專利名稱：：缺乏巖藻糖殘基的抗前列腺特異性膜抗原(psma)單克隆抗體的制作方法缺乏巖藻糖殘基的抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)單克隆抗體發(fā)明背景前列腺病是男性發(fā)病率和死亡率的主要原因。對(duì)于前列腺癌的治療包括手術(shù)、激素、》丈射療法和化學(xué)療法。對(duì)于轉(zhuǎn)移性前列腺疾病幾乎沒有有效治療。因此，代表診斷和預(yù)后標(biāo)記的基因和/或基因產(chǎn)物以及治療靶標(biāo)的鑒定是關(guān)鍵的。前列腺特異性抗原(PSA)是一種在前列腺癌的臨床診斷和分期中有用的這樣的癌標(biāo)記。但是，在4-10ng/ml范圍內(nèi)PSA不能區(qū)別良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎或者前列腺癌，因此，需要細(xì)胞學(xué)和/或組織學(xué)評(píng)價(jià)來證實(shí)正確的診斷(Barren,R.J.等人(1998)Prostate36:181—188)。前列腺特異性膜抗原(PSMA)是與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體具有5同源性的大約110kD的II型跨膜糖蛋白，具有750個(gè)氨基酸。PSMA具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)19個(gè)氨基酸的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)24個(gè)氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域，和一個(gè)707個(gè)氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域。PSMA蛋白質(zhì)顯示神經(jīng)羧肽酶和葉酸水解酶活性，據(jù)才艮道參與前列腺生長(zhǎng)和分化的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)(Heston，W,D.(1996)Urologe-AusgabeA.35:400-407)。PSM，是位于細(xì)胞質(zhì)中的PSMA的一種可變剪接形式。PSMA主要由前列腺上皮細(xì)胞表達(dá)。在前列腺癌中，特別是在低分化的、轉(zhuǎn)移的和激素難以治療的癌中，PSMA的表達(dá)增加(Gregorakis，A.K.等人(1998)SeminarsinUrologicOncology16:2—12;Silver,D.A.(1997)ClinicalCancerResearch3:85-515)。在前列腺外組織例知小腸、唾液腺、十二指腸粘膜、近端腎小管和腦中發(fā)現(xiàn)^氐水平PSMA表達(dá)(Silver,D.A.(1997)ClinicalCancerResearch3:85-515)。在一些惡性腫瘤(包括腎細(xì)胞癌和結(jié)腸癌)的腫瘤外周和腫瘤內(nèi)區(qū)域中的毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中也表達(dá)PSMA,但是在正常組織的血管中不表達(dá)。另外，據(jù)報(bào)道PSMA與腫瘤血管生成相關(guān)(Silver,D.A.(1997)ClinicalCancerResearch3:81-85)。最近，已經(jīng)證明PSMA在結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、腎癌和黑素瘤中的腫瘤相關(guān)新血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)(Chang,S.S.(2004)Curr0pinInvestigDrugs5:61H)?？筆SMA胞外域抗體已經(jīng)描述(參見，例如，Liu，H.等人(1997)CancerRes.57:3629-3634;Murphy，G.P.等人(1998)J.Urol.160:2396-2401;Wang，S.等人(2001)Int.J.Cancer92:871-876;Kato,K.等人(2003)Int.J.Urol.10:439-444;美國(guó)專利No.6,150，508和美國(guó)專利No.6,107,090)。最近，與PSMA結(jié)合的人和人源化抗體已經(jīng)描述(參見，例如，Bander,N.H.等人(2003)Semin.Oncol.30:667-676;PCT/>布WO02/098897;PCT/>布WO01/09192;PCT/>布W003/064606;PCT7>布WO03/034903;和美國(guó)申請(qǐng)No.2004/0033229)。這些抗體已經(jīng)用于對(duì)前列腺癌細(xì)胞成傳、(參見，例如，Yao,D.等人(2002)Semin.Urol.Oncol.20:211-218;Bander,N.H.等人(2003)J.Urol.170:1717—1721)?？?PSMA抗體也已經(jīng)在前列腺癌治療中用于治療性干預(yù)，一般與化療劑或放射性同位素聯(lián)合使用(參見，例如，Nanus,D.M,等人(2003)J.Urol.170:S84-89;Milowsky,M.I.等人(2004)J.Clin.Oncol.22:2522—2531;Henry，M.D.等人(2004)CancerRes.64:7995-8001)。有效治療和/或預(yù)防PSMA表達(dá)相關(guān)疾病的改進(jìn)的治療性抗PSMA抗體，特別是不需與化療劑或放射性同位素偶聯(lián)即具有細(xì)胞毒性效應(yīng)的抗體，是期望的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供分離的脫巖藻糖基化抗體(即缺乏巖藻糖殘基的抗體)，其可與人PSMA結(jié)合，并且與該抗體的非脫巖藻糖基化形式(即含有巖藻糖殘基的抗體)相比，表現(xiàn)出增強(qiáng)的對(duì)表達(dá)PSMA的細(xì)胞的抗體引導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)殺傷。還提供了使用本發(fā)明的抗體和組合物治療與PSMA表達(dá)有關(guān)的多種疾病的方法。本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體與PSMA結(jié)合，并且與該抗體的巖藻糖基化形式相比，在人效應(yīng)細(xì)胞(例如單核細(xì)胞或單個(gè)核細(xì)胞)的存在下通過增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明的抗體提供了治療以PSMA表達(dá)為特征的疾病的改進(jìn)的手段。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種分離的抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)抗體，其缺乏巖藻糖殘基。優(yōu)選地，該抗體與含有巖藻糖殘基的抗體形式相比增強(qiáng)了表達(dá)細(xì)胞表面PSMA的細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，缺乏巖藻糖殘基的抗體對(duì)LNCaP前列腺癌細(xì)胞的ADCC活性的ECs。為0.05叫/ml或更低，或0.04jLig/ml或更葉氐，或0.03)ug/ml或更低，或0.02|ag/ml或更低，或大約0.018j^g/ml或更低。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，缺乏巖藻糖殘基的抗體對(duì)LNCaP前列腺癌細(xì)胞的ADCC活性的ECs。比含有巖藻糖殘基的抗體形式對(duì)LNCaP前列腺癌細(xì)胞的ADCC活性的ECw至少低3倍(或者至少低4倍，或者至少低5倍，或者至少低6倍)。優(yōu)選地，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體為單克隆抗體。在一方面，本發(fā)明涉及人源化或嵌合單克隆抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的人源化或嵌合抗體由選自3F5.4G6、3D7.1.1、4E10-1.14、3E11、4D8、3E6、3C9、2C7、1G3、3C4、3C6、4D4、1G9、5C8B9、3G6、4C8B9、E99、J415、J533和J591的小鼠抗-PSMA抗體制備。在另一方面，本發(fā)明涉及人單克隆抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，人單克隆抗體包括人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)，其中(a)人重鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:1-9的氨基酸序列；(b)人輕鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:10-18的氨基酸序列。在各種實(shí)施方案中，優(yōu)選以下的重鏈和輕鏈組合人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:1的氨基酸序歹'區(qū)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:區(qū)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列人重《連可變區(qū)包含SEQIDNO:區(qū)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列人重《連可變區(qū)包含SEQIDNO:區(qū)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:區(qū)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:區(qū)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:區(qū)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列人重《連可變區(qū)包含SEQIDNO:區(qū)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:9的氨基酸序歹i區(qū)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體包括(a)包含選自SEQIDNO:19-27的氨基酸序歹'CDR1;(b)包含選自SEQIDNO:28-36的氨基酸序歹'CDR2;(c)包含選自SEQIDNO:37-45的氨基酸序歹'CDR3;(d)包含選自SEQIDNO:46-54的氨基酸序歹'CDR1;(e)包含選自SEQIDNO:55-63的氨基酸序歹'CDR2;和2的氨基酸序歹3的氨基酸序歹4的氨基酸序歹5的氨基酸序歹6的氨基酸序歹7的氨基酸序歹'8的氨基酸序歹'且人輕鏈可變且人輕鏈可變且人輕鏈可變且人輕鏈可變且人輕鏈可變且人輕鏈可變且人輕鏈可變且人輕鏈可變且人輕鏈可變的人重鏈可變區(qū)的人重鏈可變區(qū)的人重鏈可變區(qū)的人輕鏈可變區(qū)的人輕鏈可變區(qū)(f)包含選自SEQIDNO:64-72的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)CDR3,在各種實(shí)施方案中，優(yōu)選以下重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的組合:(a(b(c(d(e(f或(a(b(c(d(e(f或(a(b(c(d(e(f或(a(b(c(d包含SEQIDNO包含SEQID冊(cè)包含SEQIDNO包含SEQIDNO包含SEQIDNO包含SEQIDNO19的人重鏈可變區(qū)CDRl28的人重鏈可變區(qū)CDR237的人重《連可變區(qū)CDR346的人輕《連可變區(qū)CDRl55的人輕鏈可變區(qū)CDR264的人輕鏈可變區(qū)CDR3包含SEQIDNO:20的人重鏈可變區(qū)CDRl包含SEQIDNO:29的人重鏈可變區(qū)CDR2包含SEQIDNO:38的人重鏈可變區(qū)CDR3包含SEQIDNO:47的人輕鏈可變區(qū)CDRl包含SEQIDNO56的人輕鏈可變區(qū)CDR2包含SEQIDNO65的人輕鏈可變區(qū)CDR3包含SEQIDNO21的人重鏈可變區(qū)CDRl包含SEQIDNO30的人重鏈可變區(qū)CDR2包含SEQIDNO39的人重鏈可變區(qū)CDR3包含SEQIDNO48的人輕鏈可變區(qū)CDRl包含SEQIDNO57的人輕鏈可變區(qū)CDR2包含SEQIDNO.66的人輕鏈可變區(qū)CDR3包含SEQIDNO:22的人重鏈可變區(qū)CDRl包含SEQIDNO:31的人重鏈可變區(qū)CDR2包含SEQIDNO:40的人重鏈可變區(qū)CDR3包含SEQIDNO:49的人輕鏈可變區(qū)CDRl和禾:口和包含SEQIDNO(f)包含SEQIDNO或(a)包含SEQIDNO(b)包含SEQIDNO(c)包含SEQIDNO(d)包含SEQIDNO(e)包含SEQIDNO(f)包含SEQIDNO或(a)包含SEQIDNO(b)包含SEQIDNO(c)包含SEQIDNO(d)包含SEQIDNO(e)包含SEQIDNO(f)包含SEQIDNO或(a)包含SEQIDNO(b)包含SEQIDNO(c)包含SEQIDNO(d)包含SEQIDNO(e)包含SEQIDNO(f)包含SEQIDNO或(a)包含SEQIDNO(b)包含SEQIDNO(c)包含SEQIDNO(d)包含SEQIDNO(e)包含SEQIDNO58的人輕鏈可變區(qū)CDR2;67的人輕《連可變區(qū)CDR3;23的人重鏈可變區(qū)CDR1;32的人重鏈可變區(qū)CDR2;41的人重鏈可變區(qū)CDR3;50的人輕鏈可變區(qū)CDR1;59的人輕鏈可變區(qū)CDR2;68的人輕鏈可變區(qū)CDR3;24的人重《連可變區(qū)CDR1;33的人重鏈可變區(qū)CDR2;42的人重鏈可變區(qū)CDR3;51的人輕鏈可變區(qū)CDR1;60的人輕鏈可變區(qū)CDR2;69的人輕鏈可變區(qū)CDR3;25的人重鏈可變區(qū)CDR1;34的人重《連可變區(qū)CDR2;43的人重4連可變區(qū)CDR3;52的人輕鏈可變區(qū)CDR1;61的人輕鏈可變區(qū)CDR2;70的人輕鏈可變區(qū)CDR3;26的人重鏈可變區(qū)CDR1;35的人重鏈可變區(qū)CDR2;44的人重鏈可變區(qū)CDR3;53的人輕鏈可變區(qū)CDR1;62的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:71的人輕鏈可變區(qū)CDR3;(a)包含SEQIDNO:27的人重鏈可變區(qū)CDR1(b)包含SEQIDNO:36的人重鏈可變區(qū)CDR2(c)包含SEQIDNO:45的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:54的人輕鏈可變區(qū)CDR1(e)包含SEQIDNO:63的人輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:72的人輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一方面，本發(fā)明提供一種脫巖藻糖基化人抗-PSMA抗體，其包含產(chǎn)自或來源于人VH5-51或VH3-30.3基因的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明還提供一種脫巖藻糖基化人抗-PSMA抗體，其包含產(chǎn)自或來源于人VkL6、04/014或L18基因的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明還提供一種脫巖藻糖基化人抗-PSMA抗體，其包含產(chǎn)自或來源于人VH5-51或V,,3-30.3基因的重鏈可變區(qū)，和產(chǎn)自或來源于人VkL6、04/014或L18基因的輕鏈可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明涉及一種嵌合雞，其包含編碼抗-PSMA抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，使得在該嵌合雞的雞蛋中表達(dá)抗-PSMA抗體，其中在該嵌合雞的雞蛋中表達(dá)的抗-PSMA抗體缺乏巖藻糖殘基。優(yōu)選地，該免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因是人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因。另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼抗-PSMA抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，使得所述宿主細(xì)胞表達(dá)的抗-PSMA抗體缺乏巖藻糖殘基。優(yōu)選地，該免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因是人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因。優(yōu)選地，該巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是FUT8。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供一種抑制PSMA+細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。該方法包括使所述細(xì)胞與脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體在足以誘導(dǎo)所述細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的條件下接觸。所述細(xì)胞可以是，例如腫瘤細(xì)l包。優(yōu)選地，所述抗-PSMA抗體是人抗體。本發(fā)明還提供一種抑制受試者中胂瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其中該胂瘤細(xì)胞或靠近該腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA。該方法包括給受試者施用有效抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的量的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體。優(yōu)選地，所述抗-PSMA抗體是人抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是前列腺癌腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)通過下面的詳述和實(shí)施例將是顯而易見的，該詳述和實(shí)施例不應(yīng)理解為限制性的。貫穿本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、Genbank項(xiàng)、專利和公布的專利申請(qǐng)的內(nèi)容均在此處特別引入作為參考。圖1顯示4A3、7F12、8C12、8A11和16F9的重《連可變區(qū)氨基酸序列(分別為SEQIDN0s:l-5)與人種系VH5-51氨基酸序列(SEQIDNO:73)的比對(duì)。圖2顯示4A3、7F12和8C12的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(分別為SEQIDN0s:10-12)與人種系VkL6氨基酸序列(SEQIDNO:74)的比對(duì)。圖3顯示8A11和16F9的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(分別為SEQIDNOs:13和14)與人種系Vk04/014氨基酸序列(SEQIDNO:75)的比對(duì)。圖4A顯示1C3人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:78)和氨基酸序列(SEQIDNO:9)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:27)、CDR2(SEQIDNO:36)和CDR3(SEQIDNO:45)區(qū)，并指出了V、D和J的種系來源。圖4B顯示1C3人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:82)和氨基酸序列(SEQIDNO:18)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:54)、CDR2(SEQIDNO:63)和CDR3(SEQIDNO:72)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖5A顯示2A10人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核普酸序列(SEQIDNO:79)和氨基酸序列(SEQIDNO:6)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:24)、CDR2(SEQIDNO:33)和CDR3(SEQIDNO:42)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖5B顯示2A10人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:83)和氨基酸序列(SEQIDNO:15)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:51)、CDR2(SEQIDNO:60)和CDR3(SEQIDNO:69)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖6A顯示2C6人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:80)和氨基酸序列(SEQIDNO:7)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:25)、CDR2(SEQIDNO:34)和CDR3(SEQIDNO:43)區(qū)，并指出了V、D和J的種系來源。圖6B顯示2C6人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:84)和氨基酸序列(SEQIDNO:16)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:52)、CDR2(SEQIDNO:61)和CDR3(SEQIDNO:70)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖7A顯示2F5人單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:81)和氨基酸序列(SEQIDNO:8)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:26)、CDR2(SEQIDNO:35)和CDR3(SEQID冊(cè)44)區(qū)，并指出了V、D和J的種系來源。圖7B顯示2F5人單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQIDNO:85)和氨基酸序列(SEQIDNO:17)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:53)、CDR2(SEQIDNO:62)和CDR3(SEQIDNO:71)區(qū)，并指出了V和J的種系來源。圖8顯示2A10、2C6和2F5的重鏈可變區(qū)氨基酸序列(分別為SEQIDNOs:6-8)與人種系VH5-51氨基酸序列(SEQIDNO:73)的比對(duì)。圖9顯示1C3的重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:9)與人種系VH3-30.3氨基酸序列(SEQIDNO:76)和JH6b種系(SEQIDNO:86)的比對(duì)。圖10顯示2C6的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:16)與人種系VkL6氨基酸序列(SEQIDNO:74)和JK3種系(SEQIDNO:87)的比對(duì)。圖11顯示1C3、2A10和2F5的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:18、15、17)與人種系VkL18氨基酸序列(SEQIDNO:77)和JK4種系(SEQIDNO:88)的比對(duì)。圖12是Ov7.5和Ovl5表達(dá)載體的圖示。標(biāo)出了Ov的5，和3，調(diào)節(jié)序列的位置。在該載體的3'末端包括由啟動(dòng)子(Cx)驅(qū)動(dòng)的具有EGFP和嘌呤霉素(Puro)的盒，該盒在所有細(xì)胞型中起作用，以利于被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的cES細(xì)胞的分離和cES細(xì)胞對(duì)嵌合體貢獻(xiàn)的鑒定。MAb盒的細(xì)節(jié)在該圖的下部示出。細(xì)黑線表示來源于人L和H鏈的內(nèi)含子序列或非翻譯序列(盡管內(nèi)含子序列在Ovl5Mab7F12構(gòu)建體中不存在)。SiG禮L鏈的信號(hào)肽的序列，VL:L鏈的V基因的序列。Ck:kl鏈的恒定區(qū)的序列，IRES:內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列，SiGv:H鏈的信號(hào)肽的序列，VH:H鏈的V基因的序列，CH1、H、和C3:ylH鏈的CHI、鉸鏈、CH2和C,i3域的編碼序列。圖13A-13B是通過MALDITOF質(zhì)謙法測(cè)定的在雞蛋中表達(dá)的7F12抗-PSMA抗體的寡糖結(jié)構(gòu)的概況。黑色圓形表示甘露糖；空心圓形表示己糖(甘露糖或半乳糖)，黑色正方形表示N-乙?；咸前?。垂直線表示最后一個(gè)己糖能夠與甘露糖或N-乙?；咸前窔埢械娜我粋€(gè)沿該線連接。圖14A-14B顯示與同種型對(duì)照相比，使用CHO細(xì)胞表達(dá)的7F12("7F12")和雞表達(dá)的7F12的ADCC測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表示為％裂解。圖14A顯示使用IL-2刺激的效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)果。圖14B顯示使用新鮮人外周血效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)果。圖l5是顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果的條圖，其中與同種型對(duì)照相比，CH0細(xì)胞表達(dá)的7F12('"F12")和雞表達(dá)的7F12的ADCC活性被抗CD16抗體阻斷。圖16A-16C顯示與巖藻糖基化2A10mAb("親本")和同種型對(duì)照相比，使用脫巖藻糖基化2A10mAb("脫巖藻糖")的ADCC測(cè)定結(jié)果。圖16A和16B代表使用LNCaP-C42b靶細(xì)胞和IL-2刺激的效應(yīng)細(xì)胞的兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。圖16C代表使用LNCaP-C42b輩巴細(xì)胞和新鮮人外周血效應(yīng)細(xì)胞的實(shí)馬全。圖17是與巖藻糖基化2A10mAb("親本")和同種型對(duì)照或者無抗體對(duì)照相比，脫巖藻糖基化2A10mAb("脫巖藻糖")的ADCC測(cè)定結(jié)果的條圖，其中ADCC活性被抗CD16抗體阻斷。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于治療和診斷與PSMA表達(dá)和/或PSMA表達(dá)細(xì)胞有關(guān)的多種疾病的抗體組合物和改進(jìn)的基于抗體的治療。本發(fā)明的抗體在抗體的碳水化合物鏈上缺乏巖藻糖殘基。此外，該抗體表現(xiàn)出增強(qiáng)的對(duì)PSMA+細(xì)胞的抗體引導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)殺傷。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人源化或完全人抗體，并且特別可用于治療人類與PSMA表達(dá)細(xì)胞有關(guān)的疾病。本發(fā)明還包括使用缺乏巖藻糖殘基的抗-PSMA抗體進(jìn)行治療(例如治療和/或預(yù)防與PSMA的表達(dá)有關(guān)的疾病)的方法。為了使本發(fā)明更容易理解，首先定義了一些術(shù)語。其他的定義在發(fā)明詳述內(nèi)容中說明。術(shù)語"前列腺特異性膜抗原"和"PSMA"在本文中可以互換使8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3結(jié)合的人PSMA的任何變體、同種型和物種同源物。人PSMA蛋白的完整的氨基酸序列的Genbank登錄號(hào)為NP—004467。編碼人PSMA蛋白的完整的cDNA序列的Genbank登錄號(hào)為NM_004476。本文所用的術(shù)語"缺乏巖藻糖殘基的抗體，，和"脫巖藻糖基化抗體"可以互換使用，是指抗體的碳水化合物部分不含巖藻糖殘基或已經(jīng)從中除去巖藻糖殘基的抗體。缺乏巖藻糖殘基的抗體可以如下產(chǎn)生，例如在使巖藻糖殘基不與抗體的碳水化合物鏈連接或者這種連接最小化的細(xì)胞或表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)抗體，或者化學(xué)修飾該抗體以從碌_水化合物鏈上除去巖藻糖殘基(例如用巖藻糖苷酶處理抗體)。因此，術(shù)語"缺乏巖藻糖殘基"和"脫巖藻糖基化"不受制備具有改變的碳水化合物結(jié)構(gòu)的抗體的機(jī)制所限制。本文所用的術(shù)語"表達(dá)巖藻糖殘基的抗體"和"巖藻糖基化抗體"可以互換使用，是指抗體的碳水化合物部分含有巖藻糖的抗體。術(shù)語"免疫應(yīng)答"是指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的作用，導(dǎo)致選擇性損傷、破壞或從人體中清除侵入的病原體、纟皮病原體感染的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞，或(在自身免疫或病理性炎癥的情況下)正常人細(xì)胞或組織。本文所用的術(shù)語"效應(yīng)細(xì)胞"是指與免疫應(yīng)答的效應(yīng)階段有關(guān)的免疫細(xì)胞，效應(yīng)階段與免疫應(yīng)答的識(shí)別和激活階段相反。免疫細(xì)胞的例子包括骨髓或淋巴來源的細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞(例如B細(xì)胞和T細(xì)胞，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL))、殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、多形核細(xì)胞、粒細(xì)月包、肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞。某些效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)特異性的Fc受體并且行使特異性的免疫功能。在優(yōu)選實(shí)施方案中，效應(yīng)細(xì)胞能夠誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC),例如能夠誘導(dǎo)ADCC的嗜中性粒細(xì)月包。例如，表達(dá)FcR的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞參與對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷和向免疫系統(tǒng)的其他部分呈遞抗原，或者與呈遞抗原的細(xì)胞結(jié)合。在其他實(shí)施方案中，效應(yīng)細(xì)胞能夠吞噬靶抗原或靶細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞上特定FcR的表達(dá)可以用諸如細(xì)胞因子等體液因子來調(diào)節(jié)。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)G-CSF或GM-CSF可以上調(diào)FcaRI的表達(dá)。這種增強(qiáng)的表達(dá)4是高了帶有FcaRI的細(xì)胞對(duì)靶標(biāo)的效應(yīng)功能。效應(yīng)細(xì)胞能夠吞噬或裂解乾抗原或耙細(xì)胞。"靶細(xì)胞"是指如下任意的細(xì)胞或病原體，將其從受試者(例如人或動(dòng)物)中消除是有益的，并且可以被本發(fā)明的組合物(例如抗體)耙向。例如，耙細(xì)胞可以是表達(dá)或過量表達(dá)PSMA的細(xì)胞。術(shù)語"抗體依賴性細(xì)胞毒性"或"ADCC，，是指細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)，其中具有結(jié)合的抗-PSMA抗體的PSMA+耙細(xì)胞被帶有Fc受體的效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別，隨后裂解，而不需要補(bǔ)體的參與。本文使用的術(shù)語"增強(qiáng)ADCC"(例如指細(xì)胞時(shí))包括，在效應(yīng)細(xì)胞存在下(例如，靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞比為1:50),與接觸巖藻糖基化抗PSMA抗體的相同細(xì)胞的細(xì)胞殺傷相比，當(dāng)接觸缺乏巖藻糖殘基的抗-PSMA抗體時(shí)，任何可測(cè)量的細(xì)胞裂解的增加，例如，細(xì)胞裂解增加至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90°/。、100%、150%、200%、250%、300%或325%。本文提到的術(shù)語"抗體"包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即"抗原結(jié)合部分")或單鏈。"抗體，，是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(在此縮寫為V,》和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域C們、C^和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為VJ和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域"組成。Vh和VL區(qū)可進(jìn)一步再分為高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR),CDR散布在被稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更加保守的區(qū)域中。每個(gè)Vh和Vl均由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，它們從氨基端向羧基端以如下順序排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3,CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有可與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，該宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。本文所用的術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡(jiǎn)稱為"抗體部分")是指保留與抗原(例如PSMA)特異性結(jié)合的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段。已證明抗體的抗原結(jié)合功能可由全長(zhǎng)抗體的片段來行使。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"中所包括的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、Vh、Cl和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab，)2片段，即包含在鉸鏈區(qū)處通過二硫4建連接的兩個(gè)Fab片段的雙價(jià)片段；(iii)由L和C們結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的^和V,i結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片4殳(Ward等(1989)Nature341:544-546);和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域Vl和VH由單獨(dú)的基因編碼，但是它們可以利用重組方法通過合成連接體連接在一起，該連4妻體使它們能夠制成一條蛋白質(zhì)鏈，其中l(wèi)和VH區(qū)配對(duì)構(gòu)成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如Bird等(1988)Science242:423-426;和Huston等(19S8)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這種單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)。這相同的方法對(duì)這些片段的實(shí)用性進(jìn)行篩選。本文使用的術(shù)語"重組人抗體"包括通過重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如(a)從對(duì)于人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤(下文進(jìn)一步描述)中分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞如轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，(c)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組人抗體具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。但是在某些實(shí)施方案中，這些重組人抗體可以經(jīng)歷體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的Vh和叭區(qū)的氨基酸序列盡管是來源于人種系Vh和叭序列并與之相關(guān)的序列，但可能不是在體內(nèi)天然存在于人抗體種系的所有組成成分(repertoire)中。本文使用的術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物，，是指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。本文使用的術(shù)語"人抗體，，是指具有的可變區(qū)中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)都來源于人種系免疫球蛋白序列的抗體。而且，如果該抗體含有恒定區(qū)，則恒定區(qū)也來源于人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外術(shù)語"人單克隆抗體"是指表現(xiàn)單一結(jié)合特異性的抗體，其具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括與無限增殖化細(xì)胞融合的B細(xì)胞，該B細(xì)胞從具有含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)中獲得。本文所用的術(shù)語"人單克隆抗體"也包括通過重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的完全人抗體，例如(a)從對(duì)于人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤(下文進(jìn)一步描述)中分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞如轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，(c)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組人抗體具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。但是在某些實(shí)施方案中，這些重組人抗體可以經(jīng)歷體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的Vh和l區(qū)的氨基酸序列盡管是來源于人種系Vh和Vt序列并與之相關(guān)的序列，但可能不是在體內(nèi)天然存在于人抗體種系的所有組成成分(repertoire)中。本文使用的"分離的抗體"是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，與PSMA特異性結(jié)合的分離的抗體基本不含與除PSMA以外的抗原特異性結(jié)合的抗體)。但是，與人PSMA的表位、同種型或變體特異性結(jié)合的分離的抗體可以具有與諸如來自其他物種的其他相關(guān)抗原(例如PSMA種同源物)的交叉反應(yīng)性。而且，分離的抗體可基本不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，具有不同特異性的"分離的"單克隆抗體的組合以確定的組成組合。術(shù)語"人源化抗體，，是指其中來源于另外一種哺乳動(dòng)物種(如小鼠)的種系的CDR序列已經(jīng)被移植到人構(gòu)架序列上的抗體。在人構(gòu)架序列內(nèi)也可以進(jìn)行其它的構(gòu)架區(qū)修飾。術(shù)語"嵌合抗體"是指其中可變區(qū)序列來源于一個(gè)物種而恒定區(qū)序列來源于另一個(gè)物種的抗體，例如其中可變區(qū)序列來源于小鼠抗體而恒定區(qū)序列來源于人抗體的抗體。術(shù)語"表位"指能夠與抗體特異性結(jié)合或被抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)組成，如氨基酸或糖側(cè)鏈，且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于當(dāng)存在變性溶劑時(shí)與前者的結(jié)合喪失，而與后者的結(jié)合不喪失。本文所用的術(shù)語"特異性結(jié)合"是指抗體與預(yù)定的抗原結(jié)合。典型地，抗體以10—'M或更低的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合，并且與預(yù)定抗原結(jié)合的KD比與預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原以外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)結(jié)合的L至少低兩倍。短語"識(shí)別抗原的抗體"和"抗原特異性抗體，，在此與術(shù)語"與抗原特異性結(jié)合的抗體"可互換使用。本文使用的術(shù)語"同種型"是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如IgM或IgGl)。本文使用的術(shù)語"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一種核酸的核酸分子。一種載體類型是"質(zhì)粒"，它是指環(huán)形雙鏈DNA環(huán)，其中可以連接另外的DNA片段。另一種栽體類型是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接到病毒基因組內(nèi)。某些載體能夠在它所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中，由此隨宿主基因組一起復(fù)制。另外，某些載體能夠引導(dǎo)與它們有效連接的基因的表達(dá)。這些載體在本文中被稱為"重組表達(dá)載體，，(或者筒稱為"表達(dá)載體")。通常在重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體常常為質(zhì)粒形式。在本說明書中，"質(zhì)粒，，和"載體"可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明也包括其他形式的表達(dá)載體，如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們起等同的功能。本文使用的術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"(或簡(jiǎn)稱為"宿主細(xì)胞")是指已經(jīng)導(dǎo)入了重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，這些術(shù)語不僅指特定受試者的細(xì)胞，而且指該細(xì)胞的后代。因?yàn)橛捎谕蛔兓颦h(huán)境影響，某些修飾可能在后代中發(fā)生，這些后代實(shí)際上可能與親本細(xì)胞不同，但是仍然包含在本文使用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"中。重組宿主細(xì)胞包括，例如，CH0細(xì)胞、轉(zhuǎn)染瘤和'淋巴細(xì)胞。本文使用的術(shù)語"受試者"包括任何人或非人類動(dòng)物。術(shù)語"非人類動(dòng)物，，包括所有脊推動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類動(dòng)物、爬行類動(dòng)物等。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物，，是指具有含有一種或多種人類重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體(整合或者非整合到動(dòng)物的天然基因組DNA內(nèi))的基因組并且能夠表達(dá)全人類抗體的非人類動(dòng)物。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可能具有人輕鏈轉(zhuǎn)基因和人重鏈轉(zhuǎn)基因或人重鏈轉(zhuǎn)染色體，使得該小鼠在用PSMA抗原和/或表達(dá)PSMA的細(xì)胞免疫時(shí)產(chǎn)生人抗-PSMA抗體。人重鏈轉(zhuǎn)基因可以整合到小鼠的染色體DNA內(nèi)，例如轉(zhuǎn)基因(例如HuMAb)小鼠，或者人重鏈轉(zhuǎn)基因可以保持在染色體外，如W002/43478所述的轉(zhuǎn)染色體(例如KM)小鼠。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠通過經(jīng)歷V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換能夠產(chǎn)生抗PSMA人單克隆抗體的多種同種型(例如IgG、IgA和/或IgE)。本發(fā)明的各個(gè)方面在下面的部分中進(jìn)一步詳細(xì)描述。缺乏巖藻糖殘基并且具有增強(qiáng)的ADCC活性的抗-PSMA抗體本發(fā)明涉及與抗體的巖藻糖基化形式相比對(duì)表達(dá)PSMA的細(xì)胞具有增強(qiáng)的抗體引導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，例如在0.1|jg/ml的抗體濃度和1:100的靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞比例的條件下，與抗體的巖藻糖基化形式相比，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體在體外誘導(dǎo)增強(qiáng)的LnCaP前列腺癌細(xì)胞(ATCCCRL-1740)的ADCC。優(yōu)選地，使用的效應(yīng)細(xì)胞是IL-2刺激的來自人外周血的效應(yīng)細(xì)胞(例如，lxl(T人外周血單核細(xì)胞與10U/ml人IL-2在37。C下溫育過夜)。優(yōu)選地將抗體的脫巖藻糖基化形式與從哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞中表達(dá)獲得的巖藻糖基化形式進(jìn)行比較。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體的脫巖藻糖化形式的ADCC活性的ECso為0.05jag/ml或更低，更優(yōu)選0.04jag/ml或更4氐，更優(yōu)選0.03)ag/ml或更低，更優(yōu)選0.02fig/ml或更低，更優(yōu)選大約G.G18|Lig/nil。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體的脫巖藻糖化形式的ADCC活性的EC5。為0.Ol^ig/ml或更低，更優(yōu)選0.OO^g/ml或更低，更優(yōu)選0,008|iig/ml或更低，更優(yōu)選0.007pg/ml或更低，更優(yōu)選0.005pg/ml或更低，更優(yōu)選0.002jiig/ml。優(yōu)選利用實(shí)施例4所述的測(cè)定法使用IL-2刺激的效應(yīng)細(xì)胞，或者利用實(shí)施例4所述的測(cè)定法使用新鮮的人外周血效應(yīng)細(xì)胞，測(cè)定ADCC活性的EC5。。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體的脫巖藻糖化形式的ADCC活性的EC5。比抗體的巖藻糖基化形式(例如CHO細(xì)胞表達(dá)的抗體形式)的EC5。至少低3倍，更優(yōu)選至少低4倍，更優(yōu)選至少低5倍，更優(yōu)選至少低6倍，更優(yōu)選至少低7倍，更優(yōu)選至少低8倍，更優(yōu)選至少低9倍，更優(yōu)選至少低10倍。另外，優(yōu)選利用實(shí)施例4所述的測(cè)定法使用IL-2刺激的效應(yīng)細(xì)胞，或者利用實(shí)施例4所述的測(cè)定法使用新鮮的人外周血效應(yīng)細(xì)胞，測(cè)定ADCC活性的EC5。。典型地，發(fā)現(xiàn)使用新鮮的人外周血效應(yīng)細(xì)胞獲得的EC5。(巖藻糖基化)EC5。(脫巖藻糖基化)的比例較高，但是發(fā)現(xiàn)使用新鮮的人外周血效應(yīng)細(xì)胞獲得的最大裂解百分比較低。本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體的增強(qiáng)的ADCC活性可以定量為，例如，當(dāng)對(duì)于脫巖藻糖基化和巖藻糖基化形式在相同條件下(例如相同的抗體濃度和相同的靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞比)測(cè)定ADCC活性時(shí)，與該抗體的巖藻糖基化形式相比細(xì)胞裂解百分比的增加。另外或者可替代地，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體的增強(qiáng)的ADCC活性可以定量為，例如，與巖藻糖基化形式相比，脫巖藻糖基化形式的ECs。值降低所測(cè)定的增加的功效。這可以根據(jù)巖藻糖基化形式與脫巖藻糖基化形式的EC5。的比例來定量?？梢栽诒景l(fā)明的ADCC測(cè)定中使用并且本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體比該抗體的巖藻糖基化形式對(duì)其表現(xiàn)出增強(qiáng)的ADCC活性的PSMA+細(xì)胞系的例子包括LnCaP細(xì)胞、22Rvl細(xì)胞和/或PCa2b細(xì)胞。脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體獲得的增強(qiáng)的ADCC效應(yīng)可以導(dǎo)致，在使用該抗體的巖藻糖基化形式觀察不到ADCC的抗體濃度下，脫巖藻糖基化形式只寸PSMA+細(xì)月包具有ADCC活'性。抗-PSMA抗體的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體(例如鼠、嵌合、人源化和人抗體)是本領(lǐng)域公知的，并且可以在本發(fā)明中使用。本發(fā)明的抗-PSMA抗體經(jīng)過修飾，使得該抗體缺乏巖藻糖殘基?？梢酝ㄟ^多種方法中的一種來制備缺乏巖藻糖殘基的抗體。例如，可以使用重組DNA技術(shù)在具有改變的糖基化機(jī)制從而使巖藻糖殘基向碳水化合物鏈上的添加受到抑制的細(xì)胞中表達(dá)抗體。另外或者可替代地，可以通過化學(xué)去除巖藻糖殘基而使抗體脫巖藻糖基化。另外，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體可以在嵌合雞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，使得該抗體在嵌合雞的雞蛋中產(chǎn)生。在雞蛋中表達(dá)抗-PSMA抗體的嵌合雞的產(chǎn)生在實(shí)施例1中詳細(xì)描述，這種雞蛋表達(dá)的抗-PSMA抗體上缺乏巖藻糖殘基在實(shí)施例3中得到證明。適用于在雞蛋中表達(dá)蛋白質(zhì)的嵌合雞在PCT公開WO2004/015123中描述。因此，另一方面，本發(fā)明涉及一種嵌合雞，其含有編碼抗-PSMA抗體的免疫3求蛋白重鏈和輕鏈基因，使得在嵌合雞的雞蛋中表達(dá)抗-PSMA抗體，其中在嵌合雞的雞蛋中表達(dá)的抗-PSMA抗體缺乏巖藻糖殘基。優(yōu)選地，所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因是人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在一種細(xì)胞中表達(dá)抗體，該細(xì)胞缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，從而使得該細(xì)胞系產(chǎn)生在其碳水化合物中缺乏巖藻糖的蛋白質(zhì)(見實(shí)施例5和6)。例如，細(xì)胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT8(a(1,6)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)，從而在Ms704、Ms705和Ms709細(xì)胞系中表達(dá)的抗體在其碳水化合物中缺乏巖藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8—/_細(xì)胞系是通過使用兩種置換載體在CH0/DG44細(xì)胞中定向破壞FUT8基因而產(chǎn)生的(參見，Yamane等人的美國(guó)專利公開No.20040110704，和Yamane-Ohnuki等人.(2004)A/Wec力/70/5/de/^^2:614-22)。作為另一個(gè)例子，Hanai等人的EP1,176,195描述了一種細(xì)胞系，該細(xì)胞系的編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的FUT8基因被功能破壞，使得在這種細(xì)胞系中表達(dá)的抗體由于減少或消除了cc1，6鍵相關(guān)的酶而表現(xiàn)出低巖藻糖基化。Hanai等人也描述了天然具有將巖藻糖添加到與抗體Fc區(qū)結(jié)合的N-乙酰葡糖胺上的低酶活性或者不具有該酶活性的細(xì)胞系，例如大鼠骨髓瘤細(xì)胞系YB2/0(ATCCCRL1662)。Presta的PCT公開WO03/035835描述了變異的CHO細(xì)胞系Lecl3細(xì)胞，其將巖藻糖添加到Asn(297)-連接的碳水化合物上的能力降低，也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體的低巖藻糖化(參見，Shields,R.L,等人.(2002)/.C力e瓜277:26733-26740)。Umana等人的PCT公開WO99/54342描述了表達(dá)糖蛋白修飾的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的工程細(xì)胞系(例如P(1，4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII)),使得該工程細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)出增加的等分GlcNac結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗體的ADCC活性增強(qiáng)(參見Umana等人.(19")5/Wec力.17:176—180)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)抗-PSMA抗體，并且使用巖藻糖苷酶切去巖藻糖殘基。例如，巖藻糖苷酶a-L-巖藻糖苷酶從抗體上除去巖藻糖殘基(Tarentino，A.L.等人.(1975)A/oc力e瓜M:5516-23)。另外，在其他實(shí)施方案中，也修飾抗體的其他形式的糖基化。例如，可以制備非糖基化的抗體(即缺乏糖基化的抗體)。這種碳水化合物修飾可以通過(例如)改變抗體序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。例如，可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，導(dǎo)致除去一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)構(gòu)架糖基化位點(diǎn)，由此消除了該位點(diǎn)的糖基化。這種非糖基化可以增強(qiáng)抗體對(duì)抗原的親和力。這種方法在Co等人的美國(guó)專利Nos.5，714，350和6，350,861中詳細(xì)描述。抗-PSMA抗體上不含巖藻糖殘基的表征本發(fā)明的抗體缺乏巖藻糖殘基，例如，在Fc部分碳水化合物鏈中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域^知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如APTS毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)的焚光法來檢測(cè)抗體中巖藻糖殘基的不存在。簡(jiǎn)要地說，可以通過加入肽N-聚糖酶(Prozyme)并溫育過夜來釋放純化的抗-PSMA抗體的N-連接的寡糖。重懸浮碳水化合物，在脫唾液酸化和巖藻糖殘基的丟失最小的溫和還原胺化條件下用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸酯(APTS)衍生化。使用激光誘導(dǎo)的熒光4全測(cè)器(BeckmanCoulter)通過毛細(xì)管電泳分析反應(yīng)加合物。根據(jù)電泳中與含有巖藻糖的相同抗體相比的位移觀察巖藻糖的不存在。檢測(cè)抗-PSMA抗體上不含巖藻糖殘基的另外一種技術(shù)是使用HPLC的單糖分析。測(cè)定PSMA結(jié)合的合適的測(cè)定法在實(shí)施例中進(jìn)一步描述。分析抗體的碳水化合物含量和結(jié)構(gòu)的其他技術(shù)包括對(duì)表達(dá)的碳水化合物的MS序型分析(profiling)(糖組學(xué))、對(duì)釋放的完整聚糖的直接MALDI-T0F分析(提供碳水化合物類別的質(zhì)量)、低CIDMSMS譜(提供聚糖的結(jié)構(gòu)組成)、高CIDMSMS譜和MSn譜(提供關(guān)于聚糖連接的信息)和序貫外切糖苷酶消化(提供聚糖的結(jié)構(gòu)連接信息)。檢測(cè)抗體的碳水化合物含量的方法在實(shí)施例3中詳細(xì)描述。PSMA+細(xì)胞的抗體依賴的細(xì)胞殺傷的表征可以檢測(cè)脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體介導(dǎo)對(duì)表達(dá)PSMA的細(xì)胞的吞噬和殺傷的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在相同濃度下比較時(shí)，脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體與含有巖藻糖的相同抗體相比增強(qiáng)了對(duì)表達(dá)PSMA的細(xì)胞的殺傷。在另一實(shí)施方案中，脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)PSMA的細(xì)胞的殺傷，其中含有巖藻糖的相同抗體在相同濃度下不誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷。單克隆4元體的ADCC活性可以利用建立的體外測(cè)定法;險(xiǎn)測(cè)。一個(gè)例子是，可以采用鉻釋放ADCC測(cè)定。簡(jiǎn)要地說，來自健康供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)或者其他效應(yīng)細(xì)胞通過FicollHypaque密度離心純化，然后裂解摻雜的紅細(xì)胞。洗滌后的PBMC可以懸浮在含有10%熱滅活的胎牛血清的RPMI中，并以各種效應(yīng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞比例下與51Cr標(biāo)記的表達(dá)PSMA的細(xì)胞混合。然后加入各種濃度的抗-PSMA抗體?？梢允褂猛N型匹配的抗體作為陰性對(duì)照。測(cè)定可以在37°C下進(jìn)行4-18小時(shí)。通過測(cè)定"Cr向培養(yǎng)上清液中的釋放來測(cè)定樣品的細(xì)胞裂解。也可以將抗PSMA單克隆抗體互相組合4企測(cè)，以確定多種單克隆抗體是否增強(qiáng)細(xì)胞裂解?？梢杂糜跈z測(cè)抗-PSMA抗體介導(dǎo)對(duì)表達(dá)PSMA的細(xì)胞的吞噬和殺傷能力的一種替代測(cè)定法是時(shí)間分辨熒光測(cè)定。簡(jiǎn)要地說，向表達(dá)PSMA的細(xì)胞加入焚光增強(qiáng)配體的乙酰氧基甲酯(BATDA),BATDA穿透細(xì)胞膜。在細(xì)胞內(nèi)，酯鍵被水解，該化合物不再能夠通過細(xì)胞膜。然后加入各種濃度的抗-PSMA抗體。細(xì)胞裂解后，加入銪溶液(PerkinElmer),任何游離的配體均與銪結(jié)合，形成高度熒光和穩(wěn)定的螯合物(EuTDA)，該螯合物可以用微孔板讀數(shù)器(PerkinElmer)讀取。測(cè)定的信號(hào)與裂解的細(xì)力包量相關(guān)。用于斗全測(cè)本發(fā)明的抗-PSMA抗體的ADCC活性的優(yōu)選ADCC測(cè)定法在實(shí)施例4中詳細(xì)描述?？?PSMA抗體也可以在體內(nèi)模型(例如小鼠)上檢測(cè)，以確定它們介導(dǎo)對(duì)表達(dá)PSMA的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)的吞噬和殺傷的能力。例如，可以基于以下標(biāo)準(zhǔn)選擇這些抗體，這些標(biāo)準(zhǔn)不是排除性的1)與表達(dá)PSMA的活細(xì)胞結(jié)合；2)與PSMA結(jié)合的高親和力；3)與PSMA上的獨(dú)特表位結(jié)合(以消除具有互補(bǔ)活性的單克隆抗體在組合使用時(shí)竟?fàn)幗Y(jié)合相同表位的可能性)；4)被表達(dá)PSMA的細(xì)胞內(nèi)化；5)在人效應(yīng)細(xì)胞存在下對(duì)表達(dá)PSMA的細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、吞噬和/或殺傷的體外介導(dǎo)。本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體滿足這些標(biāo)準(zhǔn)中的一條或幾條。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，單克隆抗體組合使用，例如作為含有兩種或多種抗PSMA單克隆抗體或其片段的藥物組合物。例如，具有不同但是互補(bǔ)活性的抗PSMA單克隆抗體可以在一種治療中組合，以達(dá)到所需的治療或診斷效果。一種示例是如下一種組合物，其含有在效應(yīng)細(xì)胞存在下介導(dǎo)高效的靶細(xì)胞殺傷的抗-PSMA單克隆抗體，和抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞生長(zhǎng)的另一種抗PSMA單克隆抗體相組合。與PSMA結(jié)合的表征例如，通過本領(lǐng)i或/^知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，如EUSA、FACS分析和/或Biacore分析，可以檢測(cè)本發(fā)明的抗體與PSMA的結(jié)合。在典型的ELISA測(cè)定中，簡(jiǎn)要地說，用在PBS中濃度為0.25jug/ml的純化的PSMA包被樣么孔板，然后用在PBS中的5%牛血清白蛋白封閉。向每孔中加入抗體稀釋液，在37。C下溫育1-2小時(shí)。用PBS/Tween洗板，然后與偶聯(lián)到^威性磷酸酶上的第二試劑(例如人抗體或山羊抗人IgGFc-特異性多克隆試劑)在37。C下一起溫育1小時(shí)。洗滌后，板用pNPP底物(1mg/ml)顯色，并在OD405-650下分析。為了證明單克隆抗體與表達(dá)PSMA的活細(xì)胞的結(jié)合，可以使用流式細(xì)胞術(shù)。在流式細(xì)胞術(shù)方案的一個(gè)典型(但非限定性的)實(shí)例中，表達(dá)PSMA的細(xì)胞系(在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng))與在含有0.1%BSA和20%小鼠血清的PBS中的各種濃度的單克隆抗體相混合，并在37。C下溫育1小時(shí)。洗滌后，細(xì)胞與熒光素標(biāo)記的第二抗體(例如抗人IgG抗體)在與第一抗體染色相同的條件下反應(yīng)?？梢岳霉馍⑸浜蛡?cè)向散射性質(zhì)通過FACScan儀分析樣品，來對(duì)單細(xì)胞畫門(gate)。(除了或替代)流式細(xì)胞測(cè)定，可以采用一種使用熒光顯微鏡的替代測(cè)定法。細(xì)胞可以完全如上所述染色，并用焚光顯微鏡檢測(cè)。該方法允許顯示單個(gè)細(xì)胞，但是根據(jù)抗原密度可能降低靈敏度?？梢赃M(jìn)一步通過Western印跡法進(jìn)一步檢測(cè)抗-PSMA抗體與PSMA抗原的反應(yīng)性。例如，可以由表達(dá)PSMA的細(xì)胞制備細(xì)胞提取物，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用20%小鼠血清封閉，并用待檢測(cè)的單克隆抗體探針結(jié)合?？梢杂门c堿性磷酸酶連接的抗物種特異性第二抗體檢測(cè)抗體的結(jié)合，并用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.，St.Louis，MO)顯色。評(píng)價(jià)抗體與PSMA結(jié)合能力的其他技術(shù)在本領(lǐng)域中公知，包括RIA和Biacore分析。用來測(cè)定PSMA結(jié)合的合適的測(cè)定法在實(shí)施例4中詳細(xì)描述。嵌合或人源化抗-PSMA抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體是嵌合或人源化抗體。這些抗體可以用本領(lǐng)域中可以獲得的小鼠抗-PSMA抗體和建立的將小鼠抗體轉(zhuǎn)化為嵌合或人源化抗體的程序來制備。這些小鼠抗-PSMA抗體的非限定性例子包括3F5.4G6、3D7丄1、4E10-1.14、3E11、4D8、犯6、3C9、2C7、1G3、3C4、3C6、4D4、1G9、5C8B9、3G6、4C8B9、E99、J415、J533和J591單克隆抗體。分泌3F5.4G6、3D7.1.1、4E10—1.14、犯ll、4D8、3E6、3C9、2C7、1G3、3C4、3C6、4D4、1G9、5C8B9、3G6或4C8B9的雜交瘤已經(jīng)公開保藏，并且在美國(guó)專利No.6,159,508中記載。分泌E99、J415、J533或J591的雜交瘤已經(jīng)公開保藏，并且在美國(guó)專利No.6，107,090中記載。而且，人源化抗-PSMA抗體，包括J591的人源化形式，在PCT公開W002/098897中詳細(xì)記載。此外，其他小鼠抗人PSMA抗體已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述，例如mAb107—1A4(Wang，S.等人.(2001)Int.J.Cancer92:871—876)和mAb2C9(Kato，L等人.(2003)Int.J.Urol.10:439-444)。人單克隆抗-PSMA抗體本發(fā)明優(yōu)選的抗體包括人抗-PSMA單克隆抗體。人抗-PSMA單克隆抗體的例子包括如最初由PCT/^布WO03/01/09192和WO03/064606和2005年2月18日^是交的名稱為"HumanMonoclonalAntibodiestoProstateSpecificMembraneAntigen(PSMA)，，的美國(guó)臨時(shí)申i青No.60/654,125(其內(nèi)容引入本文作為參考)中所述分離并結(jié)構(gòu)表征的4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3抗體。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的Vi,氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:l-9中。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的l氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:10-18中?？梢栽诒景l(fā)明中使用的其他人抗-PSMA抗體包括在PCT公開WOO3/034903和美國(guó)申"i青No.2004/0033229中/>開的抗體。假定這些抗體中的每一個(gè)都能夠與PSMA結(jié)合，則Vh和Vl序列可以"混合并匹配，，，從而產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-PSMA結(jié)合分子。PSMA與這些"混合并匹配的，，抗體的結(jié)合可以用本領(lǐng)域公知的結(jié)合試驗(yàn)(例如FACS分析和ELISA測(cè)定)來檢測(cè)。優(yōu)選地，當(dāng)Vh和l鏈混合并匹配時(shí)，來自特定VH/Vt配對(duì)的VH序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的Vh序列。同樣，優(yōu)選地，來自特定VJ^配對(duì)的Vt序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的Vl序列。例如，4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6和2F5的Vh序列特別適合混合并匹配，因?yàn)檫@些抗體使用來源于相同種系序列(V5-51)的Vh序列,因此它們表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)相似性。同樣，4A3、7F12、8C12和2C6的Vt序列特別適合混合并匹配，因?yàn)檫@些抗體使用來源于相同種系序列(VLL6)的Vl序列，因此它們表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)相似性。同樣，8A11和16F9的Vt序列特別適合混合并匹配，因?yàn)檫@些抗體使用來源于相同種系序列(VL04/014)的V^序列，因此它們表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)相似性。同樣，1C3、2A10和2F5的W序列特別適合混合并匹配，因?yàn)檫@些抗體使用來源于相同神系序歹'J(VlL18)的Vl序列，因此它們表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)相似性。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供脫巖藻糖基化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:1-9的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQIDNO:10-18的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體與人PSMA特異性結(jié)合。優(yōu)選的重鏈和輕鏈組合包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的輕《連可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(a)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供包含4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或1C3的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3或其組合的脫巖藻糖基化抗體。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的VHCDR1的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:19-27中。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的VHCDR2的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:28-36中。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的VHCDR3的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:37-45中。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的VKCDR1的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:46—54中。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的VKCDR2的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:55-63中。4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的VKCDR3的氨基酸序列分別示于SEQIDNO:64-72中。CDR區(qū)用Kabat系統(tǒng)(Kabat,E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào)91—3242)勾畫出。假如這些抗體均能與PSMA結(jié)合，并且抗原結(jié)合特異性主要是由C脂、CDR2和CDR3區(qū)提供的，則VHCDRl、CDR2和CDR3序列與VkCDRl、CDR2和CDR3序列可以"混合并匹配"(即來自不同抗體的CDR可以混合并匹配，但是每個(gè)抗體必須含有VHCDRl、CDR2和CDR3和VKCDRl、CDR2和CDR3),產(chǎn)生本發(fā)明的其他的抗-PSMA結(jié)合分子。PSMA與這些"混合并匹配的"抗體的結(jié)合可以用本領(lǐng)域公知的結(jié)合試-驗(yàn)(例如FACS分析、ELISA測(cè)定)#全測(cè)。優(yōu)選地，當(dāng)VCDR序列混合并匹配時(shí)，來自特定Vh序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列。同樣，當(dāng)VKCDR序列混合并匹配時(shí)，來自特定Vk序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列優(yōu)選地被替換為結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，通過將一個(gè)或多個(gè)Vh和/或lCDR區(qū)序列替換為來自本文公開的單克隆抗體4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3的CDR序列的結(jié)構(gòu)上相似的序列，可以產(chǎn)生新的Vh和I序列。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種脫巖藻糖基化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNOCDR1;(b)包含選自SEQIDNOCDR2;(c)包含選自SEQIDNOCDR3;(d)包含選自SEQIDNOCDR1;(e)包含選自SEQIDNOCDR2;和(f)包含選自SEQIDNOCDR3;其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:19的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:28的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:37的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:46的人輕《連可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:55的人輕《連可變區(qū)CDR2;和(f)包含SEQIDNO:64的人輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包4舌(a)包含SEQIDNO:20的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:29的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:38的人重《連可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:47的人輕鏈可變區(qū)CDR1;:19-27的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū):28-36的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū):37-45的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū):46-54的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū):55-63的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū):64-72的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)(e)包含SEQIDNO:56的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:65的人輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包兮舌(a)包含SEQIDNO.21的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO'30的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO39的人重《連可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO48的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO57的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO66的人輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包4舌(a)包含SEQIDNO.22的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO31的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO40的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO49的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO'58的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO67的人輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO23的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO32的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO41的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO50的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO59的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:68的人輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:24的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:33的人重鏈可變區(qū)CM2;(c)包含SEQIDNO:42的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:51的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:60的人輕t連可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:69的人輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:25的人重t連可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO34的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO43的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO52的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO61的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO70的人輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO26的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO'35的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO44的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO'53的人輕《連可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO,62的人輕《連可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO71的人輕鏈可變區(qū)CDR3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO27的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO36的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO45的人重《連可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO54的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO63的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO72的人輕《連可變區(qū)CDR3。具有特定種系序列的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種脫巖藻糖基化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或來源于人VH5-51基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與人PSMA特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供提供一種脫巖藻糖基化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或來源于人VH3-30.3基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體與PSMA特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種脫巖藻糖基化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或來源于人VkL6基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與人PSMA特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種脫巖藻糖基化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或來源于人VK04/014基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與人PSMA特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種脫巖藻糖基化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含產(chǎn)自或來源于人VyL18基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體與人PSMA特異性結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種脫巖藻糖基化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體(a)包含產(chǎn)自或來源于人VH5-51或3-30.3基因(該基因分別編碼SEQIDNO:73和76所示的氨基酸序列)的重鏈可變區(qū)；(b)包含產(chǎn)自或來源于人V,L6、04/014或L18基因(該基因分別編碼SEQIDNO:74、75和77所示的氨基酸序列)的輕《連可變區(qū)；且(c)與人PSMA特異性結(jié)合。一種優(yōu)選的Vh和VK種系組合是V5-51和VKL6。分別具有VH5-51和VKL6的Vh和Vk的抗體的例子是4A3、7F12、8C12和2C6抗體。另一種優(yōu)選的Vh和VK種系組合是VH5-51和VK04/014。分別具有5-51和VK04/014的Vh和Vk的抗體的例子是8A11和16F9抗體。另一種優(yōu)選的Vh和VK種系組合是VH5-51和VKLI8。分別具有VH5-51和VKL18的Vh和Vk的抗體的例子是2A1Q和2F5抗體。另一種優(yōu)選的Vh和VK種系組合是VH3-30.3和VKL18。分別具有VH3-30.3和VKL18的Vh和Vk的抗體的一個(gè)例子是1C3抗體。如此處所用的，如果一種人抗體的可變區(qū)是從使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)中獲得的，則該人抗體包含"產(chǎn)自"或"來源于，，特定種系序列的重鏈或輕鏈可變區(qū)。這樣的系統(tǒng)包括用目標(biāo)抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或者用目標(biāo)抗原篩查展示在噬菌體上的人免疫球蛋白基因文庫。"產(chǎn)自"或"來源于"人種系免疫球蛋白序列的人抗體可以這樣鑒定將該人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較(例如使用Vbase數(shù)據(jù)庫)，選擇在序列上最接近于該人抗體序列(即有最高％同一性)的人種系免疫球蛋白序列。"產(chǎn)自"或"來源于"特定人種系免疫球蛋白序列的人抗體與該種系序列相比可能包含氨基酸差異，例如由于天然發(fā)生的體細(xì)胞突變或有意引入定點(diǎn)突變而導(dǎo)致的。但是，選擇的人抗體在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列一般至少90%相同，并且含有當(dāng)與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠種系序列)相比較時(shí)確認(rèn)該人抗體屬于人類抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體在氨基酸序列上與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列可以至少95%、或者甚至至少96%、97%、98%或99%相同。一般來說，來源于特定人種系序列的人抗體表現(xiàn)與該人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過10個(gè)氨基酸的差異。在某些情況下，該人抗體可能表現(xiàn)與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過5個(gè)、或者甚至不超過4、3、2或1個(gè)氨基酸的差異。同源抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體包含的重鏈和輕鏈可變區(qū)含有與本文所述優(yōu)選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗體保留了本發(fā)明的抗-PSMA抗體的需要的功能特性。例如，本發(fā)明提供一種脫巖藻糖基化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:1-9的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQIDNO:10-18的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；且(c)該抗體與人PSMA特異性結(jié)合。在另外一些實(shí)施方案中，Vh和/或Vt氨基酸序列可以與上述序列85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源。具有與上述序列的Vh和V^區(qū)高度(即80%或更高)同源的Vh和Vl區(qū)的抗體可以如下荻得誘變(例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變)編碼SEQIDNO:1-18的一種或多種核酸分子，然后用此處所述的結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)編碼的被改變抗體的保留的功能(即與PSMA結(jié)合)。編碼SEQIDNO:6-9和15-18的核酸分子可見SEQIDNO:78-85。編碼SEQIDNO:1-5和10-14的核酸分子可見PCT/>布WO03/064606圖17A和17B。如此處所用的，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同源性等同于兩個(gè)序列之間的百分同一性?？紤]為了兩個(gè)序列之間進(jìn)行最佳比對(duì)所需要引入的空位的數(shù)目和每個(gè)空位的長(zhǎng)度后，兩個(gè)序列之間的百分同一性是這兩個(gè)序列共有的相同位點(diǎn)的數(shù)目的函數(shù)(即％同源性=相同位點(diǎn)的數(shù)目/位點(diǎn)的總數(shù)x100)。兩個(gè)序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以如下面的非限制性實(shí)施例中所述用數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。兩個(gè)核苷酸序列之間的百分同一性可以用GCG軟件包(可從http:〃www.gcg.com獲得)中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重來確定。兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的百分同一性也可以用已經(jīng)整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))的算法來確定，其使用PAM120權(quán)重殘基表，12的空位長(zhǎng)度罰分，4的空位罰分。另外，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性也可以用已經(jīng)整合入GCG軟件包(可從http://www.gcg.com獲得)的GAP程序中的Needleman和Wimsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))的算法來確定，其使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重，和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度片又重。兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性可以用已經(jīng)整合入ALIGN程序(2.O版本)中的E.Meyers和W.Miller(Co，t.Appl.Biosci.，4:11-17("88))的算法來確定，其使用PAM120權(quán)重殘基表，12的空位長(zhǎng)度罰分，4的空位罰分。另外，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性也可以用已經(jīng)整合入GCG軟件包(可/人http:〃www.gcg.com獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444—453(1970))的算法來確定，其使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位4又重，和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重。另外或者可替代地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步用作"查詢序列"來對(duì)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，例如用來鑒定相關(guān)序列。這種檢索可以用Altschul等(1990)J.Mol,Biol.215:403—10的XBLAST程序(2.0版本)進(jìn)行。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，得分=50,字長(zhǎng)=3,以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對(duì)，可以采用如Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402所述的空位BLAST。當(dāng)采用BLAST和空位BLAST程序時(shí)，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。具有保守修飾的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體包括含CDRl、CDR2和CDR3序列的重《連可變區(qū)和含CDRl、CDR2和CDR3序列的輕4連可變區(qū)，其中這些CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)包含基于本文所述優(yōu)選抗體(例如4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或1C3)的特定氨基酸序列或其保守修飾，并且其中該抗體保留本發(fā)明抗-PSMA抗體的需要的功能特性。因此，本發(fā)明提供一種脫巖藻糖基化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重4連可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含SEQIDNO:37-45的氨基酸序列及其保守修飾；(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含SEQIDNO:64-72的氨基酸序列及其保守修飾；且(c)該抗體與人PSMA特異性結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含SEQIDNO:28-36的氨基酸序列和其保守修飾；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含SEQIDNO:55-63的氨基酸序列和其保守修飾。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR1序列包含SEQIDNO:19-27的氨基酸序列和其保守修飾；且輕鏈可變區(qū)CDRl序列包含SEQIDNO:46-54的氨基酸序列和其保守修飾。本文所用的術(shù)語"保守序列修飾"是指不會(huì)顯著影響或改變含該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特性的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失。可以通過本領(lǐng)域7>知的標(biāo)準(zhǔn)纟支術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，向本發(fā)明抗體中引入修飾。保守氨基酸置換是將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸)、(3-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，本發(fā)明抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被置換為來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以用此處所述的功能試驗(yàn);險(xiǎn)測(cè)改變的抗體保留的功能(即以上(i)至(iv)所述的功能)?？商娲兀诹硪粚?shí)施方案中，可以(例如通過飽和誘變)沿抗-PSMA抗體編碼序列的全部或部分隨才幾引入突變，并且可以針對(duì)結(jié)合活性篩查產(chǎn)生的》務(wù)飾的抗-PSMA抗體。與本發(fā)明的抗-psma抗體結(jié)合相同表位的抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與本文提供的本發(fā)明的各種抗-psma抗體結(jié)合相同表位的脫巖藻糖基化抗體，例如與本文描述的4a3、7f12、8c12、8a11、16f9、2a10、2c6、2f5或1c3抗體結(jié)合相同表位的其他人抗體。這些其他抗體可以根據(jù)它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)psma結(jié)合測(cè)定中與本發(fā)明的其他抗體(例如4a3、7f12、8c12、8a11、16f9、2a10、2c6、2f5或1c3)交叉竟?fàn)?例如以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的方式竟?fàn)幮砸种破浣Y(jié)合)的能力來鑒定。被試抗體抑制例如4a3、7f12、8c12、8a11、16f9、2a10、2c6、2f5或1c3與人psma結(jié)合的能力證明，該被試抗體可以與該抗體竟?fàn)幗Y(jié)合人psma;根據(jù)非限制性的理論，該抗體可以與人psma上與它所竟?fàn)幍目贵w相同或相關(guān)(例如結(jié)構(gòu)上相似或空間上接近)的表位結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與4a3、7f12、8c12、8a11、16f9、2a10、2c6、2f5或1c3結(jié)合人psma上相同表位的脫巖藻糖基化抗體是人單克隆抗體。這些人單克隆抗體可以如pct/^布wo01/09192和wo03/064606所述制備和分離。工程化抗體和修飾的抗體本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體還可以如下制備用具有本文所公開的一種或多種v,i和/或^序列的抗體作為起始材料，改造一種修飾的抗體，該修飾的抗體可能具有與起始抗體相比改變的特性?？梢酝ㄟ^^修飾一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)(即Vh和/或vj例如一個(gè)或多個(gè)cdr區(qū)內(nèi)和/或一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基來改造抗體。另外或者可替代地，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來改造抗體，例如改變?cè)摽贵w的效應(yīng)功能。可以進(jìn)行的一種類型的可變區(qū)改造是cdr移植。抗體主要是通過位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個(gè)原因，cdr內(nèi)的氨基酸序列比cdr外的序列在各個(gè)抗體之間更加多樣化。由于cdr序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，因此通過構(gòu)建如下的表達(dá)載體能夠表達(dá)模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體該表達(dá)載體包含來自特定天然存在抗體的CDR序列，該CDR序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構(gòu)架序列上(參見，例如，Riechmann，L.等(1998)Nature332:323-327;Jones，P.等(1986)Nature321:522-525;Queen，C.等(1989)Proc,Natl,Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033;Winter的美國(guó)專利5,225,539,和Queen等人的美國(guó)專利5,530,101;5,585,089;5,693，762和6,180，370)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種脫巖藻糖基化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包括分別包含選自SEQIDNOs:19-27,SEQIDNOs:28-36，和SEQIDNOs:37-45的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3序列，該輕4連可變區(qū)分別包含選自SEQIDNOs:46-54，SEQIDNOs:55-63，和SEQIDNOs:64-72的氨基酸序列。因此，該抗體含有單克隆抗體4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或1C3的V和VLCDR序列，但是可能含有與這些抗體不同的構(gòu)架序列。這些構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或發(fā)表的參考文獻(xiàn)中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在以下資源中發(fā)現(xiàn)"VBase，，人種系序列數(shù)據(jù)庫(可從因特網(wǎng)上www.rare-cpe.cam.ac.uk/vbase獲得)，以及Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào)91-3242;Tomlinson，I.M.等(1992)"TheRepertoireofHumanGermlineVhSequencesRevealsaboutFiftyGroupsofVHSegmentswithDifferentHypervariableLoops"J.Mol.Biol.227:776-798;和Cox，J.P.L.等(1994)"ADirectoryofHumanGerm-lineVHSegmentsRevealsaStrongBiasintheirUsage,，Eur.J.Immunol.24:827-836;其內(nèi)容均在此引用作為參考。用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選構(gòu)架序列在結(jié)構(gòu)上類似于所選擇的本發(fā)明抗體使用的構(gòu)架序列，例如，類似于本發(fā)明的優(yōu)選單克隆抗體使用的V5-51或3-30.3序列(分別為SEQIDNO:73或76)和/或VKL6、04/014或L18構(gòu)架序列(分別為SEQIDNO:74、75或77)。VCDR1、2和3序列和VkCDRl、2和3序列可以被移植到與該構(gòu)架序列的來源種系免疫球蛋白基因具有相同序列的構(gòu)架區(qū)上，或者CDR序列可以被移植到與該種系序列相比含有一個(gè)或多個(gè)突變的構(gòu)架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些情況中，將構(gòu)架區(qū)內(nèi)的殘基進(jìn)行突變對(duì)于保持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力是有利的(參見，例如，Queen等的美國(guó)專利5，530，101;5,585,089;5,693，762和6,180，370)。另一種類型的可變區(qū)修飾是突變V,,和/或VKCDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，從而改善目標(biāo)抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和力)?？梢赃M(jìn)行定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的i秀變，以引入突變，對(duì)抗體結(jié)合的影響，或者其他目標(biāo)功能特性，可以用此處所述和實(shí)施例中提供的體外或體內(nèi)試驗(yàn)來評(píng)價(jià)。優(yōu)選地引入(如上文所述的)保守修飾。這些突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但是優(yōu)選置換。而且，一般改變CDR區(qū)內(nèi)不超過1、2、3、4或5個(gè)殘基。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供脫巖藻糖基化抗PSMA單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的重鏈可變區(qū)含有(a)V"CDRl區(qū)，其包含選自SEQIDNO:19-27的氨基酸序列，或與選自SEQIDNO:19-27的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2區(qū)，其包含選自SEQIDNO:28-36的氨基酸序列，或與選自SEQIDNO:28-36的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VHCDR3區(qū)，其包含選自SEQIDNO:37-45的氨基酸序列，或與選自SEQIDNO:37-45的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VKCDRl區(qū)，其包含選自SEQIDNO:46-54的氨基酸序列，或與選自SEQIDNO:46-54的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VKCDR2區(qū)，其包含選自SEQIDNO:55-63的氨基酸序列，或與選自SEQIDNO:55-63的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VKCDR3區(qū)，其包含選自SEQIDNO:64-72的氨基酸序列，或與選自SEQIDNO:64-72的氨基酸序列相比具有1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。本發(fā)明的工程化抗體包括(例如)為了改善抗體特性而對(duì)其Vh和/或VK內(nèi)的構(gòu)架殘基進(jìn)行了修飾的抗體。進(jìn)行這樣的構(gòu)架修飾一般是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架殘基"回復(fù)突變"為相應(yīng)的種系序列。更特別地，經(jīng)歷體細(xì)胞突變的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的構(gòu)架殘基。通過比4交抗體構(gòu)架序列與衍生該抗體的種系序列，可以鑒定這些殘基。例如，對(duì)于8C12和8A11，Vh的氛基酸殘基H3(FRl內(nèi))是蘇氨酸，而在相應(yīng)的V5-51種系序列中該殘基為賴氨酸。為了使構(gòu)架區(qū)序列恢復(fù)為其種系構(gòu)型，可以通過(例如)定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，將該體細(xì)胞突變"回復(fù)突變，，為種系序列(例如，8C12或8A11的Vn的FR1的殘基13可以從蘇氨酸"回復(fù)突變，，為賴氨酸)。這些"回復(fù)突變"的抗體也包括在本發(fā)明中。另一種類型的構(gòu)架修飾涉及對(duì)構(gòu)架區(qū)內(nèi)、乃至一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基進(jìn)行突變，以除去T細(xì)胞表位，從而降低該抗體的潛在的免疫原性。該方法也被稱為"脫免疫，，，在Carr等人的公布號(hào)為20030153043的美國(guó)專利中詳細(xì)記載。除了在構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行的修飾以外，或者作為它的替代方案，也可以將本發(fā)明的抗體改造為在Fc區(qū)內(nèi)包括修飾，一般是為了改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補(bǔ)體固定、Fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，也可以將本發(fā)明的抗體化學(xué)修飾(例如一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分可以連接到該抗體上)，或者修飾以改變其糖基化，由此改變?cè)摽贵w的一種或多種功能特性。這些實(shí)施方案均在下文詳細(xì)描述。Fc區(qū)中殘基的編號(hào)是Kabat的EU指數(shù)的編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾CH1的鉸鏈區(qū)，使該鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的t:目改變，例如增加或減少。該方法在Bodmer等人的美國(guó)專利No.5，677，425中詳細(xì)記載。改變CH1鉸鏈區(qū)中半胱氨酸的數(shù)目是為了(例如)促進(jìn)輕鏈和重鏈的裝配，或提高或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一實(shí)施方案中，對(duì)抗體的Fc鉸鏈區(qū)進(jìn)行突變，以降低該抗體的生物半衰期。更具體地，向Fc-4交^i片萃殳的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，使得該抗體與葡萄球菌蛋白A(SpA)的結(jié)合比天然Fc-鉸鏈結(jié)構(gòu)域與SpA的結(jié)合減弱。該方法在Ward等人的美國(guó)專利No.6,165,745中詳細(xì)記載。在另一實(shí)施方案中，修飾抗體以提高其生物半衰期。可以使用各種方法。例如，可以引入一個(gè)或多個(gè)如下突變T252L、T254S、T256F，如Ward的美國(guó)專利No.6，277，375所述。或者，為了提高生物半衰期，可以在CHI或CL區(qū)內(nèi)改變?cè)摽贵w，使之含有來自IgGFc區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)環(huán)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位，如Presta等人的美國(guó)專利No.5，869，046和6，121，022所述。在其他一些實(shí)施方案中，通過將至少一個(gè)氨基酸殘基置換為不同的氨基酸殘基來改變Fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320、322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體對(duì)效應(yīng)配體的親和力改變，但是保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。其親和力被改變的效應(yīng)配體可以是，例如，F(xiàn)c受體或補(bǔ)體的CI成分。該方法在Winter等人的美國(guó)專利No.5，624，821和5,648，260中更詳細(xì)地描述。在另外一個(gè)實(shí)例中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體的Clq結(jié)合改變和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)降低或消除。該方法在Idusogie等人的美國(guó)專利No.6,194，551中更詳細(xì)地描述。在另外一個(gè)實(shí)例中，改變氨基酸位點(diǎn)231和239中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，從而改變?cè)摽贵w固定補(bǔ)體的能力。該方法在Bodmer等人的PCT/^布W094/29351中進(jìn)一步描述。在另外一個(gè)實(shí)例中，為了提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對(duì)Fq受體的親和力，通過在下列位點(diǎn)處修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸來修飾Fc區(qū)238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。該方法在Presta的PCT/>布W000/42072中進(jìn)一步描述。而且，人IgGl上對(duì)于FcyRI、FcyRII、FcyRIII和FcRn的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)作圖，并且已經(jīng)描述了具有改善的結(jié)合的變體(參見，Shields,R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。位點(diǎn)256、290、298、333、334和339處的特定突變顯示改善了與FqRIII的結(jié)合。另外，下列組合突變體顯示改善了與FcyRIII的結(jié)合T256A/S298A,S298A/E333A,S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。本發(fā)明涉及的抗體的另一種修飾是PEG化。例如，為了提高抗體的生物(例如血清)半衰期，可以將該抗體PEG化。為了PEG化一種抗體，一般在一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)可與抗體或抗體片段連接的條件下，將該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選地，通過與反應(yīng)性PEG分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的酰化反應(yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行PEG化。本文所用的術(shù)語"聚乙二醇，，包括用來衍生化其他蛋白質(zhì)的任何PEG形式，如單(C1-CIO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，將要PEG化的抗體是非糖基化的抗體。將蛋白質(zhì)PEG化的方法在本領(lǐng)域中公知，并且可以應(yīng)用于本發(fā)明的抗體。參見，例如，Nishimura等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP0401384。改造抗體的方法如上所述，能夠利用具有此處公開的Vh和Vk序列的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體，通過修飾Vh和/或Vk序列或與之連接的恒定區(qū)，產(chǎn)生新的抗-PSMA抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，利用本發(fā)明的抗-PSMA抗體例如4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或1C3的結(jié)構(gòu)特征，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上相關(guān)的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體，該抗體保留本發(fā)明抗體的至少一種功能特性，如與人PSMA結(jié)合。如上所述，例如，4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或1C3的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)或其突變可以與已知的構(gòu)架區(qū)和/或其他CDR重組組合，從而產(chǎn)生另外的、重組改造的本發(fā)明的抗-PSMA抗體。其他類型的修飾包括以上部分所述的修飾。用于改造方法的起始材料是此處提供的一種或多種Vn和/或Vk序列，或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)。為了產(chǎn)生工程化抗體，不一定實(shí)際制備(即表達(dá)為蛋白質(zhì))具有此處提供的一種或多種Vn和/或Vk序列，或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的抗體。而是利用該序列中所含的信息作為起始材料，產(chǎn)生由原始序列衍生的"第二代，，序列，然后制備該"第二代"序列，并將其表達(dá)為蛋白質(zhì)。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗-PSMA抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:19-27的CDR1序列、選自SEQIDNO:28-36的CDR2序列、和/或選自SEQIDNO:37-45的CDR3序列；和/或(H)輕《連可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:46-54的CDRl序列、選自SEQIDNO:55-63的CDR2序列、和/或選自SEQIDNO'.64-72的CDR3序列；(b)改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，從而產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；和(C)將所述改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備和表達(dá)所述改變的抗體序列。藻糖基化的形式，以獲得脫巖藻糖基化的改變的抗-PSMA抗體。改變的抗體的功能特性可以用本領(lǐng)域中使用的和/或此處所述的，如實(shí)施例中所述的標(biāo)準(zhǔn)試-驗(yàn)(例如流式細(xì)胞術(shù)、結(jié)合測(cè)定、ADCC測(cè)定)來評(píng)價(jià)。在改造本發(fā)明抗體的方法的某些實(shí)施方案中，可以沿全部或部分抗-PSMA抗體編碼序列隨機(jī)或選擇性引入突變，并可以針對(duì)結(jié)合活性和/或如此處所述的其他功能特性，篩選獲得的修飾的抗-PSMA抗體。突變方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述。例如，Short的PCT/>布冊(cè)02/092780記載了利用飽和誘變、合成連接裝配或它們的組合產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。另外，Lazar等人的PCT公布W003/074679也記載了利用計(jì)算篩選方法優(yōu)化抗體的生理化學(xué)性質(zhì)的方法。編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子。本文使用的術(shù)語"核酸分子，，包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，^旦優(yōu)選雙《連DNA。這些核酸可以存在于完整細(xì)J包、細(xì)胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存在。當(dāng)通過包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本領(lǐng)域公知的其他方法與其他細(xì)胞成分或其他摻雜物(例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì))分離純化時(shí)，核酸是"分離的"或"基本上純的"。參見，F(xiàn).Ausubel等ed.(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork。本發(fā)明的核酸可以是(例如)DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含內(nèi)含子序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸是cDNA分子。本發(fā)明的核酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得。對(duì)于雜交瘤(例如，由下文進(jìn)一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤)表達(dá)的抗體，編碼由雜交瘤制備的抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)獲得。對(duì)于(例如使用嗟菌體展示技術(shù))從免疫球蛋白基因文庫中獲得的抗體，可以從文庫中回收編；馬該纟元體的核酸。本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是編碼4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5或1C3單克隆抗體的VH和VL序列的核酸分子。編碼4A3、7F12、8C12、8A11、16F9的VH和VL氨基酸序列的DNA序列在PCT/>布No.W003/064606中公開(見圖17A和17B)，其內(nèi)容引入本文作為參考。編碼1C3的VH序列的DNA序列顯示在SEQIDNO:78中。編碼1C3的VL序列的DNA序列顯示在SEQIDNO:82中。編碼2A10的VH序列的DM序列顯示在SEQIDNO:79中。編碼2A10的VL序列的DNA序列顯示在SEQIDNO:83中。編碼2C6的VH序列的DNA序列顯示在SEQIDNO:80中。編碼2C6的VL序列的DNA序列顯示在SEQIDNO:84中。編碼2F5的VH序列的DNA序列顯示在SEQIDNO:81中。編碼2F5的VL序列的DNA序列顯示在SEQIDNO:85中。一旦獲得編碼VH和VL片段的DNA片段，即可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這些DM片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼VL或VH的DNA片段與編碼另外一種蛋白質(zhì)如抗體恒定區(qū)或柔性連接體的另一個(gè)DNA片段有效連接。在本文中使用的術(shù)語"有效連接"意思是兩個(gè)DNA片段連接在一起，使得這兩個(gè)DNA片段編碼的氨基酸序列保持在閱讀才匡內(nèi)。通過將編碼VH的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VH區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例如，Kabat，E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologiclInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào)91-3242),包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但是最優(yōu)選IgGl或IgG4恒定區(qū)。對(duì)于Fab片段重鏈基因來說，編碼VH的DNA可以與只編碼重《連CH1恒定區(qū)的另外一種DNA分子有效連接。通過將編碼VL的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VL區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中^^知(參見，例如，Kabat,E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologiclInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號(hào)91-3242),包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是K或X恒定區(qū)，但是最優(yōu)選K恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼VH和VL的DNA片段與編碼柔性連接體例如編碼氨基酸序列(Gly4_Ser)3(SEQIDNO:89)的另外一個(gè)片段有效連接，使得VH和VL序列可以表達(dá)為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，其VL和VH區(qū)通過該柔性連接體連接(參見，例如Bird等(1988)Science242:423-426;Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;McCafferty等(1990)Nature348:552-554)。本發(fā)明的核酸組合物通常在來自于cDNA、基因組或其混合物的天然序列(除了修飾的限制性位點(diǎn)等以外)中可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行突變，以提供基因序列。對(duì)于編碼序列來說，這些突變可能影響氨基酸序列。具體地說，涉及基本同源于或來源于天然V、D、J、恒定、轉(zhuǎn)換和本文所述的其他這些序列的DNA序列(其中"來源于"是指一種序列與另一種序列相同或由其改進(jìn)而來)。本發(fā)明的單克隆抗體的產(chǎn)生通過多種技術(shù)能制備本發(fā)明的單克隆抗體(mAb),包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature256:495所述的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。雖然優(yōu)選體細(xì)胞雜交技術(shù)，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化。用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動(dòng)物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。用小鼠產(chǎn)生雜交瘤是一種完善建立的程序。免疫程序和分離用于融合的被免疫脾細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域/>知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合程序也是公知的。在各種實(shí)施方案中，抗體可以是，例如，人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。本發(fā)明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述制備的鼠單克隆抗體的序列制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標(biāo)鼠雜交人類)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)上(參見，例如，Cabilly等人的美國(guó)專利No.4,816,567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠CDR區(qū)插入人構(gòu)架內(nèi)(參見，例如，Winter的美國(guó)專利No.5，225,539，和Queen等人的美國(guó)專利No.5，530，101;5,585,089;5，693，762和6,180,370)。在本領(lǐng)域中公知多種小鼠抗-PSMA抗體能夠用來產(chǎn)生嵌合或人源化抗-PSMA抗體，例如3F5.4G6、3D7.1.1、4E10-1.14、3E11、4D8、3E6、3C9、2C7、1G3、3C4、3C6、4D4、1G9、5C8B9、3G6、4C8B9、E99、J415、J533和J591。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體。這種抗PSMA人單克隆抗體能用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括本文中分別稱作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在此通稱為"人Ig小^,，氛。HuMAb小鼠⑧(Medarex,Inc.)包含編碼未重排的人重鏈(|^和丫)和k輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使內(nèi)源p和K鏈基因座失活的定向突變(參見，例如，Lonberg等(1994)Nature368(6474):856-859)。因此，該小鼠表現(xiàn)為小鼠IgM或K表達(dá)降低，并且響應(yīng)于免疫，導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，從而產(chǎn)生高親和力人IgGK單克隆抗體(Lonberg,N.等(1994)，同上；綜述Lonberg，N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101;Lonberg,N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13:65-93,和Harding,F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764:536—546)。HuMab小鼠的制備和使用，以及該小鼠攜帶的基因組修飾，在下面的文獻(xiàn)中詳細(xì)描述Taylor,L.等(1992)NucleicAcidsResearch20:6287—6295;Chen,J.等(1993)InternationalIm,ology5:647—656;Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.SciUSA90:3720-3724;Choi等(1993)NatureGenetics4:117-123;Chen,J.等(1993)EMB0J.12:821-830;Tuaillon等(1994)J,Immunol.152:2912—2920;Taylor,L.等(1994)InternationalImmunology6:579-591;禾口Fishwild，D,等(1996)NatureBiotechnology14:845—851，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容全文在此引入作為參考。進(jìn)一步參見，Lonberg和Kay的美國(guó)專利No.5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,789,650;5,877,397;5，661，016;5，814，318;5，874，299;和5，770，429;和Surani等人的美國(guó)專利No.5，545，807;Lonberg和Kay的PCT公布號(hào)W092/03918，WO93/12227，WO94/25585，WO97/13852，WO98/24884和WO99/45962;和Korman等人的PCIVA布號(hào)W001/14424。在另一實(shí)施方案中，可以用轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。這種小鼠在此稱為"KM小鼠，，，在Ishida等人的PCT/〉布W002/43478中詳細(xì)描述。再者，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PSMA抗體。例如，可以使用一種稱作Xenomouse(Abgenix,Inc.)的替代轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，這種小鼠在例如Kucherlapati等人的美國(guó)專利No.5,939,598;6，075，181;6，114,598;6,150，584和6，162，963中描述。而且，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PSMA抗體。例如，可以^使用攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，其被稱作"TC小鼠，，；這種小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中描述。另外，本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛(Kuroiwa等(2002)NatureBiotechnology20:889-894),其能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-PSMA抗體。也可以使用篩查人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法制備本發(fā)明的人單克隆抗體。這種用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。參見，例如，Ladner等人的美國(guó)專利No.5，223，409;5,403，484;和5，571，698;Dower等人的美國(guó)專利No.5，427，908和5,580,717;McCafferty等人的美國(guó)專利No.5,969,108和6，172，197;和Griffiths等人的美國(guó)專利No.5,885,793;6,521,404;6，544，731;6,555,313;6,582,915和6，593，081。也可以用SCID小鼠制備本發(fā)明的人單克隆抗體，該SCID小鼠中重構(gòu)了人免疫細(xì)胞，因此在免疫時(shí)能夠產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。這種小鼠在例如Wilson等人的美國(guó)專利No.5，476，996和5，698，767中描述。人Ig小鼠的免疫當(dāng)使用人Ig小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體時(shí)，可以根據(jù)Lonberg,N.等(1994)Nature368(6474):856—859;Fishwild,D,等(1996)NatureBiotechnology14:845-851;和PCT/>布W098/24884和W001/14424—般性所述，用表達(dá)PSMA的細(xì)胞系(例如LnCaP細(xì)胞，ATCCCRL-1740)、用純化的或富集的PSMA抗原制品(例如LnCaP細(xì)胞膜)和/或用重組PSMA或重組PSMA融合蛋白免疫該小鼠。優(yōu)選地，第一次輸注時(shí)小鼠為6-16周齡。例如，可以使用LnCaP細(xì)胞的膜制品腹膜內(nèi)免疫人Ig小鼠。產(chǎn)生抗PSMA完全人單克隆抗體的詳細(xì)程序在PCT公布WO01/09192和WO03/064606中描述。應(yīng)用各種抗原積累的經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)最初使用弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)(IP)免疫，接著隔周用弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內(nèi)免疫(最多共六次)時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生應(yīng)答。但是，發(fā)現(xiàn)除弗氏佐劑之外的佐劑也是有效的。另外，發(fā)現(xiàn)在沒有佐劑時(shí)，全細(xì)胞具有高度免疫原性。在免疫方案進(jìn)程中可以用眼眶后取血獲得的血漿樣品監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答。通過ELISA(如下所述)篩選血漿，用具有足夠抗-PSMA人免疫球蛋白效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。用抗原對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)加強(qiáng)免疫，3天后處死并且取出脾臟。預(yù)期每次免疫可能需要進(jìn)行2-3次融合。每一種抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCo12系都使用。另外，HCo7和HCo12轉(zhuǎn)基因都可以雜交，產(chǎn)生具有兩種不同人重鏈轉(zhuǎn)基因(HCo7/HCo12)的一種小鼠。產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生為了制備產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中分離脾細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞，并且與合適的無限增殖化細(xì)胞系(例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系)融合。針對(duì)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選得到的雜交瘤。例如，使用50%PEG,將來自被免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與六分之一數(shù)量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL1580)融合。將細(xì)胞以大約2xl0'的密度接種于平底微量滴定板中，接著在含有20。/。胎克隆血清、18%"653"條件基質(zhì)、5%0rigen(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、5mMHEPES、0.055mM2-巰基乙醇、50單位/毫升青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和lxHAT(Sigma;融合后24小時(shí)加入HAT)的選擇性培養(yǎng)基中溫育兩周。大約兩周之后，在用HT替換了HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過ELISA針對(duì)人單克隆IgM和IgG抗體篩選各孔。一旦發(fā)生廣泛的雜交瘤生長(zhǎng)，則通常在10-14天之后觀察培養(yǎng)基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，如果對(duì)于人IgG仍然是陽性，則可以通過有限稀釋將單克隆抗體至少亞克隆兩次。然后體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。為了純化人單克隆抗體，選擇的雜交瘤可以在用于單克隆抗體純化的兩升力走轉(zhuǎn)搖弁瓦中生長(zhǎng)。過濾上清液，濃縮，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway，N.J.)進(jìn)^亍親和層析。洗脫下來的IgG通過凝膠電泳和高效液相色譜法檢查以確保純度。將緩沖溶液換成PBS,用1.43的消光系數(shù)根據(jù)OD280確定濃度?？蓪慰寺】贵w分成等份并且在-8(TC下保存。產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的產(chǎn)生利用(例如)眾所周知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如，Morrison,S.(1985)science229:1202)，也能在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，使用表達(dá)目標(biāo)抗體的雜交瘤進(jìn)行PCR擴(kuò)增或cDNA克隆)，獲得編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA,并將該DNA插入到表達(dá)載體中，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列有效連接。在上下文中，術(shù)語"有效連接"意思是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)該抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相匹配的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列。抗體輕《連基因和抗體重《連基因可被插入到分開的載體中，或者，更通常地，將兩個(gè)基因插入到同一表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法將抗體基因插入到表達(dá)載體中(例如，抗體基因片段上一與載體上的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)連接，或者如果不存在限制性位點(diǎn)的活，則平端連接)。通過將本文描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得Vh區(qū)段與栽體中的Ch區(qū)段有效連接，而Vk區(qū)段與栽體中的"區(qū)段有效連接，可以產(chǎn)生任意抗體同種型的全長(zhǎng)抗體基因。另外，或者可替代的，重組表達(dá)載體可以編碼有利于宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信號(hào)肽。可將抗體鏈基因克隆到載體中，使得信號(hào)肽與該抗體鏈基因的氨基末端符合閱讀框地連接。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即，來自非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的信號(hào)肽)。除了抗體鏈基因，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還帶有控制該抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他表達(dá)控制元件(例如，多腺香酸化信號(hào))。這樣的調(diào)節(jié)序歹'J例如在Goeddel(GeneExpressionTechnology.MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990))中描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、期望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)的病毒元件，例如來源于巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子?？商娲乜梢允褂梅遣《菊{(diào)節(jié)序列，例如泛蛋白啟動(dòng)子或(3-珠蛋白啟動(dòng)子。另外，調(diào)節(jié)元件也可由來自諸如SRoc啟動(dòng)子系統(tǒng)等不同來源的序列組成，SRa啟動(dòng)子系統(tǒng)含有來自SV40早期啟動(dòng)子的序列和人1型T細(xì)胞白血病病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(Takebe，Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列以外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶另外的序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因有利于篩選載體已經(jīng)導(dǎo)入其中的宿主細(xì)胞(參見，例如，Axel等人的美國(guó)專利No.4，399，n6,4,634，665和5，179,017)。例如，選擇性標(biāo)記基因一般給已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞帶來抗藥性，例如G41S、潮霉素或氨曱喋呤抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主細(xì)胞中用于氨曱喋呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選擇)。為了表達(dá)輕鏈和重鏈，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"的各種形式包括常用于將外源DNA導(dǎo)入原核或真核宿主細(xì)胞中的各種技術(shù)，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。雖然在理論上可以在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選在真核細(xì)胞中表達(dá)，最優(yōu)選在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)該抗體，因?yàn)檎婧思?xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)月包，比原核細(xì)月包更可能裝配和分泌正確折疊并且具有免疫活性的抗體。據(jù)報(bào)道，抗體基因的原核表達(dá)無法高產(chǎn)率地產(chǎn)生活性抗體(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)ImmunologyToday6:12-13)。用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選宿主細(xì)胞包括改變所表達(dá)的抗體的巖藻糖基化的細(xì)胞。例如，該宿主細(xì)胞可以是缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶因此該宿主細(xì)胞產(chǎn)生在其碳水化合物中缺乏巖藻糖的蛋白質(zhì)的細(xì)胞，或者是表達(dá)糖蛋白修飾的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶因此在宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體具有增多的等分(bisecting)GlcNac結(jié)構(gòu)(可阻止糖基化)的宿主細(xì)胞。用于表達(dá)重組抗體的其他哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉鼠卵巢(CHO細(xì)月包)(包括Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中描述的dhfr-CH0細(xì)胞，和DHFR選擇性標(biāo)記一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621所述)、NS0骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。特別地，用于NS0骨髓瘤細(xì)胞的另一種優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)是W087/04462、W089/01036和EP338,841公開的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)足以使抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)間，或更優(yōu)選地，培養(yǎng)足以使抗體分泌到宿主細(xì)胞所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的時(shí)間，而產(chǎn)生抗體。可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收抗體。免疫偶聯(lián)物另一方面，本發(fā)明涉及與諸如細(xì)胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素等治療性部分偶聯(lián)的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體或其片段。這些偶聯(lián)物在此被稱為"免疫偶聯(lián)物，，。包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒素的免疫偶聯(lián)物被稱作"免疫毒素，，。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑包括對(duì)細(xì)胞有害(例如殺傷細(xì)胞)的任何試劑。實(shí)例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似物或同系物。治療劑還包括，例如，抗代謝物(例如，氨曱喋呤、6-巰基噤呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞香、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine)),烷化劑(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺合鉑(II)(DDP)順鉑)，氨茴霉素類(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素D(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC)),抗有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)。能與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的治療性細(xì)胞毒素的其他優(yōu)選例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它們的書f生物。刺孢霉素抗體偶聯(lián)物的一個(gè)例子是可作為商品購(gòu)得的(Mylotarg;Wyeth-Ayerst)?？梢岳帽绢I(lǐng)域中使用的連接體技術(shù)將細(xì)胞毒素與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)。已經(jīng)用于將細(xì)胞毒素與抗體偶聯(lián)的連接體類型的實(shí)例包括但不限于腙、硫醚、S旨、二硫化物和含肽的連接體。可以選擇(例如)在溶酶體區(qū)室內(nèi)易被低pH切割或易被蛋白酶切割的連接體，該蛋白酶例如是在腫瘤組織中優(yōu)先表達(dá)的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)。關(guān)于細(xì)胞毒素的類型、用于偶聯(lián)治療劑與抗體的連接體和方法的進(jìn)一步討論，參見Saito，G.等(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55:199-215;TraU，P.A.等(2003)Cancer.I醒廳l.Immunother.52:328-337;Payne,G.(2003)CancerCell3:207-212;Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer2:750-763;Pastan，I.禾口Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091;Senter，P.D.和Springer,C.J.(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。本發(fā)明的抗體也可以與》文射性同位素偶聯(lián)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性;故射性藥物，也稱作放射性免疫偶聯(lián)物。能夠與診斷或治療性使用的抗體偶聯(lián)的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、銦m、釔"和镥177。制備放射性免疫偶聯(lián)物的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。放射性免疫偶聯(lián)物的例子可以作為商品獲得，包括Zevalin(IDECPharmaceuticals)牙口Bexxar(CorixaPharmaceuticals),并且能夠利用類似、的方;去使用本發(fā)明的抗體制備放射性免疫偶聯(lián)物。分不應(yīng)理解為局限于經(jīng)典的化療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)包括，例如，具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或千擾素"7;或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，如淋巴因子、白介素-1("IL-1")、白介素-2("IL-2")、白介素-6("IL-6")、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子("GM-CSF，，)、粒細(xì)胞集落刺激因子("G-CSF，，)或其他生長(zhǎng)因子。將這種治療性部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是眾所周知的，參見，例如,Arnon等，"MonoclonalAntibodiesForI,imotargetingOfDrugsInCancerTherapy"，inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等(ed.),卯.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985);Hellstrom等，"AntibodiesForDrugDelivery",inControlledDrugDelivery(2ndEd.)，Robinson等(ed.),pp.623-53(MarcelDekker,Inc.1987);Thorpe，"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview"，inMonoclonalAntibodies，84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等(ed.)，pp.475—506(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy"，inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等(ed.),pp.303-16(AcademicPress1985)，和Thorpe等，"ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates"，Immunol.Rev.，62:119-58(1982)。藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學(xué)上可接受的載體配制在一起的一種或組合的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。這樣的組合物可以包含一種或組合的(例如兩種或多種不同的)本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物。例如，本發(fā)明的藥物組(或免疫偶聯(lián)物)。本發(fā)明的藥物組合物也可以在聯(lián)合治療中施用，即與其他藥劑聯(lián)用。例如，聯(lián)合治療可包括本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體聯(lián)合至少一種其他的抗腫瘤劑、抗炎劑或免疫抑制劑。這些治療劑包括甾體和非甾體抗炎藥(NSAIDS)，例如阿司匹林和其他水楊酸鹽，如高劑量的布洛芬(Motrin,Advil)、萘普生(Naprosyn)、舒林酸(奇諾力)、雙氯芬酸(Voltaren)、吡羅昔康(Feldene)、酮洛芬(0rudis)、二氟尼柳(Dolobid)、萘丁美酮(Relafen)、依托度酸(Lodine)、奧沙普秦(Daypro)、巧l咮美辛(Indocin)和阿司匹林?？稍诼?lián)合治療中使用的治療劑的其他例子在下面本發(fā)明抗體的應(yīng)用一節(jié)中更詳細(xì)地描述。本文所用的"藥學(xué)上可接受的載體"包括生理學(xué)相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，該載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮給藥(如通過注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，可將活性化合物即抗體或免疫偶聯(lián)物用一種材料包裹，以保護(hù)該化合物免受可使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽。"藥學(xué)上可接受的鹽，，是指保持了親代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理學(xué)作用的鹽(參見如Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些由諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氬溴酸、氫硤酸、亞磷酸等無毒性無機(jī)酸衍生的鹽，以及由諸如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等無毒性有機(jī)酸衍生的鹽。堿加成鹽包括那些由諸如鈉、鉀、鎂、4丐等堿土金屬個(gè);亍生的鹽，以及由諸如N，N，-二節(jié)基乙二胺、N-曱基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒性有機(jī)胺衍生的鹽。本發(fā)明的藥物組合物也可含有藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、辟u酸氫鈉、焦亞碌u酸鈉，亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、oc-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等?？捎糜诒景l(fā)明藥物組合物中的適當(dāng)?shù)乃曰蚍撬暂d體的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?、才直物油如橄欖油、和注射用有才兒酯如油酸乙酯。例如通過應(yīng)用諒-如卵磷脂等包被材料，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑，能夠維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。這些組合物也可含有輔料，如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上述的滅菌程序或通過包含諸如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑確保防止存在微生物。也可能需要在組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉等。另外，通過包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長(zhǎng)的吸收。藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時(shí)制備無菌注射液或分散液的粉末劑。這些用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容以外，包括其在本發(fā)明的藥物組合物中的應(yīng)用。還可以向組合物中^參入補(bǔ)充的活性化合物。治療性組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下穩(wěn)定的?？梢詫⒔M合物配制成溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其他適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散劑。例如，通過使用諸如卵磷脂等包被材料，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長(zhǎng)的吸收。通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據(jù)需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和上面所列其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對(duì)于用于制備無菌注射液的無菌粉末劑，優(yōu)選的制備方法是真空千燥和冷凍千燥(凍千)，由其預(yù)先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末?？梢耘c載體材料組合制備單一劑型的活性成分的量根據(jù)所治療的受試者和特定給藥方式而不同?？梢耘c載體材料組合制備單一劑型的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以100%計(jì)，這個(gè)量的范圍是大約0.01%至大約99%的活性成分，優(yōu)選大約0.1%至大約70%，最優(yōu)選大約1%至大約30%的活性成分，與藥學(xué)上可接受的載體相組合。調(diào)節(jié)劑量方案，以提供最佳的所需反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單一大丸劑，可以隨時(shí)間施用幾次分開的劑量，或者才艮據(jù)治療狀況的緊急情況所需，可以按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易給藥并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續(xù)單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算該預(yù)定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產(chǎn)生所需的治療效果。對(duì)本發(fā)明劑量單位形式的具體說明取決于且直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特特性和要達(dá)到的特定治療效果，和(b)本領(lǐng)域中固有的對(duì)于配制這種用于治療個(gè)體敏感性的活性化合物的限制。對(duì)于抗體的^^藥，劑量范圍為約0.0001至100mg/kg,更通常為0.01至5mg/kg宿主體重。例如，劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重，或在l-10mg/kg范圍內(nèi)。一個(gè)示例性的治療方案需要每周給藥一次、每?jī)芍芤淮?、每三周一次、每四周一次、每月一次、?個(gè)月一次、或每3-6個(gè)月一次。本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體的優(yōu)選劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)給予1mg/kg體重或3mg/kg體重，該抗體使用如下劑量方案之一給藥(i)每4周一次，共6次，然后每3個(gè)月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg體重一次，然后每3周1mg/kg體重。在某些方法中，同時(shí)施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在該情況中，每種抗體的給藥劑量落在所述范圍內(nèi)?？贵w通常多次給藥。單次給藥之間的間隔可以是，例如，每周、每月、每三個(gè)月或每年。間隔也可以是不定期的，例如通過測(cè)定患者中抗靶抗原的抗體的血液水平來確定。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量以達(dá)到約1-1000|ag/ml的血漿抗體濃度，在一些方法中為約25_300ng/ml?？商娲?，抗體也可以作為持續(xù)釋放制劑來給藥，在此情況下需要頻率較低的給藥。劑量和頻率根據(jù)抗體在患者中的半衰期而不同。通常，人抗體表現(xiàn)出最長(zhǎng)的半衰期，之后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和頻率根據(jù)處理是預(yù)防性的還是治療性的而不同。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)以較不頻繁的間隔給予相對(duì)較低的劑量。有些患者在余生中持續(xù)接受處理。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要以較短的間隔給予較高的劑量，直到疾病的進(jìn)展減輕或停止，優(yōu)選直到患者表現(xiàn)為疾病癥狀部分或完全改善。之后，可以以預(yù)防性方案給患者給藥。本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可能變化，以獲得可有效實(shí)現(xiàn)對(duì)特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應(yīng)、而對(duì)患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括應(yīng)用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、纟會(huì)藥途徑、給藥時(shí)間、所應(yīng)用的特定化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時(shí)間、與應(yīng)用的特定組合物聯(lián)合應(yīng)用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和病史、以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的類似因素。本發(fā)明的抗-PSMA抗體的"治療有效劑量"優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重程度降低、疾病無癥狀期的頻率和持續(xù)時(shí)間增加、或者防止因疾病痛苦而引起的損傷或失能。例如，對(duì)于癌性腫瘤的治療，相對(duì)于未接受治療的受試者，"治療有效劑量"優(yōu)選地使細(xì)胞生長(zhǎng)或腫瘤生長(zhǎng)抑制至少約20%，更優(yōu)選至少約40%，更優(yōu)選至少約60%，更優(yōu)選至少約80%?；衔镆种颇[瘤生長(zhǎng)的能力可以在預(yù)測(cè)對(duì)人類腫瘤的療效的動(dòng)物才莫型系統(tǒng)中評(píng)價(jià)。另外，也可以通過本領(lǐng)域4支術(shù)人員公知的i式驗(yàn)檢查該化合物的體外抑制能力，來評(píng)價(jià)組合物的這種性能。治療有效量的治療性化合物能夠減小腫瘤大小，或者以其他方式緩解受試者的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)如下因素確定該量，如受試者的大小、受試者癥狀的嚴(yán)重程度和選擇的特定組合物或給藥途徑。本發(fā)明的組合物可以利用本領(lǐng)域^>知的一種或多種方法通過一種或多種給藥途徑給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，給藥途徑和/或方式根據(jù)期望的結(jié)果而不同。本發(fā)明抗體的優(yōu)選給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外給藥途徑，例如注射或輸注。本文所用的短語"腸胃外給藥，，是指腸和局部給藥以外的給藥模式，通常是注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、嚢內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、嚢下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。可替代地，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體也可以通過非腸胃外途徑給藥，如局部、表皮或粘膜途徑給藥，例如，鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部。如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠嚢遞送系統(tǒng)。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法受專利保護(hù)或者通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。參見，例如，SustainedandcontrolledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.，MarcelDekker,Inc.，NewYork,1978。治療性組合物可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在美國(guó)專利No.5，399，163;5,383，851;5,312，335;5,064,413;4，941，880;4,790,824;或4,596,556中公開的裝置。可用于本發(fā)明的公知的植入物和模塊的例子包括美國(guó)專利No.4，487，603,該專利公開了用于以受控速率分散藥物的可植入式微量輸注泵；美國(guó)專利No.4,486,194，該專利公開了用于通過皮膚給藥的治療裝置；美國(guó)專利No.4,447,233,該專利公開了用于以精確的輸注速率遞送藥物的醫(yī)用輸注泵；美國(guó)專利No.4，447，224,該專利公開了用于連續(xù)遞送藥物的變流可植入式輸注裝置；美國(guó)專利No.4，439，196，該專利公開了具有多腔室的滲透藥物遞送系統(tǒng)和美國(guó)專利No.4,475,196，該專利^>開了一種滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專利在此引入作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知許多其他這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和模塊。在某些實(shí)施方案中，可以配制本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體以確係:在體內(nèi)的正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療性化合物能夠跨過BBB(如果需要時(shí))，可將它們配制在如脂質(zhì)體中。至于制備脂質(zhì)體的方法，參見，例如，美國(guó)專利4，522，811;5,374,548;和5，399,331。脂質(zhì)體可以包含可被選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)入特定細(xì)胞或器官內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)部分，從而增強(qiáng)定向藥物遞送(參見，例如，V.V.Ranade(1989)J.CUn.Pharmacol.29:6M)。定向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，Low等人的美國(guó)專利5,416,016);甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBSLett.357:140;M.0wais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180);表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134);p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090);也參見K.Keinanen;M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123;J.J.Killion;I.J.Fidler(1994)Immunomethods4:273。本發(fā)明的應(yīng)用和方法本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體、抗體組合物和方法具有涉及診斷和治療與PSMA表達(dá)有關(guān)的疾病的許多體外和體內(nèi)診斷和治療應(yīng)用。例如，這些分子可以施用于(例如)在體外或離體培養(yǎng)的細(xì)胞，或者例如在體內(nèi)施用于人類受試者，從而治療、預(yù)防或診斷多種疾病。本文使用的術(shù)語"受試者"包括人和非人動(dòng)物。非人動(dòng)物包括所有脊推動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、牛、馬、豬、雞、烏類、兩棲類動(dòng)物和爬行類動(dòng)物。優(yōu)選的受試者包括患有與PSMA表達(dá)有關(guān)的疾病的人類患者。這些方法特別適合治療患有異常PSMA表達(dá)相關(guān)疾病的人類患者。當(dāng)抗-PSMA抗體與另一種藥物一起給藥時(shí)，這兩種藥物可以相繼或同時(shí)給藥。在體內(nèi)和體外施用本發(fā)明的抗體組合物(例如抗體或免疫偶聯(lián)物)的適當(dāng)途徑在本領(lǐng)域中公知，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。例如，抗體組合物可以通過(例如靜脈內(nèi)或皮下)注射給藥。使用的分子的適宜劑量將取決于受試者的年齡和體重以及抗體組合物的濃度和/或配方。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在開始時(shí)檢測(cè)本發(fā)明的抗體與體外治療或診斷應(yīng)用有關(guān)的結(jié)合活性。例如，可以利用ELISA和流式細(xì)胞測(cè)定法檢測(cè)本發(fā)明的組合物。而且，可以測(cè)定這些分子引發(fā)至少一種效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性(包括抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或殺傷)的活性。測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC的方案在下面的實(shí)施例中描述。A.才企測(cè)方法在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體可以用來檢測(cè)PSMA的水平，或在膜表面上含有PSMA的細(xì)胞的水平，然后可以將這些水平與特定疾病癥狀相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供4企測(cè)樣品中PSMA抗原的存在或測(cè)定細(xì)胞表面上PSMA抗原的量的方法，包括在允許在抗體或其部分與PSMA之間形成復(fù)合物的條件下，將樣品和對(duì)照樣品與特異性結(jié)合PSMA的脫巖藻糖基化抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸。然后檢測(cè)復(fù)合物的形成，其中樣品與對(duì)照樣品相比復(fù)合物形成的不同指示樣品中知的標(biāo)準(zhǔn);險(xiǎn)測(cè)方法，如ELISA和流式細(xì)胞測(cè)定。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測(cè)樣品中PSMA(例如人PSMA抗原)的存在或測(cè)定PSMA的量的方法，包括在允許在抗體或其部分與PSMA之間形成復(fù)合物的條件下，將樣品和對(duì)照樣品與特異性結(jié)合PSMA的本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸。然后4全測(cè)復(fù)合物的形成，其中樣品與對(duì)照樣品相比復(fù)合物形成的不同指示樣品中存在PSMA。本發(fā)明的組合物也可以用來靶向表達(dá)PSMA的細(xì)胞，例如用于標(biāo)記這些細(xì)胞。為此應(yīng)用，可以將結(jié)合劑與可被檢測(cè)到的分子連接。因此，本發(fā)明提供用于離體或在體內(nèi)定位表達(dá)PSMA的細(xì)胞的方法。可檢測(cè)標(biāo)記物可以是，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。B.PSMA+細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制該抗體可以用來抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞的生長(zhǎng)，這又可以與PSMA表達(dá)相關(guān)的某些疾病癥狀的預(yù)防或緩解相關(guān)聯(lián)。與非疾病狀態(tài)相比疾病狀態(tài)期間PSMA表達(dá)的差異可以如下確定在允許在抗體與PSMA之間形成復(fù)合物的條件下，使來自該疾病患者的試樣和對(duì)照樣品與抗-PSMA抗體接觸。檢測(cè)在抗體與PSMA之間形成的任何復(fù)合物，并對(duì)樣品和對(duì)照進(jìn)行比較。例如，該抗體可以用來在體內(nèi)或在體外引起一種或多種下列生物活性抑制表達(dá)PSMA的細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或殺傷；在人效應(yīng)細(xì)胞存在下介導(dǎo)表達(dá)PSMA的細(xì)胞的吞噬作用或ADCC;抑制可溶性PSMA的脫落。如本文所述，與巖藻糖基化形式的抗體相比，本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗體表現(xiàn)出增強(qiáng)的ADCC活性。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種抑制PSMA+細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，包括在足以誘導(dǎo)所述細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的條件下，使所述細(xì)胞接觸脫巖藻糖基化的抗-PSMA抗體。例如，該細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗-PSMA抗體是人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以用來調(diào)節(jié)靶細(xì)胞上的PSMA水平，例如通過對(duì)細(xì)胞表面上的受體加帽(capping)以及將其清除。抗-Fc受體抗體的混合物也可以用于該目的。耙標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞，例如與本發(fā)明的組合物連接的效應(yīng)細(xì)胞，也可以用作治療劑。用于靶向的效應(yīng)細(xì)胞可以是人白細(xì)胞，如巨喧細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞。其他細(xì)胞包括嗜酸性細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和其他帶有IgG或IgA受體的細(xì)胞。需要時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞可以從所治療的受試者中獲得。靶標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞可以作為在生理學(xué)可接受的溶液中的細(xì)胞懸浮液施用。施用的細(xì)胞數(shù)可以是108-109個(gè)的數(shù)量級(jí)，但是根據(jù)治療目的而不同。通常，該量足以獲得在靶細(xì)胞處例如在表達(dá)PSMA的胂瘤細(xì)胞處的局部化，以及通過例如吞噬作用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的殺傷。施用途徑也可以不同。應(yīng)用靶標(biāo)特異性效應(yīng)細(xì)胞的治療可以與其他清除乾細(xì)胞的技術(shù)一起進(jìn)行。例如，使用本發(fā)明的組合物和/或帶有這些組合物的效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤治療可以與化學(xué)治療一起使用。另外，可以應(yīng)用聯(lián)合免疫治療將兩種不同的細(xì)胞毒性效應(yīng)群體導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞排斥。C.免疫偶聯(lián)物的應(yīng)用和聯(lián)合治療在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將化合物與抗體連接，本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可以將目標(biāo)化合物(例如治療劑、標(biāo)記物、細(xì)胞毒素、；改射性毒素、免疫抑制劑等)靶向至具有PSMA細(xì)胞表面受體的細(xì)胞。因此，本發(fā)明也提供用于離體或在體內(nèi)定位表達(dá)PSMA的細(xì)胞的方法(例如應(yīng)用可4企測(cè)標(biāo)記物，如;故射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)?？商娲兀庖吲悸?lián)物通過將細(xì)胞毒素或放射性毒素靶向至PSMA，也可以用來殺傷具有PSMA細(xì)胞表面受體的細(xì)胞，如表達(dá)PSMA的肺瘤細(xì)胞，由此消除腫瘤細(xì)胞。在另外一些實(shí)施方案中，可以另外用調(diào)節(jié)(例如增強(qiáng)或抑制)Fcy或Fq受體的表達(dá)或活性的藥物治療受試者，例如用細(xì)胞因子治療受試者。在治療過程中施用的優(yōu)選細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-y(IFN-y)和胂瘤壞死因子(TNF)。在另一實(shí)施方案中，可以對(duì)用本發(fā)明的抗體組合物治療的患者另外施用(在施用本發(fā)明的抗體之前、同時(shí)或之后)另一種治療劑，如增強(qiáng)或加強(qiáng)人抗體的治療效果的細(xì)胞毒劑或放射性毒劑?？贵w可以與該治療劑連接(作為免疫復(fù)合物)，或者可以與該治療劑分開給藥。對(duì)于后者(分開給藥)，抗體可以在治療劑之前、之后或同時(shí)給藥，或者可以與其他已知治療(如抗癌治療，例如放射治療)共同應(yīng)用。這些治療劑特別包括，抗腫瘤劑，如多柔比星(阿霉素)、順鉑硫酸博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、羥基脲，它們本身僅在對(duì)患者具有毒性或亞毒性的水平時(shí)有效。順鉑以100mg/ml的劑量靜脈內(nèi)給藥，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的劑量靜脈內(nèi)給藥，每21天1次。本發(fā)明的抗-PSMA抗體或其抗原結(jié)合片段與化療劑的共同給藥提供了兩種抗癌劑，它們通過對(duì)人腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的不同機(jī)制起作用。這種共同給藥能夠解決由于發(fā)展耐藥性或肺瘤細(xì)胞抗原性改變(這將使它們對(duì)抗體沒有反應(yīng)性)引起的問題。D.癌癥的治療已經(jīng)證明PSMA在腫瘤細(xì)胞如前列腺癌肺瘤細(xì)胞上表達(dá)，也已證明在靠近癌細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞如尿道上皮癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞和肝轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞上表達(dá)(見美國(guó)專利No.6,136,311)。因此，本發(fā)明的抗體通過抑制表達(dá)PSMA的肺瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或者通過抑制靠近腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，可以用來治療癌癥。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種抑制受試者中腫瘤生長(zhǎng)的方法，其中該腫瘤的細(xì)胞或靠近該腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞是PSMA+,其中給受試者施用本發(fā)明的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體，使肺瘤的生長(zhǎng)受到抑制。對(duì)于人類受試者，抗體優(yōu)選是人源化或人抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞是前列腺癌細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞來自于諸如結(jié)腸癌、腎癌、直腸癌、尿道上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌或黑素瘤等癌。本發(fā)明的治療方法包括給受試者施用有效治療或預(yù)防疾病的量的本發(fā)明的抗體組合物。抗體組合物可以單獨(dú)施用或與諸如細(xì)胞毒劑或放射性毒劑等另一種治療劑一起施用(與抗體偶聯(lián)或與抗體一起施用)，該另一種治療劑與抗體組合物聯(lián)合或協(xié)同起作用，以治療或預(yù)防與PSMA表達(dá)相關(guān)的疾病。藥盒本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括含有本發(fā)明的抗體和使用說明的藥盒。該藥盒可以進(jìn)一步含有一種或多種另外的藥物，如免疫刺激劑、細(xì)胞毒劑或放射性毒劑，或一種或多種本發(fā)明的其他抗體(例如，具有補(bǔ)充活性的人抗體，它與PSMA抗原上與第一人抗體不同的表位結(jié)合)。藥盒一般包括標(biāo)明該藥盒內(nèi)容物目標(biāo)用途的標(biāo)簽。術(shù)語標(biāo)簽包括在藥盒上提供或與藥盒一起提供或以其他方式隨藥盒提供的任何書面或記錄材料。本發(fā)明進(jìn)一步通過下面的實(shí)施例進(jìn)行闡述，不應(yīng)將這些實(shí)施例理解為進(jìn)一步的限制。全部附圖和在本申請(qǐng)中引用的全部參考文獻(xiàn)、專利和公開專利申請(qǐng)的內(nèi)容均在此引用作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1:抗-PSMA單克隆抗體在嵌合雞雞蛋中的表達(dá)在該實(shí)施例中描述了抗-PSMA人單克隆抗體7F12在嵌合雞的雞蛋中的表達(dá)。在嵌合雞的雞蛋中表達(dá)包括抗體在內(nèi)的蛋白質(zhì)的一般方法在PCT乂>開W02004/015123中描述，其內(nèi)容引入本文作為參考。關(guān)于在嵌合雞的雞蛋中表達(dá)抗體的其他信息在2005年2月18日提交的題目為"TissueSpecificExpressionofAntibodiesinChickens"、序號(hào)為11/062,325的美國(guó)申請(qǐng)中描述，其內(nèi)容引入本文作為參考。在下面的實(shí)施例中，構(gòu)建了含有包括啟動(dòng)子的內(nèi)源蛋白調(diào)節(jié)序列和外源免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因的轉(zhuǎn)基因，以在輸卵管的管狀腺細(xì)胞中產(chǎn)生組織特異性抗體表達(dá)。這樣表達(dá)的抗體分子然后沉積在轉(zhuǎn)基因雞的蛋白中。在該實(shí)施方案中，由任何重排的免疫球蛋白基因編碼的抗體在含有輸卵管壺腹(magnum)區(qū)管狀腺細(xì)胞的組織中特異性表達(dá)，并且能夠從蛋白中分離。編碼單克隆抗體的重排的免疫球蛋白基因優(yōu)先在輸卵管中表達(dá)，基本排除在其它組織中表達(dá)，盡管也可能在其他組織中的表達(dá)高于可檢測(cè)的水平。用于卵白蛋白衍生的單克隆抗體構(gòu)建體的優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體在圖12中示出。這些轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體被命名為Ov7.5和0v15,具有位于MAb編碼區(qū)5，端序列處的分別為大約7.5kb和15kb的卵白蛋白啟動(dòng)子，和位于編碼區(qū)3'側(cè)的15kb的15kb的啟動(dòng)子序列。編碼區(qū)包含輕鏈和重鏈的可變區(qū)、J-C內(nèi)含子序列、K輕鏈恒定區(qū)、IRES序列和yl同種型重鏈恒定區(qū)。該構(gòu)建體的3'末端包含GFP基因和選擇性標(biāo)記，在該例中為CX啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的嘌呤霉素抗性基因。位于單克隆抗體編碼區(qū)3，和5，側(cè)的卵白蛋白啟動(dòng)子序列的長(zhǎng)度僅是例子，類似的構(gòu)建體可以包括5'序列的25-100kb或更多，以及3，序列的不同長(zhǎng)度。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，GFP標(biāo)記的存在只是用于在生理標(biāo)本中檢測(cè)，可以除去而不背離轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用。噤呤霉素抗性標(biāo)記可以替換為具有選擇已被轉(zhuǎn)基因成功轉(zhuǎn)化的胚胎干細(xì)胞的能力的任何標(biāo)記。幾種類型的類似選擇性標(biāo)記在本領(lǐng)域眾所周知，基本可以與該實(shí)施方案的噤呤霉素抗性基因互換使用。用于表達(dá)人抗-PSMAmAb7F12的轉(zhuǎn)基因^皮稱為Ovl5raAb7F12，包括卯白蛋白啟動(dòng)子的15kb的5，調(diào)節(jié)序列。另外，信號(hào)肽直接與VL連接，以阻止它在mRNA加工過程中被除去。使用新產(chǎn)生的雌性cES細(xì)胞系(如PCT公開W02004/015123所述制備)，因此高級(jí)嵌合體能夠產(chǎn)生雞蛋。用Ovl5MAb7F12載體轉(zhuǎn)染雌性cES細(xì)胞系，通過PCR篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。通過Southern印跡法進(jìn)一步分析一個(gè)克隆(OVH)。顯示只有一個(gè)拷貝的Ovl5MAb7F12轉(zhuǎn)基因被整合到cES的基因組中，并且該轉(zhuǎn)基因至少含有10kb的5，0v啟動(dòng)子序列。由該OVH克隆產(chǎn)生嵌合雞用于轉(zhuǎn)基因分析。用10只嵌合雞進(jìn)行早期雌激素誘導(dǎo)。收集來自包括輸卵管壺腹部分、肌肉、腦、肝和腸在內(nèi)的各種組織的供體cES衍生的區(qū)域(GFP-陽性)。使用L和H鏈特異性引物利用RT-PCR監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在壺腹中檢測(cè)到L和H鏈轉(zhuǎn)錄物，但是在4只被誘導(dǎo)的母雞中有3只(0V15-34、0V15-76和0V15-8"的肌肉、腦和肝臟樣品中未檢測(cè)到。但是，在回腸、盲腸和結(jié)腸中也檢測(cè)到低水平表達(dá)。對(duì)來自雌激素誘導(dǎo)的壺腹的切片進(jìn)行免疫組化，證實(shí)單克隆抗體在GFP-陽性管狀腺細(xì)胞中表達(dá)，但不在GFP-陽性上皮細(xì)胞中表達(dá)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證明Ovl5MAb7F12載體引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在輸卵管管狀腺細(xì)胞中的表達(dá)。在腸中檢測(cè)到低水平的異位表達(dá)，提示15Kb的0V的5'調(diào)節(jié)序列可能不足以使轉(zhuǎn)基因位置獨(dú)立地、組織特異性地表達(dá)。由帶有0vHAbF12的0VHcES細(xì)胞產(chǎn)生69個(gè)嵌合體，用于評(píng)價(jià)全人MAb在雞蛋中的沉積。使30只嵌合母雞性成熟并開始產(chǎn)蛋。ELISA分析表明，所有母雞的雞蛋在蛋白中含有MAb。雞蛋中MAb的濃度和含量在嵌合母雞之間不同，這可能是由于壺腹中嵌合程度的不同所致。8只嵌合母雞產(chǎn)的蛋每只蛋含有1mg以上的MAb，30只嵌合體的最大水平為每只蛋3.4mgMAb。4只嵌合母雞產(chǎn)的蛋的平均MAb水平為每只蛋1.2至1.6mg。6只嵌合母雞產(chǎn)的蛋的平均MAb水平為每只蛋0.5至1.0mg。通過Western印跡法分析，4吏用識(shí)別H和L鏈的兔抗人IgG(H+L),進(jìn)一步分析蛋白中MAb的存在。來自野生型非嵌合白來杭雞的蛋白作為陰性對(duì)照。純化的人IgGl，K(Sigma)作為參照標(biāo)準(zhǔn)。在來自5只嵌合母雞(OV15-17、0V15-29、Ovl5-71、0V16-34和OV16-42)的蛋白樣品中檢測(cè)到全長(zhǎng)L和H鏈。也見到完全裝配的H2L2,盡管也存在少量的裝配中間體。為了確定沉積在蛋白中的MAb濃度的差異，在3-4個(gè)月的期限內(nèi)監(jiān)測(cè)5只不同嵌合母雞(OV16-34，0V16-42，OV17-29,0V17-52和0V17-83)的雞蛋。在3只雞中，MAb的量在前幾周達(dá)到峰值，然后在接下來的幾個(gè)月中下降大約兩倍，并保持穩(wěn)定。在兩只母雞中，表達(dá)水平隨時(shí)間進(jìn)程保持相對(duì)穩(wěn)定。如果當(dāng)雞蛋通過輸卵管壺腹部分時(shí)不是所有的管狀腺都分泌和沉積卵白蛋白，則由于這些母雞的管狀腺的嵌合性質(zhì)，當(dāng)每只雞蛋通過壺腹時(shí)在蛋白中沉積的MAb的量可能不同。來自26只嵌合母雞和BarredPlymouthRock(BPR)母雞(陰性對(duì)照)的血樣通過ELISA分析其中人IgG的存在。18只母雞在血液中具有可才僉測(cè)到的水平的MAb，在母雞OV17-83中觀察到39ng/ml的最高濃度。血液中MAb水平和蛋白中MAb濃度之間的相關(guān)系數(shù)(r)為0.67。但是，不同組織中嵌合程度可能顯著不同這一事實(shí)使這種比較復(fù)雜化。例如，母雞0V17-122在雞蛋中具有極少的MAb(平均O.02mg/蛋)，但是在血液中具有第二高的MAb濃度(36ng/ml)。我們推測(cè)血液中MAb的存在可能不是從輸卵管表達(dá)中泄露的結(jié)果，而是反映了異位表達(dá)(例如，通過RT-PCR在雌激素誘導(dǎo)的嵌合體的腸中檢測(cè)到異位表達(dá))。實(shí)施例2:抗體產(chǎn)物的純化和蛋白質(zhì)表征如下從蛋白中純化MAb7F12。首先在室溫下將蛋白以低剪切率混合30分鐘，然后通過本領(lǐng)域公知的方法沉淀卵粘蛋白。將一倍體積的勻漿的蛋白懸液加至3倍體積的反滲水中，攪拌30分鐘。使用0.5M磷酸將稀釋的懸浮液調(diào)節(jié)至pH6.0,然后以12，100g離心20分鐘。用通過方法除去了約3°/。的含有大多數(shù)卯粘蛋白的蛋白蛋白質(zhì)。使用0.5M磷酸氫二鈉將上清液調(diào)節(jié)至pH7.4,用結(jié)晶鹽調(diào)節(jié)至150mM氯化鈉的濃度。以120cm/h的線性流速在蛋白ASepharoseFF柱(AmershamBiosciences)上純化人IgG。用5倍體積的加樣緩沖液(PBS，pH7.4)洗下吸附的人IgG，然后用3mM磷酸洗脫。用含有230mMNaCl的60mM磷酸鈉(pH7.5)將洗脫下來的人IgG級(jí)分調(diào)節(jié)至pH7.5,達(dá)到終濃度為40mM磷酸鈉和150mMNaCl。然后將樣品通過0.2拜注射器濾器(Pall)過濾。大多數(shù)純化的材料是完全裝配的MAb分子，純度大于90%(通過ELISA和A280測(cè)定)。在幾個(gè)測(cè)定中將雞中產(chǎn)生的MAb"7F12與在常規(guī)CHO細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的MAb7F12如下進(jìn)行比較1.抗體的SEC-HPLC分析4吏用4.6x300mmBioSepSECS3000柱(Phenomenex)在Waters2795HPLC上分析大約10pgIgG樣品。在0.1M磷酸鈉，0,15MNaCl，和0.1M石克酸鈉，pH7,2中以0.4ml/min的流速進(jìn)4亍層析20分鐘。于A加監(jiān)測(cè)分離。利用分子量標(biāo)準(zhǔn)(Bio-Rad)測(cè)定大致的分子量。SEC-HPLC分析顯示均為多于90%IgG單體。2.蛋白質(zhì)的NanoLCESIMS/MS序列分析將兩種MAb制品(雞蛋表達(dá)的和CHO細(xì)胞表達(dá)的)還原并烷基化，透析過夜，在37°C下在25raM碳酸氫銨(PH8)中用胰蛋白酶消化4小時(shí)。在與QSTARpulsar質(zhì)譜儀(MDSSciex,Concord,Ontario,Canada)通過界面連才妄的NanoHPLC系統(tǒng)(Dionex，Sunnyvale,CA)上對(duì)兩種胰蛋白酶消化物進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)i普分析，以陽離子模式操作，并且使用碰撞誘導(dǎo)的解離(CID)來獲得串聯(lián)鐠。注射各1pi等份樣品，并用75jim直徑的PepmapC18柱以250nl/min的流速分離。移動(dòng)相是溶劑A(95%水，5°/。乙腈，0.5%甲酸)和溶劑B(20%水，80%乙腈，0.5%甲酸)。該設(shè)備以信息依賴性的采集模式操作，使用7s的操作循環(huán)，記錄全光譜2s,然后選擇最強(qiáng)離子在下一個(gè)5s中記錄CID語。用Mascot(MatrixScience,London,UK)分析光譜。通過上述方法對(duì)兩種MAb制品的分析顯示沒有表達(dá)系統(tǒng)引起的序列差異。3.LC-MS分析通過將樣品在6(TC下溫育90分鐘，用25mMDTT還原在4M鹽酸胍中的IgG樣品(50|_ig)。然后將樣品在45mM;f輿乙酸中在室溫下在暗處烷基化15分鐘，用22mMDTT終止反應(yīng)。在LC-MS樣品用1L25mM碳酸氫銨透析之前，使用裝備有MicromassZQ質(zhì)譜儀的Waters2795HPLC將各50pi才羊品注射到PorosRl/102,1x100mm柱(A卯liedBiosystems)上，以陽離子模式分析。移動(dòng)相為(A)0.1%甲酸和0.01。/。三氟乙酸(TFA)和(B)100%CH3CN和0.1%曱酸和0.01%TFA。用(B)在(A)中10-60%的線性梯度進(jìn)行洗脫(0."ml/min)，進(jìn)行超過100min。乙鏈的分析顯示兩種{^13制劑具有相同的質(zhì)量(+/-3Da.)。4.cIEF分析IgG樣品(各50ug,1.0mg/ml)用水透析，以在CE分析之前除去鹽。使用50nm內(nèi)徑和30cm有效長(zhǎng)度的eCAP中性毛細(xì)管(Beckman)，在正常極性的P/ACEMDQCE系統(tǒng)(Beckman)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳等電聚焦。通過20psi的壓力注射注射樣品60s。使用15kV分離45min。毛細(xì)管的溫度為20°C。陽極電解液為20mM磷酸，陰極電解液為40mM氫氧化鈉。漂洗溶液為10riiM磷酸，使用提供的陰極移動(dòng)溶液(Beckman)。于A訓(xùn)監(jiān)測(cè)分離。cIEF分析表明兩者具有相似的等電點(diǎn)(pl),盡管CH0產(chǎn)生的MAb7F12的電荷異質(zhì)性增加。5.通過差示掃描量熱法測(cè)定熱穩(wěn)定性利用差示掃描量熱法(DSC)獲得在雞和CH0表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的7F12的熱穩(wěn)定性，并與它們相應(yīng)的在Fc結(jié)構(gòu)域中脫糖基化的形式進(jìn)行比較。在與自動(dòng)采樣器組合的VP-毛細(xì)管DSC差示掃描微熱量計(jì)平臺(tái)(MicroCalLLC，Northampton,MA,USA)進(jìn)行熔解溫度(Tm)的量熱學(xué)測(cè)量。樣品細(xì)胞體積為0.144mL。關(guān)于抗體的糖基化和脫糖基化形式的變性數(shù)據(jù)如下獲得將濃度為2.3pM的樣品以rC/min的速度從30。C加熱到95°C。蛋白質(zhì)樣品存在于pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。在參照細(xì)胞中使用相同的緩沖液，通過比較獲得摩爾熱容。對(duì)觀察到的熱解曲線進(jìn)行基線校正，使用Originv7.Q軟件分析標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)。CHO和雞產(chǎn)生的抗體的解折疊譜非常不同，而Fc-脫糖基化抗體的解折疊譜幾乎相同。DSC數(shù)據(jù)表明CHO和雞產(chǎn)生的Mab的熱穩(wěn)定性不同，主要是由于在它們相應(yīng)的CH2結(jié)構(gòu)域中存在不同的糖基化模式。在幾個(gè)熔解轉(zhuǎn)變點(diǎn)中，第一個(gè)是非常重要的，因?yàn)樗鼪Q定抗體在較低溫度下的總體穩(wěn)定性。雞產(chǎn)生的抗體的L測(cè)定為63.8。C，而CHO表達(dá)的抗體的乙測(cè)定為62.7°C。由于雞產(chǎn)生的抗體的L高于CHO表達(dá)的抗體的乙，可能雞產(chǎn)生的抗體在室溫下更穩(wěn)定。實(shí)施例3:雞表達(dá)的抗-PSMA抗體的寡糖分析在該實(shí)施例中，用多種不同技術(shù)分析雞蛋表達(dá)的7F12抗體的糖基化模式。1.通過CE-LIF的寡糖表征通過樣品與12.5ml/PNGaseF(Prozyme)在40。C下溫育過夜，從IgG樣品(100pg)中釋放寡糖。在使用的條件下，從在CHO細(xì)胞和雞中表達(dá)的HuMAbFl的Fc部分釋放N-連接的聚糖。在乙醇沉淀除去MAb蛋白后，通過真空離心干燥含有聚糖的上清液，并重懸浮在15%乙酸中的19mMAPTS(Beckman)和在THF(Sigma)中的1M氰基硼氫化鈉中。聚糖標(biāo)記反應(yīng)在40。C下繼續(xù)過夜，然后用水25倍稀釋樣品。使用50pm內(nèi)徑、50cm有效長(zhǎng)度的涂覆N-CHO的毛細(xì)管(Beckman)，在具有反極性的P/ACEMDQCE系統(tǒng)(Beckman)上，對(duì)APTS-標(biāo)記的聚糖進(jìn)行激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳。壓力注射樣品(8sec.),在20。C下使用碳水化合物分離膠緩沖液(Beckman)在25kV下分離20分鐘。使用激光誘導(dǎo)的熒光^^測(cè)系統(tǒng)(Beckman)，利用3mW氬離子激光和488nm的激發(fā)波長(zhǎng)和520nm的發(fā)射波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)分離。發(fā)現(xiàn)在雞中產(chǎn)生的7F12的寡糖譜與在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的7F12非常不同。2.通過MALDIQ-TOFMS的寡糖表征純化的抗體(各1001.0fflg/ml)用4|ulPNGaseF處理，PNGaseF是一種內(nèi)切糖苷酶，切割N-連4妾的^友水化合物(Prozyme)。將樣品在37。C下溫育過夜，然后用50mM碳酸氫銨(pH8)透析過夜。通過乙醇沉淀除去蛋白質(zhì)。將釋放的碳水化合物在來自GlygenCorp.(Columbia,MD)的microcarbon柱上脫鹽，基本4安照供應(yīng)商的方案，但是洗脫體積減至5pl。各1fil等份的聚糖樣品與基質(zhì)溶液(a-氰基-4-羥基肉桂酸或2，5-二羥苯甲酸(AppliedBiosystems)1:1(v:v)混合，點(diǎn)樣至MALDI靶板上，使之風(fēng)干。利用MALDI-Q-T0F串聯(lián)分析對(duì)完整的糖偶聯(lián)物進(jìn)行分析。所有質(zhì)譜都記錄在配備有o-MALDIsource2的QSTARpulsari質(zhì)譜儀(MDSSciex,Concord,Ontario,Canada)上，其提供碳水化合物類別的質(zhì)量(組成)。在對(duì)兩種MAb進(jìn)行聚糖序列型分析后，研究每種聚糖中可能的糖苷鍵。高CID質(zhì)譜記錄在具有T0F/T0f光學(xué)系統(tǒng)的4700蛋白質(zhì)組分析儀(A卯liedBiosystems，F(xiàn)orsterCity,CA)上。對(duì)于高CIDMSMS實(shí)驗(yàn)，將碰撞能設(shè)置為1kV。在碰撞單元內(nèi)部，以2x10—6托的壓力用氬碰撞選擇的寡糖離子。通過MALDIT0F質(zhì)語法分析的在雞產(chǎn)生的7F12中11種主要聚糖的碳水化合物組成和可能的糖苷鍵總結(jié)在圖13A和13B中。發(fā)現(xiàn)寡糖結(jié)構(gòu)含有高甘露糖類型、復(fù)合類型和雜合類型的N-聚糖。沒有結(jié)構(gòu)含有巖藻糖殘基。3.通過HPAE-DAD及HPLC的單糖分析使用2NTFA(用于評(píng)價(jià)中性糖)或6NHC1(用于評(píng)價(jià)氨基糖)將IgG樣品(200)ug)在IO(TC下酸解4小時(shí)。樣品通過在室溫下真空離心干燥，用200pi水重建，之后通過HPAE-PAD(Dionex)分析。使用具有前置斗主AminoTrap禾口BorateTrap的CarboPacPA104x250mm斗主(Dionex)分離單糖。程序按照DionexTechnicalNote53進(jìn)行。使用單糖標(biāo)準(zhǔn)(Dionex)測(cè)定單糖峰身份和相對(duì)豐度。雞和CHO產(chǎn)生的7F12的單糖分析總結(jié)在下面的表l中。表1:雞和CHO產(chǎn)生的MAb7F12的單糖分析<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>單糖分析揭示了碳水化合物組成的差異，并且顯示在雞產(chǎn)生的7F12中存在N-乙酰葡糖胺殘基、甘露糖殘基和極低含量的半乳糖殘基。在雞產(chǎn)生的7F12中沒有檢測(cè)到巖藻糖殘基，與之相反，CHO表達(dá)的抗體制品含有巖藻糖殘基。為筌定末端糖殘基通過CE和質(zhì)譜法對(duì)聚糖進(jìn)行糖苷外切酶分析，證實(shí)在雞管狀腺細(xì)胞中產(chǎn)生的MAb7F12中不存在末端唾液酸和巖藻糖殘基?？傊?，N-連接的寡糖譜的最顯著的差異是，在雞產(chǎn)生的抗體中存在高甘露糖類型的N-聚糖，不存在巖藻糖，存在極低含量的半乳糖殘基。實(shí)施例4:雞表達(dá)的抗-PSMA抗體的功能分析在該實(shí)施例中，才金測(cè)了雞蛋表達(dá)的7F12抗-PSMA抗體的功能性質(zhì)，包括結(jié)合親和力、內(nèi)化、體內(nèi)血清半衰期和抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)活性。1.對(duì)PSMA的結(jié)合親和力通過流式細(xì)胞術(shù)使用LNCaP細(xì)胞(ATCCCRL1740)上的PSMA作為抗原測(cè)定抗體結(jié)合。細(xì)胞在含有10%FBS、10tnM服PES、2niML-谷氨酰胺和1mM丙酮酸鈉的RPMI1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。將在雞管狀腺細(xì)胞中產(chǎn)生的7F12的抗原結(jié)合性質(zhì)與在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的7F12相比較。200,000細(xì)胞/孔與各種濃度的50jal等份抗體一式兩份溫育30分鐘。洗滌細(xì)胞兩次，然后以50(al/孔加入1:200稀釋的山羊抗人IgGPE標(biāo)記的抗體(JacksonImmunoResearch)，在4°C下30分鐘。用含有1%BSA的PBS洗滌細(xì)胞兩次，進(jìn)行FACS分析。使用GraphPadPrism3.0(GraphPadSoftware)由結(jié)合曲線確定MAb與LNCaP細(xì)月包上PSMA結(jié)合的ECs。值。兩種抗體制品對(duì)LNCaP細(xì)胞上表達(dá)的PSMA產(chǎn)生幾乎相同的結(jié)合曲線，具有類似的ECs。值。數(shù)據(jù)證明盡管雞產(chǎn)生的和CHO產(chǎn)生的抗體被不同地糖基化，但是它們相同地識(shí)別并結(jié)合抗原。2.抗體的內(nèi)化7F12mAb與PSMA的結(jié)合導(dǎo)致抗體的內(nèi)化。在一種可能的應(yīng)用中，MAb與細(xì)胞毒素偶聯(lián)，以把向或破壞表達(dá)PSMA的肺瘤細(xì)胞。與LNCaP細(xì)胞上PSMA結(jié)合的抗體的內(nèi)化通過將細(xì)胞與MAb和Hum-Zap(AdvancedTargetingSystems)溫育來測(cè)定。H咖Zap是與核糖體滅活蛋白肥皂草毒蛋白(saporin)偶聯(lián)的山羊抗人IgG抗體。當(dāng)7F12MAb/Hum-Zap復(fù)合體與細(xì)胞表面上的PSMA結(jié)合并一皮內(nèi)化時(shí)細(xì)胞,皮殺傷，而單獨(dú)的抗體或Hum-Zap對(duì)LNCaP細(xì)胞沒有毒性。LNCaP細(xì)胞(10，000/孔)一式三份在含有300ngHum-Zap和300ng7F12MAb或?qū)φ誐Ab的l50pi培養(yǎng)基中在37。C下溫育48小時(shí)。細(xì)胞增殖和存活用CelITiter-GloLuminescentCellViabilityAssay(Promega)觀寸定。也如下進(jìn)行內(nèi)化試驗(yàn)，將抗體在細(xì)胞培養(yǎng)基中的稀釋液與10,000個(gè)附著的LNCaP細(xì)胞/孔在4DC下溫育2小時(shí)。輕輕除去抗體溶液，更換為150|al含有200ngH咖Zap的培養(yǎng)基。在37°C下溫育48小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞存活率。使用Prism3.0(GraphPadSoftware)根據(jù)圖形測(cè)定抗體內(nèi)化的ECs。值。雞表達(dá)的和CHO表達(dá)的抗體制品都以相似的效率內(nèi)化。當(dāng)在一定抗體濃度范圍內(nèi)檢測(cè)時(shí)，雞產(chǎn)生的和CHO產(chǎn)生的7F12MAb的內(nèi)化的EC5。值為0.49nM。3.體內(nèi)半衰期在BALB/c小鼠中通過靜脈注射放射性標(biāo)記的抗體平行分析了雞產(chǎn)生的7F12MAb和CHO產(chǎn)生的抗體的體內(nèi)半衰期。4吏用Iodobead法(Pierce)用mI輕微碘化10MAb蛋白質(zhì)(每個(gè)抗體少于1個(gè)I)。在實(shí)驗(yàn)前通過飲用水給6周大的雌性BALB/c小鼠(TaconicFarms,Germant冊(cè)n,NY)喂以0.1mg/ml碟化鉀，持續(xù)一周。每種蛋白質(zhì)4只小鼠向尾靜脈內(nèi)靜脈注射約600,000cpm標(biāo)記的MAb,在選定的時(shí)間使用全身y計(jì)數(shù)器(Wm.B.JohnsonNal晶體檢測(cè)器，具有Ludlumscaler)測(cè)量全身放射性。通過殘余放射性的指數(shù)回歸分析來計(jì)算半衰期。雞管狀腺細(xì)胞產(chǎn)生的7F12MAb的清除半衰期Um)為102.4主0.9小時(shí)，而CHO細(xì)胞產(chǎn)生的7F12MAb的清除更慢，半衰期為20L5±18.3小時(shí)。4.ADCC活性利用改良的"CrADCC試驗(yàn)檢測(cè)LNCaP-(M2B細(xì)胞。通過標(biāo)準(zhǔn)FicoU-paque分離從肝素化的全血中純化人外周血單核細(xì)胞。將細(xì)胞重懸浮(lxl()6細(xì)胞/na)在含有10%FBS和10U/ml人IL-2的RPMI1640培養(yǎng)基中，并在37。C下溫育過夜。次日，收集細(xì)胞，用培養(yǎng)基洗一次，并以2x107細(xì)胞/ml的濃度重懸浮。二百萬個(gè)革巴LNCaP-C42b細(xì)胞與200pCi51Cr在1ml總體積中37。C溫育1小時(shí)。將把細(xì)胞洗一次，重懸浮在lml培養(yǎng)基中，再于"。C溫育30分鐘。最后一次溫育后，將靶細(xì)胞洗一次，使終濃度為lx105細(xì)胞/ml。對(duì)于最后的ADCC測(cè)定，100iai標(biāo)記的LNCaP細(xì)胞與50n1效應(yīng)細(xì)胞和50ju1抗體一起溫育。選擇l:IOO的最終靶效比。在所有研究中還進(jìn)行人IgGl同種型對(duì)照并與CHO產(chǎn)生的抗-PSMA7F12抗體相比較。包括的其他對(duì)照有a)靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞而不含抗體，b)耙細(xì)胞而沒有效應(yīng)細(xì)胞，c)耙細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，存在3%TritonX-100。在37。C溫育4小時(shí)后，收集上清液，用y計(jì)數(shù)器(CobraIIauto-gamma，來自PackardInstruments)計(jì)數(shù)，讀取窗口為240-400keV。將每分鐘的計(jì)數(shù)作為抗體濃度的函數(shù)作圖，并使用Prism軟件(SanDiego，CA)利用非線性回歸S形劑量應(yīng)答(可變斜率)分析這些數(shù)據(jù)。裂解百分比用以下方程式來確定%裂解=(樣品CPM-無抗體CPM)/(TritonXCPM-無抗體CPM)X100我們發(fā)現(xiàn)在所有研究中既監(jiān)測(cè)EC5o值又監(jiān)測(cè)y。裂解是重要的。例如，當(dāng)比較兩種抗體時(shí)，EC5。或。/o裂解或兩者都可能改變。兩個(gè)不同ADCC實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖14A(IL-2刺激的效應(yīng)細(xì)胞)和圖14B(新鮮人外周血效應(yīng)細(xì)胞)中。圖14A顯示CHO產(chǎn)生的MAb誘導(dǎo)劑量依賴性的細(xì)胞裂解，當(dāng)使用IL-2刺激的效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，在38%裂解處達(dá)到穩(wěn)定，E"為O.11]uig/ml。相反，雞蛋產(chǎn)生的MAb更強(qiáng)更有效。對(duì)于兩種不同的抗體制劑，雞蛋產(chǎn)生的MAb的最大y。裂解為60%。比CHO產(chǎn)生的MAb增強(qiáng)的能力也得到證明，因?yàn)樵摬牧系腅Cs。為0.018jig/ml。即，雞表達(dá)的抗體的ECs。比CH0表達(dá)的抗體低約6倍。最后，如預(yù)期的，同種型對(duì)照抗體不誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。使用未刺激的效應(yīng)細(xì)胞(新鮮PBMCs)的ADCC顯示ECw值有較大差異，但是總細(xì)胞殺傷較低(圖14B)。CD16(FcyRIII)是介導(dǎo)ADCC的重要受體。使用抗CD16單克隆抗體阻斷靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的內(nèi)化顯示了ADCC應(yīng)答的特異性?？笴D16抗體對(duì)ADCC活性的阻斷按照上述ADCC測(cè)定來進(jìn)行，但具有如下改變。在存在或不存在5pg/ml抗-CD16抗體3G8或同種型對(duì)照抗體的條件下，細(xì)胞與1lag/ml(飽和劑量)或O.01fig/ml(亞最適劑量)的(雞或CH0表達(dá)的)7F12抗-PSMA抗體一起溫育。結(jié)果顯示在圖15中。對(duì)于CH0產(chǎn)生的和雞產(chǎn)生的抗體，在不存在抗-CD16時(shí)，1^g/ml的抗-PSMA抗體分別誘導(dǎo)約15°/。和38°/。的裂解。在存在抗-CD16時(shí)該％裂解降至約4%，而同種型對(duì)照抗體沒有影響。實(shí)施例5:脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體在FUT8陰性宿主細(xì)胞中的制備和表征在該實(shí)施例中，在缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞系中表達(dá)完全人類抗-PSMA單克隆抗體，因此該細(xì)胞系產(chǎn)生在其碳水化合物中缺乏巖藻糖的蛋白質(zhì)。使用多種化學(xué)分析技術(shù)，包括毛細(xì)管電泳、氨基酸序列比較、通過質(zhì)譜分析的質(zhì)量差異、和通過毛細(xì)管等電聚焦的電荷差異，相對(duì)于巖藻糖基化抗-PSMA抗體(在含有巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的不同細(xì)胞系中表達(dá))檢測(cè)脫巖藻糖基化抗體，來確定這兩種抗體之間結(jié)構(gòu)和特征的差異。使用抗PSMA完全人類單克隆抗體2A10。2A10重纟連的氨基酸和核苷酸序列在圖5A中顯示，2A10輕鏈的氨基酸和核苷酸序列在圖5B中顯示。將2A10重鏈和輕鏈可變區(qū)序列亞克隆到表達(dá)載體內(nèi)。將包括其信號(hào)序列和最佳Kozak序列的2A10K可變區(qū)cDNA亞克隆為與人k恒定區(qū)在閱讀框內(nèi)。將包括其信號(hào)序列和最佳Kozak序列的2A10重鏈可變區(qū)cDNA亞克隆為與人Yl重鏈恒定區(qū)在閱讀框內(nèi)。輕鏈和重鏈表達(dá)均由SRa啟動(dòng)子引導(dǎo)。該表達(dá)載體在PCT申請(qǐng)PCT/US2004/028954中詳細(xì)描述，其內(nèi)容引入本文作為參考。通過DNA電穿孔將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到FUT8——宿主細(xì)胞系Ms7(M內(nèi)。通過使用兩個(gè)置換載體定向破壞CHO/DG44細(xì)胞中的FUT8基因，來產(chǎn)生Ms704FUT8—〃細(xì)胞系,這在Yamane等人的美國(guó)專利申請(qǐng)20040110704和Yamane-0hnuki等人.(2004)腸&c力加7"/oe/^^2:614-22中更全面地描述。Ms704細(xì)胞適合在添加了100juM次黃噤呤和16juM胸苷(Invitrogen#11067-030)和6mML-谷氨酰胺(Invitr。gen#25030-081)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基EX-CELL325PFCHO培養(yǎng)基(JRH#14335)中懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)。將要用于電穿孔的載體DNA經(jīng)乙醇沉淀，并重懸浮在水中。8次電穿孔中的每一次使用1.5ygDNA。通過在蔗糖緩沖溶液(SBS)中洗滌細(xì)胞并將細(xì)胞以1X107細(xì)胞/mlSBS溶液的濃度重懸浮，來準(zhǔn)備Ms704細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。400jul細(xì)胞與構(gòu)建體謹(jǐn)A混合，使用250伏、275;微法拉第電容和25歐姆電阻的設(shè)置進(jìn)行電穿孔(BTXMolecularDeliverySystems#630電細(xì)力包操作器)。從電穿孔杯中取出細(xì)胞，加入20ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將細(xì)胞以每孔200|i1細(xì)胞的密度加至96孔板上，大約為4X104細(xì)胞/孔。電穿孑L2天后，從每孔中除去l50ial培養(yǎng)基，更換為150yl選擇培養(yǎng)基，即含400jug/mlG"8(Invitrogen#10131-035)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。每3-7天，將每孔150yl選擇培養(yǎng)基更換為新鮮的選擇培養(yǎng)基。使用類似的程序用相同的2A10構(gòu)建體對(duì)CHODG44宿主細(xì)胞(FUT8+/+)進(jìn)行電穿孔，建立表達(dá)含有巖藻糖基化碳水化合物的重組2A10抗體的CHODG44轉(zhuǎn)染子。將產(chǎn)量最高的Ms704和CHODG44克隆擴(kuò)增，通過蛋白A親和層析法從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化重組2A10抗體。由Ms704產(chǎn)生的N-連接的寡糖和CHODG44產(chǎn)生的抗PSMA單克隆抗體樣品的比較分析通過毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)的熒光法(cLIF)來進(jìn)行(Chen和Evangelista(1998)f/ec"o;力ares/sU:1892)。通過加入肽N-聚糖酶(Prozyme)并溫育過夜來釋放;故純化抗體的N-連接的寡糖。乙醇沉淀該蛋白質(zhì)，將含有碳水化合物的上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，使用Speedvac干燥。重懸浮該碳水化合物，在脫唾液酸化和巖藻糖殘基損失最小化的溫和還原性胺化條件下用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸酯(APTS)進(jìn)行衍生化。使用激光誘發(fā)的熒光4全測(cè)器(BeckmanCoulter)通過毛細(xì)管電泳來分析反應(yīng)加合物(Ma和Nashabeh(1999)J加7.C力e瓜21:5185)。在從Ms704細(xì)胞系和從CHODG44細(xì)胞系獲得的抗體之間觀察到寡糖譜的差異，這與Ms704衍生的抗-PSMA抗體中不存在巖藻糖殘基相一致。使用Dionex-HPLC陰離子交換及脈沖電流檢測(cè)的單糖分析證實(shí)Ms7(M表達(dá)的抗體缺乏任何巖藻糖殘基的表達(dá)。結(jié)果總結(jié)在下面的表2中。表2:來自FUT8-/-和FUT8+/+細(xì)胞的MAb2A10的單糖分析<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>除了毛細(xì)管電泳和單糖分析所顯示的寡糖的差異以外，Ms7(M和CHODG44產(chǎn)生的抗-PSMA抗體蛋白質(zhì)樣品基本上相同。N末端蛋白質(zhì)序列的分析顯示N末端氨基酸序列相同。Ms704和CHODG"產(chǎn)生的抗-PSMA抗體的輕鏈的質(zhì)譜分析分別獲得23，552和23,548的質(zhì)量，這在儀器的誤差之內(nèi)。還使用標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管等電聚焦試劑盒試驗(yàn)(BeckmanCoulter)檢測(cè)了這兩種抗體，顯示這兩種抗體樣品具有相同的等電點(diǎn)。這些研究表明，除了Ms704產(chǎn)生的抗體的脫巖藻糖基化以外，Ms7(M和CHODG44細(xì)胞產(chǎn)生的抗體樣品的蛋白質(zhì)成分基本上相同。碳水化合物分析表明，該抗體的脫巖藻糖基化形式比該抗體的巖藻糖基化形式具有更多的末端半乳糖殘基。實(shí)施例6:在RJT8陰性宿主細(xì)胞中表達(dá)的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體的ADCC活性的評(píng)價(jià)Ms7(M0產(chǎn)生的(脫巖藻糖基化)2A10抗體對(duì)LNCaP-C42B細(xì)胞的(乂人ViroMedLaboratories,Minnetonka，MN獲4尋)的纟田月包毒'l"生利用改良的"CrADCC試驗(yàn)來4全測(cè)。通過標(biāo)準(zhǔn)Ficoll-paque分離法乂人肝素^f匕的全血中純化人外周血單核細(xì)胞。將細(xì)胞重懸浮(lx106細(xì)胞/ml)在含有10%FBS和10U/ml人IL-2的RPMI1640培養(yǎng)基中，并在37。C下溫育過夜。次日，收集細(xì)胞，用培養(yǎng)基洗一次，并以2x107細(xì)胞/ml的濃度重懸浮。二百萬個(gè)耙LNCaP-C42b細(xì)胞與200juCi51Cr在1ml總體積中37。C溫育1小時(shí)。將靶細(xì)胞洗一次，重懸浮在lml培養(yǎng)基中，再于37。C溫育30分鐘。最后一次溫育后，將靶細(xì)胞洗一次，使終濃度為lx105細(xì)胞/ml。對(duì)于最后一次ADCC測(cè)定，100ju1標(biāo)記的LNCaP細(xì)月包與50m1效應(yīng)細(xì)胞和50m1抗體一起溫育。選擇1:100的最終靶效比。在所有研究中還包括人IgGl同種型對(duì)照，并與CHODG"產(chǎn)生的(巖藻糖基化)抗-PSMA2A10抗體進(jìn)行比較。包括的其他對(duì)照有a)靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞而不含抗體，b)靶細(xì)胞而沒有效應(yīng)細(xì)胞，c)靶細(xì)月包和效應(yīng)細(xì)胞，存在3%TritonX-IOO。在37。C溫育4小時(shí)后，收集上清液，用y計(jì)數(shù)器(CobraIIauto-gamma,來自PackardInstruments)計(jì)數(shù)，讀取窗口為240-400keV。將每分鐘的計(jì)數(shù)作為抗體濃度的函數(shù)作圖，并使用Prism軟件(SanDiego，CA)利用非線性回歸S形劑量應(yīng)答(可變斜率)分析這些數(shù)據(jù)。裂解百分比用以下方程式來確定%裂解=(樣品CPM-無抗體CPM)/(TritonXCPM-無抗體CPM)X100三個(gè)分開的ADCC實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖16A、16B(IL-2刺激的效應(yīng)細(xì)胞)和16C(新鮮人外周血效應(yīng)細(xì)胞)中。使用各種濃度的fuc-2A10和defuc-2A10確定對(duì)于LnCaP細(xì)胞系的細(xì)胞毒性曲線，并且確定E"和°/。裂解值。分別對(duì)應(yīng)于圖16A、16B、16C的三個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在下面的表3中顯示。表3:脫巖藻糖基化抗-PSMAmAb2A10的細(xì)胞毒性能力<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>Ms704產(chǎn)生的(即脫巖藻糖基化的)2A10mAb與CHODG44產(chǎn)生的(即巖藻糖基化的)2A10bmAb相比增強(qiáng)的能力通過脫巖藻糖基化形式抗體的較低的EC50值和較高的％裂解得到證明。例如，脫巖藻糖基化形式的EC50值比巖藻糖基化形式大約低3倍至18倍。與IL-2刺激的效應(yīng)細(xì)胞相比，對(duì)未刺激的效應(yīng)細(xì)胞(新鮮PBMC)的ADCC活性顯示EC50值有較大差異，但是總細(xì)胞殺傷較低(圖16C)。CD16(FcYRIII)是介導(dǎo)ADCC的重要受體。使用抗CD16單克隆抗體阻斷耙細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的內(nèi)化顯示了ADCC應(yīng)答的特異性。抗CD16抗體對(duì)ADCC活性的阻斷按照上述ADCC測(cè)定來進(jìn)行，但是具有如下改變。在存在或不存在5pg/ml抗-CD16抗體3G8或同種型對(duì)照抗體的條件下，細(xì)胞與1網(wǎng)/ml(飽和劑量)或0.01pg/ml(亞最適劑量)的(Ms704或CHODG44表達(dá)的)"10抗-PSMA抗體一起溫育。結(jié)果顯示在圖17中。對(duì)于巖藻糖基化和脫巖藻糖基化抗體，在不存在抗-CD16時(shí)，1jag/ml的抗-PSMA抗體分別誘導(dǎo)約12%和37%的裂解。在存在抗-CD16時(shí)該％裂解降至小于5%，而同種型對(duì)照抗體基本沒有影響。等同方案僅僅應(yīng)用常少見實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域:技術(shù)人員就將認(rèn)識(shí)到或者能夠確定本文描述的本發(fā)明特定實(shí)施方案的許多等同方案。這些等同方案包含在下面的權(quán)利要求書中。序列表概述<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>權(quán)利要求1.一種分離的抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)抗體，其缺乏巖藻糖殘基。2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體與含有巖藻糖殘基的抗體形式相比增強(qiáng)了表達(dá)細(xì)胞表面PSMA的細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性。3.權(quán)利要求2的抗體，其中缺乏巖藻糖殘基的抗體對(duì)LNCaP前列腺癌細(xì)胞的ADCC活性的E"為0.05pg/ml或更低。4.權(quán)利要求2的抗體，其中缺乏巖藻糖殘基的抗體對(duì)LNCaP前列腺癌細(xì)胞的ADCC活性的ECs。比含有巖藻糖殘基的抗體形式對(duì)LNCaP前列腺癌細(xì)胞的ADCC活性的ECs。至少低3倍。5.權(quán)利要求1的抗體，它是單克隆抗體。6.權(quán)利要求5的抗體，它是人源化或嵌合抗體。7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述人源化或嵌合抗體是由選自3F5.4G6、3D7.1.1、4E10-1.14、3E11、4D8、3E6、3C9、2C7、1G3、3C4、3C6、4D4、1G9、5C8B9、3G6、4C8B9、E99、J415、J533和J591的小鼠抗-PSMA抗體制備的。8.4又利要求5的抗體，它是人抗體。9.權(quán)利要求8的抗體，其中所述人抗體包括人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)，其中(a)人重鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:1-9的氨基酸序列；(b)人輕鏈可變區(qū)包含選自SEQIDNO:10-18的氨基酸序列。10.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:IO的氨基酸序列。11.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:ll的氨基酸序列。12.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。13.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，人輕《連可變區(qū)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列。14.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列。15.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列。16.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列。17.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列。18.權(quán)利要求9的抗體，其中人重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列，人輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列。19.權(quán)利要求5的抗體，該抗體包括(a)包含選自SEQIDNO:19-27的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含選自SEQIDNO:28-36的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含選自SEQIDNO:37-45的氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含選自SEQIDNO:46-54的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含選自SEQIDNO:55-63的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)CDR2;和(f)包含選自SEQIDNO:64-72的氨基酸序列的人輕鏈可變區(qū)CDR3。20.^又利要求19的抗體，該抗體包括(a)包含SEQIDNO(b)包含SEQIDNO(c)包含SEQIDNO19的人重鏈可變區(qū)CDR128的人重鏈可變區(qū)CDR237的人重鏈可變區(qū)CDR3(d)包含SEQIDNO:46的人輕鏈可變區(qū)CDRl(e)包含SEQIDNO:55的人輕鏈可變區(qū)CDR2(f)包含SEQIDNO:64的人輕鏈可變區(qū)CDR321.權(quán)利要求19的抗體，該4元體包4舌(a)包含SEQIDNO20的人重鏈可變區(qū)CDRl;(b)包含SEQIDNO29的人重《連可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO38的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO47的人輕鏈可變區(qū)CDRl;(e)包含SEQIDNO:56的人輕《連可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO.65的人輕鏈可變區(qū)CDR3。22.權(quán)利要求19的4元體，該4元體包4舌(a)包含SEQIDNO-21的人重《連可變區(qū)CDRl;(b)包含SEQIDNO30的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:39的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQID冊(cè):48的人輕《連可變區(qū)CDRl;(e)包含SEQIDNO'57的人輕《連可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO66的人輕《連可變區(qū)CDR3。23,權(quán)利要求19的4元體，該抗體包才舌(a)包含SEQIDNO22的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO31的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO40的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO.49的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO.58的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:67的人輕鏈可變區(qū)CDR3。24.權(quán)利要求19的抗體，該抗體包j舌(a)包含SEQIDNO:23的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:32的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:41的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:50的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO,59的人輕《連可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO68的人輕鏈可變區(qū)CDR3。25.權(quán)利要求19的抗體，該抗體包才舌(a)包含SEQIDNO24的人重《連可變區(qū)CDRl;(b)包含SEQIDNO33的人重《連可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO42的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO51的人輕《連可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO60的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:69的人輕鏈可變區(qū)CDR3。26.權(quán)利要求19的才元體，該4元體包4舌(a)包含SEQIDNO.25的人重《連可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:34的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO'43的人重《連可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:52的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO-61的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO70的人輕鏈可變區(qū)CDR3。27.權(quán)利要求19的抗體，該抗體包4舌(a)包含SEQIDNO26的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO35的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO44的人重《連可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:53的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e)包含SEQIDNO:62的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:71的人輕鏈可變區(qū)CDR3。28.權(quán)利要求19的4元體，該4元體包4舌(a)包含SEQIDNO:27的人重鏈可變區(qū)CDR1;(b)包含SEQIDNO:36的人重鏈可變區(qū)CDR2;(c)包含SEQIDNO:45的人重鏈可變區(qū)CDR3;(d)包含SEQIDNO:54的人輕鏈可變區(qū)CDR1;(e〕包含SEQIDNO:63的人輕鏈可變區(qū)CDR2;(f)包含SEQIDNO:72的人輕鏈可變區(qū)CDR3。29.權(quán)利要求8的抗體，其包括產(chǎn)自或來源于人VH5-51或VH3-30.3基因的重鏈可變區(qū)。30.權(quán)利要求8的抗體，其包括產(chǎn)自或來源于人VkL6、04/014或L18基因的輕鏈可變區(qū)。31.權(quán)利要求8的抗體，其包括產(chǎn)自或來源于人VH5-51或VH3-30.3基因的重鏈可變區(qū)和產(chǎn)自或來源于人VkL6、04/014或L18基因的輕鏈可變區(qū)。32.—種宿主細(xì)^^，其包括編碼抗-PSMA抗體的免疫3求蛋白重4連和輕鏈基因，其中所述宿主細(xì)胞缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，使得所述宿主細(xì)胞表達(dá)的抗-PSMA抗體缺乏巖藻糖殘基。33.權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，其中所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因是人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因。34.權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，其中所述巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是FUT8。35.權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，它是CH0細(xì)胞。36.—種抑制PSMA+細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括使所述細(xì)胞與脫巖藻糖基化的抗-PSMA抗體在足以誘導(dǎo)所述細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的條件下接觸。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。38.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗-PSMA抗體是人抗體。39.—種抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其中該腫瘤細(xì)胞或靠近該胂瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PSMA，該方法包括給受試者施用有效抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的量的脫巖藻糖基化抗-PSMA抗體。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述抗-PSMA抗體是人抗體。41.權(quán)利要求39的方法，其中所述腫瘤細(xì)刀包是前列尿泉癌腫瘤細(xì)胞。42.權(quán)利要求39的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是選自結(jié)腸癌、腎癌、直腸癌、尿道上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌或黑素瘤的癌的腫瘤細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及缺乏巖藻糖殘基的抗-PSMA抗體。本發(fā)明的抗體與該抗體的巖藻糖化抗體形式相比表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。本發(fā)明還提供表達(dá)缺乏巖藻糖殘基的抗-PSMA抗體的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。也提供了使用抗體抑制PSMA+細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。文檔編號(hào)C07K16/30GK101160324SQ200680005451公開日2008年4月9日申請(qǐng)日期2006年2月17日優(yōu)先權(quán)日2005年2月18日發(fā)明者D·B·帕斯莫爾,J·M·卡達(dá)雷里,J·阿爾巴內(nèi)斯,磊朱申請(qǐng)人:米德列斯公司