專利名稱：Iv型膠原樣免疫反應性多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及IV型膠原樣免疫反應性多肽及其抗體、IV型膠
原樣免疫反應性多肽選出方法、免疫反應性抗體或免疫反應性 多肽的篩選方法、腎炎模型、慢性腎炎的檢測方法、疫苗以及 腎炎治療藥。
背景技術：
IV型膠原尚未被完全闡明。IV型膠原的眾多分子相互結 合，多種類的成分關聯(lián)其上，由此形成組織基底膜。另外，因IV
型膠原為組織基底膜的主要成分，從而也被稱為基底膜膠原。
IV型膠原有al鏈~ a6鏈6種異構體，1分子IV型膠原由3種a鏈構 成。3種a鏈的構成因組織而異，胎盤來源的基底膜中富含al、 (x2鏈，在全身各組織的基底膜中都可看到。腎來源的基底膜特 異性富含a3鏈~ a6鏈。
1分子IV型膠原分為三個區(qū)域，從N末端起的具有三螺旋結 構的7S和主三螺旋區(qū)(TH)、位于C末端區(qū)域的非螺旋結構的 NC1。從生物體組織中提取時，根據(jù)不同處理方法所得的區(qū)域 不同， 一般方法為用胃蛋白酶處理得到三螺旋區(qū)域，用細菌 來源的膠原酶處理得到NC1 (非專利文獻l)。
另 一方面，腎炎根據(jù)癥狀大致分為"急性腎炎"與"慢性腎 炎"，各種各樣的詳細分類的腎疾病由?？漆t(yī)生命名。因通常稱
為腎炎的疾病指"慢性腎炎"，本發(fā)明中在無特別說明的情況下 將"腎炎"與"慢性腎炎"作為同義使用。"慢性腎炎"包括所謂的 慢性腎炎、IgA腎病、微小病變型腎病、膜性腎病、繼發(fā)性腎 病中的糖尿病性腎病、高血壓性腎病等，但不限定于此。腎炎
5每年新增透析案例3萬人，無論是對于病人的生活質(zhì)量(QOL)、 還是對于國民醫(yī)療費(每l例透析費用為600萬日元/年)都是極 大的負擔。透析的技術不斷進步，但在發(fā)病的早期確定腎病變、 直接治療腎炎的藥劑尚不存在。其原因很大程度上是由于腎炎 的發(fā)病機制尚未#皮闡明。
另外，腎炎存在腎炎特有的抗原，世界上正在對各種抗原 物質(zhì)進行研究(非專利文獻2)。若抗原得到確定，就可望以之 為靶標物質(zhì)進行診斷試劑與腎炎治療劑的開發(fā)。已確定抗原的 p眷一例子有肺出血-腎炎綜合癥(Goodpasture's syndrome )(狹 義的抗腎小球基底膜(GBM)抗體腎炎)。有報告指出該抗 原存在于a3鏈NCl的C末端36位氨基酸殘基與N末端起的氨基 酸序列17- 31、以及127- 141 (非專利文獻3)等，任意一種抗 原的該部位都位于a3鏈上。另外，a3鏈上的17-31 (氨基酸殘 基數(shù)15個)以及127- 141 (氨基酸殘基數(shù)15個)為從嵌合型al /a3NCl檢索到的。
作為罕見的腎炎的肺出血-腎炎綜合癥屬于"急性腎炎"，因 典型情況下2周左右即發(fā)展為重癥狀態(tài)，必須迅速進行確診。確 診中，使用腎活檢的免疫組化染色，根據(jù)抗GBM的自身抗體免 疫球蛋白I g G有無沉淀來判斷。
非專利文獻l: Extracelluar Matrix IRL PRESS/OXFORD UNIVERSITY PRESS Oxford New York
非專利文獻2:腎h透析(腎與透析)2005 July Vol59 No.l 東京醫(yī)學社
非專利文獻3: J.Biol Chem ( 1993 ) 268， 26033 — 2603
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題然而該檢驗存在如下問題在樣品采集時對患者造成痛苦 并具危險性，免疫組化染色中需要病理學專家的高度診斷能力。
因此，作為簡便方法，可使用對血中出現(xiàn)的自身抗體進行 ;險測的ELISA (酶聯(lián)免疫吸附試^r )試劑盒(商品名氺7 口 7力，一 GBM、進口商二 、乂 、> 3 —股份有限公司、銷售商二 7?？诠煞萦邢薰?。然而，根據(jù)上述ELISA試劑盒附帶的說 明書以及所引用的文獻(臨床機器*試薬(臨床設備'試劑)、 Vol.20 No.3、 367 - 374 ( 1997 )),只有肺出血-腎炎綜合癥的 自身抗體被高濃度地檢測到，其他腎炎時僅能檢測到與健康者 同樣的低水平。根據(jù)該說明書，使用的抗原為牛GBM抗原，GBM 由以IV型膠原為主要成分的多種成分組成，考慮大小的話，為 GBM〉 IV型月交原〉NC1 〉 a3《連的NCl 〉上述的各氨基酸殘基 (抗原)。使用牛GBM作為抗原時，該巨大區(qū)域中沒有其他的 腎炎的抗原，作為腎炎的檢測是不充分的。另外，現(xiàn)在雖為日 本唯一獲得許可并在醫(yī)保范圍內(nèi)的診斷試劑，但存在因價格昂 貴且為進口商品而使用困難的問題。
因此本發(fā)明的目的在于提供對腎炎的檢測有用的IV型膠 原樣免疫反應性多肽及其抗體、IV型膠原樣免疫反應性多肽選 出方法、免疫反應性抗體與免疫反應性多肽的篩選方法、腎炎 模型、慢性腎炎的檢測方法、以及疫苗與腎炎治療藥。
用于解決問題的手段
本發(fā)明人為解決上述問題，在伴隨腎病、其他疾病的繼發(fā) 性腎病的治療藥開發(fā)與早期檢測方法上經(jīng)長期努力專心研究， 通過使用慢性腎炎來源的生物試樣找出腎炎的抗原部位，確立 了IV型膠原樣免疫反應性多肽及其抗體、IV型膠原樣免疫反應 性多肽選出方法、免疫反應性抗體與免疫反應性多肽的篩選方 法、腎炎模型、慢性腎炎的檢測方法、以及疫苗與腎炎治療藥，
7完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的iv型膠原樣免疫反應性多肽，其特征在于，
與分離出的慢性腎炎來源的生物試樣發(fā)生免疫反應。
另外，本發(fā)明的IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體，其特 征在于，與上述IV型膠原樣免疫反應性多肽發(fā)生免疫反應。
此外，本發(fā)明的IV型膠原樣免疫反應性多肽選出方法，其
特征在于，所述方法以分離出的慢性腎炎來源的生物試樣為配 體，選出與上述慢性腎炎來源的生物試樣發(fā)生免疫反應的上述
IV型膠原樣免疫反應性多肽。
此外，本發(fā)明的免疫反應性抗體的篩選方法，其特征在于，
使用上述IV型膠原樣免疫反應性多肽。
此外，本發(fā)明的免疫反應性多肽的篩選方法，其特征在于，
使用上述IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體。
此外，本發(fā)明的腎炎模型，其特征在于，以選自上述IV型 膠原樣免疫反應性多肽及上述IV型膠原樣免疫反應性多肽的
抗體中的任意 一種以上為引發(fā)原。
此外，本發(fā)明的慢性腎炎的檢測方法，其特征在于，使用
選自上述IV型膠原樣免疫反應性多肽及上述IV型膠原樣免疫
反應性多肽的抗體中的任意一種以上。
此外，本發(fā)明的疫苗，其特征在于，使用選自上述IV型膠 原樣免疫反應性多肽及上述IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗
體所組成的組中的任意一種以上。另外，腎炎治療藥，其特征 在于，含有該疫苗。
發(fā)明效果
通過本發(fā)明，可提供對腎炎的檢測有用的IV型膠原樣免疫 反應性多肽及其抗體、IV型膠原樣免疫反應性多肽選出方法、
免疫反應性抗體與免疫反應性多肽的篩選方法、腎炎模型、慢性腎炎的檢測方法、以及疫苗與腎炎治療藥。


圖l為示意健康者與尿中白蛋白值高者的比較(抗NC1抗 體)的圖。
圖2為示意不同疾病抗NC1抗體的一覽的圖。 圖3為示意同 一腎炎患者抗三鏈抗體與抗NC1抗體的關聯(lián) 的圖。
圖4為示意慢性腎炎TD 3 8 、糖尿病性腎炎TD4 2與健康者 (TD31 ~ 37、 TD39 ~ 41 )的測定比壽交it才居(4元NCl4元體)的圖。 圖5為示意人NCl的a3鏈、a4鏈、a5鏈、a6鏈的圖。 圖6為示意慢性腎炎No38、糖尿病性腎炎No42、 IgA腎病與 健康者No31、 32、 33的NC1樣抗原性的比較的圖。
具體實施例方式
以下對本發(fā)明的IV型膠原樣免疫反應性多肽進行說明。 本發(fā)明的IV型膠原樣免疫反應性多肽特征在于與分離出 的慢性腎炎來源的生物試樣發(fā)生免疫反應。所述免疫反應為IV
型膠原樣免疫反應性多肽為抗原，分離出的慢性腎炎來源的生 物試樣為抗體的免疫反應。免疫反應不限定于酶免疫反應，另
外還含AB法、RIA,免疫發(fā)光法、沉淀反應、凝集反應等，酶 標記抗體可為多克隆抗體或單克隆抗體，另外也可為將其用放 射性物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)標記后的標記物、無標記物。反應形式不 限定于夾心法(sandwich method )，也可為竟爭法等。作為反 應板的替代，可使用玻璃、磁性物質(zhì)、乳膠，也可沒有載體不 使用固相法。
另夕卜，本發(fā)明中"慢性腎炎"包括所謂的慢性腎炎、IgA腎病、
9微小病變型腎病、膜性腎病、繼發(fā)性腎病中的糖尿病性腎病、 高血壓性腎病等，但不限定于此。
此外，本發(fā)明的IV型膠原樣免疫反應性多肽只要與慢性腎 炎來源的生物試樣發(fā)生免疫反應即可，此外不受特別限定，但
優(yōu)選具有選自下組中的至少一個以上作為結構a鏈的l鏈~ 6 鏈中的任意l條鏈以上、作為結構區(qū)域的選自7S、主三螺旋區(qū) 及NC1中的任意 一種以上、以及作為結構多肽的氨基酸數(shù)為3 個以上、35個以下。更優(yōu)選為a5鏈，更優(yōu)選結構區(qū)域為NC1。 另外，從費用與效率出發(fā)，優(yōu)選該IV型膠原樣免疫反應性多肽 的多肽長度為3個以上、35個以下氨基酸，同時考慮抗體制備的 容易性，最優(yōu)選為10個 20個。
本發(fā)明的IV型膠原樣免疫反應性多肽，與IV型膠原同樣與 分離出的慢性腎炎來源的生物試樣發(fā)生免疫反應。另外，優(yōu)選 與該IV型膠原的a5鏈的氨基酸序列有同源性。
此外，本發(fā)明的IV型膠原樣免疫反應性多肽的結構區(qū)域優(yōu)
選含有N C1來源的下述氨基酸序列中的任意 一 個以上，
1) GRGTC NYYAN SYSFW LATVD No. ypl3
2) SCLEE FRSAP FIECH GRGTC No. ypl2
3) GWDSL WIGYS FMMHT SAGAE No. yplO
4) PFISR CAVCE APAW IAVHS No. yp08
5) STMPF MFCNI NNVCN FASRN No. yp05
(式中，A表示丙氨酸，C表示半胱氨酸，D表示天冬氨酸， E表示谷氨酸，F(xiàn)表示苯丙氨酸，G表示甘氨酸，H表示組氨酸， I表示異亮氨酸，L表示亮氨酸，M表示曱硫氨酸，N表示天冬酰 胺，P表示脯氨酸，R表示精氨酸，S表示絲氨酸，T表示蘇氨酸， V表示纈氨酸，W表示色氨酸及Y表示酪氨酸，各多肽將連續(xù)的 氨基酸序列從N端起以5個為單位來進行表示)，優(yōu)選與上述氨
10基酸序列中的3個以上的氨基酸的序列有同源性。予以說明，對于氨基酸序列1 ) ~ 5 )分別給予了特定的編號(No. ypl3等)。
此外，上述分離出的慢性腎炎來源的生物試樣有抗IV型膠原抗體，并與具有選自下述所組成的組中的至少一個以上的IV型膠原發(fā)生免疫反應結構a鏈為l鏈~ 6鏈中的任意的l條鏈以上，結構區(qū)域為選自7S、主三螺旋區(qū)及NC1中的任意一種以上，以及結構多肽的氨基酸數(shù)為3個以上、35個以下。另外，該分離出的慢性腎炎來源的生物試樣只要為腎炎來源的生物試樣即可，不僅可為人腎炎來源，也可為動物腎炎來源，包括尿、血清、腎臟、腎臟的提取物及培養(yǎng)物等、但優(yōu)選為尿。動物來源的情況下，優(yōu)選與人慢性腎炎的"分離出的腎炎來源的生物試樣"對比來使用。
所述的尿在保存時優(yōu)選冷凍保存，使用時解凍后均勻分散于磷酸緩沖生理鹽水(以下稱PBS )中，離心后除去沉淀，所得的上清液用凍干機干燥，再溶解于PBS ( pH7.4)中。另外，也可使用生理鹽水或注射用蒸餾水代替PBS,為了不使滴度降低，還要進行滅菌、除菌等其他操作，即特別留心處理生物來源的制劑時操作人員應注意之處，由此能制成注射劑或內(nèi)服劑。另外，也可將結合有N C1抗原的親和色語分離柱純化后的抗體及用硫酸銨沉淀等所得的抗體再次稀釋以滿足濃度要求，也可從血清或腎臟純化抗體的免疫球蛋白。
另外，本發(fā)明的IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體，其特征在于，與上述IV型膠原樣免疫反應性多肽發(fā)生免疫反應，對于IV型膠原樣免疫反應性多肽，顯示出與分離出的慢性腎炎來源的生物試樣相同的免疫反應。
另外，本發(fā)明的IV型膠原樣免疫反應性多肽選出方法，其特征在于，以分離出的慢性腎炎來源的生物試樣為配體，選出與上述慢性腎炎來源的生物試樣發(fā)生免疫反應的上述IV型膠原樣免疫反應性多肽。通過使用分離出的慢性腎炎來源的生物試樣為配體，能選出對腎炎檢測有用的IV型膠原樣免疫反應性多肽。
本發(fā)明的IV型膠原樣免疫反應性多肽選出方法中的上述分離出的慢性腎炎來源的生物試樣及IV型膠原可使用與前面記載相同的物質(zhì)。另外，選出的IV型膠原樣免疫反應性多肽也
可使用與前面記載相同的物質(zhì)。
本發(fā)明的免疫反應性抗體的篩選方法，其特征在于，使用
上述IV型膠原樣免疫反應性多肽，優(yōu)選上述IV型膠原樣免疫反應性多肽的氨基酸數(shù)為3個以上、35個以下，更優(yōu)選為10個~ 20個。具體來說， -使用抗a5鏈NCl抗體或抗a5鏈NCl來源的多肽抗體代替上述慢性腎炎來源的生物試樣，能夠篩選出免疫反應性抗體。通過此方法，可篩選對腎炎檢測有用的免疫反應性抗體。
另外、本發(fā)明的免疫反應性多肽的篩選方法，其特征在于，使用上述IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體，優(yōu)選IV型膠原樣免疫反應性多肽的氨基酸數(shù)為3個以上、35個以下，更優(yōu)選為IO個 20個。具體來說，通過使用候補免疫反應性多肽代替a5鏈NC1來源的合成多肽，能篩選出免疫反應性多肽。通過此方法，可篩選出對腎炎檢測有用的免疫反應性多肽。
此外，本發(fā)明的腎炎模型，其特征在于，以選自上述IV型膠原樣免疫反應性多肽及上述IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體中的任意一種以上作為引發(fā)原。以往一直使用腎小球基底膜(GBM)、腎小球來源的NC1作為腎炎引發(fā)抗原。然而其為急性腎炎的模型，對人的慢性腎炎的模型來說并不適合。另夕卜，也有a3鏈來源的多肽的例子，但也為急性腎炎模型。本發(fā)明的
12腎炎模型通過使用IV型膠原樣免疫反應性多肽，廉價地得到一定的抗原，適合于制作慢性腎炎的實驗模型。
另外，以往使用抗抗原的抗體(抗血清)的腎炎引發(fā)例可
舉出抗GBM、 NC1、 a3鏈的抗體例，但均為急性腎炎才莫型。此外，尚未看到抗a5鏈的抗體，尤其是尚未看到使用抗人a5鏈的多肽的抗體的例子。與此相對，本發(fā)明的IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體作為人的慢性腎炎模型是有用的，且能夠適用。
該腎炎引發(fā)抗原特別優(yōu)選a5鏈的NC1 。腎小球來源的NC1引發(fā)的腎炎模型為急性腎炎的一種，因此，其抗NC1抗體大部分與急性腎炎的肺出血-腎炎綜合癥的自身抗體接近，優(yōu)選與人慢性腎炎的"分離出的腎炎來源的生物試樣"對比來使用。也可使用動物的糖尿病模型、高血壓模型來源的生物試樣，但與上述同樣優(yōu)選與人慢性腎炎的"分離出的腎炎來源的生物試樣"對比來使用。
此外，本發(fā)明的慢性腎炎的檢測方法，其特征在于，使用選自上述IV型膠原樣免疫反應性多肽及上述IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體中的任意一種以上。另夕卜，優(yōu)選為使用ELISA法的試劑盒，通過其可進行腎炎的早期診斷。
此外，本發(fā)明的疫苗，其特征在于，使用選自上述IV型膠原樣免疫反應性多肽及上述IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體所組成的組中的任意一種以上，可作為腎臟疾病的預防藥或治療藥使用。另外，腎炎治療藥的特征在于，含有該疫苗。本發(fā)明的疫苗或腎炎治療藥只要含上述IV型膠原樣免疫反應性多肽或上述IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體即可，不受特別限制，舉個例子，例如將ypl2等溶解于水，通過給予該溶解劑能抑制腎炎等。
此外，本發(fā)明涉及腎炎血液(也包括血清、血漿)的凈化器具，可作為醫(yī)療器具使用。原理為使腎炎血液中的目標抗體或目標抗原與固定于載體上的有吸附作用的配體(對應的抗原或抗體)接觸從而吸附除去。腎炎血液中的目標抗體為抗IV型膠原抗體、抗其結構區(qū)域抗體、抗其結構多肽(與結構多肽的長度無關)抗體時，對應的配體抗原使用與分離出的慢性腎炎來源的生物試樣發(fā)生反應的IV型膠原樣多肽。
腎炎血液中的目標抗原為IV型膠原、其結構區(qū)域、結構多肽(與結構多肽的長度無關)時，對應的配體抗體為抗IV型膠原樣多肽抗體。
配體優(yōu)選與目標抗原對應的抗體，與目標抗體對應的抗原，也可用蛋白質(zhì)A及蛋白質(zhì)G來代替與目標抗體對應的抗原，但也存在目標抗體以外的免疫球蛋白從血液中一皮除去的可能性。
腎炎血液的凈化中，優(yōu)選暫時將血液從腎炎患者的上臂靜脈取出后，用血漿分離膜(或分離機)分離為血漿成分與血細胞成分。當然也可保持血液的狀態(tài)而不分成血漿成分與血細胞成分，但靶標物質(zhì)以外的白蛋白等正常成分在體外會與額外的物質(zhì)接觸。使分離出的血漿成分通過內(nèi)部具有載體的柱子，且所述載體上固定了具有吸附作用的配體(與靶標物質(zhì)對應的抗原或抗體)，吸附除去靶標物質(zhì)后，與血細胞成分合并，回輸至體內(nèi)。這一系列的血液凈化操作無菌、機械化地進行，可作為醫(yī)療用具使用。予以說明，柱子可以分為與目標抗原對應的的抗體一主、與目標抗體對應的抗原柱。
抗體柱優(yōu)選抗a5鏈抗體柱，更優(yōu)選抗a54連NCl抗體柱，更加優(yōu)選對應于與分離出的慢性腎炎來源的生物試樣發(fā)生免疫反應的、a5鏈來源的多肽的抗體柱。
抗原柱優(yōu)選a5鏈柱，更優(yōu)選a5鏈NCl柱，更加優(yōu)選與分離出的慢性腎炎來源的生物試樣發(fā)生免疫反應的a5鏈來源的多肽的柱。
以下結合實施例詳細說明本發(fā)明。實施例
l.抗NCl抗體測定法
基于ELISA開發(fā)NC1 (牛腎小球來源，收率0.0025 % )作為抗原的抗NC1抗體測定法，測定了血清及尿。圖l為示意健康者與尿中白蛋白值高者的比較(抗NC1抗體)的圖。圖l中，虛線示意臨界值(0.072 ),設定為尿白蛋白正常血糖也正常的7例的平均OD ( 0.028 ) + 2SD ( 0.044 )。圖1的左側(Alb ( mg /mL) <30)的12例中，除尿白蛋白正常血糖也正常的例子(7例)夕卜，包括尿白蛋白正常但血糖值高的例子(5例)。結果不僅肺出血-腎炎綜合癥的血清，從尿中白蛋白值高者的血清及尿(圖l)、透析患者的血清中都高頻度地^r測出抗NC1抗體。
因此，以已診斷為腎炎的尿為樣品進行了測定。以健康者的測定平均值+ 2SD作為臨界值，腎炎樣品80%以上顯示陽性。由該結果，得出NCl并非僅是肺出血-腎炎綜合癥的抗原，也有為腎炎共同的抗原的可能性。
圖2為示意不同疾病抗NC1抗體的 一 覽的圖。慢性腎炎的發(fā)展通常緩慢地以年至十年以上為單位緩慢惡化，但與該慢性腎炎同樣通常緩慢發(fā)展的繼發(fā)性腎病中的糖尿病性腎病等也檢測到了抗NC1抗體，i貪斷名與抗NCl抗體水平看不出有特別關系(圖2)。由此，可認為腎炎有共同的抗原部位存在。
此外，將牛腎來源的具有IV型膠原三螺旋結構的三鏈區(qū)域(7S與主三螺旋區(qū)(TH),以下稱三鏈)純化，代替NC1作為抗原，測定了抗三鏈抗體。圖3為示意同一腎炎患者的抗三鏈抗體與抗NC1抗體關聯(lián)的圖?？筃C1抗體與抗三鏈抗體顯示9(T/0以上的關聯(lián)。NC1與三鏈雖具有完全不同的結構和氨基酸序列， 但對腎炎發(fā)生相同的免疫反應，表明對于同一a鏈，抗原可為 形成三鏈的7S或主三螺旋區(qū)(TH)(圖3)。
2.將分離出的慢性腎炎來源的生物試樣(以下稱生物試樣) 作為檢測抗體，通過IV型膠原找出發(fā)生反應的抗原部位的方 法。
直接使用尿作為檢測抗體的生物試樣，但也可用腎炎來源 的試樣中的血清、腎臟(也可使用腎臟的提取物、培養(yǎng)物等)， 此外也可用調(diào)整過的免疫球蛋白。另外，生物試樣不僅可采用 人腎炎來源，也可采用動物腎炎來源(別冊'醫(yī)學Ofe沙^、 腎疾患(增刊-醫(yī)學進展，腎疾病)state of arts 2003 - 2005醫(yī) 歯薬出版社)。對于發(fā)生反應的抗原的多肽制備，示出一級序 列的合成多肽，但也可為嵌合型多肽、重組、其他的方法。氨 基酸序列使用了 a5鏈的NCl，但也可為其他a鏈的NCl,只要與 生物試樣發(fā)生反應即可。另外，氨基酸序列為三鏈(7S及/或 主三螺旋區(qū))時優(yōu)選a5鏈，^f旦只要與生物試樣反應則也可為其 他的a鏈來源。從費用與效率出發(fā)，優(yōu)選抗原的多肽的長度為3 個以上、35個以下氨基酸，同時考慮抗體制備的容易性，最優(yōu) 選為10個 20個。予以說明，本檢索方法與結果不限定于a5鏈， 適用于IV型膠原所有a鏈的檢索及檢索的結果。
用ELISA法測定了使用IV型膠原NC1的生物試樣的選定。 在用100ul/孑L (10ug/mL)牛腎小球來源的NC1包被過的96 孔微量反應板中，加入用PBS ( pH7.4)稀釋4倍的生物試樣(本 實施例中為尿)，23。C下(以下溫度相同)經(jīng)2小時孵育后用PBS 洗滌，加入酶(HRP )標記抗人IgG抗體液，孵育l小時后洗滌， 加入底物液(TMB) ， 5 ~ 30分鐘的身見定時間后(本實驗中為 10分4中)加入反應終止液(lN碌u酸溶液)，立即測定450nm處的吸光度(OD )。
圖4為示意慢性腎炎TD3 8 、糖尿病性腎炎TD42與健康者 (TD31 ~ 37、 TD39~ 41 )的測定比專交凄丈才居(4元NCW元體)的圖， 本實驗測定尿中的抗NC1 - IgG抗體，用酶標記抗人IgG抗體(人 HRP326 ) 4000倍反應60分鐘。圖中臨界值為OD. 0.443 (健康 - 10;平均0.255 + 2SD. 0.188 ),慢性腎炎(以下記為A) 為1.008,糖尿病性腎病(以下記為B)為2.696。由該結果，將 抗NC1抗體水平高而被選擇的尿直接作為"分離出的腎炎來源 的生物試樣(生物試樣)"使用， 一部分分成小份冷凍保存。 分離出的腎炎來源的生物試樣(生物試樣)的制備 因酸性尿中抗體發(fā)生劣化，于18 °C下?lián)u 一 夜解凍以使冷凍 保存的尿試樣與沉淀物 一 起均勻分散。接著準確地用P B S稀釋 至4倍量，在18。C下?lián)u24小時，制成均一分散液。將其在約3000G 下離心5分鐘，除去沉淀。測量上清液量，用凍干機干燥，加入 前面測量的量的已滅菌的PBS (pH7.4),洗滌容器，回收PBS。 通過重復該操作4次~ 5次，可得到pH置換為中性且穩(wěn)定的"生 物試樣"。隨后，再次測量抗NC1抗體水平，測定的OD值作為 lmL的滴度。也可使用生理鹽水或注射用蒸餾水代替PBS,但 為了不使滴度降低，還要進行滅菌、除菌等其他操作，即特別 留心處理生物來源的制劑時操作人員應注意之處，由此能制成 注射劑或內(nèi)服劑。另外，也可作為腎炎模型的引發(fā)原使用。此 外，"生物試樣"也可將結合有N C1抗原的親和色譜柱純化所得 的抗體及用硫酸銨沉淀等獲得的抗體再次稀釋以滿足濃度要 求，也可從血清或腎臟純化抗體的免疫球蛋白。尤其是用從腎 炎患者自身得到的生物試樣再對自身給藥，由于親和性好，即 使作為注射劑也不易引起異常免疫反應。另外，口服給藥劑也 因口服免疫耐受性而優(yōu)選。
17另外，也可使用動物來源的生物試樣。引發(fā)原特別優(yōu)選a5 鏈的NC1 。由腎小球來源的NC1引發(fā)的腎炎模型為急性腎炎的 一種，其抗N C1抗體大部分與急性腎炎的肺出血-腎炎綜合癥的 自身抗體相近，因而優(yōu)選與人慢性腎炎的"分離出的腎炎來源的 生物試樣"對比來進行。也可使用動物的糖尿病模型及高血壓模 型來源的生物試樣，但與上述相同，優(yōu)選與人慢性腎炎的"分離 出的腎炎來源的生物試樣"對比來進行。
使用分離出的腎炎來源的生物試樣(生物試樣)選出IV型 膠原樣NC1免疫反應性多肽的方法
公布的氨基酸序列有多種，但本發(fā)明人按照Ninomiya等的 文獻 (pp235 - 260 In Extra celluar matrix - cellular inter raction: Molecules to diseases.(月包夕卜基質(zhì)一細月包相互作用乂人 分子到疾病)ed by Ninomiya Y et al, Japan Sci Press, Tokyo /SKarger, Basel.1998.)中所記載示出的序列(圖5) 。 l條a 鏈中的NC1的氨基酸殘基數(shù)約為230。 a鏈有6條，NC1總計調(diào)查 1380個氨基酸殘基即可。
預實驗
上述ELISA法中，用合成多肽代替包被抗原的NC1進行了 預實驗。測定條件為抗原濃度10pg/mL( 10mMPBS)， 100jiL /孔，封閉(blocking)液Block Ace (大日本制藥制)稀釋 至25%， 250(iL/孑L，尿人來源、20~100倍稀釋，第二抗體 (酶標記^t人IgG抗體)x800，底物液TMB ( + ) ( DAKO 公司制)。樣品的稀釋與以NC1為抗原時稀釋4倍不同，需稀釋 20~100倍。結果樣品A(慢性腎炎)、B(糖尿病性腎病)都 顯示抗原501 ( a5鏈NCl上由N端開始連續(xù)的20個氨基酸殘基) 比抗原多肽301 ( a3鏈NCl上由N端開始連續(xù)的20個氨基酸殘 基)的免疫反應要強。因此用a5鏈的NCl進行本實-瞼。予以說
18明，301含電腦軟件指出的肺出血-腎炎綜合癥(Goodpastures' syndrome)的a3鏈上的N端5 ~ 18位的氨基酸序列。另夕卜，與301 同樣地對a5鏈以外的鏈進行了調(diào)查。此外，301與501的任意一 個由于腎炎尿比健康者的尿抗體水平顯著高、可充分識別，因 而可作為腎炎檢測試劑使用。
a5鏈NCl上的抗原部位的篩選
使用上述ELISA法，用合成多肽代替包被抗原的NC1，其 他的測定條件完全相同地進行實驗。圖6為示意慢性腎炎No 3 8 、 糖尿病性腎炎No42、 IgA腎病與健康者No31、 32、 33的NC1樣 抗原性的比較的圖。
a5鏈的多肽如下制備。將a5鏈NCl從N端開始，以20氨基 酸殘基為單位，相互間有5氨基酸殘基重疊，由此將a5鏈NCl 的全區(qū)域以20氨基酸殘基為單位制成15種合成多肽(以下稱 yp01 ~ ypl5 (圖6中H4NA5 - 1 ~ 5 — 15 ) , ypl5包括超過20個 的氦基酸)。其結果，樣品A(慢性腎炎No38)與yp05、 08、 13、 10、 12反應強，樣品B(糖尿病性腎病No42)與yp10、 13、 08、 05、 12反應強，IgA腎病與yp08、 05、 10、 13、 12反 應強，因高水平的多肽群一致，該5種多肽為病因不同的樣品A、 樣品B及IgA腎病的共同的抗原部位。如上所述對于腎炎尿，牛 腎小球來源的NC1與三鏈的反應性大致相同，可認為其任意一 種都是腎炎的共同的抗原，a5鏈三鏈(7S或/及主三螺旋區(qū)) 以及其多肽都可作為候補免疫反應性多肽。予以說明，a5鏈整 體也可以作為抗原使用但較為麻煩。
如上所述，"生物試樣"是對篩選NC1樣免疫反應性多肽有 效的配體，找出的多肽及其抗體同樣可作為相應抗體或抗原多 肽檢測的配體使用。尤其是通過免疫反應性多肽制備的抗體， 不論是單克隆抗體還是多克隆抗體，均可代替"生物試樣"在新的免疫反應性多肽的檢測中發(fā)揮作用。對于通過(X5鏈找出的多
肽的任意一種，腎炎尿與健康者間的反應差別都很大(圖6)、
可在腎炎檢測的試劑盒中使用。本發(fā)明的免疫反應性多肽為對
"生物試樣"具有IV型膠原樣免疫反應性的多肽，并不限定于a5 鏈來源。
3.新型的a5鏈NCl樣免疫反應性多肽的篩選方法
候補免疫反應性多肽的篩選中，使用候補免疫反應性多肽 代替上述a5鏈NCl來源的合成多肽。也可4吏用抗a5鏈NCl抗體 代替生物試樣，也可用抗a5鏈NCl來源的多肽抗體來代替。該 情況下，使用對應于抗體來源動物的標記抗體。
用作候補免疫反應性多肽的多肽只需為與a5鏈NCl來源的 呈遞多肽有同等以上的免疫反應性的多肽即可，可為任意的序 列，不限定于IV型膠原。另外，也可為將呈遞多肽縮短、增加、 改變、置換、修飾、也可為合并后的氨基酸序列。例如為ypl2 與ypl3的合并。改變呈遞多肽的一部分時，也可簡易地使用動 物來源的序列。另外，只要是使用了 a5鏈NCl的一部分氨基酸 序列的多肽、并與從生物體提取純化的NC1相比有免疫反應性， 即可使用任意氨基酸序列。
本發(fā)明適用于含三鏈(7S及/或主三螺旋區(qū))的a5鏈的全 部氨基酸序列。優(yōu)選為相對于a5鏈全區(qū)域更小的區(qū)域，在類三 鏈及NC1樣免疫反應性優(yōu)秀的多肽中，更優(yōu)選為更短、顯示更 佳免疫反應性的多肽，從費用與效果出發(fā)，優(yōu)選多肽的長度為3 個以上、35個以下，其選定方法可通過已示意過的ELISA法進 行，但不限定于此。
因以上對于其他a鏈也可同樣適用，作為生物試樣的替代， 也可使用各種抗體，例如抗NC1、 7S、主三螺旋區(qū)等的各區(qū)域、 各a鏈、IV型膠原來源的各多肽等等的抗體。生物試樣以外的
20動物種屬的情況下，將上述的人用試劑成分依動物種屬進行調(diào)
整。另外，應用于其他的a鏈時，優(yōu)選預先確認與分離出的腎 炎來源的生物試樣的反應性。
免疫反應不限定于酶免疫反應，還包括AB法、RIA，免疫 發(fā)光法、沉淀反應、凝集反應等，酶標記抗體可為多克隆抗體 或單克隆抗體，另外也可為將其用放射性物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)標記 后的標記物、無標記物。反應形式不限定于夾心法，也可為竟 爭法等。作為反應板的替代，可使用玻璃，磁性物質(zhì)，乳膠， 也可沒有載體不使用固相法。
在反應板上包被多肽時，包被物質(zhì)可通過親和素、生物素、 或其組合成分進行包被。包被反應板的多肽可將多種進行混合， 也可將后面選出的混合多肽樣品按結構多肽區(qū)分來選擇。多肽 不僅可為合成的，在其他領域中使用的任意方法本領域技術人 員均可使用。此外，第二抗體不限定于抗樣品IgG抗體，也可 為抗樣品IgM抗體、抗樣品IgA抗體、抗樣品免疫球蛋白抗體， 但優(yōu)選抗樣品IgG抗體。
4.以免疫反應性多肽為引發(fā)原的腎炎模型的制作
選出的多肽可單獨及/或用多種一起作為腎炎的引發(fā)原。 多肽示意了yp08、 ypl2,動物示意了兔與豚鼠，但多肽、動物 及給藥方法都不限定于此。
對于兔(雌)，將0.3mg/mL (僅初次時為0.15mg )多肽 與等量的FCA—同，每2周l次共4次皮內(nèi)給藥。yp08的尿蛋白(# 2; + 2)與ypl2的尿蛋白(# 1; +2)都顯示陽性。
另外，使用《鼓量反應板被多肽ypl2 ( 10ug/mL )包被的 ELISA法，在初次給藥的7周后，血清的抗體水平在稀釋32000 倍條件下達到吸光度計的測定上限附近的3.00。
ELISA抗體滴度；yp08( # 2x8000; A450證/3.00) ypl2 ( # 1x32000; A450證/3.00)
對于豚鼠(雌)，將0.1mg/mL多肽與等量的FCA—同， 每2周l次共4次皮內(nèi)給藥。ypl2的尿蛋白(#1; +1、 #2; ±, #3; ±)任一都顯示弱陽性。由于人的腎炎緩慢發(fā)展，因此該 結果表明其為合適的模型。
另外，使用孩么量反應板凈皮多肽ypl2 ( 10ug/mL )包^皮的 ELISA法，在初次給予的7周后，豚鼠血清的抗體水平在稀釋 8000倍條件下達到吸光度計的測定上限附近的3.00。此外，這 些抗免疫反應性多肽抗體(抗血清)給予到大鼠與小鼠的腹腔 內(nèi)，與以往的抗NC1抗體(抗血清)的給藥差異小，可成為與 人相似的慢性的腎炎模型。
5. 利用免疫反應性多肽抑制腎炎
在2只豚鼠購入后1周的馴化期間內(nèi)，給予總量5~ 10mg的 溶解于水中的yp12。其后如上所述進行腎炎的引發(fā)。未見尿蛋 白，(#1: - , #2:-),不呈現(xiàn)腎炎尿。
免疫反應性多肽的口服給藥顯示了腎炎的疫苗及治療藥。 免疫反應性多肽及其抗體可在口服給藥劑及脫敏療法中使用， 也可在注射劑中使用。類似的先例在日本特開2000 - 214163號 公報中可見，但本發(fā)明多肽更加特異，效果也更好。
6. 使用抗免疫反應性多肽的抗體的ELISA試劑盒
E LIS A法為檢測抗原或抗體的通常方法，因測定步驟上無 太大差異，在此示意先前的抗體的組合例。
夾心ELISA法的"抗原NC1 "的測定中，作為"抗NC 1單克隆 抗體與抗NC1抗體(豚鼠)"的替代，使用上述示意的"抗yp12 抗體(兔)與抗ypl2抗體(豚鼠)"及"抗NC1單克隆抗體與抗 ypl2抗體或抗yp08抗體"的組合，任意一種都可進行NC1的測定，可以尿為樣品在腎炎早期的檢測中使用。測定范圍例如用
"抗NC1單克隆抗體(PCT / JP2005 / 002669 )與抗NC1抗體(豚 鼠)，，，微量反應板被抗NC1單克隆抗體(2ug/mL)包被，抗 NC1抗體(豚鼠)(IgG AP -生物素0.95mg/ mL )運用AB法 (親和素-HRP x 4000 )時，可能對NCl進行從50ng/ mL至lng /mL的微量測定，作為其用途，在腎炎尤其是糖尿病性腎炎的 早期可通過尿檢測。發(fā)展后的尿中抗原無法檢測，因此其為疾 病的早期診斷試劑。該情況下，將腎炎來源的試樣作為樣品， 通過yp08或ypl2的抗原固定化反應板;險測對應的抗體(也包括 抗NC1抗體)。另外，"抗ypl2抗體(兔)與抗ypl2抗體(豚鼠)" 及"抗NCl單克隆抗體與抗ypl2抗體或抗yp08抗體"的組合因可 進行ypl2或yp08的測定，可作為研究試劑4吏用。
通過與a5鏈NCl使用的方法相同的手法，選出三鏈(7S及/ 或主三螺旋區(qū))來源的免疫反應性多肽，使用抗選出的免疫反 應性多肽的抗體，也可進行三鏈(7S及或主三螺旋區(qū))及/或 其免疫反應性多肽的測定。
通過使用分離出的腎炎來源的生物試樣，可選出IV型膠原 樣免疫反應性多肽。另外，選出的IV型膠原樣免疫反應性多肽 可作為IV型膠原的替代，在腎炎的診斷試劑、腎炎治療藥、腎 炎治療用具、從生物試樣中去除抗體及抗體采集中發(fā)揮作用， 另外，抗IV型膠原樣免疫反應性多肽抗體在腎炎的診斷試劑、 治療藥、腎炎治療具、從生物試樣中去除抗原及抗原采集中發(fā) 揮作用。
權利要求
1. 一種IV型膠原樣免疫反應性多肽，其特征在于，與分離出的慢性腎炎來源的生物試樣發(fā)生免疫反應。
2. 根據(jù)權利要求1所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽，具 有選自下組中的至少一個以上作為結構a鏈的l鏈~ 6鏈中的任意l條鏈以上、 作為結構區(qū)域的選自7S、主三螺旋區(qū)及NC1中的任意一種 以上、以及作為結構多肽的氨基酸數(shù)為3個以上、35個以下。
3. 根據(jù)權利要求2所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽，其 為a5鏈。
4. 根據(jù)權利要求3所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽，其 與IV型膠原的a5鏈的氨基酸序列有同源性。
5. 根據(jù)權利要求l ~ 4中任意一項所述的IV型膠原樣免疫 反應性多肽，其結構區(qū)域含有NC1來源的下述氨基酸序列中的4壬意 一 個以上，1) GRGTC NYYAN SYSFW LATVD2) S(XEE FRSAP FIECH GRGTC3) GWDSL WIGYS FMMHT SAGAE4) PFISR CAVCE APAW IAVHS5) STMPF MFCNI NNVCN FASRN(式中，A表示丙氨酸，C表示半胱氨酸，D表示天冬氨酸， E表示谷氨酸，F(xiàn)表示苯丙氨酸，G表示甘氨酸，H表示組氨酸， I表示異亮氨酸，L表示亮氨酸，M表示甲硫氨酸，N表示天冬酰 胺，P表示脯氨酸，R表示精氨酸，S表示絲氨酸，T表示蘇氨酸， V表示纈氨酸，W表示色氨酸及Y表示酪氨酸，各多肽將連續(xù)的 氨基酸序列從N端起以5個為單位來進行表示)。
6. 根據(jù)權利要求5所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽，其 與所述氨基酸序列中的3個以上氨基酸序列有同源性。
7. 根據(jù)權利要求l ~ 6中任意一項所述的IV型膠原樣免疫 反應性多肽，其中，所述分離出的慢性腎炎來源的生物試樣為 尿。
8. 根據(jù)權利要求7所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽，其 中，所述尿在保存時冷凍保存，使用時解凍后均勻分散于磷酸 緩沖生理鹽水中，離心后除去沉淀，所得上清液用凍干機干燥， 再溶解于磷酸緩沖生理鹽水中。
9. 一種IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體，其特征在于， 與權利要求l ~ 8中任意一項所述的IV型膠原樣免疫反應性多 肽發(fā)生免疫反應。
10. —種IV型膠原樣免疫反應性多肽選出方法，其特征在 于，以分離出的慢性腎炎來源的生物試樣為配體，選出與所述 慢性腎炎來源的生物試樣發(fā)生免疫反應的、權利要求l ~ 8中任 意一項所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽。
11. 一種免疫反應性抗體的篩選方法，其特征在于，使用 權利要求l ~ 8中任意一項所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽。
12. 根據(jù)權利要求ll所述的免疫反應性抗體的篩選方法， 其中，所述IV型膠原樣免疫反應性多肽的氨基酸數(shù)為3個以上、 35個以下。
13. —種免疫反應性多肽的篩選方法，其特征在于，使用 權利要求9所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體。
14. 根據(jù)權利要求13所述的免疫反應性多肽的篩選方法， 其中，IV型膠原樣免疫反應性多肽的氨基酸數(shù)為3個以上、35 個以下。
15. —種腎炎模型，其特征在于，以選自權利要求1 8中任意 一 項所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽及權利要求9所述 的IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體中的任意一種以上作為 引發(fā)原。
16. —種慢性腎炎的檢測方法，其特征在于，使用選自權 利要求l ~ 8中任意一項所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽及 權利要求9所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體中的任意 一種以上。
17. —種疫苗，其特征在于，使用選自權利要求l ~ 8中任 意 一 項所述的IV型膠原樣免疫反應性多肽及權利要求9所述的 IV型膠原樣免疫反應性多肽的抗體所組成的組中的任意一種 以上。
18. —種腎炎治療藥，其特征在于，含有權利要求17所述 的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對腎炎的檢測有用的IV型膠原樣免疫反應性多肽及其抗體、IV型膠原樣免疫反應性多肽選出方法、免疫反應性抗體與免疫反應性多肽的篩選方法、腎炎模型、慢性腎炎的檢測方法、以及疫苗與腎炎治療藥。一種IV型膠原樣免疫反應性多肽，其與分離出的慢性腎炎來源的生物試樣發(fā)生免疫反應。所述IV型膠原樣免疫反應性多肽優(yōu)選具有選自下組中的至少一個以上作為結構α鏈的1鏈～6鏈中的任意1條鏈以上、作為結構區(qū)域的選自7S、主三螺旋區(qū)及NC1中的任意一種以上、以及作為結構多肽的氨基酸數(shù)為3個以上、35個以下。
文檔編號C07K14/78GK101466732SQ200780022028
公開日2009年6月24日 申請日期2007年6月12日 優(yōu)先權日2006年6月12日
發(fā)明者橫山司甫 申請人:橫山司甫