專利名稱：：削弱hiv-1增殖的方法和組合物的制作方法削弱HIV-1增殖的方法和組合物發(fā)明背景本發(fā)明總的涉及用于抑制有癥狀或無癥狀的慢性感染患者中的人免疫缺陷病毒-ICHIV-I)增殖、從而盡可能減少發(fā)展成AIDS的組合物和方法。目前采用了或正在研究多種治療人免疫缺陷病毒(HIV-1)患者的治療方法。某些治療HIV-1的方法關(guān)注于HIV-1的反式激活基因(^0，該基因產(chǎn)生病毒高水平轉(zhuǎn)錄必需的蛋白質(zhì)(Tat)。已測定了^^基因及其蛋白質(zhì)的序列，并檢測了它們在HIV的建議治療中的作用(例如可參見美國專利6,525,179)。Tat蛋白在細胞外釋放，使它可被其它感染細胞攝取，以增強這些細胞中HIV-1的轉(zhuǎn)錄，它也可被未感染的細胞攝取，從而改變宿主細胞的基因激活作用并使細胞易于被病毒感染。細胞對Tat的攝取非常強烈，己報道這種攝取由該蛋白質(zhì)的一條短的堿性序列介導(S.Fawell等，1994Proc.Natl,Acad.Sci.，USA,91:664-668)。已經(jīng)在動物中制得了Tat蛋白的單克隆和多克隆抗體，這兩種抗體顯示能在體外阻斷Tat蛋白的攝入，將Tat蛋白的這種單克隆或多克隆抗體加入組織培養(yǎng)介質(zhì)能在體外減弱HIV-1感染(例如可參見美國專利6,524,582中提到的文獻)。本發(fā)明共同發(fā)明人之一先前發(fā)表的科學論著和專利(例如，G.Goldstein,1996NatureMed.，2:960;G.Goldstein,2000Vaccine,18:2789;1995年11月30日公布的國際專利申請WO95/31999;1999年1月21日公布的國際專利申請WO99/02185;2002年11月8日公布的國際專利申請WO01/82944;美國專利5,891,994;6，193,981;6,399,067;6,524,582;和6,525,179;公布的美國專利申請US2003/0,166,832和US2003/0,180,326)指出，HIV-1Tat蛋白上某些表位的抗體可作為AIDS疫苗和治療劑。例如，這些公布涉及與跨越下述Tat氨基酸殘基4-12的"HIV-1Tat表位1"序列內(nèi)的表位特異性結(jié)合的抗體Val-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-Trp-Z12-(SEQIDNO:1)，其中，X7是Arg、Lys、Ser或Asn，Y9是Glu或Asp，Z^是Lys或Asn，以及由該抗體和HIV-1Tat的其它抗體組成的組合物。這些公布還涉及含有與跨越下式所示Tat氨基酸殘基41-50的"HIV-1Tat表位2"序列內(nèi)的表位特異性結(jié)合的分離抗體的其它抗體組合物-Lys-X4rLeu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-(SEQIDNO:2)，其中，X42是Gly或Ala。此外，這些公布涉及與跨越下式所示Tat氨基酸殘基56-62的"HIV-1Tat表位3"序列內(nèi)的表位特異性結(jié)合的分離抗體-Arg-ATg-X58-Z59-A6(rY61-Ser-(SEQIDNO:3)，其中，Xss是Ala、Pro、Ser或Gln，Zs9是Pro或His，A6o是Gln或Pro，Y^是Asp、Asn、Gly或Ser，或是與跨越下式所示Tat氨基酸殘基62-73的"HIV-1Tat表位4"序列內(nèi)的表位特異性結(jié)合的分離抗體-Ser-Gln-X64-His-Gln-Y67-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-(SEQIDNO:4),其中，X64是Asn或Thr，Y67是Ala或Val。由這些抗體的組合，其中尤其包括一種表位1變體的抗體和分別結(jié)合不同表位1變體的一種或多種抗體的組合，以及這種表位1抗體和表位2抗體的其它組合，形成的組合物能夠結(jié)合大量多種HIV-l毒株和亞型(B進化支和非B進化支)特有的Tat變體序列。這些抗體組合物被設(shè)計用來在感染初期和/或血清轉(zhuǎn)化后病毒載量較低時抑制HIV-l感染，從而延遲發(fā)展成AIDS。再者，這些所得組合物或這種抗-Tat抗體的混合物具有可治療病毒許多毒株和亞型的優(yōu)點，因此不需要不同的、特異于毒株的治療劑。盡管關(guān)于HIV-l疾病發(fā)展的知識不斷積累，但本領(lǐng)域仍需要開發(fā)治療慢性HIV-l感染的組合物和方法，以延遲或阻止感染發(fā)展到通常致命的、全面的AIDS。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了一種單一分離的抗體或其片段，其結(jié)合多種HIV-lTat表位1變體序列(以后稱為"泛-表位(pan-epitope)1"抗體)，從而結(jié)合多種毒株和亞型的HIV-1Tat蛋白。一實施方案中，所述單一泛-表位1抗體結(jié)合HIV-lTat表位1的5種或至少5種變體序列，這將在以下本發(fā)明的詳細描述中詳細定義。另一實施方案中，所述單一泛-表位1抗體結(jié)合HIV-lTat表位1的至少2種變體序列。再在其它實施方案中，所述單一泛-表位1抗體或片段結(jié)合至少一種如下文所定義的變體Tat表位1序列(a)-(d)和至少一種如下文所定義的變體序列(e)-(h)。另一實施方案中，所述單一泛-表位l抗體結(jié)合至少3種、或者至少4種變體HIV-lTat表位1序列。另一實施方案中，所述單一泛-表位1抗體結(jié)合這些序列中的至少6種。另一實施方案中，所述單一泛-表位1抗體結(jié)合至少7種或者至少8種變體HIV-1Tat表位1序列。另一實施方案中，所述單一泛-表位1抗體結(jié)合9種或更多變體HIV-1Tat表位1序列。另一實施方案中，單一泛-表位1抗體與95%以上的HIV-1Tat蛋白(B進化支和非B進化支)的已知變體反應(yīng)。另一方面，本發(fā)明提供了一種含有一種上述單一泛-表位1抗體的藥物組合物。另一實施方案中，所述組合物含有多種不同上述泛-表位1抗體。再在另一實施方案中，所述組合物含有其它HIV-1抗體。這種組合物被用來使導致AIDS的慢性病毒血癥最小化。這種組合物對于有或沒有癥狀慢性感染患者或?qū)τ诮邮芷渌鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療的患者有用。再一方面，本發(fā)明提供了一種診斷試驗試劑，其中含有上述單一泛-表位1抗體或片段以及可檢測標記或標記系統(tǒng)。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于進行夾心試驗的試劑盒，其中裝有一種或多種泛-表位1抗體或片段、一種或多種結(jié)合HIV-1Tat上除表位1之外的表位的其它HIV-1Tat抗體，以及任選的一種或多種用于鑒定抗體的結(jié)合的可檢測標記或標記系統(tǒng)。在其它方面，本發(fā)明提供了一種用于進行某種試驗的試劑盒，其中裝有一種或多種泛-表位1抗體或片段以及一種或多種用于鑒定泛-表位1抗體與Tat的結(jié)合的可檢測標記或標記系統(tǒng)。本發(fā)明的另一種試劑盒還包括有涂層的固態(tài)支持物、混雜基材和引起或檢測由標記提供的信號的裝置，以及采集血樣的常規(guī)裝置、合適的試管和其它診斷試驗組件。再在另一方面，本發(fā)明提供了一種通過給予受感染的人類對象這里所述的藥物組合物以在所述對象中抑制HIV-1復制或降低HIV-1病毒水平的方法。一實施方案中，所述方法包括給予本發(fā)明的組合物以在慢性感染對象中維持較低的HIV-1病毒水平。另一方面，本發(fā)明提供了泛-表位1抗體在制備用于在人類對象中抑制HIV-1復制的藥物中的應(yīng)用。一實施方案中，該應(yīng)用采用結(jié)合5種或更多不同表位1變體序列的泛-表位1抗體。另一方面，本發(fā)明提供了泛-表位1抗體或抗體片段以及抗-表位2抗體或抗體片段在制備用于在人類對象中抑制HIV-1復制的藥物中的應(yīng)用。再一方面，本發(fā)明提供了一種制造單個分離泛-表位1抗體或其片段的方法。再在另一方面，本發(fā)明提供了一種測定對象中HIV-1Tat水平的診斷試驗。一實施方案中，所述試驗是一種采用本發(fā)明的泛-表位1抗體的競爭性試驗。在其它實施方案中，所述泛-表位1抗體是一種結(jié)合至少5種Tat表位1變體序列的抗體，即泛-表位1抗體#5。在以下對本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細描述中將進一步描述本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點。附圖簡述圖1比較了在接觸升高劑量(ng/ml)的本發(fā)明的泛-表位1IgG抗體(pan-Ep-laby，菱形)和抗體對照(方形)的被HIV-1感染的(1%最初感染)Jurkat細胞中HIV-1毒株IIIB復制的抑制情況。泛-表位1IgG抗體結(jié)合HIV-1Tat表位1的5種變體。這5種變體存在于95%以上的HIV-1B和非B毒株中。病毒水平在感染后的第7天通過HIV-1p24蛋白檢測ELISA測定。數(shù)據(jù)顯示了相比對照，在抗體濃度增加下的抑制情況。圖2顯示了在圖1的試驗中，劑量為10TCID50的相同的泛-表位1IgG抗體(pan-Ep-l;菱形)、結(jié)合表位2的單克隆抗體(Ep2aby;方形)、同時使用的兩種單克隆抗體(三角形)以及抗體對照(X)的抑制圖。所得曲線(三角形)表明，與單獨使用泛-表位1抗體(菱形)或表位2抗體(方形)得到的結(jié)果相比，同時使用泛-表位1抗體和表位2抗體產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)。圖3顯示了競爭性試驗的結(jié)果，其中，用200ng/mlTat包被平板。在緩沖液中含有升高量HIV-1Tat的樣品與包被的Tat競爭結(jié)合10ng用生物素標記的檢測劑泛-表位1抗體。隨著樣品中Tat量的增加，結(jié)合到平板的泛-表位1抗體的量減少。用羊抗人抗體IgG-辣根過氧化物酶(HRP)試劑檢測結(jié)合，該試劑結(jié)合結(jié)合的泛-表位1抗體上的生物素。所述抗體與圖l所用抗體相同。圖4是通過類似于圖3所述的在50%血槳中進行的競爭性試驗產(chǎn)生的人血漿中重組Tat劑量反應(yīng)曲線。產(chǎn)生了典型的劑量反應(yīng)曲線，該曲線表明，血漿對泛-表位1抗體與樣品中Tat的結(jié)合沒有影響。所述抗體與圖1所用抗體相同。圖5比較了用類似于圖3的試驗得到的重組Tat(rTat)和對應(yīng)于Tat表位1變體的肽在緩沖液中的劑量反應(yīng)曲線。用Tat(200ng/ml)包被平板。肽用E1-RE("RE")、E1-NE("NE")、E1-SE("SE")、E1-KE("KE")、E1-ND("ND")和全長Tat("Tat")標記。這些肽和其它肽都稱為"alt"，其定義見下表1。泛-表位-1抗體的濃度為10ng/ml。所有所得結(jié)合曲線都類似地表明，所有變體提供類似的結(jié)果。注意，在整篇說明書中，較短的生物素化的肽和較長的("alt")生物素化的肽產(chǎn)生相同結(jié)果。圖6A是用類似于圖3的競爭性試驗在3名HIV-1感染的人類對象中得到的圖。對象用編號和符號區(qū)別，即，對象A(圓形)、對象B(方形)和對象C(菱形)。采用圖l所示泛-表位1抗體的本發(fā)明的競爭性試驗可用于在未感染血漿中進行RNA檢測數(shù)天后鑒定TatRNA的水平(ng/ml)。圖6B是與圖6A類似的患者的圖，該圖測量了最初的RNA檢測之后每天的病毒效價(RNA拷貝數(shù)/ml)。注意，對象B在第0天時就從極性感染中恢復。圖7顯示了正常人外周血單個核細胞(PMBC)中HIV-1復制與IgGl泛表位#5抗體(即結(jié)合5種表位1變體的抗體)激活和抑制Tat的函數(shù)關(guān)系。前5根柱表示可變水平，即Tat濃度為0、0.1、1.0、10和100ng/ml。由圖可見，誘導HIV-1復制的最佳濃度為10ng/ml。后6根柱顯示了在接觸10ng/ml最佳濃度的Tat的PBMC中，IgGl泛-表位#5抗體濃度不同時對HIV-1復制的抑制。在該圖中，泛-表位#5抗體用任意參考符號"E"表示，顯示了抗體濃度為0.2^g/ml、1ng/ml和10jig/ml時以及對照IgGl抗體濃度為l、10和50pg/ml時的結(jié)果。注意，在所有對照及IgGl泛-表位#5抗體濃度為0.2ng/ml中對HIV-1復制的抑制不顯著(NS)(用任意參考符號"C"表示)，即p>0.05。發(fā)明詳述本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域?qū)τ糜谥委熀驮\斷多種毒株和亞型HIV-1感染的治療和診斷劑及組合物的需要。本發(fā)明的泛-表位1組合物的一個獨特優(yōu)點包括，療法的組成和應(yīng)用比較簡單，使用較少的試劑，但可有效抵抗全部的HIV-1毒株和亞型。類似地，本發(fā)明能夠用一個試驗和最少數(shù)量的試劑檢測多種HIV-1毒株和亞型，從而無需許多單獨的試驗和用于可能感染對象的各種HIV-1毒株或亞型的試劑。rw表泣/浙泛-表泣/貧沐文中，術(shù)語"變體HIV-lTat表位1序列"指下式表示的序列R廣Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-R2(SEQIDNO:5)，其中，X7是Arg、Lys、Ser或Asn;Y9是Glu或Asp;R,不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val;和R2不存在或是Trp-Z12-R3，其中，Z,2不存在或是Lys或Asn，R3不存在或是是序歹U-His-Pro-Gly-Ser-(SEQIDNO:27)的全部或部分。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，表位1序列在X7、丫9位含有可變氨基酸，Ri是Val，R2不存在，即Val-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro(SEQIDNO:28)。根據(jù)另一個實施方案，表位1序列含有三個可變位置X7、Y9和Zu位，不存在RPR2是Trp-Z!2-R3，其中，R3不存在，例如，Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-Trp-Z12(SEQIDNO:29)。在上述式中，變體表位1序列的完整范圍可以是長度約為7-14個氨基酸的序列，含有上述SEQIDNO:5的片段或是包含SEQIDNO:5的片段或整個SEQIDNO:5的更長的序列。因此，下面的實施例中具體給出了8種以上的表位1變體序列。另一個實施方案中，其它變體HIV-1Tat表位1序列包含下式表示的序列Glu-Val-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro(SEQIDNO:30)、Val-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Trp-Z12-(SEQIDNO:31)和Val-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Trp-Z12-His-Pro-Gly-Ser-(SEQIDNO:32)，以及上式范圍內(nèi)的其它。在下面的一個具體實施方案中，某些選出的變體HIV-l表位1序列可用以下8種序列表示(a)-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-(SEQIDNO:33)(b)-Val-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-(SEQIDNO:34)(c)-Val-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-(SEQIDNO:35)(d)-Val-Asp-Pro-Asn-Leu隱Glu-Pro-(SEQIDNO:36)(e)-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Asp-Pro-(SEQIDNO:37)(f)-Val-Asp-Pro-Lys-Leu-Asp-Pro-(SEQIDNO:38)(g)-Val-Asp-Pro-Ser-Leu-Asp-Pro-(SEQIDNO:39)(h)-Val-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-(SEQIDNO:40)因此，一實施方案中，例如，泛-表位1抗體結(jié)合變體(a)、(b)、(c)、(d)和(h)。另一實施方案中，泛-表位1抗體結(jié)合(a)-(h)中多個變體的不同組合。表位1的定義還包括同源或類似修飾的表位序列，其中，SEQIDNO:5中的非可變氨基酸(即不是用單個字母和下標表示的氨基酸)可用具有類似特性的氨基酸殘基保守性取代。例如，SEQIDNO:5的非可變氨基酸殘基可用具有相同電荷和/或類似側(cè)鏈長度的其它氨基酸殘基取代。類似地，SEQIDNO:5中的非可變的天然產(chǎn)生的.氨基酸可用非天然氨基酸殘基(即在化學結(jié)構(gòu)上具有修飾的氨基酸，如D-氨基酸、具有非天然產(chǎn)生的側(cè)鏈的氨基酸、N-甲基化氨基酸等)取代。參見與N-甲基化氨基酸有關(guān)的參考文獻。例如可參見L.Aurelio等，2002OrganicLetters,4(21):3767-3769以及其中提到的參考資料。因此，本發(fā)明提供了"泛-表位1抗體"，該術(shù)語是指能夠結(jié)合多種HIV-1表位1氨基酸序列的單一分離的抗體或其片段。如下面的實施例中所證實的，希望泛-表位1抗體對其結(jié)合的所有變體序列的Ko為1.0xl0力或更小。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解，解離常數(shù)KD是通過測量締合(ka)和解離(kd)得到的。希望本發(fā)明的所有泛-表位1抗體都具有類似的Kd値。如這里所例證的，泛-表位1抗體的一個實施方案是能夠結(jié)合至少5種變體HIV-1表位1序列的單一分離的抗體或片段，在進一步的實施方案中，所述泛-表位l抗體是能夠結(jié)合5種變體HIV-1表位1序列的單一分離的抗體或片段，再在進一步的實施方案中，所述泛-表位1抗體是能夠結(jié)合以下5種變體HIV-1表位1氨基酸序列的單一分離的抗體或片段VDPRLEPW-ZirR3(SEQIDNO:6);VDPKLEPW-Z12-R3(SEQIDNO:7);VDPSLEPW-ZirR3(SEQIDNO:8);VDPNLEPW-Z12-R3(SEQIDNO:9);和VDPNLDPW-ZirR3(SEQIDNO:10)，其中，Z12是Lys或Asn，R3不存在或是是序列-His-Pro-Gly-Ser-(SEQIDNO:27)的全部或部分。在下面的試驗中顯示，這種結(jié)合5種變體的示例性IgGl泛-表位1抗體對所有5種變體序列的Ko為l.Oxl(T9或更小。泛-表位1抗體的另一種實施方案是能夠結(jié)合至少2種變體HIV-1表位1序列，如上述變體表位1序列(a)-(h)中的兩種的單一分離的抗體或其片段。再在其它實施方案中，泛-表位1抗體是能夠結(jié)合至少3種變體HIV-1表位1序列的單一分離的抗體或其片段。在其它實施方案中，泛-表位1抗體是夠結(jié)合至少4種變體HIV-1表位1序列的單一分離的抗體或其片段。另一實施方案中，結(jié)合2-4種不同表位1變體的本發(fā)明的泛-表位1抗體是結(jié)合至少1種在Y"立為Glu的變體HIV-1表位1序列和至少1種在Y"立為Asp的變體HIV-1表位1序列的抗體或片段。另一實施方案中，所述單一分離的抗體或片段是結(jié)合至少6種變體HIV-1表位1序列的泛-表位1抗體。其它實施方案包括能夠結(jié)合至少7種變體HIV-1表位1序列的單一分離的抗體或其片段。該術(shù)語還指能夠結(jié)合至少8種變體HIV-1表位1序列的單一分離的抗體或其片段。當考慮Z,2位的其它變化或任何側(cè)翼氨基酸時，該術(shù)語還指能夠結(jié)合至少9種或更多變體HIV-1表位1序列的單一分離的抗體或其片段。再在其它實施方案中，如下面的實施例所證實的，所述泛-表位1抗體對各變體序列的K。為1.0xl(^或更小。一實施方案中，如下面的實施例中詳細教導的，選出的單一泛-表位1抗體結(jié)合用上述8種序列(a)-(h)表示的序列變體HIV-1表位1序列中的2種到至多8種。因此，一種單個分離泛-表位l抗體或片段結(jié)合變體序列(a)-(h)中的至少2種。本發(fā)明的另一種單一分離的抗體或片段結(jié)合2-4種所述不同變體序列。在一個具體的實施方案中，這種單個分離泛-表位1抗體或片段結(jié)合所述變體序列(a)-(d)中的至少一種和所述變體序列(e)-(h)中的至少一種。再其它的單個分離泛-表位1抗體或片段結(jié)合變體序歹U(a)-(h)中的任何5種到所有的8種。如下文所例證的，所述泛-表位1抗體由一種結(jié)合表位1(a)-(d)和(h)這5種變體的特定克隆產(chǎn)生。這種特定的抗體在本說明書中被稱為泛-表位抗體#5。然而，如上所述，泛-表位l抗體的其它例子可結(jié)合含Zu氨基酸的其它表位l序列或是用(a)-(h)表示的其中至少一個非可變氨基酸是非天然氨基酸的同源序列。因此，本發(fā)明的單一泛-表位抗體或片段結(jié)合多種毒株和亞型的HIV-lTat蛋白。一實施方案中，單一泛-表位抗體或片段結(jié)合95n/。以上的己知HIV-l毒株和亞型，其中包括B進化支和非B進化支的毒株和亞型。文中，術(shù)語"抗體"指含有兩條輕鏈和兩條重鏈的完整的免疫球蛋白。因此，單一分離的抗體或片段可以是單克隆抗體、合成抗體、重組抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。術(shù)語"抗體片段"指不完整的抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于分離的單一抗體鏈、Fv構(gòu)建物、Fab構(gòu)建物、Fc構(gòu)建物、輕鏈可變區(qū)或互補決定區(qū)(CDR)序列等。這種泛-表位1抗體或片段是用例如下面實施例所述的連續(xù)選擇和篩選技術(shù)或用其它合成或重組技術(shù)產(chǎn)生的。根據(jù)上文，本發(fā)明的單個分離泛-表位l抗體或片段可用包括從抗體或抗體片段庫中連續(xù)和依次選擇和篩選的方法制備。例如，選擇包括使各個單鏈人Fv庫與合成表位1肽和/或重組Tat蛋白接觸，并將變體Tat表位1序列引入該庫。例如，單鏈抗體可變序列(scFv)庫可用于選擇結(jié)合第一表位1變體氨基酸序列的序列，如含有該變體序列的生物素化的肽。獲得結(jié)合到該第一序列的scFv混合物并棄去庫中未結(jié)合的scFv。然后使選出的scFv混合物再連續(xù)并依次接觸上述多種不同的表位1序列并連續(xù)棄去未結(jié)合的scFv，直到得到結(jié)合表位1的多種變體，如2、3、4、5、6、7或8種或者更多種表位l的不同序列的scFv混合物。然后處理并克隆所得結(jié)合所需數(shù)量表位1變體的scFv以提供選擇的scFv的來源。例如，可對scFV進行處理以使其以所需的抗體或片段形式出現(xiàn)。之后對各克隆進行篩選以確定其與不同HIV-1毒株和亞型的不同HIV-1Tat表位1變體的反應(yīng)性?？蓪⒑Y選放大直到獲得能結(jié)合選出的多種變體序列，如SEQIDNO:5的2、3、4、5、6、7或8種或者更多種表位1變體序列的抗體或抗體片段或構(gòu)建物。泛-表位1抗體必需含有能夠介導與多種表位1變體結(jié)合的scFv的可變區(qū)。然而恒定區(qū)可用現(xiàn)在常用的方法改變。例如，可將各泛-表位lscFv的可變區(qū)插入恒定區(qū)主鏈，如人IgGl主鏈。這種抗體描述于下面的實施例1。如此得到的泛-表位l抗體可以是含有人輕鏈可變區(qū)和人或非人來源(如猴子等)的重鏈的嵌合抗體、或是采用人IgG抗體主鏈的人源化抗體、或是抗體片段。在本說明書和免疫學常規(guī)技術(shù)中，選擇合適的抗體主鏈和插入泛-表位1scFv是本領(lǐng)域的公知技術(shù)。根據(jù)本說明書的指導，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員可得到這里所述的任何不同的泛-表位1抗體。錄辦秀激僻靜旅因此，本發(fā)明的另一方面涉及一種用于治療HIV-1的含有泛-表位1抗體或片段及藥學上可接受的載體的藥物組合物。這種藥物組合物優(yōu)選含有結(jié)合表位1結(jié)構(gòu)式所示的8種X7/Y9變體的單一泛-表位1抗體或片段。另一種藥物組合物可含有結(jié)合表位1的5種或更多種X7/Y9變體的單一泛-表位1抗體或片段。再一種藥物組合物可含有結(jié)合表位1的2-7種X7/Y9變體的單一泛-表位1抗體或片段。再另一種組合物可含有結(jié)合表位1的9種或更多種X7AVZ,2變體的單一泛-表位1抗體或片段。藥物組合物的其它實施方案可含有兩種或多種本發(fā)明的不同泛-表位1抗體，例如，兩種或三種各自結(jié)合多個不同變體的抗體。例如，組合物中的一種泛-表位l抗體可僅結(jié)合其中的￥9是Glu的表位1變體，而組合物中的第二種表位1抗體僅結(jié)合其中的Y9是Asp的變體。通過這里的公開，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員可方便地制備許多這種組合。本發(fā)明的藥物組合物也可含有其它HIV-1表位的抗體，如之前鑒定的HIV-1Tat表位2。文中，術(shù)語"HIV-1Tat表位2"指序歹卜1^-:^42-1^11-0&-116-861"-丁乂1"-0^-&§-1^-(SEQIDNO:2)，其中&2是Gly或Ala。因此，一種藥物組合物可含有與特異性結(jié)合表位2中的表位序列的抗體組合的本發(fā)明的泛-表位1抗體。可方便地產(chǎn)生HIV-1病毒上其它蛋白質(zhì)和免疫位點的其它抗體并使其含在本發(fā)明的合適的藥物組合物中。或者，本發(fā)明的組合物可與其它HIV-1抗病毒療法或藥物方案聯(lián)合使用或交替使用。如文中所定義的，適用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)性免疫組合物的藥學上可接受的載體是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。這種載體包括但不限于水、鹽水、緩沖鹽水、磷酸緩沖液、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液。根據(jù)常規(guī)技術(shù)也可加入其它常用稀釋劑、佐劑和賦形劑。這種載體可包括乙醇、多元醇及其適當?shù)幕旌衔?、植物油以及可注射的有機酯。也可采用緩沖劑和pH調(diào)節(jié)劑。緩沖劑包括但不限于從有機酸或堿制備的鹽。代表性的緩沖劑包括但不限于有機酸的鹽，如檸檬酸(例如檸檬酸鹽)、抗壞、酒石酸、琥珀酸、乙酸或鄰苯二甲酸的鹽，Tris,鹽酸氨基丁三醇(trimethanminehydrochloride)或磷酸鹽緩沖液。腸胃外載體可包括氯化鈉溶液、林格葡萄糖溶液、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格溶液或不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載體可包括體液和營養(yǎng)補充劑、電解質(zhì)補充劑，如基于林格葡萄糖溶液的載體等。防腐劑和其它添加劑如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等也可提供在藥物載體中。本發(fā)明對載體的選擇沒有限制。從上述組分制備這些具有合適pH等滲性、穩(wěn)定性和其它常規(guī)特性的藥學上可接受的組合物是本領(lǐng)域的公知技術(shù)。例如可參見《雷明頓藥物科學與實踐》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy),第20版，LippincottWilliams&Wilkins，publ,，2000;和《藥物賦形劑手冊》(TheHandbookofPharmaceuticalExcipients)，第4版，R.C.Rowe等編，APhAPublications,2003。因此，本發(fā)明提供了泛-表位1抗體在制備用于在人類對象中抑制HIV-1復制的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的這種藥物組合物可用于在接觸HIV-1的人類對象中抑制HIV-1復制的方法。給予人類對象的本發(fā)明組合物的合適劑量是有效結(jié)合受感染細胞釋放的HIV-1Tat蛋白的量。一實施方案中，所述藥物組合物可治療性地給予受HIV-1感染的人以治療或控制病毒感染。這種受感染的人可以是無癥狀或是有癥狀的。泛-表位1抗體能減輕受感染對象的慢性病毒增殖并使發(fā)展成AIDS的進展最慢。例如可參見上述圖1中的抑制試驗的體外結(jié)果。該方法通過使泛-表位1抗體阻斷Tat從被感染的細胞轉(zhuǎn)移到其它被感染或未感染的細胞而發(fā)揮作用。這種作用降低了感染復數(shù)并阻斷了HIV-1病毒擴散的爆發(fā)，從而降低了病毒水平。在已經(jīng)被感染的患者中，這種降低病毒水平的方法可減輕慢性病毒血癥和向AIDS的發(fā)展。該方法可包括長期給予組合物。適合用這種方法治療的患者是對疾病免疫妥協(xié)且無法產(chǎn)生強免疫應(yīng)答的HIV-1感染患者。在HIV感染的晚期階段，由于疾病造成免疫力受損，幾乎沒有產(chǎn)生有效抗體效價的可能性。這種患者還包括被HIV-1感染的懷孕婦女、受感染母親的新生兒以及推定被感染的未免疫的患者(例如，由于疏忽而被受到HIV-1感染的人用過的針頭"刺中"的人)。這些泛-表位1抗體組合物被作為被動免疫療法給予以抑制病毒增殖和降低病毒載量。與95%以上、或99%以上的已知HIV-1Tat蛋白反應(yīng)的外源抗體在患者中可立即阻止Tat從病毒感染的細胞轉(zhuǎn)移到其它被感染或未感染的細胞。根據(jù)該方法，可在一長期治療方案中用所述抗體組合物長期治療患者。本發(fā)明的另一特有方面涉及另一種抑制HIV-1復制的方法，該方法包括同時給予被感染的患者泛-表位1抗體和表位2抗體。預計這種方法可給予泛-表位1抗體和表位2抗體的組合作為單一組合物?；蛘?，各抗體可作為單獨的組合物同時或依次給予患者。令人吃驚的是，這兩種抗體或抗體片段的組合產(chǎn)生了協(xié)同結(jié)果。這種結(jié)果表明，當一起使用時，使用比單獨使用各抗體時所用的劑量低的抗體劑量可實現(xiàn)所需治療結(jié)果，即減輕病毒血癥。抑制試驗證實了這兩種試劑之間的協(xié)同作用。當用于用來測定被HIV-1感染的細胞培養(yǎng)物中HIV-1Tat抑制水平的體外抑制試驗時，將泛-表位1抗體和表位2抗體作為藥物組合物單獨使用時產(chǎn)生了平行的病毒抑制結(jié)果。例如可參見圖2。然而，出乎意料的是，當同時給予這兩種抗體時提供了比單獨使用任何一種抗Tat單體所提供的相對相等的抑制更強的對病毒水平的抑制。該試驗的結(jié)果描述于圖2。泛-表位1抗體和表位2抗體的這種協(xié)同活性是未曾料到的。在上述各方法中，本發(fā)明的這些組合物是通過適當途徑給予的，如通過皮下、口服、粘膜、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、鼻或吸入途徑。目前優(yōu)選的給藥途徑是皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)。各劑中有或沒有其它抗HIV-1抗體存在時，本發(fā)明的泛-表位1抗體的量將根據(jù)患者年齡、體重、性別、一般健康狀況等加以選擇。在患者中產(chǎn)生外源效應(yīng)且沒有顯著不良副作用所需的抗體的量將根據(jù)所采用的藥物組合物而變化。在感染患者中，各劑通常含有約5-400mg/mL泛-表位1抗體的無菌溶液注射液。另一種劑量約為200mg抗體。再一種劑量約為100mg抗體。再其它的實施方案是劑量約為50mg抗體。進一步的實施方案是劑量約為10mg抗體。當一起使用時，如上所述，在一實施方案中，泛-表位l抗體表位2抗體的劑量是相同的。另一實施方案中，由于兩種抗體之間的協(xié)同作用，組合劑量低于單獨使用各抗體的單一添加劑量。長期給藥的頻率可從每天1次到每周1次或2次到每月1次，并取決于抗體的半衰期(例如，約7-21天)。然而，對這種感染患者的長期治療時間估計是不確定的，但是會持續(xù)很久。其它劑量范圍也是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預計的，尤其是與其它抗病毒治療聯(lián)合或依次給予抗體組合物時。本發(fā)明的組合物可用于長期治療由于針頭刺穿或母嬰感染而有急性感染風險的對象。本發(fā)明的抗體組合物也可用于長期治療受感染的患者或進行性HIV患者。試微浙微本發(fā)明的其它實施方案包括將本發(fā)明的泛-表位1抗體或片段用作診斷試驗試劑，并可與可檢測標記或標記系統(tǒng)一起使用，或者固定在基質(zhì)上，或者與介導固定作用的其它試劑聯(lián)合。這種診斷試劑可含有結(jié)合表位1公式的8種X/T9變體的單一泛-表位1抗體或片段。另一種診斷試劑可含有結(jié)合表位1的5種或更多種X/T9變體的單一泛-表位1抗體或片段。再另一種診斷試劑可含有結(jié)合表位1的2-8種X/T9變體的單一泛-表位1抗體或片段。再另一種診斷試劑可含有結(jié)合表位1的9種或更多種X/IV變體的單一泛-表位1抗體或片段。本發(fā)明的再一個實施方案包括本發(fā)明的診斷試劑盒，試劑盒中可裝有本發(fā)明的單一泛-表位1抗體或者裝有一些不同的本發(fā)明的泛-表位1抗體。例如，試劑中的一種泛-表位1抗體可僅結(jié)合其中的￥9是Glu的表位1變體，而試劑中的第二種表位1抗體僅結(jié)合其中的Y9是Asp的變體。通過這里的描述，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員可方便地制備各種此類組合。這種診斷或試驗試劑盒還可含有其它HIV-1表位或非Tat蛋白的抗體。這種試劑盒和試劑可用于測量和檢測被HIV-1感染或可能被感染的對象中HIV-1和HIV-lTat的效價?？贵w可被固定在合適的基質(zhì)上，如結(jié)合到包被抗生物素蛋白的固體支持物如平板、桿或珠上。當然，也可采用精通診斷試驗領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它結(jié)合劑。試劑盒中還提供了檢測抗體與HIV-1Tat結(jié)合的試劑，如非人抗體，例如羊抗人免疫球蛋白，等等。其它試劑包括常用的診斷標記或標記系統(tǒng)。例如，可用以下物質(zhì)直接或間接標記抗體，例如，放射性化合物、放射性同位素，如32P、1251、tecnicium;熒光或化學發(fā)光化合物，如FITC、羅丹明或熒光素；和蛋白質(zhì)，如生物素或酶以及酶輔因子，如堿性磷酸酶、卩-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶；和/或分子標記，如FLAG等，例如可參見ChubetRG，BrizzardBL.1996Biotechniques20(1):136-141;和KnappikA，PluckthunA.1994Biotechniques1994;17(4):754-761。標記系統(tǒng)的其它元件包括用來在與標記系統(tǒng)的其它組分反應(yīng)時產(chǎn)生信號的物質(zhì)，例如，鏈霉抗生物素蛋白和辣根過氧化物酶系統(tǒng)。也可采用本領(lǐng)域已知的將抗體單獨偶聯(lián)到可檢測分子的任何方法，包括Hunter等，1962Nature133:945;Pain等，1981J.Immunol.,Meth.40:219和其它常用教科書中所述的那些方法?；蛘?，還可使用除抗體之外的標記。因此，該試劑盒中還包含閱讀標記的多種試劑和裝置，例如，某些與酶類標記反應(yīng)產(chǎn)生有色信號的物質(zhì)等等、采取血樣的裝置、以及合適的試管和其它診斷試驗組分。本發(fā)明的抗體可用于任何已知的試驗方法，如競爭性結(jié)合試驗、直接和間接夾心試驗以及免疫沉淀試驗。例如可參見Zola，《單克隆抗體技術(shù)手冊》(MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques)第147-158頁(CRCPress,Inc.1987)以及有關(guān)許多試驗方法的其它常用試驗教科書。一個實施方案是，用來檢測患者HIV-lTat水平的試劑盒可包含一種或多種泛-表位1抗體或片段、一種或多種與HIV-l上不同于表位1序列的表位結(jié)合的任選的其它HIV-lTat抗體；以及一種或多種用來鑒定這些抗體的結(jié)合的可檢測標記或標記系統(tǒng)。精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以方便地選擇用于這種試劑盒的其它常用診斷組分。另一實施方案中，用于檢測患者HIV-lTat水平的試劑盒包含單一泛-表位1抗體或片段，或者多種泛-表位l抗體and片段，以及一種或多種用于鑒定這些抗體的結(jié)合的可檢測標記或標記系統(tǒng)。這種試劑盒適用于競爭性試驗。這種試劑盒和試劑可用于多種評估患者HIV-l效價的試驗模式。這種患者可以是未感染的、感染的或正在用本發(fā)明的藥物組合物或其它抗HIV-l療法治療的。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述泛-表位1抗體還可用于競爭性試驗。在該實施方案中，測量對象中HIV-lTat水平的診斷試驗包括使其上固定有已知量HIV-lTat蛋白的基材接觸含未知量HIV-l的對象的生物樣品以及與可檢測標記相連的本發(fā)明的單個分離泛-表位1抗體或片段。泛-表位1抗體或片段的存在量相對于基材上結(jié)合的Tat的量不完全飽和(subsaturation)。沖洗基材并測量結(jié)合到所述基材的泛-表位抗體或片段的量。將結(jié)合的泛-表位1抗體的量與標準結(jié)合曲線比較，該標準結(jié)合曲線測量不存在所述樣品時各種已知量的泛-表位1抗體或片段與所述已知量的結(jié)合的Tat的結(jié)合。從而可通過與結(jié)合到所述基材的所述抗體的量的倒數(shù)關(guān)系確定所述樣品中Tat的量。這種競爭性試驗采用結(jié)合2-8種(g卩2、3、4、5、6、7或8)或更多數(shù)量的表位1變體序列的泛-表位1抗體或片段，并可進行簡單且更加有效的試驗。本發(fā)明的依次試劑檢驗能夠檢測多種毒株和亞型的HIV-l感染而無需多種試劑和多次試驗。例如，測量HIV-lTat水平的診斷試驗的另一個實施方案包括使對象的生物樣品如體液，優(yōu)選血液、血清或血漿，但也可以是尿液、唾液及其它液體或組織，接觸與樣品中的HIV-lTat結(jié)合的固定的"捕獲"抗體。這種固定的捕獲抗體可以是泛-表位1抗體或是結(jié)合不同于表位1的HIV-1Tat表位的抗體。固定是將捕獲抗體結(jié)合到固體支持物如平板、桿或珠實現(xiàn)的。一旦生物樣品暴露于固定的抗體足夠時間，即可洗滌支持物以除去生物樣品中任何未結(jié)合到肽上的物質(zhì)。這種洗滌步驟是診斷試驗中常用的，并優(yōu)選采用常規(guī)緩沖液。如果樣品中存在HIV-lTat蛋白，則Tat將結(jié)合到結(jié)合的捕獲抗體而被固定。之后，使結(jié)合的材料接觸HIV-1Tat的第二"檢測"抗體。檢測抗體可以是泛-表位1抗體或是結(jié)合不同于表位l的HIV-lTat表位的抗體，或是不同種類的非人抗體，只要該檢測抗體不同于捕獲抗體幾何。檢測抗體在HIV-1Tat上結(jié)合的表位不同于捕獲抗體結(jié)合的表位，因此能夠檢測固體支持物上的捕獲抗體與生物樣品中的HIV-1Tat的結(jié)合。第二檢測抗體可用可檢測標記或能夠產(chǎn)生可檢測信號的組分標記，如被生物素化或者可含有分子標簽，如FLAG?；蛘?，標記可以不是抗體的一部分。合適的標簽選自上述通常使用的診斷標記。一實施方案中，所述標記可以是酶，當該酶與基材接觸后可產(chǎn)生可檢測的顏色或化學發(fā)光信號。顏色或化學發(fā)光的存在和/或強度表明了樣品中Tat的量。采用本發(fā)明抗體的任何常規(guī)試驗可用來確定治療方法的功效以及對疾病進行最初的診斷。以下實施例例證了本發(fā)明的組合物和方法的某些實施方案。這些實施例不是要限制權(quán)利要求書和說明書的范圍。實施例實施例1:制造泛-表位1抗體IgG的選擇和篩選過程A嚴在以下實施例中，氨基酸用熟知的單個字母代碼表示。用于以下實施例的肽示于下面的表1。這些肽是在N-末端用生物素-Ser-Gly-Ser-Gly-(SEQIDNO:U)合成的。N-末端序列作為間隔區(qū)以確保有關(guān)肽序列延伸到抗生物素蛋白的生物素結(jié)合口袋。某些示例性肽序列的典型Z,2位為Ser，Z,2位也可作為間隔區(qū)并可被取代。表位1可變位置X7、Y9的氨基酸殘基在表中用黑體表示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>文中，較短的生物素化的肽和較長的("alt")生物素化的肽都產(chǎn)生相同結(jié)果。因此，較長的肽上的其它氨基酸的差別是微不足道的，不會影響表位序列本身的抗體結(jié)合功能。5.遂雍"Fv從n-CoDeRLib-2000單鏈片段(ScFv)庫(BiolnventInternationalAB，瑞典)選擇克隆。用展現(xiàn)變體表位l序列的肽和完整的Tat蛋白篩選選出的scFv，步驟如下。在步驟1中，基本上按照GriffithsA.D.等，EMBOJ.，1994，13，3245-3260和Hawkins,R.E.等，J.Mol.Biol，1992，226，889-896的描述，用包被鏈霉抗生物素蛋白的Dynabead基材(DynalA.S.，奧斯陸，挪威)捕獲生物素化的肽El-RE(alt)。對這些公開的步驟進行了修飾，即用胰蛋白酶洗脫結(jié)合的噬菌體，如EngbergJ.等，Mol.Biotechnology.,1996，6，287-310所述。步驟2用稱為E1-NE(alt)、E1-KE(alt)和E1-SE(alt)的生物素化的肽的混合物進行。在步驟1和2中，肽的濃度范圍為l-5xl(T8M。在步驟3中，將4xlO'SM完整的Tat蛋白(aa1-86，Xeptagen，意大利)固定到微量滴定板上并用于在胰蛋白酶洗脫之后進行固相選擇。第一、第二和第三次選擇時所用噬菌體的量分別為9.4x1012、3.4xl()U和1.410'2pfo。為在步驟1和2之后進行噬菌粒擴增，使大腸桿菌(Eco//)HB101F'細胞在Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)中生長至OD6。Q0.5并在37'C用洗脫的噬菌體感染30分鐘。然后繼續(xù)孵育并在含有100pg/ml氨芐青霉素和15嗎/ml四環(huán)素的500cm2LB-瓊脂平板上30。C孵育過夜。將菌落重懸于LB培養(yǎng)基并在37。C生長至達到OD60Q0.5。菌落用6xl(^pftiR408/ml輔助噬菌體感染30分鐘。以100的濃度加入異丙基-卩-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并在25。C繼續(xù)孵育過夜。為在步驟3之后制備質(zhì)粒DNA，如上所述感染所得噬菌體并使其生長1.5小時，然后更換培養(yǎng)基(LB+15pg/ml四環(huán)素+100(ig/ml氨芐青霉素+0.1%葡萄糖)。在3(TC繼續(xù)生長過夜并用質(zhì)粒微制備試劑盒(BioRad，732-6100)進行微制備。C.篩選scFv為表達可溶性scFv，通過限制性酶消化除去基因III編碼區(qū)，將所得載體轉(zhuǎn)化入Top10細菌。表達的scFv克隆用針對靶的化學發(fā)光ELISA檢測(用于選擇步驟1和2的靶肽的混合物，對照抗原為E2-BI0，用卩-FLAG檢測(SIGMA，A-9469))。注意，用較短和較長(alt)的肽篩選產(chǎn)生的結(jié)果相同，各組短肽和長肽含有相同的表位1變體序列，即相同的X和Y變體。第一次篩選中發(fā)現(xiàn)4271個克隆中總共有590個陽性克隆，即與靶E1-NE(alt)反應(yīng)的克隆。在第二次篩選中用所有四種單獨的肽、Tat蛋白(Xeptagen，意大利)和對照抗原(E2-BI0和BSA-噁唑酮)重新檢測陽性克隆。對于所有檢測的克隆，發(fā)現(xiàn)有322個克隆對所有四種特定的肽El-RE(alt)、El-KE(alt)、E1-SE(alt)和E1-NE(alt)以及對Tat蛋白呈陽性，但對對照呈陰性。通過測序?qū)@些克隆中的288個克隆進行了進一步分析?？偣舶l(fā)現(xiàn)26個克隆具有獨特的反應(yīng)模式和超變區(qū)序列，并以大體積表達為scFVo篩選過程得到能識別1-4種變體序列和完整的Tat蛋白的scFv。只對識別Tat蛋白和所有四種變體的克隆進行進一步處理，并用第5種變體EI-ND進行測試。用固定的生物素化的肽，即El-RE(alt)、El-SE(alt)、El-KE(alt)、El-NE(alt)和E1-ND進行親和力分析。一些測試的克隆能夠識別所有5種變體。識別l、2、3、4或5種序列變體的克隆的例子列在表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>基于這些ELISA結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了8種結(jié)合含有固定的表位1的Tat蛋白/肽和游離Tat蛋白的克隆。這些克隆被大規(guī)模表達并在Ni-NTA瓊脂糖凝膠上純化以在Biacore試驗(采用BIA評價3.2和1:1Langmuir結(jié)合模型計算數(shù)據(jù)；見Biacore手冊)中進一步分析。發(fā)現(xiàn)8個克隆中有2個克隆(稱為泛-表位1#5和泛-表位1#6)以高親和力結(jié)合所有5種表位1肽。見表3。表3:抗TacscFv對固定的肽的親和力分析<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>A紗成錢麵G7貧伴將克隆泛-表位1#5和泛-表位1#6轉(zhuǎn)變成完整的IgGi抗體。對scFv泛-表位1#5和泛-表位1#6的VH和VL基因進行PCR擴增。產(chǎn)生的PCR片段用限制性酶消化并連接入將pcDNA3修飾得到的專用表達載體。該表達載體含有Yl基因組恒定區(qū)(NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號Z17370)以插入PCR擴增的VH基因或X基因組恒定區(qū)(NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號X06875)以插入PCR擴增的VL基因。然后用NucleoBondPlasmidMegaKit(BDBiosciences,目錄號K3004-l)大規(guī)模產(chǎn)生所得重鏈和輕鏈構(gòu)建物。質(zhì)粒DNA用MicroSpinS-400HR柱(AmershamBiosciences,目錄號27-5240-01)旋轉(zhuǎn)純化并用來短暫轉(zhuǎn)染COS-7綠猴細胞(ATCC登錄號CRL-1651)。COS-7細胞在添加了10。/。胎牛血清(Invitrogen，目錄號26140-079)和lx非必需氨基酸(Invitrogen，目錄號11140-035)的D-MEM(Invitrogen,目錄號31966-021)中于37°C、5%C02下培育。用Lipofectamine2000(Invitrogen，目錄號11668-019)根據(jù)制造商的方法進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染20小時后用添加了10%超低IgG胎牛血清(Invitrogen，目錄號16250-078)和lx非必需氨基酸(Invitrogen，目錄號11140-035)的D-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen，目錄號31%6-021)代替細胞培養(yǎng)基。培育5天后收獲細胞培養(yǎng)基并回收所有IgG分子。用蛋白A柱純化在COS-7細胞中短暫表達的轉(zhuǎn)化的IgGl分子。純化的物質(zhì)通過SDS-PAGE、凝膠過濾層析、等電聚焦、劑量反應(yīng)性ELISA和LAL-檢測進一步定性。在最初的檢測中只有一種IgGr泛-表位1抗體以可接受的水平表達。對第二種IgGi泛-表位1抗體#6未作進一步分析。對IgGi泛-表位1抗體可變區(qū)Hl測序，其序列為FSDYYMSWIRQAPG(SEQIDNO:41)。用Biacore試驗測定IgGi泛-表位1抗體#5和表位1肽或完整的Tat蛋白之間的親和力。將8種特定的生物素化的肽和對照肽固定到鏈霉抗生物素蛋白芯片(BiacoreSA-芯片，BR-1000-32)。由于肽被固定且IgG是二價的，下面的表5A-5B和6中的表觀動力學常數(shù)可能部分是由親和力造成的。未檢測到與芯片基質(zhì)或無關(guān)肽的背景結(jié)合，見表5A-5B和6。使用由美國的ATG公司表達的含氨基酸(aa)1-86的重組Tat蛋白。其序列與表1所列的序列相同，但殘基42上的氨基酸丙氨酸被替換成甘氨酸。表4A:固定的生物素化的肽和IgGl泛-表位1抗體#5之間的親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表4B<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表5:氨基偶聯(lián)的a-TatlgGi和Tat蛋白之間的親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>辦勸虔銀究在一組在瑞典斯德哥爾摩Karolinska實驗室進行的實驗中檢測了IgG「泛-表位1抗體#5抑制HIV-1復制的能力。這些實驗基于被HIV-1毒株IIIB感染的Jurkat細胞，通過直接針對HIV-1gag蛋白p24的ELISA監(jiān)測該細胞中的病毒復制(Re等，1995J.Acq.Imm.Def.SyndromesandHumanRetrovir.，10，408-416)。在病毒感染過程中，在37'C用病毒接種物感染指數(shù)生長的Jurkat細胞1小時，然后洗滌細胞并重懸于培養(yǎng)基(含Glutamax試劑、10%FCS、50IU/ml青霉素和50pg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基)。將感染的細胞與各種濃度未感染的細胞混合。同時在培養(yǎng)物中加入升高濃度的抗TatIgG,或?qū)φ湛笷ITC(S6derlind等，2000Nat.Biotech.,18(8):852-856)。培養(yǎng)物在37。C、5%(:02下孵育。3-4天后拆分培養(yǎng)物并重新加入加有抗體的新鮮培養(yǎng)基。在感染后的第7天通過p24檢測ELISA測定病毒水平。圖1和2提供了該實驗得到的支持數(shù)據(jù)。圖1顯示了用1%最初感染的細胞進行的實驗。從用1%和3%最初感染的細胞進行的抑制實驗計算出的IgGj乏-表位1抗體#5的ICs。值分別為0.14pg/ml和0.44ng/ml。因此，圖1證明了本發(fā)明的泛-表位1抗體對HIV-1復制的劑量相關(guān)的抑制作用。圖2證明，單獨使用泛-表位1抗體和Tat表位2抗體有類似的劑量相關(guān)的抑制曲線。當組合使用這兩種抗體時產(chǎn)生協(xié)同反應(yīng)。這兩種抗體的組合令人驚訝地產(chǎn)生了比單獨使用任何一種抗體有效10倍的病毒水平抑制作用。這說明，與抗表位2抗體一起使用泛-表位l抗體產(chǎn)生了一種意想不到但格外有價值的治療組合物和抑制HIV-1病毒水平的方法。按照競爭性實驗模式，采用了用可檢測標記標記的單一泛-表位1抗體，優(yōu)選泛-表位1抗體。在進行該試驗之前，用HIV-lTat蛋白包被平板。在平板中加入次最佳量或不完全飽量的泛-表位1抗體稀釋液及含有己知量HIV-1Tat的血漿樣品。測量泛-表位1抗體與平板上Tat結(jié)合的標準結(jié)合曲線。血漿樣品中的HIV-1Tat越多則結(jié)合的泛-表位1抗體越少。圖3圖示了該試驗的結(jié)果。使包被200ng/mlTat的平板接觸含有升高量的HIV-1Tat和次最佳量的用生物素標記的10ng泛-表位1抗體的患者的緩沖樣品。結(jié)合在包被平板上的HIV-1Tat序列和樣品中的HIV-1Tat序列競爭性結(jié)合泛-表位1抗體。隨著樣品中Tat量的增加，結(jié)合到平板的泛-表位1抗體的量降低。加入結(jié)合到鏈霉抗生物素蛋白的抗人IgG檢測這種結(jié)合。IgG結(jié)合泛-表位1抗體。將平板洗滌之后在平板中加入辣根過氧化物酶，產(chǎn)生了與結(jié)合的泛-表位1抗體的量成比例的可檢測信號。通過測量樣品中結(jié)合到平板的泛表位1抗體的量并將其與標準結(jié)合曲線比較可計算出樣品中HIV-lTat的量。如上所述，精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然明白，該試驗可采用其它能產(chǎn)生信號的標記，且對信號生成系統(tǒng)的選擇不構(gòu)成對該試驗的限制。圖4是通過與上述試驗類似并在50%血漿中進行的競爭性試驗產(chǎn)生的人血漿中的重組Tat劑量反應(yīng)曲線。生成了典型的劑量反應(yīng)曲線，這表明血漿對泛-表位1抗體與樣品中Tat的結(jié)合沒有影響。該試驗能夠測量患者血漿中的Tat水平。在緩沖液中進行類似的試驗以產(chǎn)生類似的重組Tat和表位1變體肽的劑量反應(yīng)曲線，結(jié)果示于圖5。測試的肽是E1-RE、E1-NE、E1-SE、E1-KE、E1-ND和全長Tat。所有曲線都是類似的，說明所有變體都提供類似結(jié)果。最后，在三名被HIV-1感染的人類對象中進行一組如上所述的競爭性試驗。如圖6A和6B所示，對象用編號和符號區(qū)別，艮卩，對象A(圓形)、對象B(方形)和對象C(菱形)。采用泛-表位5抗體E9的本發(fā)明的競爭性試驗可用于在未感染血漿中進行RNA檢測數(shù)天后鑒定TatRNA的水平和病毒效價。這些數(shù)據(jù)證明，采用單一泛表位l抗體的本發(fā)明的競爭性試驗能夠檢測臨床樣品中的Tat水平，因此通過檢測感染對象中Tat編碼的蛋白質(zhì)便可證實HIV-l感染。上述實施例和數(shù)據(jù)證實，競爭性試驗模式的一個優(yōu)點是可減少試驗所采用的試劑(抗體)的數(shù)量。我們可以用泛-表位1抗體代替針對SEQIDNO:5中多個序列的單克隆抗體的混合物以實現(xiàn)在一個試驗中檢測多種毒株和亞型的HIV-1Tat。raf仝激實邀浙/gG/泛-表泣；^"沐弁5游滯劍/，屑正常的人外周血單個核細胞(PBMC)不支持HIV-1復制，但被促分裂原或被HIV-1Tat蛋白體外激活后允許HIV-l復制(LiCJ等，1997ProcNatlAcadSciUSA94:8116-1820)。此外，Li等證實，Tat誘導的允許可被Tat的多克隆或單克隆抗體抑制。這種方法被用來開發(fā)生物實驗以得到抑制Tat-誘導的允許人PBMC進行HIV-1復制的單克隆抗體(Mab)。該實驗采用批號為03AP04的PBMC(AstarteBiologies)和在大腸桿菌中表達并通過反相層析純化的重組Tat(ATG，Inc.)。每孔使用100pl細胞(5xl0Vml)，在細胞中僅加入100pl各種濃度的Tat，或加入10ng/ml與各種濃度的單克隆抗體預先孵育過的Tat，并在37°C、5-6%0)2和80-90%濕度下孵育5夫。采用96孔平底組織培養(yǎng)平板。5天后用移液管在各孔中加入介質(zhì)以使細胞從平板表面釋放，并將細胞轉(zhuǎn)移到V形底96孔板并充分洗滌。在各孔中加入100nl1/10稀釋的純化的HIV-1病毒裂解液(BUT)(ZeptometrixCorp.)并培育4小時。這樣使每孔有35ng單位HIV-1蛋白p24。4小時后充分洗滌細胞，將細胞重懸于組織培養(yǎng)基并再培育4-5天。培育結(jié)束后將細胞400xg旋轉(zhuǎn)10分鐘并收獲上清液。用ZeptometrixRETROtekHIV-1p24AntigenELISA按照制造商的建議檢測上清液中的HIV-1p24。10復孔用于不含Tat的對照(OTat);10復孔用于含10ng/mlTat。所有其它的孔都一式5份。將數(shù)據(jù)裝入PrismGraphPacFM程序并通過單向ANOVA進行統(tǒng)計分析，然后分析柱間的差異并對多次分析進行校正。結(jié)果示于圖7，該圖顯示，10ng/ml使PBMC允許進行HIV-l復制(PO.OOl)。1嗎/ml(PO.05)和10嗎/ml(PO.01)IgGl泛-表位1#5抗體能抑制這種允許，但1、10或50ng/ml的對照IgGl抗體則不可以。因此，存在泛-表位1抗體，即結(jié)合5種表位1變體的單一抗體，能通過抑制Tat而抑制人PBMC中的HIV-1復制。對本發(fā)明進行的大量修改和變動都包括在上述內(nèi)容中，這些修改和變動對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的。對本發(fā)明的組合物和方法進行的這些修改和改動都包括在附帶的權(quán)利要求的范圍中。上面列出或提到的所有文獻都納入本文作為參考。權(quán)利要求1.一種單一分離的抗體或其抗體片段，其結(jié)合HIV-1Tat蛋白表位內(nèi)的多種變體序列，其中，所述表位用下式表示R1-Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-R2(SEQIDNO5)，其中，X7是Arg、Lys、Ser或Asn；其中，Y9是Glu或Asp；其中，R1不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val；其中，R2不存在或是Trp-Z12-R3；其中，Z12不存在或是Lys或Asn；和其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-的全部或部分；所述單一抗體或片段結(jié)合多種毒株和亞型的HIV-1Tat蛋白。2.如權(quán)利要求1所述的單一分離的抗體或片段，其結(jié)合5種所述變體序列。3.如權(quán)利要求1所述的單一分離的抗體或片段，其特征在于，對于各變體序列，Ro是Val，而R2不存在。4.如權(quán)利要求1所述的單一分離的抗體或片段，其結(jié)合至少一種Y9是Glu的所述變體序列和至少一種Y9是Asp的所述變體序列。5.如權(quán)利要求1所述的單一分離的抗體或片段，其結(jié)合至少2種所述不同變體序列。6.如權(quán)利要求1所述的單一分離的抗體或片段，其結(jié)合至少3種所述不同變體序列。7.如權(quán)利要求1所述的單一分離的抗體或片段，其結(jié)合4種所述不同變體序列。8.如權(quán)利要求l所述的單一分離的抗體或片段，其結(jié)合6-8種所述不同變體序列。9.如權(quán)利要求1所述的單一分離的抗體或片段，其結(jié)合9種或更多種所述不同變體序列。10.如權(quán)利要求l所述的單一分離的抗體或片段，其特征在于，所述變體序列選自下組(a)SEQIDNO:5，其中，R,是Val，112不存在，X是Arg，Y9是Glu;(b)SEQIDNO:5，其中，R,是Val，112不存在，X7是Lys，Y9是Glu;(c)SEQIDNO:5，其中，R,是Val，112不存在，X7是Ser，Y9是GIu;(d)SEQIDNO:5，其中，R,是Val，112不存在，X7是Asn，Y9是Glu;(e)SEQIDNO:5，其中，R！是Val，尺2不存在，X是Arg，Yg是Asp;(f)SEQIDNO:5，其中，R!是Val，112不存在，X是Lys，Y9是Asp;(g)SEQIDNO:5，其中，R,是Val，112不存在，X7是Ser，Yg是Asp;禾口(h)SEQIDNO:5，其中，R是Val，112不存在，X是Asn，Yg是Asp。11.如權(quán)利要求10所述的單一分離的抗體或片段，其結(jié)合至少一種選自(a)-(d)的所述變體序列和至少一種選自(e)-(h)的所述變體序列。12.如權(quán)利要求10所述的單一分離的抗體或片段，其結(jié)合5種所述不同變體序列。13.如權(quán)利要求10所述的單一分離的抗體或片段，其結(jié)合2-7種所述不同變體序列。14.如權(quán)利要求IO所述的單一分離的抗體或片段，其結(jié)合(a)-(h)中所有的所述變體序列。15.如權(quán)利要求1所述的單一分離的抗體或抗體片段，其選自單克隆抗體、合成抗體、重組抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、分離的單一抗體鏈、或所述抗體或抗體鏈的片段。16.—種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1所述的抗體或抗體片段以及藥學上可接受的載體。17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其含有如權(quán)利要求1所述的多種不同抗體或抗體片段。18.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述如權(quán)利要求1所述的抗體承抗體片段結(jié)合至少一種丫9是Glu的所述變體序列和至少一種￥9是Asp的所述變體序列。19.如權(quán)利要求16所述的組合物，其含有HIV-1的其它抗體或其它抗體片段。20.如權(quán)利要求19所述的組合物，其特征在于，所述其它抗體或其它抗體片段結(jié)合HIV-1Tat。21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其特征在于，所述HIV-lTat的其它抗體或其它抗體片段是結(jié)合位于式Lys-X-Leu-Gly-IIe-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-(SEQIDNO:2)所示表位內(nèi)的序列的抗體或抗體片段，其中，X是Gly或Ala。22.—種診斷試驗試劑，其含有如權(quán)利要求l所述的單一分離的抗體或抗體片段以及可檢測標記。23.如權(quán)利要求22所述的試劑，其特征在于，所述權(quán)利要求1所述的抗體或抗體片段結(jié)合至少一種Y9是Glu的所述變體序列和至少一種Y9是Asp的所述變體序列。24.—種用于對生物樣品進行試驗的試劑盒，所述試劑盒中裝有(a)—種或多種如權(quán)利要求1所述的抗體或抗體片段；(b)任選的一種或多種HIV-lTat的其它抗體，該抗體特異性結(jié)合與(a)所述抗體結(jié)合的表位不同的HIV-lTat上的表位；和(c)一種或多種鑒定所述抗體與所述樣品中存在的任何HIV-lTat結(jié)合的可檢測標記或標記系統(tǒng)。25.如權(quán)利要求24所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體或抗體片段(a)結(jié)合至少5種所述變體。26.如權(quán)利要求24所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體或抗體片段(a)結(jié)合至少2-8種所述變體。27.—種在接觸過HIV-l的人類對象中抑制HIV-l復制的方法，所述方法包括給予所述對象結(jié)合受感染細胞釋放的HIV-lTat蛋白有效量的如權(quán)利要求16所述的組合物。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述給予步驟發(fā)生在感染之后。29.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述給予步驟以周期性間隔重復進行。30.—種單一分離的抗體或其抗體片段，其結(jié)合HIV-lTat蛋白表位內(nèi)的至少5種變體序列，其中，所述表位用下式表示R!-Asp-Pro-X7匿Leu-Y9陽Pro-R2(SEQIDNO:5)，其中，X是Arg、Lys、Ser或Asn;其中，Yq是Glu或Asp;其中，R,不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val;其中，R2不存在或是Trp-Zi2-R3;其中，Z,2不存在或是Lys或Asn;禾口其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-的全部或部分；所述單一抗體或片段結(jié)合多種毒株和亞型的HIV-lTat蛋白。31.如權(quán)利要求30所述的單一分離的抗體或其片段，其結(jié)合Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Trp-Z12-R3(SEQIDNO:6);Val-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Trp-Z12-R3(SEQIDNO:7);Val-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Trp-Z12-R3(SEQIDNO:8);Val-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Trp-Zl2-R3(SEQIDNO:9);禾口Val-Asp-ProAsn-Leu-Asp-Trp-ZirR3(SEQIDNO:10);其中，Zn不存在或是Lys或Asn;禾口其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-(SEQIDNO:27)的全部或部分。32.—種在接觸HIV-1的人類對象中抑制HIV-1復制的方法，所述方法包括給予所述對象(a)單一分離的抗體或其抗體片段，其結(jié)合HIV-1Tat蛋白表位內(nèi)的多種變體序列，其中，所述表位用下式表示RrAsp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-R2(SEQIDNO:5)，其中，X是Arg、Lys、Ser或Asn;其中，Y9是Glu或Asp;其中，Ri不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val;其中，R2不存在或是Tip-Z,2-R3;其中，Z,2不存在或是Lys或Asn;和其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-的全部或部分；禾口(b)單一分離的抗體或其抗體片段，其結(jié)合位于式Lys-X-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-(SEQIDNO:2)所示表位內(nèi)的序列，其中，X是Gly或Ala。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述抗體或片段(a)及抗體或片段(b)與藥學上可接受的載體混合成單一組合物。34.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述抗體或片段(a)及抗體或片段(b)以任何順序依次給予。35.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述抗體或片段(a)及抗體或片段(b)同時給予。36.如權(quán)利要求1所述的抗體在制備用于在人類對象中抑制HIV-1復制的藥物中的應(yīng)用。37.(a)和(b)在制備用于在人類對象中抑制HIV-l復制的藥物中的應(yīng)用，其中(a)單一分離的抗體或其抗體片段，其結(jié)合HIV-1Tat蛋白表位內(nèi)的多種變體序列，其中，所述表位用下式表示R廣Asp-Pro-X7-Leu-Y9-Pro-R2(SEQIDNO:5)，其中，X7是Arg、Lys、Ser或Asn;其中，Y9是Glu或Asp;其中，R,不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val;其中，R2不存在或是Trp-Zu-R3;其中，Z,2不存在或是Lys或Asn;和其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-的全部或部分；禾口(b)單一分離的抗體或其抗體片段，其結(jié)合位于式Lys-X-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-(SEQIDNO:2)所示表位內(nèi)的序列，其中，X是Gly或Ala。38.—種制造HIV-1Tat泛-表位l的單一分離的抗體或其抗體片段的方法，所述方法包括以下步驟選擇具有HIV-1Tat蛋白表位內(nèi)的第一變體氨基酸序列的單鏈抗體可變序列(scFv)庫，其中，所述表位用下式表示R廣Asp-Pro-X7-Leu-Y9隱Pro-R2(SEQIDNO:5)，其中，X是Arg、Lys、Ser或Asn;其中，Y9是Glu或Asp;其中，R，不存在或是Val、Glu-Val或Glu-Pro-Val;和其中，R2不存在或是Trp-Z,rR3，其中，Z,2不存在或是Lys或Asn，和其中，R3不存在或是序列-His-Pro-Gly-Ser-的全部或部分；從所述選擇的庫中獲得結(jié)合所述第一變體序列的第一scFv混合物；用所述表位內(nèi)的第二不同變體序列連續(xù)并依次篩選所述第一變體混合物，并獲得結(jié)合所述第一和所述第二變體序列的那些所得scFv的第二混合物；和任選用含有所述表位內(nèi)不同變體序列的scFv的各種連續(xù)混合物重復所述連續(xù)和依次篩選步驟，以獲得結(jié)合所述表位內(nèi)多種不同變體序列的所得scFv的混合物。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述表位內(nèi)的所述變體序列選自下組(a)SEQIDNO:5，其中，R,是Val，112不存在，X是Arg，Y9是Glu;(b)SEQIDNO:5，其中，R!是Val，R2不存在，X7是Lys，Y9是Glu;(c)SEQIDNO:5，其巾，R,是Val，112不存在，X是Ser，Y9是G1U;(d)SEQIDNO:5，其中，R'是Val，R2不存在，乂7是Asn，Y9是Glu;(e)SEQIDNO:5，其中，R,是Val，R2不存在，乂7是Arg，丫9是Asp;(f)SEQIDNO:5，其中，R,是Val，R2不存在，X是Lys，Yg是Asp;(g)SEQIDNO:5，其中，R,是Val，R2不存在，乂7是Ser，Y9是Asp;(h)SEQIDNO:5，其中，R!是Val，112不存在，乂7是Asn，Y9是Asp。40.如權(quán)利要求38所述的方法，還包括將各個所述所得scFv插入恒定區(qū)主鏈的額外步驟。41.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述主鏈是人IgGl主鏈。42.—種用權(quán)利要求38-41中任一項所述方法制備的分離抗體或抗體片段，其特征在于，所述單一抗體或抗體片段結(jié)合HIV-1的多種毒株和亞型。43.如權(quán)利要求38所述的抗體或片段，其特征在于，所述抗體或抗體片段結(jié)合至少一種￥9是Glu的所述變體序列和至少一種￥9是Asp的所述變體序列。44.如權(quán)利要求38所述的抗體或片段，其特征在于，所述抗體結(jié)合2-8種所述變體序列。45.—種測量對象中HIV-lTat水平的診斷試驗，所述試驗包括以下步驟(a)使固定有已知量HIV-1Tat蛋白的基材接觸含有未知量HIV-lTat的對象的生物樣品及權(quán)利要求1所述的單一分離的抗體或抗體片段，其中，所述抗體或抗體片段的存在量相對于結(jié)合的Tat的量不完全飽和；—(b)確定與所述基材結(jié)合的如權(quán)利要求1所述抗體或抗體片段的量；和(c)將所述量(b)與標準曲線比較，該標準曲線測量不存在所述樣品時各種已知量的所述抗體或片段與所述已知量的結(jié)合的Tat的結(jié)合，從而通過與結(jié)合到所述基材的所述抗體的量的倒數(shù)關(guān)系確定所述樣品中Tat的量。46.如權(quán)利要求45所述的試驗，其特征在于，所述單一分離的抗體或片段結(jié)合2-8種所述變體序列。全文摘要一種結(jié)合出現(xiàn)在HIV-1多種毒株和亞型中的HIV-1Tat蛋白表位內(nèi)的多種變體序列的單一分離的抗體或其抗體片段。這種“泛-表位”抗體被用于治療性和預防性組合物及治療HIV-1感染而無論是何種毒株。這種泛-表位抗體被用于基于測量生物樣品中Tat蛋白的量而檢測HIV-1水平的試驗。文檔編號C07K16/10GK101213212SQ200680004720公開日2008年7月2日申請日期2006年2月13日優(yōu)先權(quán)日2005年2月15日發(fā)明者E·索內(nèi)森,G·戈爾茨坦,L·斯特蘭德伯格,R·卡爾松,Y·斯藤伯格申請人:西蒙有限公司