利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法
【專利摘要】利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法，它涉及生物科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，它的檢測(cè)方法為：(1)將兩個(gè)偶聯(lián)核酸序列的抗體與待測(cè)蛋白質(zhì)在溶液中進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，使連接在抗體上的兩條核酸序列互相靠近，在DNA聚合酶的催化下，3’DNA鏈延伸，形成DNA雙鏈；(2)利用TaqMan核酸探針和引物定量檢測(cè)所述抗體特異性核酸序列，從而定量檢測(cè)待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。它利用抗原-抗體特異結(jié)合的原理和定量PCR特異擴(kuò)增的原理，將二者有機(jī)組合，使特異性信號(hào)擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)甚至上千萬(wàn)倍，從而大大提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，可對(duì)檢測(cè)樣本中的微量蛋白實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
【專利說明】利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及生物科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
檢測(cè)血液或其它標(biāo)本中微量蛋白標(biāo)志物是臨床進(jìn)行疾病診斷的重要手段，目前最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)，其原理是利用抗原抗體反應(yīng)和酶底物顯色的方法檢測(cè)特定的蛋白標(biāo)志物。在測(cè)定時(shí)，加入待測(cè)樣品，使樣品中的抗體或抗原與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。然后通過洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與溶液中的其他分子分開。再加入酶標(biāo)記的檢測(cè)抗原或抗體，并通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。這樣固相載體上的酶量與標(biāo)本中待測(cè)目標(biāo)分子的量呈一定的比例關(guān)系。加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中待測(cè)目標(biāo)分子的量直接相關(guān)，因此可根據(jù)反應(yīng)顏色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，可間接放大免疫反應(yīng)的結(jié)果，因此ELISA方法具有較高的敏感度。該方法雖然可以達(dá)到定量分析的目的，但受酶-底物反應(yīng)的限制，其檢測(cè)靈敏度仍無法對(duì)標(biāo)本中極微量的蛋白標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，因而限制了其在疾病早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。另外，由于操作步驟比較復(fù)雜，因此影響結(jié)果的各種因素較多；操作時(shí)間和操作過程要求比較嚴(yán)格；線性范圍較窄，一般只有I到2個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍；特異性較差，血清中各種物質(zhì)的干擾會(huì)影響反應(yīng)結(jié)果；陰陽(yáng)性的界定比較模糊，需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)；手工操作繁瑣，難以自動(dòng)化和批量化；不同批次的反應(yīng)板差異較大，結(jié)果很難歸一化；樣品和試劑消耗量較大，一般需50微升以上的體積進(jìn)行反應(yīng)，因此成本較聞。
[0003]基于ELISA，又開發(fā)了與PCR高靈敏特性結(jié)合的免疫PCR方法。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高靈敏度有機(jī)結(jié)合起來，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的高靈敏度而建立的一種抗原檢測(cè)技術(shù)。其本質(zhì)是一種以PCR擴(kuò)增一段DNA報(bào)告分子代替酶反應(yīng)來放大抗原抗體作用的ELISA方法。免疫PCR具有很高的靈敏度，但是其操作過程基于ELISA反應(yīng)，步驟仍比較繁瑣復(fù)雜，為了保證結(jié)果的特異性，有多步洗板步驟，所以仍存在ELISA所固有的局限性。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是提供一種利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法，它利用抗原-抗體特異結(jié)合的原理和定量PCR特異擴(kuò)增的原理，將二者有機(jī)組合，使特異性信號(hào)擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)甚至上千萬(wàn)倍，從而大大提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)樣本中的微量蛋白實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
[0005]為了解決【背景技術(shù)】所存在的問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:它的檢測(cè)方法為:
(I)將兩個(gè)偶聯(lián)核酸序列的抗體與待測(cè)蛋白質(zhì)在溶液中進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，使連接在抗體上的兩條核酸序列互相靠近，在DNA聚合酶的催化下，3’ DNA鏈延伸，形成DNA雙鏈。
[0006](2)利用TaqMan核酸探針和引物定量檢測(cè)所述抗體特異性核酸序列，從而定量檢測(cè)待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。[0007]所述的待測(cè)蛋白質(zhì)是血中微量蛋白質(zhì)。
[0008]所述抗體是針對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)的一對(duì)單克隆抗體或一種多克隆抗體。
[0009]所述的與抗體偶聯(lián)的核酸序列是3’端可形成互補(bǔ)雙鏈序列的核酸序列。
[0010]所述的引物是指用于進(jìn)行PCR，特別是實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的核苷酸序列。
[0011]所述的TaqMan核酸探針是指和上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的核苷酸序列。
[0012]本發(fā)明具有以下有益效果:它利用抗原-抗體特異結(jié)合的原理和定量PCR特異擴(kuò)增的原理，將二者有機(jī)組合，使特異性信號(hào)擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)甚至上千萬(wàn)倍，從而大大提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)樣本中的微量蛋白實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
[0013]【具體實(shí)施方式】:
本【具體實(shí)施方式】采取以下技術(shù)方案:它的檢測(cè)方法為:(I)將兩個(gè)偶聯(lián)核酸序列的抗體與待測(cè)蛋白質(zhì)在溶液中進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，使連接在抗體上的兩條核酸序列互相靠近，在DNA聚合酶的催化下，3’ DNA鏈延伸，形成DNA雙鏈。
[0014](2)利用TaqMan核酸探針和引物定量檢測(cè)所述抗體特異性核酸序列，從而定量檢測(cè)待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。
[0015]所述的待測(cè)蛋白質(zhì)是血中微量蛋白質(zhì)。
[0016]所述抗體是針對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)的一對(duì)單克隆抗體或一種多克隆抗體。
[0017]所述的與抗體偶聯(lián)的核酸序列是3’端可形成互補(bǔ)雙鏈序列的核酸序列。
[0018]所述的引物是指用于進(jìn)行PCR，特別是實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的核苷酸序列。
[0019]所述的TaqMan核酸探針是指和上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的核苷酸序列。
[0020]本【具體實(shí)施方式】利用抗原-抗體特異結(jié)合的原理和定量PCR特異擴(kuò)增的原理，將二者有機(jī)組合，使特異性信號(hào)擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)甚至上千萬(wàn)倍，從而大大提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)樣本中的微量蛋白實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法，其特征在于它的檢測(cè)方法為:(1)將兩個(gè)偶聯(lián)核酸序列的抗體與待測(cè)蛋白質(zhì)在溶液中進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，使連接在抗體上的兩條核酸序列互相靠近，在DNA聚合酶的催化下，3’DNA鏈延伸，形成DNA雙鏈； (2)利用TaqMan核酸探針和引物定量檢測(cè)所述抗體特異性核酸序列，從而定量檢測(cè)待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述的待測(cè)蛋白質(zhì)是血中微量蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述的抗體是針對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)的一對(duì)單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述的抗體微量蛋白質(zhì)的方法為針對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)的一種多克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述的與抗體偶聯(lián)的核酸序列是3’端可形成互補(bǔ)雙鏈序列的核酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述的引物是指用于進(jìn)行PCR，特別是實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用抗體-核酸聯(lián)合擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)血中微量蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所述的TaqMan核酸探針是指和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的核苷酸序列。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103454427SQ201210178664
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月3日
【發(fā)明者】李全貞, 祝令香 申請(qǐng)人:河北省健海生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司