一種新型檢測(cè)個(gè)體化胰島素的免疫質(zhì)譜試劑盒及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)、評(píng)估個(gè)體化胰島素水平的免疫質(zhì)譜試劑盒及制備方法，為一種非侵入性的體外檢測(cè)方法。本方法用抗體吸附表面基質(zhì)及質(zhì)譜法進(jìn)行鑒別檢測(cè)發(fā)現(xiàn)一種新型變異的胰島素。變異的胰島素或5835.65Da峰值可用于個(gè)體化胰島素水平的檢測(cè)及評(píng)估。通過(guò)5835.65Da峰值或被抗體吸附表面基質(zhì)上捕獲的變異的胰島素，用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清控制下的定量性質(zhì)譜分析來(lái)檢測(cè)，可以應(yīng)用到已經(jīng)脫離人體體液的生物標(biāo)志組合的檢測(cè)試劑盒的開發(fā)。本方法精確、方便且快捷。
【專利說(shuō)明】一種新型檢測(cè)個(gè)體化胰島素的免疫質(zhì)譜試劑盒及制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種非侵入性檢測(cè)、評(píng)估胰腺癌伴有重型糖尿病病人試劑盒的新方法，其特征是采用質(zhì)譜法對(duì)樣品中已被磁珠或抗體捕獲的胰島素進(jìn)行精確地鑒別、檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和完成，科學(xué)家們提出了后基因組(post-genome)計(jì)劃的概念，研究要點(diǎn)轉(zhuǎn)移到功能基因組學(xué)上，而生物功能主要體現(xiàn)物質(zhì)是蛋白質(zhì)。1994年，澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams首先提出蛋白質(zhì)組(proteome)的概念，指的是“一種基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。對(duì)于蛋白質(zhì)組的研究是功能基因組學(xué)研究的核心，稱為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)。蛋白質(zhì)組學(xué)被認(rèn)為是后基因組研究中最主要的部分。與基因組相比，蛋白質(zhì)組的組成更復(fù)雜，功能更活躍，應(yīng)用前景更廣泛。蛋白質(zhì)組學(xué)從細(xì)胞整體水平進(jìn)行蛋白質(zhì)屬性的研究，如表達(dá)水平、翻譯后修飾及相互作用等，并由此獲得對(duì)于疾病過(guò)程、細(xì)胞生理生化特征和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的廣泛完整的認(rèn)識(shí)。 所以，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)正在逐步成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及制藥學(xué)等的重要研究手段。
[0003]不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定人體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本診斷及篩查，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析。用抗體及質(zhì)譜聯(lián)合可克服這一技術(shù)缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明的目的是建立一種在生物樣品中檢測(cè)變異的胰島素的免疫質(zhì)譜試劑盒和制備方法。該方法為疾病的早期檢測(cè)提供了新的途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的變異的或修飾的生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明涉及一種非侵入性檢測(cè)的新方法，其特征是采用質(zhì)譜法對(duì)樣品中已被抗胰島素抗體捕獲的變異的胰島素進(jìn)行精確地鑒別、檢測(cè)的方法。
[0006]變異的胰島素的免疫質(zhì)譜試劑盒制備及檢測(cè)方法:
[0007]—小管標(biāo)有抗胰島素抗體的磁珠,50微升；
[0008]一小管結(jié)合緩沖液(磷酸鹽緩沖液，PBS buffer, pH 7.0-8.0)，500微升；
[0009]一小管洗滌液(去離子水)，500微升；
[0010]一小管洗脫液(1-2%三氟乙酸)，50微升；
[0011]一小管以50%乙腈、0.5%三氟乙酸的制備的吸能分子標(biāo)準(zhǔn)溶液，50微升。
[0012]上述各小管置于4°C冷藏盒中。
[0013]具體操作步驟如下:(I)將生物樣品稀釋在結(jié)合緩沖液中；用O型血，男女相等，混合制備質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清；所述步驟(2)將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點(diǎn)樣在已標(biāo)記上抗胰島素抗體的基質(zhì)上,常用與抗體結(jié)合的基質(zhì)可選擇Protein A、Protein G、或streptavidin-biotin系統(tǒng)；基質(zhì)的支持物用陶瓷珠、磁性珠、多聚體或Sepharose beads ；所述基質(zhì)的支持物采用陶瓷珠、磁性珠、多聚體或Sepharose beads之中的任一種；所述步驟(3)用洗滌液洗滌；在樣品完全干燥前將第一份洗滌液加到該位點(diǎn)；洗滌液在位點(diǎn)上至少停留10秒；徹底清除第一份洗滌液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟；用I?2%三氟乙酸洗脫液徹底洗滌磁珠，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用的金屬片上，自然干燥金屬片，加0.5μ L以50%乙腈、0.5%三氟乙酸制備的吸能分子標(biāo)準(zhǔn)溶液；吸能分子用sinapinic acid或alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid ;所述步驟(4)用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，用波長(zhǎng)337nm的氮激光儀和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析變異的胰島素；用儀器的軟件進(jìn)行定量性質(zhì)譜自動(dòng)調(diào)控:每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1Da或6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至質(zhì)譜儀信號(hào)強(qiáng)度最大值的50%。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示5807.65Da或5835.65Da生物標(biāo)志。
[0014]本發(fā)明中變異的胰島素是利用一臺(tái)高精確度的質(zhì)譜儀來(lái)發(fā)現(xiàn)的；該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為0.001%。
[0015]變異的胰島素生物標(biāo)志物首先能夠被具有能與生物標(biāo)志物結(jié)合的抗體或磁珠基質(zhì)WCX吸附表面捕獲，非吸附物能從基質(zhì)上洗脫，吸附到底基的生物標(biāo)志物在飛行質(zhì)譜儀中被檢測(cè)。生物標(biāo)志物通過(guò)離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個(gè)離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過(guò)的離子。之后，檢測(cè)器將檢測(cè)的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。用儀器的軟件進(jìn)行定量性質(zhì)譜自動(dòng)調(diào)控:每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的4091.1Da或6634.0Da標(biāo)準(zhǔn)峰強(qiáng)度調(diào)至質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度最大值的50%。生物標(biāo)志物的檢測(cè)明顯地將與信號(hào)強(qiáng)度的檢測(cè)有關(guān)。這樣，生物標(biāo)志物的數(shù)量與質(zhì)量都可以被檢測(cè)出來(lái)。
[0016]飛行質(zhì)譜對(duì)待分析物的分析生成飛行時(shí)間譜。該飛行時(shí)間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個(gè)樣本所產(chǎn)生的單獨(dú)的脈沖信號(hào)，而是一系列脈沖的信號(hào)之和。這樣降低了干擾，并增加了動(dòng)態(tài)范圍。該飛行時(shí)間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時(shí)間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過(guò)濾高頻噪音而減輕高頻噪音。
[0017]通過(guò)對(duì)生物標(biāo)志物的吸附和檢測(cè)而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)分析程序進(jìn)行分析。該計(jì)算機(jī)程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測(cè)出的標(biāo)記物的數(shù)量，并顯示信號(hào)的強(qiáng)度和確定被檢測(cè)的每個(gè)生物標(biāo)志物的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定生物標(biāo)志物的信號(hào)強(qiáng)度和矯正數(shù)據(jù)對(duì)預(yù)定統(tǒng)計(jì)分布狀態(tài)的偏離。例如，通過(guò)計(jì)算與某些參數(shù)相關(guān)的每個(gè)峰值的高度，可規(guī)范觀測(cè)到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學(xué)成分產(chǎn)生的不重要的干擾，這可以設(shè)置調(diào)零。
[0018]計(jì)算機(jī)可以將計(jì)算結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來(lái)表現(xiàn)。其標(biāo)準(zhǔn)譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生一個(gè)較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標(biāo)志物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個(gè)或更多的譜比較，便于突顯獨(dú)特的生物標(biāo)記物和那些高于或低于校準(zhǔn)樣本的生物標(biāo)志物。
[0019]軟件分析一般包括展示從待分析物得到的信號(hào)的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過(guò)視圖進(jìn)行選擇，可用軟件自動(dòng)檢測(cè)峰。一般情況下，該軟件通過(guò)鑒定信號(hào)具有信噪比高于一個(gè)選擇閾值并標(biāo)記出在峰信號(hào)的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個(gè)有效的程序中，比較許多譜線以認(rèn)定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個(gè)版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對(duì)所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個(gè)質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。
[0020]對(duì)生物標(biāo)志的檢測(cè)需要將一個(gè)樣本放基質(zhì)的一個(gè)吸附點(diǎn)上，接著進(jìn)行清洗。向吸附點(diǎn)上加入SINAPINIC酸等并讓其干燥。而后，用質(zhì)譜測(cè)定法對(duì)基質(zhì)進(jìn)行分析，而一個(gè)顯示了蛋白質(zhì)分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量-電荷比的基礎(chǔ)上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來(lái)的。
[0021]因?yàn)楸卷?xiàng)發(fā)明中的生物標(biāo)記是通過(guò)分子的質(zhì)量和特異性抗體來(lái)標(biāo)識(shí)的，因而它們可通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)而直接知道它們特定的身份。這種方法比以抗體為基礎(chǔ)的ELISA及免疫熒光法等夾心法更準(zhǔn)確。
[0022]然而，如果有必要，這些生物標(biāo)志也可通過(guò)，比如，確定多肽的氨基酸序列來(lái)進(jìn)行鑒別。例如，一個(gè)生物標(biāo)志能用許多酶描繪出來(lái)，例如V8蛋白酶(V8pr0teaSe)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestion fragments)的分子量可被用來(lái)在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索序列,這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合?；蛘?，如果此生物標(biāo)志不是已知數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)分子，在生物標(biāo)志的N極氨基酸序列(N-terminal amino acid sequence)的基礎(chǔ)上，可使用降解探針，而后，這些探針會(huì)被用來(lái)描繪由探測(cè)到了生物標(biāo)志的樣本所生成的基因組或cDNA庫(kù)。最后，蛋白質(zhì)生物標(biāo)志可用蛋白質(zhì)梯狀排序法(protein ladder sequencing)進(jìn)行排序。通過(guò)將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個(gè)單個(gè)氨基酸分子的方法進(jìn)行處理后，可生成蛋白質(zhì)梯度(protein ladders)。然后,用質(zhì)譜對(duì)此梯度進(jìn)行分析。階梯狀碎片(ladder fragments)在質(zhì)量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的氨基酸。
[0023]特異性是指某一物質(zhì)或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質(zhì)或某種疾病的特征。通過(guò)某些特征可以識(shí)別某種物質(zhì)或某種疾病，從而把它和其他物質(zhì)或疾病區(qū)分開來(lái)。對(duì)專有特征的識(shí)別往往依賴于特殊的檢測(cè)方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就要用有關(guān)特異性抗體來(lái)檢測(cè)。自蛋白質(zhì)組學(xué)研究有新發(fā)展以來(lái)，這種傳統(tǒng)意義上特異性檢測(cè)和界定方法有了很大的突破，如一個(gè)蛋白質(zhì)不同片段變異是不同類型腫瘤的標(biāo)志。根據(jù)基因到蛋白質(zhì)表達(dá)的復(fù)雜過(guò)程，一種特異性基因的產(chǎn)物——蛋白質(zhì)必定有相關(guān)多組分蛋白質(zhì)的表達(dá)。通過(guò)對(duì)這些不同組分的檢測(cè)形成一個(gè)綜合模式圖(蛋白指紋圖譜)，將這種圖譜(如某種腫瘤)與其他圖譜(如正常人或其他疾病)相比較，進(jìn)而識(shí)別這種特異蛋白(如腫瘤抗原或其片段)，從而將正常人與患某種疾病病人的離體血液區(qū)分開來(lái)。
[0024]具體操作步驟:
[0025]以下是用本發(fā)明提供的一個(gè)操作方案實(shí)例。
[0026]1.樣品處理及標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備
[0027]將生物樣品稀釋在結(jié)合緩沖液中，視需要離心澄清樣品。質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn):供血者10人，5男5女，血型為O型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標(biāo)正常，包括:總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢查、腎功檢查；無(wú)遺傳病家族史；無(wú)重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。[0028]2.樣品上樣
[0029]將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點(diǎn)樣在磁性珠子(磁珠)作為支持物的基質(zhì)上[a.可用WCX基質(zhì)的磁珠，陰離子表面(WCX, Weak Cationic Exchanger, 一羧酸基團(tuán))基質(zhì)磁珠(實(shí)施例1);或用b.已標(biāo)記上抗胰島素抗體基質(zhì)的磁珠(實(shí)施例2)]。可以將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清用于質(zhì)譜的定量方法。基質(zhì)的支持物可以是陶瓷珠、磁性珠、多聚體或Sepharose beads。
[0030]3.洗滌
[0031]用洗滌液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌液加到該位點(diǎn)。洗滌液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。
[0032]4.洗脫
[0033]I-2%三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)磁珠陣列點(diǎn)，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5 μ L吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液)。
[0034]吸能分子可用sinapinic acid 或 alpha-cyano-4_hydroxycinnamic acid 等。
[0035]5.質(zhì)譜的定量控制及測(cè)試
[0036]用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析滯留與各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示；可展示5807.65Da或5835.65Da生物標(biāo)志。
[0037]定量性質(zhì)譜調(diào)控:每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1Da或6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至信號(hào)強(qiáng)度最大值的50%。
[0038]用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，通過(guò)WCX磁珠試劑盒的血清蛋白指紋峰分析，發(fā)現(xiàn)下述一種分子量為5835.65及5807.65Da蛋白指紋可以用于區(qū)分正常人血清、胰腺癌伴有重型糖尿病病人的血清、糖尿病病人的血清:
[0039]表一、WCX磁珠試劑盒的血清蛋白指紋峰分析
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種來(lái)自胰腺癌伴有重型糖尿病病人的生物樣品中的生物標(biāo)志，該生物標(biāo)志為變異的胰島素；其分子量特征為5835.65Da ;該生物標(biāo)志的鑒定是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)樣品處理及質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清制備； (2)樣品上樣至基質(zhì)上； (3)洗漆； (4)質(zhì)譜的定量控制及質(zhì)譜測(cè)試； 其中所述步驟(I)將生物樣品稀釋在結(jié)合緩沖液中；用O型血，男女相等，混合制備質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清；所述步驟(2)將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清及樣品點(diǎn)樣在已標(biāo)記上抗胰島素抗體的基質(zhì)上，基質(zhì)的支持物用陶瓷珠、磁性珠、多聚體或Sepharose beads ;所述步驟(3)用洗滌液洗滌；在樣品完全干燥前將第一份洗滌液加到該位點(diǎn)；洗滌液在位點(diǎn)上至少停留10秒；徹底清除第一份洗滌液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟；用I?2%三氟乙酸洗脫液徹底洗滌磁珠，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用的金屬片上，自然干燥金屬片，加0.5μ L以50%乙腈、0.5%三氟乙酸制備的吸能分子標(biāo)準(zhǔn)溶液；吸能分子用sinapinic acid或alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid ;所述步驟(4)用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，用波長(zhǎng)337nm的氮激光儀和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析變異的胰島素；用儀器的軟件進(jìn)行定量性質(zhì)譜自動(dòng)調(diào)控:每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰4091.1Da或6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至質(zhì)譜儀信號(hào)強(qiáng)度最大值的50%。
2.權(quán)利要求1中所述的變異的胰島素在制備試劑盒中的用途，其特征在于，用于制備檢測(cè)胰腺癌伴有重型糖尿病病人中的變異的胰島素的免疫質(zhì)譜試劑盒。
3.權(quán)利要求2中所述的變異的胰島素為甲基化的胰島素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為: A 鏈:GIVEQCCTSICSLYQLENYCN B 鏈:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGE R(CH3)2G F F Y T P K T。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103454428SQ201210180854
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月5日
【發(fā)明者】許洋 申請(qǐng)人:許洋