology,"(出處同上)所述，這類(lèi)修飾是本領(lǐng)域公知和常規(guī)實(shí)施的。本文示例性舉出的是結(jié)合蛋白，特別是包含一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白被修飾，使得它能以改變了的(即增加了的或P爭(zhēng)低了的)結(jié)合親和力和/或特異性結(jié)合一種或多種免疫球蛋白特異性Fc受體，所述受體包括但不限于IgG免疫球蛋白特異性Fc受體FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和/或FcyRIII(CD16)中的一種或多種。這種類(lèi)型的結(jié)合蛋白包括例如這樣的結(jié)合蛋白，其中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入在結(jié)合蛋白的一級(jí)氨基酸序列當(dāng)中，在鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中，在負(fù)責(zé)Fcy-受體結(jié)合的序列中。這種變化包括但不限于在這樣的氨基酸片段中間和/或近鄰37插入一個(gè)或多個(gè)M酸，該氨基酸片段通過(guò)直接接觸而促使結(jié)合蛋白與一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白特異性Fc受體發(fā)生締合，所述免疫球蛋白特異性Fc受體包括FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和/或FcyRIII(CD16)。本發(fā)明這些方面的具體實(shí)施方案包括包含一個(gè)或多個(gè)IgGCH2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該CH2結(jié)構(gòu)域是IgG,和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域。一些這類(lèi)實(shí)施方案提供了這樣的結(jié)合蛋白，其在Ig^和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域的鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)L-L-G-G-P當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或氨基酸插入。本文具體示例性舉出的是這樣的結(jié)合蛋白，其在以下鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)當(dāng)中"*"所示的位置處包含單個(gè)氨基酸的單一插入。因此，本文提供包含經(jīng)修飾的鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)L-L-*-G-G-P、L-L-G-*-G-P和L-L-G-G-*-P的結(jié)合蛋白。本文還提供這樣的結(jié)合蛋白，其在鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)L-L-*-G-G-P、L-L-G-*-G-P和L-L-G-G-*-P當(dāng)中"*，，所示的位置處包含兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的單一插入。因此，在這些實(shí)施方案當(dāng)中，"*，，表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。通常，適用于產(chǎn)生具有這種經(jīng)修飾的鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合蛋白的氨基酸選自Ala、Gly、Ile、Leu和Val。其他這類(lèi)實(shí)施方案提供這樣的結(jié)合蛋白，其包含一個(gè)或多個(gè)IgGCH2結(jié)構(gòu)域，其中該CH2結(jié)構(gòu)域是IgGpIgG2和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域。一些這類(lèi)實(shí)施方案提供了這樣的結(jié)合蛋白，其在IgGpIgG2和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域的BC環(huán)結(jié)構(gòu)D-V-S-H-E當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或氨基酸插入。本文具體示例性舉出的是這樣的結(jié)合蛋白，其在以下BC環(huán)結(jié)構(gòu)當(dāng)中"*"所示的位置處包含單個(gè)氨基酸的單一插入。因此，本文提供包含經(jīng)修飾的BC環(huán)結(jié)構(gòu)D-V-*-S-H-E和D-V-S-*-H-E的結(jié)合蛋白。本文還提供這樣的結(jié)合蛋白，其在BC環(huán)結(jié)構(gòu)D-V-、S-H-E和D-V-S-、H-E當(dāng)中"*"所示的位置處包含兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的單一插入。因此，在這些實(shí)施方案當(dāng)中，"*，，表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。通常，適用于產(chǎn)生具有這種經(jīng)^f務(wù)飾的BC環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合蛋白的氨基酸選自Ala、Gly、Ile、Leu和Val。另外其他這類(lèi)實(shí)施方案提供這樣的結(jié)合蛋白，其包含一個(gè)或多個(gè)IgGCH2結(jié)構(gòu)域，其中該CH2結(jié)構(gòu)域是IgG，和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域。一些這類(lèi)實(shí)施方案提供了這樣的結(jié)合蛋白，其在CH2結(jié)構(gòu)域的FG環(huán)結(jié)構(gòu)A-L-P-A-P-I當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或氨基酸插入。本文具體示例性舉出的是這樣的結(jié)合蛋白，其在以下FG環(huán)結(jié)構(gòu)當(dāng)中"*，，所示的位置處包含單個(gè)氨基酸的單一插入。因此，本文提供包含經(jīng)修飾的FG環(huán)結(jié)構(gòu)A-L-*-P-A-P-I、A-L-P-*-A-P-I和A-L-P-A-*-P-I的結(jié)合蛋白。本文還提供這樣的結(jié)合蛋白，其在FG環(huán)結(jié)構(gòu)A-L-*-P-A-P-I、A-L-P-*-A-P-I和A-L-P-A，*-P-I當(dāng)中"*"所示的位置處包含兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的單一插入。因此，在這些實(shí)施方案當(dāng)中，"*，，表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。通常，適用于產(chǎn)生具有這種經(jīng)4務(wù)飾的FG環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合蛋白的氨基酸選自Ala、Gly、Ile、Leu和Val。第一插入受體結(jié)合序列和第二插入受體結(jié)合序列之間的間距，第二插入受體結(jié)合序列和第三插入受體結(jié)合序列之間的間距，和依此類(lèi)推的兩序列之間的間距，按間插氨基酸殘基的數(shù)目來(lái)說(shuō)，可從零(O)個(gè)間插M酸殘基至約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。第一插入受體結(jié)合序列和第二插入受體結(jié)合序列之間的及第二插入受體結(jié)合序列和第三插入受體結(jié)合序列之間的間插氨基酸殘基(如果存在的話(huà))的準(zhǔn)確數(shù)目，要以提高受體結(jié)合親和力的方式來(lái)變動(dòng)。在包含超過(guò)兩個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)的修飾結(jié)合蛋白中，各受體結(jié)合序列之間的間插氨基酸殘基的數(shù)目可相同或者可不同。間隔區(qū)中的間插氨基酸殘基可進(jìn)行具體選擇，或者可通過(guò)測(cè)定結(jié)合親和力來(lái)隨機(jī)選擇。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案當(dāng)中，結(jié)合蛋白功能性例如G-SMIP產(chǎn)品功能性，可按上文所述方式通過(guò)對(duì)經(jīng)修飾的G-SMIPTM產(chǎn)品的結(jié)合作出變化來(lái)改變，以提高或降低Fc丫RI(CD64)結(jié)合、FcyRII(CD32)結(jié)合和/或FcyRina(CD16)結(jié)合。在這些示例性實(shí)施方案的某些方面當(dāng)中，這種對(duì)免疫球蛋白功能性的變化能有效地分別提高或降低相應(yīng)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)。在某些這種實(shí)施方案當(dāng)中，結(jié)合蛋白是這樣的G-SMIP產(chǎn)品，其功能性是如上所述通過(guò)在Fcy環(huán)當(dāng)中插入和/或缺失tt^列來(lái)作出改變。在相關(guān)的實(shí)施方案當(dāng)中，結(jié)合蛋白是這樣的G-SMIP產(chǎn)品，其功能性是通過(guò)對(duì)環(huán)與FcyR和/或Clq的接觸作出變化來(lái)改變。例如，可進(jìn)行氬基酸的插入和/或缺失，以^使改變對(duì)Fc丫R的結(jié)合面(bindingface),或者以便通過(guò)降低Clq結(jié)合來(lái)降低CDC。要將氨基酸殘基插入到結(jié)合蛋白的氨基酸序列中，這可例如通過(guò)在編碼免疫球蛋白氨基酸序列的多核苷酸當(dāng)中的一個(gè)或多個(gè)插入突變來(lái)作出，或者通過(guò)如本文所述在特定區(qū)域中的隨機(jī)突變來(lái)作出。FcyRI結(jié)合、Fc丫Rn結(jié)合、FcyRffl結(jié)合和FcaRIII結(jié)合，可通過(guò)用本領(lǐng)域-公知的和下文進(jìn)一步詳述的方法分別測(cè)量與CD64、CD32、CD16和CD89的結(jié)合來(lái)進(jìn)行評(píng)估。能改變IgG基免疫球蛋白FcY-受體結(jié)合親和力和/或特異性的、包含糖基化序列的突變根據(jù)某些實(shí)施方案，本文所述的本發(fā)明結(jié)合蛋白可按需包含供進(jìn)行糖基化的另外位點(diǎn)，所述糖基化例如是諸如單糖或寡糖的碳水化合物部分的共價(jià)連接。為多肽糖基化提供底物的氨基酸序列的摻入，是在相關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
的扶能范圍內(nèi)，包括例如使用遺傳工程或蛋白質(zhì)工程方法，來(lái)獲得含有例如供進(jìn)行N-(天冬酰胺)連接糖基化的經(jīng)典Asn-X-Ser/Thr位點(diǎn)的多肽序列，或者含有作為O-連接糖基化的合適底物的Ser殘基或Thr殘基的序列，或者適于進(jìn)行C-甘露糖基化、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)/糖基磷脂酰肌醇修飾作用或磷酸加糖作用(phosphoglycation)的序列，其中所有都可4會(huì)本領(lǐng)域確立的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定(辨如Spiro,G/>^/o/ogvi2:43R(2002))。免疫球蛋白CH2DE環(huán)的N-連接糖基化據(jù)認(rèn)為能改變CH2構(gòu)象和提供與Fc丫R的直接糖接觸。免疫球蛋白糖形(glycoform)當(dāng)中的修飾，可通過(guò)插入一個(gè)或多個(gè)包含N-連接糖基化位點(diǎn)的氨基酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述氨基酸序列例如氨基酸序列YNSTY。這種新的糖形可具有改變了的FCyR結(jié)合特性。在這類(lèi)實(shí)施方案的另外一個(gè)方面當(dāng)中，可在CH2DE環(huán)當(dāng)中插入第二N-連4妄糖基化位點(diǎn)。例如，可將野生型序列YNSTY轉(zhuǎn)變成YNSTYNSTY。這種免疫球蛋白修飾會(huì)極大地影響FcyR結(jié)合，并因此影響抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)。已證實(shí)N-連接糖基化特別是在氨基酸位置Asn297處的N-連接糖基化，對(duì)于IgG類(lèi)免疫球蛋白與其關(guān)聯(lián)Fcy受體的結(jié)合來(lái)說(shuō)是必要的。因此，已證實(shí)Asn297突變成Ala297會(huì)廢除Fc丫RI的識(shí)別。類(lèi)似地還證實(shí)，在位置Asn297處如不存在N-連接寡糖，F(xiàn)cyRI、FcyRII、FcyRHI(以及補(bǔ)體Clq)的識(shí)別和/或激活會(huì)被廢除，而A蛋白和類(lèi)風(fēng)濕因子結(jié)合則不受影響。N-連接和O-連接糖基化序列是本領(lǐng)域公知的，例如描述于Gooleyef5zWzew.所o/—.Was.Co附ww".178:1194-1201(1991)和PisanoWa/"G^coWo/ogy2:429-435(1993)中。在某些方面當(dāng)中，本發(fā)明提供這樣的+l"飾，其包括在一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)或多個(gè)0-連接和/或N-連接糖基化位點(diǎn)的鉸鏈區(qū)和/或恒定區(qū)免疫球蛋白環(huán)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸。因此，本發(fā)明提供結(jié)合蛋白，特別是包含一個(gè)或多個(gè)重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白在一個(gè)或多個(gè)重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)修飾，其中該修飾包含插入一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化序列和/或一個(gè)或多個(gè)O-連接糖基化序列，該糖基化序列足以實(shí)現(xiàn)在插入位置處的N-連接和/或O-連41接糖基化，從而改變(即提高或降低)結(jié)合蛋白與一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白特異性fc受體或其他靶蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力和/或特異性。這種類(lèi)型的結(jié)合蛋白包括例如在一級(jí)氨基酸序列中這樣的位置處包含變化的結(jié)合蛋白，該位置處在負(fù)責(zé)未修飾結(jié)合蛋白的糖基化的區(qū)域、結(jié)構(gòu)^或和/或環(huán)結(jié)構(gòu)的近側(cè)和/或遠(yuǎn)側(cè)。本文示例性舉出的是這樣的結(jié)合蛋白，其包含一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，其中該結(jié)合蛋白在該一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)修飾，其中該修飾包含插入一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化序列和/或一個(gè)或多個(gè)O-連接糖基化序列，該糖基化序列足以實(shí)現(xiàn)在插入位置處的N-連接和/或0-連接糖基化,從而改變(即提高或降低)結(jié)合蛋白與一種或多種以下IgG免疫球蛋白特異性受體的結(jié)合親和力和/或特異性FcYRI(CD64)、FcyRII(CD32)和/或FcyRIII(CD16)，所述改變是相比于包含一個(gè)或多個(gè)未修飾的IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)結(jié)合蛋白而本發(fā)明這些方面的具體實(shí)施方案包括這樣的結(jié)合蛋白，其包含一個(gè)或多個(gè)IgG鉸鏈結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)IgGCH2結(jié)構(gòu)域和/或一個(gè)或多個(gè)IgGCH3結(jié)構(gòu)域，其中該鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域是IgG,鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，IgG2鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，IgG3鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域和/或IgG4鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域。一些這類(lèi)實(shí)施方案提供了包含這樣的插入的結(jié)合蛋白，該插入是在相應(yīng)的天然IgG免疫球蛋白IgGi鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中的N-連接和/或0-連接糖基化位點(diǎn)的近側(cè)和/或遠(yuǎn)側(cè)，插入一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化序列N-X-(S/T)(其中X為任何M酸)和/或一個(gè)或多個(gè)O-連接糖基化序列X-P-X-X(其中至少一個(gè)X為T(mén))、T-X-X-X(其中至少一個(gè)X為T(mén))、X-X-T-X(其中至少一個(gè)X為R或K)和/或S-X-X-X(其中至少一個(gè)X為S))。在這些實(shí)施方案的某些方面當(dāng)中，結(jié)合蛋白顯示出改變了的(即提高了的或降低了的)FcyR結(jié)合親和力和/或特異性。本文示例性舉出的是這樣的實(shí)施方案，其中結(jié)合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)IgG鉸鏈結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)IgGCH2結(jié)構(gòu)域和/或一個(gè)或多個(gè)IgGCH3結(jié)構(gòu)域，且其中結(jié)合蛋白還包含一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化序列N-X-(S/T)(其中X為任何氨基酸)的插入。例如，本發(fā)明提供包含這樣的插入的結(jié)合蛋白，該插入是在接近一個(gè)或多個(gè)IgGi、IgG2、IgG3和/或IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的DE環(huán)當(dāng)中的天然N-S-T序列處，插入一個(gè)或多個(gè)N-X-(S/T)序列。在這些實(shí)施方案的某些方面當(dāng)中，結(jié)合蛋白顯示出改變了的(即提高了的或降4氐了的)FcyR結(jié)合親和力和/或特異性。在具體的這類(lèi)實(shí)施方案當(dāng)中，一個(gè)或多個(gè)IgG,、IgG2、IgG3和/或IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的DE環(huán)當(dāng)中的N-連接糖基化序列包含氨基酸序列N-S-T,并被插入到距天然N-S-T序列的氨基末端和/或羧基末端0-100個(gè)氨基酸的近鄰或當(dāng)中，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z被修飾成(AAa)-N-S-T-(AAb)-N-S-T-(AAC),其中AAa、AAb和AA。每一個(gè)獨(dú)立地從1-100個(gè)氨基酸指定。在具體的這類(lèi)實(shí)施方案當(dāng)中，一個(gè)或多個(gè)IgG!、IgG2、IgG3和/或IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的DE環(huán)當(dāng)中的N-連接糖基化序列包含氨基M^列N-S-T,并被插入到天然N-S-T序列的近鄰，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z被修飾成X-N-S畫(huà)T-Z-N-S-T-Z，其中X和Z獨(dú)立選自Tyr(Y)和Phe(F)。在另選的這類(lèi)實(shí)施方案當(dāng)中，插入在一個(gè)或多個(gè)IgG!、IgG2、IgG3和/或IgG4CH3結(jié)構(gòu)域的BC環(huán)當(dāng)中的N-連接糖基化序列包含氨基酸序列N-S-T,并被插入到天然N-S-T序列的遠(yuǎn)側(cè)，使得天然氨基*列Y-P-S-D-I-A被修飾成Y-P-N-S-T-D-I-A和Y-N-S-T-P-S-D-I-A。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供結(jié)合蛋白，特別是包含一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白在該一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)修飾，其中該修飾包含插入一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化序列和/或一個(gè)或多個(gè)O-連接糖基化序列，該糖基化序列足以實(shí)現(xiàn)在插入位置處的N-連接和/或O-連接糖基化，從而改變(即提高或降低)結(jié)合蛋白與一種或多種免疫球蛋白特異性Fc受體的結(jié)合親和力和/或特異性，所述免疫球蛋白特異性Fc受體包括IgG免疫球蛋白特異性受體FqRI(CD64)、FcyRII(CD32)和/或FcyRIII(CD16)，所述改變是相比于包含一個(gè)或多個(gè)未修飾的IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)結(jié)合蛋白而言。這種類(lèi)型的結(jié)合蛋白包括例如在一級(jí)M酸序列中這樣的位置處包含變化的結(jié)合蛋白，該位置處在負(fù)責(zé)未修飾結(jié)合蛋白的糖基化的區(qū)域、結(jié)構(gòu)域和/或環(huán)結(jié)構(gòu)的近側(cè)和/或遠(yuǎn)側(cè)。這種變化包括例如在這樣的氨基酸片段中間和/或近鄰，插入三個(gè)或更多個(gè)包含供進(jìn)行N-連接糖基化的YNS序列的氨基酸，該氨基酸片段當(dāng)在結(jié)合時(shí)與包括FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和/或FcyRIII(CD16)在內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白特異性Fc受體發(fā)生接觸。當(dāng)前描述的實(shí)施方案的一個(gè)這種方面提供這樣的修飾，該修飾是在被稱(chēng)為G-SMIpTM產(chǎn)品的IgG類(lèi)免疫球蛋白的CH2結(jié)構(gòu)域的DE環(huán)當(dāng)中，這類(lèi)免疫球蛋白含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列YNSTY，該序列是供進(jìn)行N-連接糖基化和FcyR接觸的位點(diǎn)。同時(shí)具有關(guān)聯(lián)受體和非關(guān)聯(lián)受體結(jié)合特異性的結(jié)合蛋白在還進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供這樣的結(jié)合蛋白，其中新的功能性是通過(guò)用第二免疫球蛋白類(lèi)別的一個(gè)或多個(gè)第二免疫球蛋白環(huán)替代第一免疫球蛋白類(lèi)別的一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中該第二免疫球蛋白環(huán)給經(jīng)修飾的結(jié)合蛋白賦予新的結(jié)合特異性，這種新的結(jié)合特異性是相應(yīng)的未修飾結(jié)合蛋白中不存在的。根據(jù)本發(fā)明這些方面的結(jié)合蛋白包含第一免疫球蛋白類(lèi)別(即IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的一個(gè)或多個(gè)重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，其中該結(jié)合蛋白在第一免疫球蛋白類(lèi)別的一個(gè)或多個(gè)重鏈鉸44鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的一級(jí)氨基酸序列中被修飾(即氨基酸替代和/或氨基酸插入)，以產(chǎn)生能夠結(jié)合與第一免疫球蛋白類(lèi)別不同的第二免疫球蛋白類(lèi)別的一個(gè)或多個(gè)關(guān)聯(lián)Fc受體的結(jié)合蛋白。這種變化包括例如用第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)環(huán)或其氨基酸和/或肽部分來(lái)替代和/或重塑第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)環(huán)或其氨基酸和/或肽部分，其中第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)這樣的氨基酸，這些氨基酸能形成第二免疫球蛋白特異性Fc受體的結(jié)合序列的至少一部分。根據(jù)本發(fā)明這些方面的結(jié)合蛋白除了能夠特異性結(jié)合FcyRI、FcyRII和/或FcyRIII外，還能夠特異性結(jié)合FcaR。本文示例性舉出的是包含一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白被修飾成能結(jié)合一個(gè)或多個(gè)非IgG免疫球蛋白特異性Fc受體，包括但不限于IgA免疫球蛋白特異性受體FcaR(CD89)。這類(lèi)結(jié)合蛋白包括例如這樣的結(jié)合蛋白，其在一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的一級(jí)氨基,列中包含變化(即氨基酸替代和/或氨基酸插入)，以產(chǎn)生能夠結(jié)合非IgG免疫球蛋白特異性Fc受體如結(jié)合Fca受體的氨基酸序列。在某些這類(lèi)實(shí)施方案當(dāng)中提供的是包含一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白^皮修飾成能結(jié)合IgA免疫球蛋白特異性受體FcccR(CD89)。這類(lèi)示例性結(jié)合蛋白在IgGCH3FG環(huán)當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換和/或在IgGCH3CD環(huán)當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換。例如，一種這類(lèi)示例性結(jié)合蛋白包含這樣的替代，該替代是用包含氨基財(cái)列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgACH3FG環(huán)或其相應(yīng)部分替代包含氨基酸序列C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q的IgGCH3FG環(huán)或其相應(yīng)部分。另一種示例性結(jié)合蛋白包含這樣的替代，該替代是用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgACH3CD環(huán)或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgGCH3CD環(huán)或其部分。45又一種這類(lèi)示例性結(jié)合蛋白包含這樣的替代，該替代是用包含氨基酸序列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgACH3FG環(huán)或其相應(yīng)部分替代包含氨基酸序列C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q的IgGCH3FG環(huán)或其部分，和用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgACH3CD環(huán)或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgGCH3CD環(huán)或其部分。任何上述結(jié)合蛋白實(shí)施方案可進(jìn)一步包含這樣的置換，該置換是用氨基酸Leu置換IgG重鏈CH3氨基酸Met(在序列K-D-T-L-M28-I-S-R-T當(dāng)中CH3氨基酸位置28),使得該結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含氨基酸序列K-D-T-L-L28-I-S-R-T?；蛘呋蛄硗?，任何上述結(jié)合蛋白實(shí)施方案可進(jìn)一步包含這樣的置換，該置換是用氨基酸Arg置換IgG重鏈CH3絲酸Glu(在序列D-I-A-V-E157-W-E-S-N當(dāng)中CH3氨基酸位置157),使得該結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含氨基酸序列D-I-A-V-R157-W-E-S-N。本文在某些實(shí)施方案中示例性舉出包含非FcyR的結(jié)合接觸的環(huán)，該環(huán)被插入到包含一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的IgG基結(jié)合蛋白，其中該結(jié)合蛋白被修飾成能結(jié)合一個(gè)或多個(gè)非IgG免疫球蛋白特異性Fc受體，包括但不限于IgA免疫球蛋白特異性Fc受體FcaR(CD89)。這類(lèi)結(jié)合蛋白包括例如這樣的結(jié)合蛋白，其在一個(gè)或多個(gè)IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的一級(jí)M酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)變化(即氨基酸替代和/或氨基酸插入)，以產(chǎn)生能夠結(jié)合非IgG免疫球蛋白特異性Fc受體如結(jié)合Fca受體的氨基酸序列。這種變化包括例如用一個(gè)或多個(gè)非IgG免疫球蛋白環(huán)和/或其肽部分替代和/或重塑一個(gè)或多個(gè)IgG免疫球蛋白環(huán)，其中該非IgG免疫球蛋白環(huán)包含非IgG免疫球蛋白特異性Fc受體的結(jié)合序列。在某些實(shí)施方案當(dāng)中，結(jié)合蛋白是G-SMIP產(chǎn)品，其中G-SMIP產(chǎn)品功能性被改變，使得G-SMIP產(chǎn)品能結(jié)合一個(gè)或多個(gè)FcaR如CD89。IgG的CH3結(jié)構(gòu)域上的幾個(gè)環(huán)如上所述被進(jìn)行基因工程改造(engineered),以提供新的和/或經(jīng)修飾的分子相互作用。例如，可將IgG鉸鏈氨基酸、CH2氨基酸和/或CH3氨基酸用能參與IgA和FcaR之間的結(jié)合的IgA鉸鏈殘基、CH2殘基和/或CH3殘基進(jìn)行替代。例如和如上對(duì)結(jié)合蛋白一般所述，可將IgGCH3FG環(huán)用IgACH3FG環(huán)加上其他能接觸FcaR的氨基酸進(jìn)行替代?；蛘呋蛄硗?，可將IgGCH3CD環(huán)用IgACH3CD環(huán)加上其他能接觸FcaR的氨基酸進(jìn)行替代。示例性的G-SMIP產(chǎn)品包含來(lái)自稱(chēng)為2H7-018014的人源化抗體的氨基末端。包含例如能賦予FcaR結(jié)合活性的氨基酸的G-SMIPTM產(chǎn)品，保持著未》務(wù)飾G基SMIPTM產(chǎn)品的好處，例如體內(nèi)半壽期長(zhǎng)、容易通過(guò)A蛋白進(jìn)行純化和/或IgG效應(yīng)子功能。還另外的實(shí)施方案提供結(jié)合蛋白對(duì)非抗體受體結(jié)合的特異性方面的修飾，所述非抗體受體結(jié)合例如是對(duì)T細(xì)胞表面蛋白、B細(xì)胞表面蛋白、髓樣細(xì)胞表面蛋白質(zhì)和非免疫細(xì)胞蛋白的結(jié)合。產(chǎn)生、表達(dá)和鑒定效應(yīng)子功能改變了的結(jié)合蛋白的功能性的方法一旦設(shè)計(jì)出本文所提供的結(jié)合蛋白，可將編碼該結(jié)合蛋白的多核苷酸包括DNA，通過(guò)例如Sinha"Wwc/e/c爿c/Aies.，12:4539-4557(1984)中所述的寡核苷S臾合成進(jìn)行完全或部分合成；并例如Innis,Ed"PCRProtocols"(AcademicPress,1990)及BetterWg/"J"B/o/.C/^m.^2:16712-16118(1992)中所述通過(guò)PCR進(jìn)行裝配。對(duì)這種未經(jīng)修飾的和經(jīng)修飾的結(jié)合蛋白進(jìn)行測(cè)序、克隆和表達(dá)的方法是本領(lǐng)域公知的，例々口可參考Ausubela/"五ds."CurrentProtocolsinMolecularBiology"(JohnWiley&Sons,NewYork,1989)及Robinson"/，i/ww.爿油77od//少^Womos2:84-93(1991)中所描述的程序。本發(fā)明的結(jié)合蛋白可在真核細(xì)胞系(例如CHO細(xì)胞系)中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)A蛋白層析進(jìn)行純化和通過(guò)功能試驗(yàn)進(jìn)行鑒定?？稍诒绢I(lǐng)域公知的任何常規(guī)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中如下來(lái)實(shí)現(xiàn)表達(dá)分離編碼目的結(jié)合蛋白的DNA片段并克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體如pD18中。得自陽(yáng)性克隆的DNA可用QIAGEN質(zhì)粒制備試劑盒(QIAGEN,Valencia,CA)進(jìn)行擴(kuò)增。重組質(zhì)粒DNA可通過(guò)用合適的限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化在非必需區(qū)域中進(jìn)行線性化，通過(guò)苯酚提取進(jìn)行純化，并重懸在組織培養(yǎng)基(辦如Excell302;目錄號(hào)14312-79P,JRHBiosciences,Lenexa，KS)中。適用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是例如CHODG44細(xì)胞，通常處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。收獲細(xì)胞供進(jìn)行每個(gè)轉(zhuǎn)染反應(yīng)，并將線性化的DNA加入到細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染或電穿孔。例如，本發(fā)明結(jié)合蛋白的穩(wěn)定生產(chǎn)可如下實(shí)現(xiàn)用含有在CMV啟動(dòng)子控制下的編碼結(jié)合蛋白的cDNA的可選擇可擴(kuò)增質(zhì)粒如pD18,對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)4亍電穿孔。(所有的細(xì)胞系均獲自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所；Manassas，VA)。包含結(jié)合蛋白cDNA的表達(dá)盒可亞克隆在合適的啟動(dòng)子(如CMV啟動(dòng)子)的下游。讓被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在非選擇性培養(yǎng)基中過(guò)夜恢復(fù)，然后以例如從125個(gè)細(xì)胞/孔到2000個(gè)細(xì)胞/孔的不同系列稀釋度選擇性接種在％孔平底板(Costar)中，該板含有供進(jìn)行細(xì)胞克隆的合適培養(yǎng)基如Excell302完全培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有選擇劑(例如在DHFR抗性的情況中含有100nM曱氨喋呤)。對(duì)來(lái)自原孔(masterwell)的培養(yǎng)上清液的系列稀釋液進(jìn)行篩選，找出與表勤目應(yīng)結(jié)合蛋白配體的細(xì)胞的結(jié)合。通常從表達(dá)結(jié)合蛋白的CHO細(xì)胞收集上清液，濾過(guò)0.2,濾器(Nalgene，Rochester,NY),并通過(guò)A蛋白-瓊脂糖(IPA300交聯(lián)瓊脂糖)柱(Repligen,Needham,MA)。用PBS洗滌該柱，用0.1M^寧檬酸鹽緩沖液(pH3)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。收集各流分，將洗脫的蛋白質(zhì)用1MTris(pH8.0)中和，然后透析到PBS中。純化的結(jié)合^"白的濃度可通過(guò)280nm處的吸收進(jìn)行測(cè)定?？梢罦3口在Harlowe/1fl/""Antibodies:ALaboratoryManual"Chapter14(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor，1988)和Munson"a/.，^朋/.歷oc/zew.巡:220-239(1980)中所述，對(duì)結(jié)合蛋白進(jìn)48行所需的活性方面的測(cè)試，例如與靶受體如FcyRI、Fq/RII、FcyRin和/或FcaR的結(jié)合活性或者特異性抗原結(jié)合活性，以及通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，對(duì)結(jié)合蛋白進(jìn)行抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)方面的測(cè)試。ADCC測(cè)定和CDC測(cè)定、二級(jí)體外抗體應(yīng)答、使用確立的標(biāo)志抗原系統(tǒng)對(duì)各種外周血或淋巴單核細(xì)胞亞群的流式免疫細(xì)胞熒光術(shù)分析、免疫組織化學(xué)測(cè)定和其他相關(guān)的測(cè)定，都是例如參考RoseWa/.Eds."ManualofClinicalLaboratoryImmunology"(AmericanSocietyofMicrobiology,Washington,DC，1997)在本文中提供。結(jié)合蛋白介導(dǎo)ADCC的能力可用任何合適的靶細(xì)胞系和PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞來(lái)測(cè)量。例如，在CD20特異性結(jié)合蛋白的具體情況中，合適的細(xì)胞系包括B細(xì)胞系Ramos和Bjab。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比通常如下變動(dòng)100:1、50:1、25:1和10:1,其中每孔的靶細(xì)胞數(shù)保持恒定，而改變PBMC的數(shù)量。將靶細(xì)胞標(biāo)記以51Cr(^/;^Na251Cr04),以5乂104個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度等分到96孔板的每個(gè)孔。將純化的結(jié)合蛋白以10pg/ml的濃度加到PBMC的各個(gè)稀釋液中。自發(fā)釋放是通過(guò)不加PBMC或結(jié)合蛋白來(lái)測(cè)量，最大釋放是通過(guò)向適當(dāng)?shù)目字屑尤肴ノ蹌?1%NP-40)來(lái)測(cè)量。溫育進(jìn)行反應(yīng)，將細(xì)胞上清液收獲到Y(jié)閃爍計(jì)lt器(辨如Lumaplate;PackardInstruments)?？偭呀夂妥园l(fā)裂解是通過(guò)將耙細(xì)胞分別在0.2%SDS或完全培養(yǎng)基中進(jìn)行溫育來(lái)測(cè)定。按以下公式計(jì)算裂解百分?jǐn)?shù)-樣品中的釋放一自發(fā)釋放xHK)衣f、/Q;總裂解釋放一自發(fā)釋放裂解百分?jǐn)?shù)用LU(裂解單位)表示，它是用ProssW.，《/C""./wwww/.J_:51-63(1981)所述的指數(shù)擬合方程來(lái)測(cè)定的。一個(gè)裂解單位定義為為獲得20%靶細(xì)胞裂解所需的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)測(cè)定還可用51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞在PMBC存在下進(jìn)行(如上對(duì)ADCC所迷)。經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞通常以2000個(gè)細(xì)胞/孔接種在含有遞增濃度的結(jié)合蛋白的96孔板中，然后與兔補(bǔ)體(Pei-Freez，Rogers,AK)以1:100的最終稀釋度在37。C下溫育1小時(shí)。將來(lái)自正常供體的人血清加到含有靶細(xì)胞的各孔中，在37。C下溫育?？蓪釡缁畹难逵米鲗?duì)照，以保證補(bǔ)體特異性裂解的測(cè)量。特異性靶細(xì)胞裂解如上文對(duì)ADCC所述進(jìn)行測(cè)定。結(jié)合蛋白介導(dǎo)的CDC是通過(guò)減去只歸因于補(bǔ)體的靶細(xì)胞裂解的百分?jǐn)?shù)來(lái)測(cè)定。FcR結(jié)合可通過(guò)評(píng)估對(duì)可溶性Fclg(辨如CD64Ig、CD32Ig、CD16Ig和CD89Ig)的結(jié)合和/或在表達(dá)各個(gè)Fc受體的細(xì)胞(即CD6f、CD32+、CD16+和CD89+細(xì)胞)的結(jié)合來(lái)測(cè)定和定量。FcR接合(engagement)和激活可例如通過(guò)由白細(xì)胞(例如U937細(xì)胞)產(chǎn)生過(guò)氧化物來(lái)測(cè)量。效應(yīng)子功能改變了的結(jié)合蛋白的設(shè)想用途本發(fā)明的結(jié)合蛋白會(huì)在眾多治療應(yīng)用中具有效用。如上文所述和如下文所示例性舉出，在某些實(shí)施方案當(dāng)中，本發(fā)明提供在免疫球蛋白鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和/或CH3區(qū)當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入的結(jié)合蛋白，其中該免疫球蛋白顯示出改變了的(即提高了的或降4氐了的)對(duì)FqRI(CD64)、FcyRII(CD32)和/或FcyRIII(CD16)中的一個(gè)或多個(gè)的結(jié)合親和力和/或特異性。這類(lèi)結(jié)合蛋白的設(shè)想用途包括例如在如下患者中對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行定向耗盡(targetteddepletion):(a)具有低/次功能性自然殺傷(NK)細(xì)胞群體的患者和/或(b)能受益于經(jīng)修飾的結(jié)合蛋白的改進(jìn)效應(yīng)強(qiáng)度(potency)的患者。這種結(jié)合蛋白的另選的設(shè)想用途包括治療細(xì)菌性、寄生蟲(chóng)性和/或病毒性感染，其中與FcyRI、FcYRB和/或FcyRni中的一種或多種的結(jié)合的提高或下降會(huì)增加病原體中和或清除。這種Fcr/R結(jié)合活性的改變，對(duì)于其中傳染可通過(guò)抗體FcyR相互作用來(lái)促進(jìn)的傳染病的治療也會(huì)有用，所述疾病包括但不限于諸如HIV-1的疾病。在另選的實(shí)施方案當(dāng)中提供的是包含這樣的插入的結(jié)合蛋白，該50插入是在相應(yīng)的天然免疫球蛋白Fc區(qū)中的N-連接和/或O-連接糖基化位點(diǎn)的近側(cè)和/或遠(yuǎn)側(cè)，插入一個(gè)或多個(gè)N-連接和/或O-連接糖基化序列(例如一個(gè)或多個(gè)N-連接N-X-(S/T)糖基化序列和/或一個(gè)或多個(gè)0-連接X(jué)-P-X-X(其中至少一個(gè)X為T(mén))、T-X-X-X(其中至少一個(gè)X為T(mén))、X-X-T-X(其中至少一個(gè)X為R或K)和S-X-X-X(其中至少一個(gè)X為S))，其中該結(jié)合蛋白顯示出改變了的(即提高了的或降低了的)FeyR結(jié)合親和力和/或特異性，如改變了的對(duì)Clq、FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和/或FcyRIII(CD16)的結(jié)合親和力和/或特異性。在某些方面當(dāng)中，這類(lèi)結(jié)合蛋白的設(shè)想用途M于結(jié)合蛋白的半壽期的保持和交聯(lián)潛在性的相應(yīng)減少。例如，本發(fā)明設(shè)想到，這種經(jīng)修飾的結(jié)合蛋白會(huì)可用于對(duì)Clq、FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和/或FcyRIII(CD16)中的一種或多種進(jìn)行優(yōu)先靶向，且交聯(lián)作用介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)如CD3和/或CD28信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減低。這類(lèi)結(jié)合蛋白的另選的設(shè)想用途，包括以較低的細(xì)胞損耗潛在性保持半壽期，和當(dāng)交聯(lián)作用驅(qū)動(dòng)所需的信號(hào)但不需要靶細(xì)胞耗損時(shí)保持交聯(lián)作用以供使用。例如(Ex.)EPO-R的激動(dòng)劑SMIP。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案提供包含這樣的插入和/或替代的結(jié)合蛋白，該插入和/或替代是在IgG免疫球蛋白CH2區(qū)和/或CH3區(qū)當(dāng)中插入和/或替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其中該氨基酸插入和/或替代包含一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)于IgA免疫球蛋白CH2區(qū)和/或CH3區(qū)的氨基酸，其中IgA免疫^(guò)求蛋白CH2區(qū)和/或CH3區(qū)的該一個(gè)或多個(gè)氨基酸參與IgA免疫球蛋白與其關(guān)聯(lián)Fca受體的特異性結(jié)合，且其中該經(jīng)修飾的結(jié)合蛋白能夠特異性結(jié)合FcaR。這類(lèi)結(jié)合蛋白的設(shè)想用途包括耗損被靶向細(xì)胞，其中例如包含一個(gè)或多個(gè)IgGCH2區(qū)和/或CH3區(qū)和一個(gè)或多個(gè)IgACH2區(qū)和/或CH3區(qū)的組合的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CD16、CD32和/或CD64中的一個(gè)或多個(gè)以及結(jié)合CD89。這種結(jié)合蛋白會(huì)使得可以除了使用自然殺傷細(xì)胞(NK)/單核細(xì)胞效應(yīng)子外，還可使用多形核細(xì)胞(PMN)效應(yīng)子，來(lái)實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞的消除。本文所述的結(jié)合蛋白的結(jié)合特異性的這種改變，會(huì)因此導(dǎo)致在廣大的患者群體中有改進(jìn)的效應(yīng)強(qiáng)度(potency)和更大的功效(efficacy)。如上文對(duì)在免疫球蛋白鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和/或CH3區(qū)當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)插入的氨基酸的結(jié)合蛋白所述，具有對(duì)一個(gè)或多個(gè)IgGCH2區(qū)和/或CH3區(qū)和一個(gè)或多個(gè)IgACH2區(qū)和/或CH3區(qū)的組合的結(jié)合特異性的結(jié)合蛋白，將可用于治療細(xì)菌性、寄生蟲(chóng)性或病毒性感染，其中在FcyR結(jié)合和/或在FcaR結(jié)合上的改進(jìn)可導(dǎo)致病原體中和和/或清除活性的增加。在FcyR結(jié)合和/或在FcaR結(jié)合上的改變，還可用于治療其中傳染可通過(guò)抗體FcR相互作用來(lái)促進(jìn)的傳染病，所述疾病例如與HIV-1感染有關(guān)的疾病。以下實(shí)施例是以示例性方式而非限制性方式提供。實(shí)施例實(shí)施例1對(duì)IgG免疫球蛋白鉸鏈結(jié)構(gòu)域和/或CH2結(jié)構(gòu)域當(dāng)中的環(huán)的修飾能賦予改進(jìn)的FcR結(jié)合親和力IgG類(lèi)抗體的成員能特異性結(jié)合CD16(FcRyin)。構(gòu)建了示例性IgG抗體的環(huán)結(jié)構(gòu)域當(dāng)中的突變變化，以改變IgG對(duì)其關(guān)聯(lián)Fc受體CD16的結(jié)合親和力。特異性靶向的是CH2IgG結(jié)構(gòu)域的四個(gè)在兩個(gè)界面4妄觸CD16分子的環(huán)。基于SondermamP.efa/.，iVafwre楊,3):267-73(2000)所描述的晶體結(jié)構(gòu)，第一個(gè)界面涉及CD16與CH2的a鏈的鉸鏈區(qū)環(huán)和FG環(huán)的相互作用。第二個(gè)界面涉及CD16分子與CH2的(3鏈的鉸鏈區(qū)環(huán)、BC環(huán)、DE環(huán)(即碳水化合物環(huán))和FG環(huán)的相互作用。這些接觸位點(diǎn)的示意圖見(jiàn)圖1。應(yīng)用插入誘變來(lái)在以下三個(gè)非碳水化合物環(huán)當(dāng)中的兩個(gè)界面產(chǎn)52生變化(l)鉸鏈區(qū)環(huán)、(2)BC環(huán)和(3)FG環(huán)。這種插入突變的文庫(kù)適用于選擇具有所需的對(duì)一個(gè)或多個(gè)FcRy受體的結(jié)合親和力的個(gè)體突變體。圖2中的指向下方的箭頭表示供摻入氨基酸插入以獲得才艮據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的插入突變體的代表性位置。插入突變體的文庫(kù)是通過(guò)將多核苷酸序列插入在三個(gè)鉸鏈區(qū)的每一個(gè)當(dāng)中的NWN序列編碼區(qū)當(dāng)中來(lái)構(gòu)建。文庫(kù)1A、1B和1C在鉸鏈區(qū)環(huán)制作，文庫(kù)2A和2B在BC環(huán)制作，文庫(kù)3A、3B和3C在FG環(huán)制作。共含有96個(gè)成員的文庫(kù)是通過(guò)將12個(gè)獨(dú)特序列插入在8個(gè)不同位置的每一個(gè)來(lái)構(gòu)建。具有長(zhǎng)的或體積大的側(cè)鏈的氨基酸苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)、酪氨酸00、組氨酸(H)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、賴(lài)氨酸(K)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。文庫(kù)1A、1B、1C、2A和2B的每一個(gè)的cDNA序列，是用重疊PCR延伸方法采用6個(gè)寡核苷酸引物(序列在表3中提供)來(lái)構(gòu)建。用于產(chǎn)生文庫(kù)1A的寡核苷酸是LiblA_Fl、LiblA_F2、LiblA—F3、LiblARl、LiblAR2和LiblAR3。用于產(chǎn)生文庫(kù)IB的寡核苷酸，—*~除了寡核苷酸LiMB—F2替代LiblA—F2和LiMB—Rl替代LiblA_Rl外，所有的寡核苷酸都相同。用于產(chǎn)生文庫(kù)LiblC的寡核苷酸，同樣除了寡核苷酸LiblC—F2替代LiblA—F2和LiblC—Rl替代LiblA—Rl外，所有的寡核苷酸都相同。用于產(chǎn)生文庫(kù)2A的寡核苷酸是LiblA_Fl、Lib2A—F2、Lib2A—F3、Lib2A—Rl、Lib2A—R2和LiblA—R3。用于產(chǎn)生文庫(kù)2B的寡核苷酸,所用的寡核苷酸與文庫(kù)2A所用的相同，例外的是oligoLib2B—F3替代Lib2A—F3和寡核苷酸Lit^B—R2替代oligoUb2A一R2。對(duì)于每個(gè)文庫(kù)，將6個(gè)濃度20nM的長(zhǎng)寡核苷酸引物與濃度1mM的兩個(gè)短末端寡核苷酸引物(包含Bci-1的限制位點(diǎn)(正向引物)和Sac-II的限制位點(diǎn)(反向引物》進(jìn)行混合。用Invitrogensupermix聚合酶(Carlsbad,CA)，采用以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)(a)初始94。C解鏈1分鐘，(b)94。Cl分鐘，50°C2分鐘，72。C3分鐘，30個(gè)循環(huán)。表3用以產(chǎn)生抗體文庫(kù)1A、1B、1C、2A和2B的寡核苷酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>將擴(kuò)增的片段連接到Invitrogen的TOPO載體中，并轉(zhuǎn)化到TOP10細(xì)菌細(xì)胞中。匯集超過(guò)200個(gè)菌落，通過(guò)對(duì)15個(gè)菌落進(jìn)行序列分析來(lái)確定每個(gè)文庫(kù)的復(fù)雜度(complexity)。然后將各片段用Bci-I和Sac-II消化，并連接到Bci-1/Sac-II消化的pD18表達(dá)載體中，該載體編碼抗CD20小模塊免疫藥物產(chǎn)品(SMIPTM產(chǎn)品)，且經(jīng)基因工程法除去了額外的Sac-II限制位點(diǎn)，及經(jīng)基因工程法引入了終止密碼子和獨(dú)特的限制位點(diǎn)(Not-I),該Not-I限制位點(diǎn)能使得含有野生型CH2結(jié)構(gòu)域的背景載體可以線性化。文庫(kù)3A、3B和3C的基因用Stratagene(LaJolk，CA)的Quikchange方法來(lái)構(gòu)建。設(shè)計(jì)了33個(gè)堿基對(duì)的正義和反義寡核苷酸引物，以促進(jìn)編碼氨基酸序列NWN(即天冬酰胺-色氨酸-天冬酰胺)的核苷酸序列的摻入。這些寡核苷酸引物的序列在表4中給出。文庫(kù)3A的寡核苷酸是Lib3A-F和Lib3A-R。文庫(kù)3B的寡核苷酸是Lib3B-F和Lib3B-R。文庫(kù)3C的寡核苦酸是Lib3C-F和Lib3C-R。表4用以產(chǎn)生抗體文庫(kù)3A、3B和3C的寡核香酸引物寡核苷酸名稱(chēng)SEQIDNO:序列l(wèi)ib3A-F46gtctccaacaaagccnwnctcccagcccccatclib3A-R47GATGGGGGCTGGGAGNWNGGCTTTGTTGGAGACLib3B-F48cccaacaaagccctcnwnccagcccccatcgagLib3B-R49CTCGATGGGGGCTGGNWNGAGGGCTTTGTTGGAGLib3C-F50cacaaagccctcccanwngcccccatcgagaaaacLib3C-R51GTTTTCTCGATGGGGGCNWNTGGGAGGGCTTTGTTG對(duì)于每個(gè)文庫(kù)，100jiLPCR反應(yīng)中含有20ng的模版DNA(即編碼CD37特異性小模塊免疫藥物產(chǎn)品(SMIPTM產(chǎn)品)的pD18表達(dá)載體、各125ng的正向和反向寡核苷酸引物、500nM的dNTP和2.5單位的StratageneUltraPfliDNA。采用以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)(a)初始95°C解鏈1分鐘，(b)95。Cl分鐘，60°Cl分鐘，68。C6.5分鐘，18個(gè)循環(huán)。每個(gè)PCR反應(yīng)后，將野生型載體通過(guò)與限制性?xún)?nèi)切核酸酶Dpn-I溫育2小時(shí)進(jìn)行消化。然后將DNA混合物轉(zhuǎn)化到TOP10細(xì)菌細(xì)胞中。每個(gè)文庫(kù)匯集超過(guò)200個(gè)菌落，通過(guò)對(duì)15個(gè)菌落進(jìn)行序列分析來(lái)確定每個(gè)文庫(kù)的復(fù)雜度。將各文庫(kù)用Sac-II和Bsr-Gl限制性?xún)?nèi)切核酸酶進(jìn)行消化并連接到pD18中，該pD18具有抗Cd37前末端(anti-CD37frontend)、額外的Sac-II位點(diǎn)、終止密碼子和獨(dú)特的Notl限制位點(diǎn)，該Not-I限制位點(diǎn)能使含有野生型CH2序列的背景載體線性化。圖3。在96孔板或24孔板中將每個(gè)文庫(kù)的成員克隆在COS細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。各克隆與CD16的結(jié)合可這樣進(jìn)行測(cè)試采用具有人(HuIg)或鼠(MuIg)免疫J求蛋白尾(tail)的生物素?；疌D16，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方法篩選各個(gè)候選蛋白質(zhì)，按該方法，各板包被著A蛋白，加入含有各個(gè)候選蛋白質(zhì)的.各上清液，然后加入CD16HuIg-生物素和鏈霉親和55素-HRP。然后可選擇出與相應(yīng)的野生型SMIPTM產(chǎn)品相比具有更高的對(duì)CD16的特異性結(jié)合親和力的分子，以供在ADCC測(cè)定中作進(jìn)一步的鑒定和供與A蛋白進(jìn)行相互作用。實(shí)施例2對(duì)IgG免疫球蛋白CH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中的環(huán)的修飾能賦予獨(dú)特的結(jié)合特異性本實(shí)施例公開(kāi)IgGCH3區(qū)當(dāng)中的示例性修飾，該修飾能提供新的非天然的識(shí)別表面，并因此提供新的非天然的結(jié)合特異性。對(duì)IgG的CH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中的幾個(gè)環(huán)進(jìn)行基因工程改造以提供IgA特異性結(jié)合相互作用(在本文中稱(chēng)為IgG/A成環(huán)作用(looper))。以下三種IgG/A成環(huán)作用(looper)構(gòu)建物的表達(dá)在Cos細(xì)胞中進(jìn)行(a)IgGCH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中的IgG氨基酸被來(lái)自IgACH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸以及CD環(huán)當(dāng)中的兩個(gè)另外的氨基酸所替代，該野生型IgA免疫^(guò)泉蛋白中的氨基酸直接接觸Fca-受體(即CD89);(b)IgGCH3FG環(huán)結(jié)構(gòu)域當(dāng)中的IgG氨基酸被來(lái)自IgACH3FG環(huán)結(jié)構(gòu)域以及其他接觸Fca-受體的氨基酸所替代；和(c)IgGCH3CD環(huán)結(jié)構(gòu)域當(dāng)中的IgG氨基酸被來(lái)自CH3CD環(huán)結(jié)構(gòu)域的氨基酸以及其他接觸Fca-受體的氬基酸所替代。在所有情況中，每個(gè)所得的突變IgGSMIP，產(chǎn)品的前末端是人源化2H7-0讓4。FcRa受體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合特異性和/或親和力是通過(guò)改變CH3的CD環(huán)和FG環(huán)處的氨基酸殘基來(lái)修飾。圖1顯示IgG和IgA的CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的序列比對(duì)。當(dāng)骨架疊合時(shí)由均方根(RMS)偏差為1.7A表明，IgG和IgA的三級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似。該三種基因用重疊PCR延伸方法進(jìn)行構(gòu)建。對(duì)于每種基因形式，將一組4個(gè)濃度20nM的長(zhǎng)寡核苷酸與兩個(gè)濃度1uM的短末端寡核普酸(短F和短R)進(jìn)行混合。用Invitrogensupermix聚合酶采用以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)(1)初始94°C解鏈1分鐘和(2)94°C1分鐘，50°C2分鐘和72°C3分鐘，30個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增的片段用Bsr-Gl和Xba-I消化并插入到pD18載體中，該載體攜有人源化抗CD20SMIPTM產(chǎn)品(018014),經(jīng)Bsr-Gl和Xba-I消化以除去野生型CH3結(jié)構(gòu)域。各寡核苷酸的序列在表5中給出。用以修飾IgG免疫球蛋白CH3結(jié)構(gòu)域當(dāng)中的環(huán)的寡核苷酸引物寡核苷酸名稱(chēng)SEQIDNO:序列Flverl52cagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgsccaagaacc郷F2verl53agcttctatccaagcgacatcgcc魄cgttgggagagcaatgggcaggagctgccgF3verl54ccccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaaF4-verl55gcttctcctgcatggtgatgcatgaggctctgccactcgccttcacgcagaagagccRlverl56tgcttggatagaagcctttgaccaggcaggtcaggctgacctggttcttggtcagctR2verl57cgagtccagcacgggaggc魄gtcttgtagttgttctccggcagctcctgcccattR3verl58cccatgcaggagaagacgttcccctgctgccacctgctcttgtccacggtgagcttgR4verl59cgctataatctagatcatttacccggagacagggagaggctcttctgcgtgaagg短-F60cagaaccacaggtgtacaccctgccc短-R61cctataatctagatcatttaccF4ver262gtcttctcctgcatg魄ggccacgaggccctgccgctggccttcacacagaagaccaR4ver263cgctataatctagatcatttacccgccaagcggtcgatggtcttctgtgtgaaggF2ver364aggcttctatccaagcgacatcgccgttcgctggctgcaggggtcacaggagctgcccR2ver365cgagtccagcacgggaggcgtggtcttgtacttctcgcggggcagctcctgtgaccc通過(guò)PCR誘變，將靠近CH2區(qū)的起始處的MI氨基酸替代成LL。這兩個(gè)氨基酸是IgA同種型的免疫球蛋白與其關(guān)聯(lián)Fc受體CD89(FcaR)之間的另外的接觸點(diǎn)。參見(jiàn)圖2。對(duì)三個(gè)經(jīng)修飾的IgG基SMIPTM產(chǎn)品的每一個(gè)的序列進(jìn)行了確證，相應(yīng)的pD18載體轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)。通過(guò)將Wil2S染色和流式細(xì)胞術(shù)分析，4全查上清液的與CD20的結(jié)合活性。CD20染色與2H7SMIPCH3突變用于與IgA受體的結(jié)合(CD20stainingwith2H7SMIPCH3mutatedforbindingtoIgAreceptor)。57首先將上清液與Wii2S細(xì)胞在冰上溫育30分鐘。將細(xì)胞洗滌兩次，加入PE綴合的抗人IgG的1:100稀釋液。再次洗滌細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定每個(gè)樣品的MF。與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得知，三個(gè)經(jīng)4奮飾的免疫球蛋白的每一個(gè)都以大約2-4嗎/mL的水平表達(dá)。為測(cè)試這些分子與IgA受體的結(jié)合，將Wil2S細(xì)胞與上清液溫育30分鐘，用1%BSA/PBS洗滌兩次，加入5pg/ml的CD89(IgA受體)人Ig于PBS中的溶液，再溫育30分鐘。再次洗滌細(xì)胞，加入50pL1:100稀釋的PE綴合A蛋白于1%BSA/PBS中的溶液，溫育30分鐘。將樣品用1。/。BSA/PBS洗滌，重懸在100ml的洗滌緩沖液中。然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)樣品讀it。三個(gè)經(jīng)修飾的免疫球蛋白的每一個(gè)都以大約2-4^g/ml的水平表達(dá)，用A蛋白親和層析進(jìn)4亍純化，并采用CD89HuIg和PE標(biāo)記的A蛋白通過(guò)常規(guī)的流式細(xì)胞術(shù)方法，對(duì)它們與Wil2S細(xì)胞和與CD89的特異性結(jié)合進(jìn)行鑒定。權(quán)利要求1.一種包含一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白恒定區(qū)鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中所述一個(gè)或多個(gè)鉸鏈和/或恒定區(qū)CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入和/或缺失，其中所述結(jié)合蛋白顯示出改變了的對(duì)一種或多種關(guān)聯(lián)Fc受體的結(jié)合親和力。2.權(quán)利要求1的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白選自抗體、抗體片段和小模塊免疫藥物產(chǎn)品(smiptm產(chǎn)品)。3.權(quán)利要求1的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的IgG免疫球蛋白重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，其中所述一個(gè)或多個(gè)IgG免疫球蛋白重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域是通過(guò)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)修飾，其中所述經(jīng)修飾的結(jié)合蛋白以較高的親和力結(jié)合選自FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRHI(CD16)的Fc受體，所述豐支高親和力是相比于包含未修^飾的IgG免疫球蛋白重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)結(jié)合蛋白而4.權(quán)利要求3的結(jié)合蛋白，其中所述經(jīng)修飾的IgG結(jié)構(gòu)域是經(jīng)修飾的IgG!CH2結(jié)構(gòu)域、經(jīng)修飾的IgG2CH2結(jié)構(gòu)域、經(jīng)修飾的IgG3CH2結(jié)構(gòu)域和/或經(jīng)修飾的IgG4CH2結(jié)構(gòu)域。5.權(quán)利要求4的結(jié)合蛋白，其中所述經(jīng)修飾的IgG結(jié)構(gòu)域是經(jīng)修飾的IgG!CH2結(jié)構(gòu)域和/或經(jīng)修飾的IgG3CH2結(jié)構(gòu)域，且其中所述經(jīng)修飾的IgG,CH2結(jié)構(gòu)域和/或經(jīng)修飾的IgG3CH2結(jié)構(gòu)域在IgG,和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域的鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)L-L-G-G-P當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或氨基酸插入。6.權(quán)利要求5的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白在鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)L-L-G-G-P當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)插入。7.權(quán)利要求6的結(jié)合蛋白，其中所述鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)在位置"*"處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入，使得該鉸鏈近側(cè)環(huán)結(jié)構(gòu)包含選自L-L-*-G-G-P、L-L-G-氣G-P和L-L-G-G入P的序列，其中"*"表示插入至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。8.權(quán)利要求7的結(jié)合蛋白，其中所述"*"包含一個(gè)或多個(gè)選自Ala、Gly、Ile、Leu和Val的氨基酸。9.權(quán)利要求4的結(jié)合蛋白，其中所述經(jīng)》務(wù)飾的IgG結(jié)構(gòu)域是經(jīng)修飾的IgGtCH2結(jié)構(gòu)域、經(jīng)修飾的IgG2CH2結(jié)構(gòu)域和/或經(jīng)修飾的IgG3CH2結(jié)構(gòu)域，且其中所述經(jīng)修飾的IgG,CH2結(jié)構(gòu)域、經(jīng)修飾的IgG2CH2結(jié)構(gòu)域和/或經(jīng)修飾的IgG3CH2結(jié)構(gòu)域在IgG。IgG2和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域的BC環(huán)結(jié)構(gòu)D-V-S-H-E當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或氨基酸插入。10.權(quán)利要求9的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白在BC環(huán)結(jié)構(gòu)D-V-S-H-E當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)插入。11.權(quán)利要求10的結(jié)合蛋白，其中所述BC環(huán)結(jié)構(gòu)在位置"*"處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入，使得該BC環(huán)結(jié)構(gòu)包含選自D漏V-、S-H-E和D-V-S-、H-E的序列,其中"*"表示插入至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。12.權(quán)利要求11的結(jié)合蛋白，其中所述"*"包含一個(gè)或多個(gè)選自Ala、Gly、Ile、Leu和Vai的氨基酸。13.權(quán)利要求4的結(jié)合蛋白，其中所述經(jīng)修飾的IgG結(jié)構(gòu)域是經(jīng)修飾的IgG,CH2結(jié)構(gòu)域和/或經(jīng)修飾的IgG3CH2結(jié)構(gòu)域，且其中所述經(jīng)修飾的IgGtCH2結(jié)構(gòu)域和/或經(jīng)修飾的IgG3結(jié)構(gòu)域在IgG!和/或IgG3CH2結(jié)構(gòu)域的FG環(huán)結(jié)構(gòu)A-L-P-A-P-I當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失和/或氨基酸插入。14.權(quán)利要求13的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白在FG環(huán)結(jié)構(gòu)A-L-P-A-P-I當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)插入。15.權(quán)利要求14的結(jié)合蛋白，其中所述FG環(huán)結(jié)構(gòu)在位置w處包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入，使得所述BC環(huán)結(jié)構(gòu)包含選自A-L-*-P-A-P-I、A-L-P-、A-P-I和A-L-P-A-、P-I的序列，其中"*，，表示插入至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。16.權(quán)利要求15的結(jié)合蛋白，其中所述"*"包含一個(gè)或多個(gè)選自Ala、Gly、Ile、Leu和Val的tt酸。17.權(quán)利要求1的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的IgG重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，其中所述一個(gè)或多個(gè)重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域是通過(guò)在天然糖基化序列的近側(cè)和/或遠(yuǎn)側(cè)的一個(gè)或多個(gè)位置處插入一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化序列來(lái)修飾，該糖基化序列足以實(shí)現(xiàn)在插入位置處的N-連接糖基化，其中所述經(jīng)修飾的結(jié)合蛋白能以較高的親和力結(jié)合選自FcyRI(CD64)、Fc丫RII(CD32)和FcyRIII(CD16)的Fc受體，所述較高親和力是相比于包含未修飾的IgG免疫球蛋白重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)結(jié)合蛋白而言。18.權(quán)利要求17的結(jié)合蛋白，其中所述4史鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域是包含一個(gè)或多個(gè)N-連接糖基化序列N-X-(S/T)的插入的IgG!鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，IgG2鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，IgG3鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，和/或IgG4鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，其中X是處在相應(yīng)的天然IgG免疫球蛋白鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中的N-連接糖基化位點(diǎn)的近側(cè)和/或遠(yuǎn)側(cè)的任何氨基酸。19.權(quán)利要求18的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包含IgGCH2結(jié)構(gòu)域，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)N-X-(S/T)序列的插入，該插入在所述IgGCH2結(jié)構(gòu)域的DE環(huán)當(dāng)中的距天然N-S-T序列的氨基末端和/或羧基末端0-100個(gè)氨基酸的近鄰或當(dāng)中。20.權(quán)利要求19的結(jié)合蛋白，其中所述IgGCH2結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列N-S-T,這個(gè)序列被插入到距天然N-S-T序列的氨基末端和/或羧基末端0-100個(gè)氨基酸的近鄰或當(dāng)中，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z被修飾成(AAa)-N-S-T-(AAb)-N-S-T-(AAC)，其中AAa、AAb和AA。每一個(gè)獨(dú)立地從1-100個(gè)氨基酸指定。21.權(quán)利要求20的結(jié)合蛋白，其中所述IgGCH2結(jié)構(gòu)域被修飾，使得氨基酸序列N-S-T被插入到距天然N-S-T序列一個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z^皮修飾成X-N-S-T-Z-N-S-T-Z,其中X和Z獨(dú)立選自Tyr(Y)和Phe(F)。22.權(quán)利要求18的結(jié)合蛋白，其中所述N-連接糖基化序列被插入在所述CH2結(jié)構(gòu)域當(dāng)中的天然N-連接糖基化位點(diǎn)的遠(yuǎn)側(cè)的一個(gè)或多個(gè)IgGi、IgG2、IgG3和/或IgG4CH3結(jié)構(gòu)域的BC環(huán)當(dāng)中，使得天然氨基酸序列Y-P-S-D-I-A被修飾成Y-P-N-S-T-D-I-A或被修飾成Y-N-S-T畫(huà)P-S-D-I-A。23.權(quán)利要求3的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包含選自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的第一免疫球蛋白類(lèi)別的一個(gè)或多個(gè)重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，其中該結(jié)合蛋白通過(guò)在所述第一免疫球蛋白類(lèi)別的一個(gè)或多個(gè)重鏈鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的一級(jí)氨基,列中進(jìn)行氨基酸替代和/或氨基酸插入而被修飾，以產(chǎn)生能夠結(jié)合第二免疫球蛋白類(lèi)別的一個(gè)或多個(gè)Fc受體的結(jié)合蛋白，其中所述第二免疫球蛋白類(lèi)別與所述第一免疫球蛋白類(lèi)別不同。24.權(quán)利要求23的結(jié)合蛋白，其中所述第一免疫球蛋白類(lèi)別是IgG,且其中所述笫二免疫球蛋白類(lèi)別是IgA。25.權(quán)利要求24的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白能夠特異性結(jié)合(a)選自FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和Fc^RIII(CD16)的Fc受體，和(b)FcaR(CD89)。26.權(quán)利要求25的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白在IgGCH3FG環(huán)當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換和/或在IgGCH3CD環(huán)當(dāng)中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換。27.權(quán)利要求26的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包含這樣的替代，該替代是用包含氨基酸序列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgACH3FG環(huán)或其相應(yīng)部分替代包含氨基酸序列C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q的IgGCH3FG環(huán)或其部分。28.權(quán)利要求27的結(jié)合蛋白，其中所迷結(jié)合蛋白包含這樣的替代，該替代是用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgACH3CD環(huán)或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgGCH3CD環(huán)或其部分。29.權(quán)利要求28的結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包含這樣的替代，該替代是用包含氨基酸序列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgACH3FG環(huán)或其相應(yīng)部分替代包含氨基酸序列C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q的IgGCH3FG環(huán)或其部分，和用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgACH3CD環(huán)或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgGCH3CD環(huán)或其部分。30.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含這樣的置換，該置換是用氨基酸Leu置換序列K-D-T-L-M-I-S-R-T當(dāng)中CH3氨基酸位置28處的IgG重鏈CH3氨基酸Met,使得所述結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含氨基酸序列K-D-T-L-L-I-S-R-T。31.權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)的結(jié)合蛋白，所述結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含這樣的置換，該置換是用氨基酸Arg置換序列D-I-A-V-E-W-E-S-N當(dāng)中CH3氨基酸位置157處的IgG重鏈CH3氨基酸Glu,使得所述結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含氨基酸序列D-I-A-V-R-W-E-S-N。全文摘要本發(fā)明提供包含一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白Fc區(qū)鉸鏈、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合蛋白，其中所述一個(gè)或多個(gè)鉸鏈和/或恒定區(qū)CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域被修飾，以改變結(jié)合蛋白對(duì)關(guān)聯(lián)受體(例如Fc受體)的結(jié)合親和力和/或特異性，和/或賦予該鉸鏈和/或恒定區(qū)一種或多種新的結(jié)合特異性，這些新的結(jié)合特異性是相應(yīng)的未修飾結(jié)合蛋白所不具有的(例如對(duì)與未修飾結(jié)合蛋白所特異性結(jié)合的關(guān)聯(lián)受體類(lèi)別不同的關(guān)聯(lián)受體類(lèi)別的親和力)。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合蛋白包括例如經(jīng)修飾的抗體、抗體片段、重組結(jié)合蛋白和分子工程改造的結(jié)合結(jié)構(gòu)域-免疫球蛋白融合蛋白，包括小模塊免疫藥物產(chǎn)品(SMIP^TM產(chǎn)品)在內(nèi)。文檔編號(hào)C07K16/00GK101466733SQ200780022215公開(kāi)日2009年6月24日申請(qǐng)日期2007年4月13日優(yōu)先權(quán)日2006年4月14日發(fā)明者E·S·埃斯普林,P·A·湯普遜,P·R·鮑姆,P·譚申請(qǐng)人:特魯比昂藥品公司