專利名稱：：用于免疫抗分枝桿菌的組合物的制作方法用于免疫抗分枝桿菌的組合物本發(fā)明涉及一種用于產生宿主T細胞免疫反應的方法。該方法包括施用載體疫苗的步驟，所述載體疫苗包含非復制或復制受損的病毒載體，所述病毒載體表達分枝桿菌抗原85A基因(在本文還稱為"Ag85A"基因)的翻譯產物。本文引用的所有公布、專利和專利申請通過引用全部結合入本文。
背景技術：
：結核病是由呼吸病原體結核分沖支桿菌(Afyc<96"cter/"w7^^/rw/osz:y)引起的，每年導致2百萬人死亡，主要在發(fā)展中世界(http:〃www.who.int/gtb/publications/globrep01/index.html)?？谂e一4尋至ll"i午可的抗結核分枝桿菌的疫苗，即卡介苗(BCG)(Calmette,A.,C.Guerin.(1924)Ann.Inst.Pasteur.38:371),是牛分沖支4干菌(腳cokcfeWMw6ov/s)的減毒株，其在發(fā)展中國家通常作為單次劑量皮內施用于新生兒。許多研究的綜述表明，BCG免疫保護性抵抗兒童腦膜結核和系統(tǒng)形式的疾病。然而，針對全球主要的結核病死亡原因一一成人肺部疾病的保護效力是可變的(范圍為0-80%)(Colditz,G.A.等，(1994).JAMA271:698),并隨時間而減弱(Sterne,J.A.等，(1998)Int.J.Tuberc.LungDis.2:200)。變化的基礎是不確定的。即使如此，每年全球有80%的嬰兒接受BCG(http://www.who.int/inf-fs/en/fact104.html)。結核分枝桿菌是一種細胞內病原體，對抗其的保護效力與以下因素有關保持強烈的細胞介導的對感染的反應，所述反應涉及CD4+和CD8+T細胞；和與Thl-型細胞因子(特別是IFN-力反應的能力(Flynn，J.L.,J.Chan.(2001)Annu.Rev.Immunol.19:93)。BCG免疫誘導分泌IFN-y的T細胞，主要是CD4+T細胞表型，其與結核分枝桿菌蛋白交叉反應(LaunoisP等,(1994)InfectionandImmunity62(9):3679-87)。近期研究表明，胃腸外纟合藥的BCG未能誘導可能是保護性抵抗肺部疾病的關鍵的肺粘膜T細胞免疫反應。因此，需要開發(fā)其他的抵抗分枝桿菌疾病的疫苗。
發(fā)明內容令人驚訝的是，目前已經發(fā)現表達分枝桿菌抗原85A(Ag85A)的病毒載體在作為免疫原性組合物施用時，可以誘導人類患者的T細胞免疫反應。因此，本發(fā)明提供了一種在人類患者中誘導針對分枝桿菌抗原的T細胞免疫反應的方法，該方法包括為患者施用免疫原性組合物的步驟，所述組合物包含表達分枝桿菌Ag85A基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體。優(yōu)選地，所述免疫原性組合物是載體疫苗。該新型疫苗方法顯著提高了所述T細胞免疫反應的強度和持續(xù)時間。優(yōu)選地，所述T細胞反應是i己憶T細月包反應。85A抗原(Ag85A)(登記號CAA17868和BX842584)是Ag85復合體的成員。Ag85復合體是由結核分枝桿菌、BCG和許多其他種類的分枝桿菌分泌的蛋白質家族，包括Ag85A、Ag85B和Ag85C(Harth,G.等，(1996)Infect.Immun.64:3038-3047)?？乖?5A(Ag85A)在所有分枝桿菌種類之中是高度保守的，并且在動物和人類研究中是免疫顯性的。Ag85A(Ag85A)由基因編碼。來自結核分枝桿菌的85A抗原(Ag85A)在本文列于SEQIDNO1和SEQIDNO2)。在結核疫苗研究中，誘導加強的T細胞反應的近期策略已經利用了使用質粒、細菌或病毒載體的重組DNA技術和重組蛋白質來表達結核分枝桿菌抗原。已經顯示，在結核分枝桿菌攻擊后，使用表達Ag85A的MVA載體加強的Ag85ADNA對小鼠的免疫提供了相當于BCG的保護程度(McShane,H.等，(2002).Infect.Immun.70:1623-1626)。然而，單獨使用重組MVA載體單次或反復免疫所產生的免疫反應是弱的。對于針對分枝桿菌疾病(例如結核病)的長期保護，認為重要的是保持可持續(xù)刺激保護性免疫數十年的"記憶T細胞"。所述T淋巴細胞直接產生于分化的效應T細胞，并保持一致的休眠狀態(tài)。認為效應T細胞和記憶T細胞分布至機體的所有組織，特別是病原體可能再次相遇的上皮表面(例如，皮膚和消化道)。記憶T細胞已經顯示為異質的，并包括至少兩種具有不同遷移能力和效應功能的亞型(Reinhardt,R丄.等，(2001)Nature.410,101-105)。第一亞型細胞類似于初次應答中產生的效應細胞，因為其缺乏淋巴結-歸巢受體L-選擇蛋白和CCR7，并表達用于遷移入發(fā)炎組織的受體。當與抗原再次相遇后，這些"效應記憶T細胞"(TEM)可以快速產生IFN-y或IL-4,或釋放預先存儲的穿孔蛋白。第二亞型細胞表達L-選擇蛋白和CCR7，并缺乏直接的效應功能。這些"中央記憶T細胞"(TCM)具有低的活化閾值，并且在次級淋巴樣器官中再次刺激后，增殖并分化為效應細胞(Iezzi,G.等,(2001).J.Exp.Med.193,987-994)。本發(fā)明的發(fā)明人已經發(fā)現，當單獨用于BCG首次健康志愿受試者時，復制受損的表達Ag85A(Ag85A)的病毒載體(在這種情況下，示例為"MVA85A，，)可以誘導高水平的抗原特異性分泌干擾素y的記憶T細胞-效應記憶T細胞和中心記憶T細胞兩者。在過去的10年，已經建立了用于檢測和定量T細胞反應的新的免疫測定法。本發(fā)明的發(fā)明人利用干擾素y(IFN-y)ELISPOT測定法作為使用MVA85A的臨床實驗的主要的免疫讀數，因為IFN-y從抗原特異性T細胞的分泌是保護性對抗結核分支桿菌的最佳的可利用的相關因素。而且，ELISPOT測定法是非?？芍噩F且靈壽文的定量分泌IFN-y的抗原特異性T細胞數目的方法。本發(fā)明的發(fā)明人利用了兩種ELISPOT測定法體外(新鮮)ELISPOT測定，其中使用抗原培養(yǎng)外周血液單核細胞(PBMC)18小時，以測定CCR7-循環(huán)效應T細胞的水平；和培養(yǎng)的ELISPOT測定，其中^f吏用抗原培養(yǎng)PBMC10至14天，以檢測CCR7+中央記憶T細胞的水平(Godkin等，JI,2002)。本發(fā)明的發(fā)明人已經發(fā)現，用MVA85A的免疫誘導特異性針對抗原85A(Ag85A)的強烈的中央記憶T細胞反應，在免疫3周后，當循環(huán)效應幾乎不可4全測到T細胞反應時，依然可4企測到抗原85A。這首次證明可以通過施用表達分枝桿菌抗原的免疫原性組合物而顯著提高患者的長期中央記憶T細胞群。如本文使用的，術語"記憶T細胞"意于包括T細胞的兩個亞型一一CCR7-(效應記憶T細胞)和CCR7+(中央記憶T細胞)。該定義還包4舌II類限制的CD4記憶T細胞和I類限制的CD8記憶T細胞。優(yōu)選地，由本發(fā)明載體疫苗誘導的記憶T細胞的特征為CCR7+的細胞表面表達。這些細胞在本文被稱為中央記憶T細胞。優(yōu)選地，由本發(fā)明免疫原性組合物誘導的記憶T細胞反應是保護性T細胞反應?？梢酝ㄟ^免疫測定IFN-y分泌，優(yōu)選抗原特異性T細胞的IFN-y分泌，來檢測保護性免疫反應。優(yōu)選地，所述記憶T細胞反應是長期的，并持續(xù)至少1、2、5、10、15、20、25或更多年。最優(yōu)選地，所述保護性免疫反應是終生的。優(yōu)選地，在病毒載體中表達Ag85A基因。優(yōu)選地，在非復制或復制受損的病毒載體中表達Ag85A基因。術語"載體疫苗"是本領域公知的。在根據本發(fā)明的方法中使用的載體是非復制或復制受損的病毒載體。如本文使用的術語"非復制的"或"復制受損的，，意思是在多數正常人類細胞中不能復制至任何顯著的程度。非復制或復制受損的病毒可以天然(即，其可以作為這樣的病毒從自然界分離)或人工(例如，通過體外培養(yǎng)或通過基因操作，例如刪除對復制關鍵的基因)變成。一般存在一種或幾種可以培養(yǎng)所述病毒的細胞類型，例如用于經修飾的Ankara病毒(MVA)的CEF細胞。通常，所述病毒載體應該能夠刺激T細胞反應?？稍谶@里使用的病毒載體的實例是牛痘(vaccinia)病毒載體，例如MVA或NYVAC。優(yōu)選的病毒載體是牛痘株MVA或從MVA衍生的毒抹。牛痘載體的替代物包括其他痘病毒(poxvirus)載體，包括禽痘(avipox)載體，例如雞痘(fowlpox)或金絲雀痘(canarypox)載體。特別適合作為禽痘載體的是已知為ALVAC(可作為Kanapox商購獲得)的金絲雀痘抹，和從ALVAC衍生的毒抹，和已知為FP9的雞痘抹。其他替代物是曱病毒屬載體、腺病毒載體、皰滲病毒載體、黃病毒屬載體、逆轉錄病毒載體和流感病毒載體。例如，所述載體可以是非人類腺病毒載體。已經令人驚訝地發(fā)現，腺病毒載體的使用除了誘導非常強的CD4記憶T細胞反應外，還誘導了非常強的CD8記憶T細胞反應。同一疫苗誘導CD8和CD4兩種記憶T細胞反應，可能在預防和治療分枝桿菌疾病中都是有益的。因此，本申請的范圍內還包括使用腺病毒載體誘導針對抗原的CD8和CD4記憶T細胞反應的方法，所述腺病毒載體表達所述抗原或其免疫原性片段。由所述腺病毒載體表達的抗原優(yōu)選為上述分枝桿菌抗原，最優(yōu)選為Ag85A，但可選地，可以是任何其他適當抗原。本發(fā)明范圍內還包括:表達抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體在制備用于誘導針對所述抗原的CD8和CD4記憶T細胞反應的藥劑中的用途。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了表達分枝桿菌抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體在制備用于治療或預防分枝桿菌疾病的藥劑中的用途。所述抗原優(yōu)選為上述分枝桿菌抗原，最優(yōu)選為Ag85A，但可選地，可以是任何其他適當抗原。優(yōu)選的是，所述病毒載體不能在人類患者中導致嚴重的感染。一般通過兩種方法檢測病毒的復制1)DNA合成和2)病毒滴度(viraltitre)。更準確地i兌，如本文4吏用的并當用于痘病毒時，術語"非復制或復制受損的"表示滿足下述標準的任一或兩者的病毒1)與牛痘病毒Copenhagen抹相比，表現出在MRC-5細胞(人類細胞系)中的DNA合成減少1log(10倍)；2)與牛痘病毒Copenhagen抹相比，表現出在HELA細胞(人類細胞系)中的病毒滴度減少21og。落入該定義的痘病毒的實例為MVA、NYVAC和禽痘病毒，而在該定義之外的病毒是減毒的牛痘林M7。枝桿菌疾病的藥劑中的用途，所述免疫原性組合物包含非復制或復制受損的病毒載體，該病毒載體表達分枝桿菌Ag85A基因的翻譯產物。優(yōu)選地，所述免疫原性組合物是載體疫苗。所述免疫原性組合物和載體疫苗通過在所述患者中誘導T細胞免疫反應而起作用。根據本發(fā)明的疫苗可以是預防性的(即，防止感染)、暴露后的(即，在感染后但在疾病前治療)或治療性的(即，治療疾病)，但通常是預防性或暴露后的?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的載體疫苗治療或預防的分枝桿菌疾病包括結核病、麻風病、鳥分枝桿菌(綺co^cten'wmaWwm)感染、非結核分枝桿菌感染、布魯利(Buruli)潰瘍、牛分枝桿菌(MycoMcteWMmZwv/s)感染或疾病、副結核分枝桿菌(綺co6(2Cfe"'wm/7ara^6e/rw/a^)感染或相關疾病。其他疾病(即，非分枝桿菌疾病)包括炎性腸病、克隆氏病、自身免疫疾病、癌癥、力旁力光癌、天花和賓吳痘?？梢允褂脤ｉT的病毒載體構建體來幫助所述載體疫苗的制備和利用。本文描述的所有載體構建體形成了本發(fā)明的方面。包含這些病毒構建體的載體疫苗也作為本發(fā)明的方面被涵蓋。例如，一種或多種抗原基因可以在所述基因的羧基端或氨基端被截短。這可以具有促進克隆和構建所述載體疫苗的作用，并且可選地或另外，可以導致效力提高。用于截短的方法將是本領域技術人員已知的。實現這種截短的最簡單的方法是使用各種公知的基因工程技術，以選4奪性刪除所述抗原基因任一端的編碼核酸序列，然后將所需的編碼序列插入所述病毒載體。例如，分別使用3'和/或5'核酸外切酶策略選擇性地侵蝕所述編碼核酸的3'和/或5'端，生成所述候選蛋白的截短。優(yōu)選地，野生型基因序列被截短，這樣所表達的抗原相對于母抗原被截短了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個氨基酸。最優(yōu)選地，抗原基因是相對于野生型Ag85A抗原在羧基端被截短了15個氨基酸的Ag85A(SEQIDNO:3，SEQIDNO:4的表達產物)。適用于本發(fā)明的抗原還包括所述母抗原的片段，條件是那些片段具有與母抗原共同的抗原決定簇或表位，或者與母抗原是免疫可識別的。編碼這些片段的多核苷酸也適用于本發(fā)明的免疫原性組合物和載體疫苗。如本文使用的，術語"片段"指多肽，該多肽的氨基S菱序列與衍生該多肽的母抗原或其一個功能等同物的氨基酸序列部分但非全部相同。所述片段應該包括至少n個來自所述序列的連續(xù)氨基酸，并且根據特定的序列，n優(yōu)選為7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20或更多)。小的片段可以形成抗原決定簇。本發(fā)明的抗原基因還可以編碼所述母抗原的變異體或功能等同物。這種核酸分子可以是天然存在的變異體，例如天然存在的等位基因變異體，或者所述分子可以是未知天然存在的變異體。所述核酸分子的這種非天然存在的變異體可以通過誘變技術制備，包括應用于核酸分子、細胞或有機體的那些技術。在這點上，所述變異體是通過核苷酸置換、缺失或插入而不同于前述抗原基因序列的變異體。所述置換、缺失或插入可以涉及一個或多個核苷的變更可以生成保守或非保守的氨基酸置換、缺失或插入?？蛇x地，或除了使用基因平截以外，編碼所述抗原的基因可以包括編碼標簽多肽的核酸，這樣所述標簽多肽在翻譯后共價連接至所述抗原。優(yōu)選地，所述標簽多肽選自PK標簽、FLAG標簽、MYC標簽、多組氨酸標簽或任何可以#皮單克隆抗體4企測的標簽組成的組。其他實例將對本領域技術人員而言是清楚的。如果被使用，所述PK標簽優(yōu)選地具有Pro-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp序列。這種類型的標簽可以有助于4企測抗原表達和表達所述抗原的克隆，并可選地或另外，可以導致效力的提高?？梢远ㄎ痪幋a所述標簽多肽的核酸，這樣，在翻:^奪后，所述標簽位于所表達的抗原的羧基端或氨基端，或者可以在所表達的抗原的內部。優(yōu)選地，所述標簽位于所表達抗原的羧基端。編碼連接子序列的核香酸可以插入編碼所述標簽多肽的核酸與編碼所表達的抗原的核酸之間。優(yōu)選地，當-陂表達時，所述連接子序列包含氨基酸Gly-Ser-Ile。更優(yōu)選地，氨基酸Gly-Ser-Ile插入抗原序列氨基端和所表達的抗原的標簽之間。最優(yōu)選地，所表達的抗原是Ag85a(Ag85A),且PK標簽位于Ag85a(Ag85A)基因的羧基端。編碼抗原的基因還可以包括前導序列。所述前導序列可以影響初級轉錄物加工為mRNA、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。優(yōu)選地，所述前導序列提高所述抗原的表達和/或免疫原性。提高的免疫原性可以通過例如培養(yǎng)和體外ELISPOT測定法測定。提高的表達水平可以通過例如使用單克隆抗體檢測所產生的蛋白質的量來測定。優(yōu)選地，當與未使用所述前導序列表達的抗原相比較時，表達和/或免疫原性被提高了2倍、3倍或更多。適當的前導序列的實例是t-PA(組織纖溶酶原激活物)(MalinA.S.等，(2000)MicrobesInfect.2000Nov;2(14):1677-85)。優(yōu)選地，所述病毒載體構建體包括與TPA前導序列融合的羧基端截短了的Ag85A序列。而在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的病毒載體表達與TPA前導序列和與PK標簽序列融合的羧基端截短的Ag85A序列。優(yōu)選地，所述前導序列與所述抗原的氨基端融合，且所述標簽序列融合至所述蛋白質的內部或羧基端。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述病毒載體的構建體包括編碼羧基端截短了15個氨基酸的Ag85a(Ag85A)的多核苷酸，所述Ag85a融合至TPA序列并帶有Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp序列的羧基端PK標簽，其中氨基酸殘基Gly-Ser-Ile存在于所述Ag85A序列和所述PK標簽之間(SEQIDNO:5)。優(yōu)選地，病毒載體的表達產物具有SEQIDNO:6的氨基酸序列。已經發(fā)現，本發(fā)明的發(fā)明人注意到的保護性T細胞的作用在之前已經暴露于分枝桿菌抗原的人類患者中特別有效。異源初始-加強(prime-boost)免疫策略在動物和人類中誘導了比使用相同疫苗的同源性加強更高水平的效應T細胞反應(Schneider,J.等，(1998)Nat.Med.4,397-402,McShane,H.等，(2001)Infect.Immim.69，681-686)。對BCG的效力在(新生接種的)個體年齡到達10至15歲時逐漸消失的潛在機制還了解甚少。一個可能的假設是，BCG產生的免疫性已經消失，而所述個體變得等同于首次用于實驗的宿主，其可以使用設計成誘導初次免疫的新候選疫苗進行免疫。盡管使用BCG重復免疫沒有表現出進一步提高對抗TB的保護(參考RodriguesL等，Lancet2005)，但BCG結合入異源初次-加強方案將維持BCG的保護效應。使用表達抗原85A(Ag85A)的病毒載體加強的BCG在幾種動物模型中的免疫原性和保護效力之前已經有記載(Goonetilleke,N.R等，(2003)J.Immunol.171,1602-1609;WilliamsA等，InfectionandImmunity(73(6):3814-6),但沒有記載保護性記憶T細胞反應的誘導。因此，本發(fā)明還提供了一種用于提高人類患者中T細胞免疫反應的方法，其包括聯合載體疫苗為患者施用至少一種分枝桿菌抗原的步驟，所述載體疫苗包含表達分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體。優(yōu)選地，所述T細胞免疫反應是記憶T細胞免疫反應。本發(fā)明還提供了(a)至少一種分枝桿菌抗原和(b)包含表達分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的載體疫苗，在制備用于施用至患者以誘導T細胞免疫反應的藥劑中的用途。可以同時、順序或分開施用包含表達分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的載體疫苗和分枝桿菌抗原。例如，可以在施用所述載體疫苗之前，施用所述分枝桿菌抗原以對患者進行預免疫，或者在施用所述載體疫苗之后，施用所述分枝桿菌抗原以加強患者對所述載體疫苗的免疫反應。另外，本發(fā)明還提供了一種在人類患者中誘導T細胞免疫反應的方法，其包括給人類患者施用免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包括表達分枝桿菌Ag85A基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體，其中所述患者已經預先暴露于至少一種分枝桿菌抗原。優(yōu)選地，所述T細胞免疫反應是記憶T細胞免疫反應。本發(fā)明還提供了包含表達分枝桿菌Ag85A基因翻譯產物的非復制或中分枝桿菌疾病的藥劑中的用途，所述患者已經預先暴露于分支桿菌抗原。分枝桿菌抗原可以來自結核分枝桿菌和/或可以來自一種或多種其他分枝桿菌，例如鳥胞內分枝桿菌(M"Www-/"/race〃w/flre)、堪薩斯分枝桿菌(A/!femsos7'/)、海分枝桿菌(Mwan'm/w)和/或潰瘍分枝桿菌w/cerara)。當患者已經預先暴露于僅一種抗原時，所述抗原可以是賦予針對分枝桿菌感染的保護性免疫反應的抗原。在本發(fā)明的一個實施方案中，預先暴露于患者的抗原不是Ag85A。可選地或另外，患者可以預先暴露于一種或多種分枝桿菌本身。例如，患者預先暴露于至少一種分枝桿菌抗原可以包括預先暴露于結核分枝桿菌?？蛇x地或另外，患者預先暴露于至少一種分枝桿菌抗原可以包括預先暴露于環(huán)境分枝桿菌，例如鳥胞內分枝桿菌(Mm^wwWrace〃w/aw)、堪薩斯分枝桿菌(似.A:a"mw7)、海分枝桿菌(Mmon'wwm)和/或潰瘍分枝桿菌(Mw/ceram)。優(yōu)選地，患者潛伏感染所述分枝桿菌。例如，患者可以預先暴露于結核分枝桿菌并潛伏感染結核。當所述藥劑用于治療潛伏感染了所述分枝桿菌的患者時，所述治療優(yōu)選根除所述分枝桿菌感染。可選地或另外，預先暴露可以包括使用BCG的新生期免疫或預免疫。本發(fā)明的發(fā)明人已經發(fā)現，在先前使用BCG免疫和然后接受加強劑量的本發(fā)明載體疫苗的志愿者中，誘導了顯著較高水平的抗原特異性的分泌干擾素y的T細胞，并且在免疫后24周，所述水平比施用單獨BCG免疫的受免疫者中高5-30倍。因此，本發(fā)明的該方面提供了一種在人類患者中誘導T細胞免疫反應的方法，該方法包括以下步驟使所述患者暴露于至少一種分枝桿菌抗原，和通過施用包括免疫原性組合物的加強組合物加強所述免疫反應，所述免疫原性組合物包含表達分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體。本發(fā)明的該方面還涉及一種用于在人類患者中產生T細胞免疫反應的方法，該方法包括以下步驟i)使所述患者暴露于至少一種分枝桿菌抗原；ii)給所述患者施用至少一次劑量的包括載體疫苗的加強組合物，所述載體疫苗包含表達分枝桿菌85a(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體。在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述患者在步驟i)中僅暴露于一種分枝桿菌抗原，所述抗原是賦予保護性免疫反應的抗原，但不是Ag85A。步驟i)可以在任何年齡的患者中進行，例如，在新生期、嬰兒期、青春期或成人期過程中。優(yōu)選地，所述患者在新生期暴露于所述至少一種分枝桿菌抗原。免疫原性組合物的施用可以發(fā)生在預先暴露于至少一種分枝桿菌抗原之后的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多周或者0.25、0.5、0.75、1、5、10、15、20、25、30、35或40或更多年。優(yōu)選地，當步驟i)在患者處于嬰兒期時進行時，則步驟ii)在嬰兒期或青春期進行。當步驟ii)包括給所述患者施用超過一次劑量的加強組合物時，所述超過一次的劑量可以以短時間周期或長時間周期施用。例如，所述加強組合物劑量可以以小時、天、周、月或年的周期施用。例如，第二次加強劑量可以在下述時間施用在第一次加強劑量之后0.5小時和24小時之間，在第一次加強劑量之后1天和7天之間，在第一次加強劑量之后1周和1個月之間，在第一次加強劑量之后的l個月和6個月之間，在第一次加強劑量之后的6個月和1年之間，或者在第一次加強劑量之后的1至2年之間、2至5年之間、6至10年之間或超過10年。加上適當的修正(mwta^swwto^fo)，這些時間間隔優(yōu)選還應用于任何隨后劑量之間的周期。在本發(fā)明的第二方面中，除了誘導的抗85a(Ag85A)抗原的免疫反應以外，所述病毒載體刺激載體特異性的T細胞反應。4艮據本發(fā)明的該方面，本發(fā)明的載體疫苗的施用促進了抗病毒的T細胞免疫反應，所述病毒載體從所述病毒衍生。例如，在本發(fā)明的載體疫苗中使用MVA載體促進抗牛痘病毒的T細胞免疫反應。優(yōu)選地，該T細胞反應是保護性的T細胞反應。該類型的作用在之前已經被報道并且是明顯有利的，因為所述載體疫苗在以下兩個方面具有雙重作用首先在保護性抵抗分枝桿菌疾病中，和第二在保護性抵抗所述載體相關病毒介導的疾病中。在MVA載體的情況中，這樣的疾病是天花?？梢酝ㄟ^本發(fā)明載體疫苗治療或預防的病毒衍生疾病對于本領域^支術人員是清楚的；實例包括天花、猴痘和播散性牛痘感染。因此，本發(fā)明的該方面提供了一種在人類患者中誘導抗分枝桿菌抗原和病毒的T細胞免疫反應的方法，包括給所述人類患者施用包含表達分枝桿菌Ag85A基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的免疫原性組合物。優(yōu)選地，所述T細胞免疫反應是記憶T細胞反應。本發(fā)明的該方面還提供了包含表達分枝桿菌Ag85A基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的免疫原性組合物，在制備用于在人類患者中誘導抗分枝桿菌抗原和病毒的T細胞免疫反應的藥劑中的用途。本發(fā)明的疫苗遞送免疫有效量的至少一種抗原至患者。對于"免疫有效量"，其意思是該量以單次劑量或作為一系列劑量的部分對個體的施用，對于治療或預防是有效的。該量根據所述待治療個體的健康和身體狀況、年齡、所述個體免疫系統(tǒng)的能力、希望保護的程度、所述疫苗的組成、治療醫(yī)生對醫(yī)療情境的評價和其他相關因素而變化。預期所述量將處于可以通過常規(guī)試驗測定的相對寬的范圍內。在本發(fā)明的第三個方面，所述病毒載體可進一步表達一種或多種附加抗原基因的翻譯產物，所述抗原基因可用以誘導針對這類附加抗原的抗原特異性免疫反應。所述免疫反應可以是CD8+、CD4+和/或抗體反應。優(yōu)選地，所述一種或多種附加抗原來源于結核分枝桿菌、癡原蟲(P/^m^Z/wwW)、流感病毒、HIV、丙型肝炎病毒(T/epa"'toCWn^)、細胞巨化病毒(Qvto附ega/ov/n^)、人IL頭瘤病毒(//wwaw/qp/〃omov/ras)、癡疾、利什曼寄生蟲(leishmaniaparasites),或優(yōu)選地，4壬<可分4支桿菌亞種(mycobacteriaspp)。優(yōu)選地，所述一種或多種附加抗原基因編碼的抗原選自來自任何分枝桿菌的抗原85家族的抗原或任何由分枝桿菌亞種表達的抗原組成的組；更優(yōu)選地，一種或多種潛伏抗原，例如16kDa抗原或肝素結合血細胞凝集素(haemagglutinin)(HBHA)或ESAT6或稱為72F的融合蛋白。還預期，所述附加抗原可以是內源衍生的，這樣所誘導的免疫反應定向抵抗腫瘤。適合本發(fā)明使用的內源衍生抗原是人類熱激蛋白，和肺瘤相關抗原，例如CEA、PSA、Muc畫1、Her2neu。所述病毒載體可以凈皮設計為表達作為表位串(epitopestring)的Ag85A基因和一種或多種附加抗原基因。有利地，一串多個表位中的表位連接在一起而沒有間插序列，這樣避免不必要的核酸和/或氨基酸物質。所述表位串的生成可優(yōu)選通過使用重組DNA構建體來實現，所述重組DNA構建體編碼所述表位串的氨基酸序列，且編碼Ag85A的DNA與編碼所述附加抗原的DNA在同一閱讀框?；蛘?，Ag85A和所述附加抗原可以作為分離的多肽#:表達。本發(fā)明的該方面還提供了包含表達分枝桿菌Ag85A基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的載體疫苗，在制備通過在所述患者中誘導T細胞免疫反應用于治療或預防人類患者中分枝桿菌疾病和至少一種其他疾病的藥劑中的用途。根據本發(fā)明的該方面，所述載體疫苗可用以通過在人類患者中誘導T細胞免疫反應來保護性抵抗分枝桿菌疾病和一種或多種選自HIV、瘧疾和天花組成的組的疾病，所述T細胞免疫反應優(yōu)選記憶T細胞免疫反應。盡管本發(fā)明的載體疫苗可單獨使用，但其也可以與其他免疫或治療方案結合用于治療或預防其他疾病。因此，除提供上述載體疫苗之外，本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明載體疫苗和一種或多種衍生于致病因子的其他抗原或表位的組合物。適用于本發(fā)明的組合物的抗原和表位可以是細菌或病毒來源的。適當的抗原可以進一步被分類為蛋白質抗原、糖類抗原或糖軛合物抗原。本發(fā)明的組合物可以包括一種或多種其他抗原或表位。實例為-不同的分枝桿菌抗原或表位。-fflV抗原或表位；。-疾原蟲抗原或表位。-疾疾抗原或表4立。一來自月申炎4連J求菌(Sfreptococcws/wewmo"/ae)的灃唐4元原。-來自肺炎鏈球菌(例如，來自PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Spl25、Spl01、Spl28、Spl30和Spl33)的蛋白質抗原。-來自甲型肝炎病毒(例如滅活病毒)的抗原或表位。-來自乙型肝炎病毒(例如表面抗原和/或核心抗原)的抗原或表位。-來自丙型肝炎病毒的抗原或表位。-來自b型流感嗜血桿菌的糖抗原。-脊髓灰質炎病毒抗原或表位(例如IPV中)。-白喉疫苗或其組成性表位或抗原或類毒素。-破傷風疫苗或其組成性表位或抗原或類毒素。-麻滲、流行性腮腺炎和/或風滲抗原或表位。-流感抗原或表位，例如血細胞凝集素和/或神經氨酸酶表面蛋白。所述流感抗原可以選自廣泛流行的毒抹，例如禽流感，例如H5N1抹。-來自金黃色葡萄球菌(及，/ococc船)的#元原或表4立。-癌抗原或表4立。當使用糖抗原時，其優(yōu)選與載體軛合，以提高免疫原性。當必要時，毒性蛋白抗原可以通過化學和/或遺傳方法脫毒。糖抗原優(yōu)選為軛合物形式。用于軛合物的優(yōu)選載體蛋白是細菌毒素或類毒素，例如白喉類毒素或破傷風類毒素。當為白喉類毒素時，白喉毒素的CRM197突變體是特別優(yōu)選的載體。其他適當的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟菌(TV.we"/"g/^fe)外膜蛋白、合成肽、熱激蛋白、百日咳蛋白、細胞因子、淋巴因子、激素、生長因子、人工蛋白質，所述人工蛋白質包括多種來自各種病原體衍生抗原的人類CD4+T細胞表位，例如N19蛋白、來自流感嗜血桿菌(/"ywew加e)的蛋白D、肺炎球菌表面蛋白PspA、肺炎球菌溶血素、鐵吸收蛋白質、來自艱難梭菌(C.^爐cZ/e)的毒素A或B，等。所述組合物中的其他抗原通常每種以至少1嗎/ml的濃度存在。一舶二而言，任何給定抗原的濃度足以引發(fā)針對該抗原的免疫反應。作為在所述混合物中使用其他蛋白質抗原的替代，可以使用編碼所述抗原的核酸。因此，所述混合物的蛋白質組分可以由編碼所述蛋白質的核酸(優(yōu)選DNA,例如，以質粒形式)所取代。類似地，本發(fā)明的組合物可以包含模擬糖抗原的蛋白質，例如模擬表位或抗獨特型抗體。另外，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明載體疫苗和一種或多種抗微生物化合物的組合物。適用于本發(fā)明的組合物的抗微生物劑的實例是抗結核的化療劑，例如利福平、異煙肼、乙胺丁醇、吡。秦酰胺(pyrizinamide)等。因此，本發(fā)明提供了一種在人類患者中提高針對至少一種抗原的T細胞免疫反應的方法，該方法包括以下步驟結合至少一種其他抗原和/或抗微生物劑，給所述患者施用包含表達分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的載體疫苗。本發(fā)明還提供了(a)包含表達分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的載體疫苗和(b)至少一種其他抗原和/或微生物，在制備用于施用至人類患者以誘導T細胞免疫反應的藥劑中的用途?？梢酝瑫r、順序或分開施用包括表達分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的載體疫苗和其他抗原和/或抗微生物劑。例如，可以在施用所述抗原/抗樣i生物劑之前施用所述載體疫苗至以對患者進行預免疫，或施用所述抗原之后，施用所述載體疫苗以加強患者對所述抗原的免疫反應。所述載體疫苗和抗原/抗微生物劑優(yōu)選混合施用。本發(fā)明還提供了至少一種抗原和/或抗微生物劑在制備用于誘導患者T細胞免疫反應的藥劑中的用途，其中所述藥劑與載體疫苗一起施用，所述載體疫苗包含表達分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體。類似地，本發(fā)明提供了包含表達分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的載體疫苗在制備用于誘導患者T細胞免疫反應的藥劑中的用途，其中所述藥劑與至少一種其他抗原和/或抗微生物劑一起施用。本發(fā)明還提供了至少一種抗原和/或抗微生物劑在制備用于誘導患者T細胞免疫反應的藥劑中的用途，其中所述患者已經用包含表達分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的載體疫苗預處理。本發(fā)明還提供了包含表達分枝桿菌Ag85A(Ag85A)基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的載體疫苗在制備用于誘導患者T細胞免疫反應的藥劑中的用途，其中所述患者已經用至少一種抗原和/或抗微生物劑預處理。如上所述，本發(fā)明可用以誘導或提高多種免疫反應。特別地，本發(fā)明的目的是確定免疫抵抗涉及分枝桿菌的疾病的有效方法。所述疾病包括漢森氏病、結核病、骨髓炎、克隆氏病、麻風病、淋巴腺炎、約尼氏病。本發(fā)明的上述方面適用于多種不同的患者，包括例如兒童；患有HIV、AIDS的患者，免疫妥協/免疫抑制的患者，或經歷過器官移植、骨髓移植的患者，或患有遺傳免疫缺陷的患者。當所述疫苗用于預防用途時，所述患者可以是兒童(例如新生兒或1-5歲的兒童)、年長的兒童或青少年；當所述疫苗用于治療用途時，所述患者優(yōu)選為成年人。預期用于兒童的疫苗也可以施用至成年人，例如以評價安全性、劑量、免疫原性等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該組合物包含(l)本發(fā)明的免疫原性組合物和(2)藥學上可接受的載體。本發(fā)明提供了一種制備藥物的方法，該方法包括以下步驟(i)制備本發(fā)明的載體疫苗；和(ii)將所述免疫原性組合物與一種或多種藥學上可接受的載體混合。載體(2)可以是本身不誘導生成對接受所述組合物的患者有害的抗體并且其施用沒有異常毒性的任何物質。適當的載體可以是大的緩慢代謝的大分子，例如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和無活性的病毒顆粒。這樣的載體是本領域普通技術人員公知的。藥學上可接受載體可包括液體，例如水、鹽水、甘油和乙醇。這類載體中還可以存在輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。還可以存在穩(wěn)定劑(例如海藻糖)或允許室溫下水溶性糖玻璃形成的物質。后者包括使用混合的可溶性玻璃穩(wěn)定技術，以微球形式懸浮于全氟碳液體中。脂質體也是適當的載體。藥物載體的全面討論可獲自Gennaro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.第20版,ISBN:0683306472。本發(fā)明的藥物組合物還可預防性應用于例如下述情況希望與微生物接觸時和要防止建立感染時。例如，可在外科手術之前施用所述組合物。所述藥物組合物優(yōu)選是無菌的。其優(yōu)選是無熱原的。其優(yōu)選是緩沖的，例如介于pH6和pH8之間，通常約pH7。優(yōu)選地，所述組合物基本是與人類等滲的。本發(fā)明的組合物可通過多種不同的途徑施用。某些途徑對于某些組合物是更有利的，因為導致生成更有效的反應，或者因為較少可能誘導副作用，或者因為更容易給藥。例如，本發(fā)明使用的組合物可以通過任何幾種途徑施用，包括j旦不限于經口、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、經皮或經皮膚應用(transdermalortranscutaneousapplication)、皮下、腹月莫內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸方式。所述組合物可制備用于鼻內給藥，作為鼻腔噴霧、滴鼻劑、凝膠或粉末，注射劑(液體溶液或懸浮劑)；也可制備成在適合于在注射前溶解于或懸浮于液體載體中的固體形式。所述組合物的直接給藥一般將通過皮下、腹膜內、靜脈內或肌內注射完成，或者遞送至組織的細胞間隙。劑量治療可以是單次劑量方案或多劑量方案?，F在將通過參考下述附圖以舉例方式更詳細描述本發(fā)明的各方面和實施方案附圖簡述圖1:各免疫組中免疫后的平均IFN-yELISPOT反應單獨BCG;單獨MVA85A;BCG預免疫-MVA85A加強。(a)各組中免疫的適當時間(周)；(b)結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)反應；(c)純化的抗原85(Ag85A)蛋白反應；(d)累加的池肽反應；(e)對于三種受測蛋白的每一種，使用Mann-Whitney統(tǒng)計值比較各疫苗組在各時間點的反應。表明了統(tǒng)計學上的顯著對照；(f)在BCG免疫的個體中MVA加強之后的T細胞表位展示。所有單個肽的反應被CD4+T細胞清除所消除；圖2:免疫之前，對于單獨MVA85A研究中的4名志愿者，篩查針對結核分枝桿菌PPD、鳥分枝桿菌PPD和重組抗原85A(Ag85A)的血液培養(yǎng)的ELISPOT反應。通過代碼TXXXXXX識別每個志愿者，其中前3個X相應于試驗號，后3個X相應于志愿者號，例如T002022意思為T002是試驗號，022是志愿者號；圖3:5名志愿者(每個通過代碼TXXXX識別，其中XXXX是四位數，第l位相應于試驗號，第2、3和4位相應于志愿者號，例如T2003意思為T2是試驗號，而003是志愿者號(T2與上述圖2中的T002相同》在單獨MVA85A免疫給藥3周后，針對多池Ag85A肽(使用大寫字母標記)的培養(yǎng)的(標記為"培養(yǎng)")和體外ELISPOT反應。免疫后的反應非常高，并高于免疫前的反應。志愿者之前沒有使用BCG免疫；圖4:隨訪在第1周接受免疫的MVA-85A免疫的健康志愿者中針對MVA-Lac-z的T細胞反應，所述MVA-Lac-z用作體外ELISPOT測定中的抗原。志愿者之前沒有使用BCG免疫；圖5(a):在潛伏感染結核分枝桿菌的受試者中單獨使用MVA85A免疫后對PPD、重組抗原85A(Ag85A)和累加抗原85A(Ag85A)肽池的平均Elispot反應；圖5(b):在BCG預免疫的受試者(T005,即實-驗5;參見實施例1)和潛伏感染結核分枝桿菌的受試者(T007,即實驗7)中MVA85A誘導的累加抗原85A(Ag85A)池肽反應的比較；圖5(c):在BCG預免疫的受試者(T005)和潛伏感染結核分枝桿菌的受試者(T007)中MVA85A誘導的重組抗原85A(Ag85A)反應的比較；圖6(a):在預免疫(BCG)和加強(MVA85A)之間長(超過10年)間隔的受試者組免疫后至少1年的MVA85A誘導的免疫反應的持久性；圖6(b):在預免疫(BCG)和加強(MVA85A)之間短(一個月)間隔的受試者組免疫后至少1年的MVA85A誘導的免疫反應的持久性；圖7(a):BCG和MVA85A免疫之間的間隔與MVA85A后1周針對抗原85A(Ag85A)累加肽池的T細胞反應之間相關性的缺乏；圖7(b):BCG和MVA85A免疫之間的間隔與MVA85A后24周針對抗原85A(Ag85A)累加肽池的T細胞反應之間相關性的缺乏；圖8(a)顯示了免疫后IFN-y的平均水平；圖8(b)顯示了攻擊后IFN-y的平均水平；圖9(a)顯示了BCG預免疫的英國志愿者中針對MVA85A的體外IFN-丫Elispot反應；和圖9(b)顯示了BCG預免疫的剛比亞志愿者中針對MVA85A的體外IFN畫yElispot反應。實施例實施例1MVA85A疫苗之前已經描述了MVA85A的構建(McShane，H.等，(2002)Infect.Immun.70,1623-1626)。臨床級的MVA85由ImpfstoffwerkeDessau-Tomau生產，達到良好操作規(guī)范標準。對于臨床試驗中使用MVA85A，藥物和保健產品監(jiān)管署(MedicinesandHealthcareproductsRegulatoryAgency,London)頒發(fā)了醫(yī)師和牙醫(yī)害谷免"i正書(DoctorsandDentistsExemptionCertificate)。臨床實驗在OxfordshireResearchEthicsCommittee批準的協議下招募志愿者用于免疫研究，并且只有在獲得書面知情同意之后才可以使志愿者加入。包括的年齡范圍是18-55,并且所有受試志愿者在篩查中對HIV、HBV和HCV血清反應陰性。在免疫之前進行常規(guī)的實驗室血液學和生物化學檢查，且所有值均在正常范圍之內。隨訪全部志愿者6個月，并在規(guī)律時間點采:f又血樣。接受了MVA85A免疫的那些志愿者完成日志卡，記錄了免疫后7天的局部和全身副作用以及體溫。免疫首先的兩項研究在BCG預免疫的健康志愿者中進行，所述BCG預免疫的志愿者使用Heaf試驗確定。Heaf試驗包括將結核菌素純化蛋白衍生物(PPD)置于皮膚上，然后使用噴槍生成多個刺傷。在72小時在刺傷部位超過4個丘滲的為陽性反應。陽性皮試表明活性結核感染或之前的BCG免疫。陰性(0級)Heaf試驗(相當于結核菌素皮試為Omm)的志愿者使用BCG(使用BCGGlaxo抹單次免疫，皮內注射100n41)或MVA85A(皮內注射5xl07pfu,相隔3周2次免疫，n44)免疫。在第三項研究中，招募了之前已經用BCG免疫的志愿者(n=17)。BCG免疫和MVA85A免疫之間的平均時間為18年(范圍為0.5-38年)。Heaf試驗強度不超過11級(相當于結核菌素皮試<15mm)的志愿者加入該研究，并使用單次劑量的5xl07pfliMVA85A皮內注入BCG免疫的對側手臂的三角肌上的皮膚?？傆嫞?1名健康志愿者使用MVA85A免疫。14名首次接觸BCG的志愿者中有l(wèi)l名接受了2次免疫，相隔3周進行。其他3名志愿者接受單次免疫。全部17名BCG預免疫的志愿者接受了單次MVA85A免疫。所有志愿者完成了6個月的隨訪期，且在任何這些研究中沒有嚴重或劇烈的不良事件。免疫原性的測量用以確定疫苗免疫原性的主要免疫測量是體外IFN-yELISPOT測定法。其針對在下述時間點采取的血樣進行在結核菌素皮試之前的篩查時，和然后在免疫后的1、4、12和24周。這些測量針對新鮮的PBMC進行，使用結核菌素PPD(20jig/ml，SSI)、純化的抗原85(Ag85A)復合體(10pg/ml)和7個池的9-10條15-mer肽，所述肽有IO個氨基酸重疊(各肽在ELISPOT孔中的終濃度為10(ig/ml)。簡言之，300,000PBMC/孔的lOO(ilR10(RPMI加10%胎兒小牛血清)直接鋪板于存在抗原的ELISPOT板(MAIPS4510,Millipore)，并培養(yǎng)18小時。所有測定中使用鏈激酶(250U/ml)/鏈道酶(12.5U/ml)和植物血細胞凝集素(10嗎/ml)作為陽性對照。測定進行兩次，結果取平均。表位作圖根據免疫后的首次樣品或隨后樣品測試針對單個肽的反應。對單個肽的反應進行磁珠清除(Dynal)。通過與軛合亞鐵珠的抗CD4和CD8的單克隆抗體一起培養(yǎng)30分鐘來進行CD4+和CD8+T細胞清除，所述珠與細胞的比例為5:1，所述培養(yǎng)使用M-450(Dynal，Oslo,Norway)于200jilR10中在水上培養(yǎng)。使用磁體(Dynal)去除抗體包裹的細胞。根據未清除的、CD4+清除的和CD8+T細胞清除的組來分析樣品。細胞清除通過FACS掃描證實，并通常對于CD8+T細胞〉90Q/c),對CD4+T細胞>97%(數據未顯示)。免疫原性的分析ELISPOT數據的分析是通過從帶有抗原或肽池和細胞的孔中斑點的平均計^:扣除介質中平均^:目的斑點和單獨對照孔的細胞。忽略小于5斑點/孔的計數。如果所述計數是陰性對照孔的至少兩倍并且比陰性對照孔多至少5個斑點，則認為該孔是陽性的。對于肽池孔，累加各志愿者在各時間點的所有肽池的結果。例如，當有7個肽池時，每個含有9-10個肽，每個池測試兩次。計算每個池的兩次測試的平均值，然后減去陰性對照孔的平均值，以生成該池的結果。然后將7個單個池的結果加在一起。這將可能對于對任何10-mer重疊區(qū)反應的T細胞計數兩次，所述重疊區(qū)出現于具有相鄰肽的兩個池中。數據分析基于對數轉化的數據，使用篩查時的基線結果作為協變量進行重復測量的變量分析，以比較各組。然后使用Mann-Whitney檢驗用于組間的所有比較，使用Wilcoxon檢驗用于篩查和BCG預免疫-MVA85A加強組的24周樣品之間的配對比較。培養(yǎng)的ELISPOT方法對于培養(yǎng)的ELISPOT,使用20ng/ml的結核分支桿菌PPD("PPD-T，，)、鳥分枝桿菌PPD("PPD-A，，)或10嗎/ml重組抗原85A(Ag85A)在24孔板中刺激1x10"令藏保存的PBMC。經過+37。C、5%(:02大氣下的3天培養(yǎng)期之后，去除500pl的細胞培養(yǎng)物上清液，并由R10中5IU/ml的Lymphocult-T(Biotest,Dreieich,Germany)取代。這在第7天重復。在第9天，細胞經三次洗滌，于+37。C、5。/。C02大氣下R10中靜置過夜。在第10天，細胞經洗滌并懸浮于2ml的R10中，將50jil經培養(yǎng)的細胞(2.5x104最初鋪板的細胞)轉移至ELISPOT板的復孔，并用PPD-T(20|ig/ml)、PPD-A(20嗎/ml)和Ag85A(10pg/ml)刺激18小時。然后如之前所描述的培養(yǎng)ELISPOT板。結果使用MVA85A的免疫是安全并良好耐受的(表1)。比較了使用單獨BCG、單獨MVA85A和BCG預免疫-MVA85A加強免疫所誘導的抗原特異性T細胞反應的動力學和強度。在測定中使用PPD-T、抗原85(Ag85A)蛋白或來自抗原85(Ag85A)的重疊肽作為抗原，全部三種免疫方案都誘導了顯著的免疫反應(表2,圖1)。在PPD-T(F=3.624;P=0.037)、抗原85(Ag85A)(F=16.605;PO.OOl)和累力。的池抗原85A(Ag85A)肽組(F=39.982;PO.001)中存在顯著的疫苗主要作用。使用BCG的免疫誘導了中等水平的抗原特異性IFN-y分泌T細胞，其在免疫后4周達到峰值(表2,圖lb-d)。在BCG免疫后，針對池抗原85A(Ag85A)肽的反應是顯著弱的(圖ld)。11名志愿者中只有4名志愿者在體外ELISPOT測定中對任何7肽池反應。這些肽池反應可全部歸因于肽12、13、27和28，并完全由CD4+T細胞清除所消除。表l:使用MVA85A免疫后訴求的不良事件在首次接觸BCG和BCG預免疫的組之間，所報道的不良事件的頻率和嚴重度沒有差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>所有全身癥狀在7天內消退b范圍37.7-38.1°C;全部在24小時內自發(fā)消退在首次接觸BCG的志愿者中，在13/14個志愿者中，使用MVA85A單次免疫誘導了高水平的抗原特異性分泌IFN-y的T細胞，其在免疫后7天達到峰值(表2，圖lb-c)。經過4周，該反應已經降至僅在基線之上的水平。在第3周使用MVA85A第二次免疫，沒有發(fā)現加強作用。一個志愿者在用MVA85A免疫后沒有生成插入特異性T細胞，然而，雖然其沒有牛痘免疫既往史，但該志愿者確實生成了針對的MVA載體的特異性T細胞反應(數據未顯示)。通過進行使用MVA-lac-Z抗原的體外ELISPOT測定來進一步考察MVA85A免疫的志愿者中對MVA-lac-Z的反應。測定方法如上"免疫原性測量，，中所討論的。MVA85A免疫的健康志愿者表現了在免疫后持續(xù)達24周的強烈的抗MVAT細胞反應。與BCG免疫相比，在所有13/14反應志愿者中，MVA85A免疫誘導了強烈的針對幾個肽池的反應(表2,圖ld)。觀察到對跨越抗原85A(Ag85A)全長的大范圍的肽的反應。這些個體肽反應都完全被〔04+T細胞清除所消除(數據未顯示)。在BCG預免疫-MVA85A加強組的16/17志愿者中，免疫后1周觀察到抗原特異性T細胞的顯著增加(表2,圖1)。BCG預免疫-MVA85A加強組在免疫后1周的峰值反應顯著高于單獨BCG或MVA85A組(圖lb-e)。這些反應以比單獨BCG或MVA85A免疫后顯著更高的水平維持至少24周(圖le)。如預期的，之前已經用BCG免疫的志愿者在篩查時的基線反應高于首次接觸BCG的組。然而，在BCG預免疫-MVA85A加強組中使用MVA85A免疫后24周的反應顯著高于該組關于PPD(Wilcoxonz=-3.010,P=0.003)、抗原85(Ag85A)(Wilcoxonz=-3.516,PO.001)和累加的池肽(Wilcoxonz=-3.408,P二O.OOl)的基線計數。單獨MVA85A組(未顯示)和BCG預免疫-MVA85A加強組(圖If)中觀察到的肽反應的寬度非常相似。然而，BCG預免疫-MVA85A加強組中的反應強度顯著更高(圖le)。4吏用來自抗原85A(Ag85A)的全部66個肽測定了BCG預免疫-MVA85A加強組中12名志愿者的PBMC。這些肽的幾個被超過50。/。的受試者識別(圖lf),說明了這些肽由不同的HLAII類分子的泛宿主識別，如之前所報道的(Launois,R等，(1994)Infect.Immun.62,3679-3687)。表2.各免疫組在各時間點對PPD、抗原85(Ag85A)和累加的池肽的ELISPOT反應的算術平均值(SE)和中值(IQR)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在單獨MVA85A組中觀察到的T細胞反應強度比迄今使用的其他重組MVA強約10倍(McConkey,SJ.等，"EnhancedT-cellimmunogenicityofplasmidDNAvaccinesboostedbyrecombinantmodifiedvacciniavirusAnkarainhumans，，，Nat.Med.,9，729-735(2003》；Mwau，M.等，"Ahumanimmunodeficiencyvirus1(HIV-1)cladeAvaccineinclinicaltrials:stimulationofHIV-specificT-cellresponsesbyDNAandrecombinantmodifiedvacciniavirusAnkara(MVA)vaccinesinhumans",J.Gen.Virol"85,911-919(2004))。表達來自熱帶疾原蟲(P/fl/c—謂)的抗原的重組MVA在免疫后7天誘導了90SFC/106PBMC的平均累加的肽反應(McConkey,SJ.等，(2003)Nat.Med.9,729-735)。相比之下，在MVA85A免疫后7天觀察到對1365SFC/106PBMC7的累加肽的平均反應(表2)。對此的一個解釋是這些志愿者具有一些預先存在的抗分枝桿菌免疫性，其經由MVA85A的免疫而被加強。我們使用了培養(yǎng)的而非體外ELISPOT測定法，來進一步對其考察。已經顯示培養(yǎng)的ELISPOT測定法測量中央記憶型T細胞而非由體外ELISPOT測量的活化效應T細胞(Reece,W.H.等，(2004)NatMed.10,406-410,Godkin，AJ.等，(2002)J.Immunol.169,2210-2214)。針對來自單獨MVA85A組的4名志愿者的預免疫篩查PBMC進行培養(yǎng)的IFN-yELISPOT測定。細胞用結核分枝桿菌PPD、鳥分枝桿菌PPD和重組抗原85A(Ag85A)進行培養(yǎng)。全部4名志愿者對鳥分枝桿菌PPD反應，2/4對結核分枝桿菌PPD反應，而2/4對重組抗原85A(Ag85A)反應(圖2)。根據篩查體外ELISPOT,這些志愿者沒有一個對結核分枝桿菌PPD或純化的抗原85(Ag85A)具有任何基線反應。為進一步考察MVA85A免疫后的記憶T細胞反應的誘導，對免疫后3周的PBMC進行體外和培養(yǎng)的ELISPOT測定。細胞使用結核分枝桿菌PPD、鳥分枝桿菌PPD和重組抗原85A(Ag85A)進行培養(yǎng)。在第3周的體外反應是非常低或檢測不到的，然而，根據培養(yǎng)的ELISPOT,在全部5名受試志愿者中存在強烈的反應，這表明經由特異性針對抗原85A(Ag85A)的中央記憶T細胞的免疫的誘導(圖3)。實施例2潛伏感染結核分枝桿菌的受試者的安全性和免疫原性數據使用MVA85A對9名潛伏感染結核分枝桿菌(MA)的健康成人進行免疫。在12個月的時期內，以免疫后的規(guī)律的時間間隔測量每名受試者中的血漿炎性標志物。在免疫前和免疫后10周，在每名受試者中進行肺部高分辨率CT掃描。進行這些測試以檢測肺炎的任何亞臨床病征。圖5a顯示了從所述9名潛伏感染的志愿者獲得的體外Elispot的結果。該組中MVA85A的安全性與在實施例1中描述的先期試-瞼中所觀察到的相同。沒有4企測到局部或全身副作用的增加，也沒有^r測到任何肺炎病征。炎性標志物在免疫后沒有改變，并且通過免疫后CT掃描沒有^r測到肺炎。作為比較，17名在0.5至37年前已經接受過BCG注射的健康成人-使用MVA85A免疫進^"加強。實施例l描述了結果。在潛伏感染組(試驗7,"T007")中觀察到的免疫后免疫反應的強度類似于在BCG預免疫組(試驗5，"T005")中觀察到的免疫反應。結果顯示于圖5b和5c。該數據是顯著的，因為鑒于遍及發(fā)展中國家的潛伏感染的流行，重要的是任何新型的TB疫苗在潛伏感染的受試者中是安全的。另夕卜，加強的免疫原性支持該疫苗作為暴露后疫苗施用至潛伏感染的人的應用，目的為消除這種潛伏感染。免^X應的持續(xù)時間BCG預免疫的志愿者在MVA85A加強后的體外ELISPOT反應在免疫后持續(xù)至少l年，且預免疫(BCG)和加強(MVA85A)之間既有短間隔(1個月)也有長間隔(超過10年)。圖6中顯示了在BCG后超過10年使用MVA85A免疫的12名志愿者以及在BCG后1個月使用MVA85A免疫的IO名志愿者的長期隨訪數據。來自兩組志愿者的數據顯示，免疫后1年時的免疫反應的持久性與免疫后6個月時觀察到的持久性處于相同的強度。疫苗誘導的免疫反應的持久性說明記憶反應的誘導。除非已經誘導了記憶反應，否則在使用非復制的疫苗免疫一年后預期不會看到持久的疫苗i秀導的反應。預免疫-加強間隔與免^應水平之間的相關性圖3中顯示的數據表明，在MVA85A加強免疫后看到的BCG誘導的免疫反應的加強不依賴于BCG預免疫和MVA85A加強之間的間隔。短(1個月)和長(超過10年)的加強間隔觀察到相等的加強。預免疫(BCG)和加強(MVA85A)免疫的間隔與峰(1周)或平高線(6個月)MVA85A誘導的免疫反應之間沒有相關性(圖7)。因此，在BCG免疫后不久(例如，在發(fā)展中國家的嬰兒期)或者在更后的時間點(例如，在青春期)，加強分枝桿菌免疫是同樣可行的。既在嬰兒期加強又在青春期加強是效力試驗的可能選擇，并且是加強TB疫苗的潛在適應癥。BCG預免疫-MVA85A加強在獼猴中的免疫原性和保護效力在免疫原性和攻擊實驗中，使用以下物質對獼猴(6/組)進行免疫i)單獨BCG,ii)BCG并然后在9周后用MVA85A加強，或者iii)鹽水(對照組)。所有動物在BCG免疫(或者給對照組鹽水免疫)后18周經氣管內攻擊，然后在安樂死之前被跟隨16周。免疫原性結果顯示于圖8中。圖8a顯示了該攻擊實驗中的全部3個組免疫后的IFN-y平均水平(如3天淋巴細胞刺激試—險所測量的)。而在BCG組和BCG預免疫-MVA85A組中，對PPD反應中的IFN-y水平似乎是相當的，而對Ag85A的反應在BCG預免疫-MVA85A加強組中明顯較高。因此，存在單獨BCG組(組i)中沒有只見察到的MVA85A免疫(組ii)后Ag85A特異性IFN葉分泌的顯著升高(圖8a)。圖8b顯示了該攻擊實驗中全部3組攻擊后的IFN-y平均水平(如3天淋巴細胞刺激試驗所測量的)。在使用結核分枝桿菌攻擊后，BCG-MVA85A組(組ii)比單獨BCG組(組i)具有顯著較高的Ag85A特異性反應。同時，與鹽水組相比較，BCG組和BCG-MVA85A組中的ESAT6/CFP10反應(早期分泌的抗原靶蛋白/培養(yǎng)物濾出液蛋白10)較低，所述ESAT6/CFP10反應是結核分支桿菌特異性免疫反應(強度與細菌免疫量有關)。這兩組之間的PPD反應是相當的。ESAT6/CFP10結果是重要的(最底下的小圖)，因為這些抗原是TB特異性的，并且針對這些抗原的免疫反應的水平與細菌免疫量相關(即，細菌免疫量越高(鹽水組)，則對ESAT6和CFP10的免疫反應越高)。與鹽水組相比，BCG組和BCG-MVA85A組中較低水平的ESAT6/CFP10反應意味著疫苗的保護效力。在尸4全時，在BCG-MVA85A組中觀察到比單獨BCG組中少很多的病理改變。這兩組中細菌免疫量的減少為BCG-MVA85A組，0.97;單獨BCG組，0.42。獼猴是良好的人類疾病模型，盡管動物的數目小，但這一充滿前景的保護效力的提高表明，預期在人類中具有相似的效力結果。南非成人中ii期研究的安全性和免疫原性數據已經在南非的西開普開始了II期安全性和免疫原性研究。該試驗是在成人中進行，且目標是24名受試者。該研究排除了潛伏感染的受試者。目前，已經對12名受試者進行了免疫。根據其免疫后1周的Elispot測定，全部12名受試者具有顯著的MVA85A誘導的免疫反應。目前的安全性特征與在英國和岡比亞研究中觀察到的安全性特征相同。圖l和圖9a顯示了英國研究的結果，圖9b顯示了岡比亞研究的結果。總計，在岡比亞對11名BCG首次接觸志愿者和10名BCG預免疫志愿者進行了免疫。BCG首次接觸組的免疫原性結果(圖9b)類似于在英國的BCG預免疫組的免疫原性結果(圖lb、lc、ld)，這是因為其在隨訪期間保持在基線之上。這可能反映了較大程度的經由處于基線的環(huán)境分枝桿菌的預免疫，還反映了正在暴露于維持所述反應的環(huán)境分枝桿菌。在岡比亞的BCG首次接觸組和BCG預處理組之間沒有顯著差異，其如上解釋為該組中較大程度的環(huán)境預處理。相反，在英國，BCG首次接觸組的免疫原性結果在隨訪過程中返回至基線(圖9a和圖lb、lc和ld)，而BCG預處理組在隨訪期間保持在基線之上(圖lb、lc和ld)。貫穿BCG文獻，在不同國家和洲有許多保護效力廣泛差異性的實例。在英國、西非和南非，MVA85A—致的安全性和免疫原性特征是非常顯著的。小鼠中表達抗原85A(Ag85A)的腺病毒的免疫原性表達抗原85A(Ag85A)的重組腺病毒(人類株5，刪除了El和E3)已顯示在小鼠中單獨施用時誘導了強烈的免疫反應(CD4反應c800斑/百萬脾細胞；CD8反應c1200斑/百萬脾細胞)。當施用至之前已經接受過BCG的小鼠時，該表達抗原85A(Ag85A)的腺病毒刺激了甚至更強的反應(CD4反應c1400斑/百萬脾細胞；CD8反應c2500斑/百萬脾細胞)。因此，值得注意地，顯示該腺病毒載體除了誘導非常強的CD4T細胞反應外，還誘導非常強的CD8T細胞反應，并且經由相同疫苗對這些反應的誘導可能在預防和治療分枝桿菌疾病中都有益處。之前，腺病毒載體已經被視為誘導CD8T細胞反應的良好方法，但在這里，表明CD4和CD8反應都被強有力地誘導了。該數據表明腺病毒載體可以是BCG預免疫的T細胞反應的強有力加強劑。以上只是通過舉例的方式描述了本發(fā)明。應該理解，可以在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，作出細節(jié)的修改。AG85A特異序列SEQIDNO:1(AG85A多肽序列)GAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGASEQIDNO:2(AG85A核苦,列)atgcagcttgttgacagggttcgtggcgccgtcacgggtatgtcgcgtcgactcgtggtcggggccgtcggcgcggccctagtgtcgggtctggtcggcgccgtcggtggcacgcccgccctgtacc'atcaacaccccggcgttcgagtggtacgaccagtcgggcctgtcggtggtcatgccgggttgccagacttacaagtgggagaccttcctgaccagcgagctgccggggtggctggcttcttcggcgctgacgctggcgatctatcacccccagcagttcgtctacgcgggagcgstgtcgggcctgttggscccctcccsggcgatgggtcccaccctgatcggcctggcgatgggtgacgctggcggctacaaggcctccgacatgtggggcccgsaggaggacacccgcgtctgggtgtsctgcggcsacggcaagccgtcggatctgggtggcaacMccacagctgggagtactggggcgcgcagctcaacgctatgaagcccgacctgcaacgggcsctgggtgccacgcccsacsccgggcccgcgccccngggcgcctagSEQIDNO:3(15#^酸AG85A平截多肽序列)GAQ，AMKPDLQRSEQIDNO:4(15氨基酸AG85A平截核苷酸序列)atgcagcttgttgacagggttcgtggcgccgtcacgggtatgtcgcgtcgactcgtggtcgg:acctgctcgacggcctgcgcgcgcaggacgacttcagcggctgggacatcaacaccccggcgttcgagtggtacgaccagtcgggcctgtcggtggtcatgccggtgggtggccagtcaagcttctactccgactggtaccagcccgcctgcggcasggccggttgccagacttacaagtgggagaccttcctgactcggtctttcgatggctgcttcttcggcgctgacgctggcgatctatcacccccagcagttccggcctggcgatgggtgacgctggcggctacaaggcctccgacstgtggggcccgaaggaggcgcgtctgggtgtactgcggcaacggcaagccgtcggatctgggtggcaacaacctgccggcgtggcggccacascggcgtgttcgacttcccggacagcggtacgcacagctgggagtactggggcgcgcsgctcaacgctstgsagcccgacctgcaacggSEQIDNO:51176核苦酸序列的插入片段如下(上例中表達的序列，下劃線的Ag85A編碼序列)tctgtacgggcccgtacggtaccgagctcggatctgcgcgccgccaccATGGATGCAGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGTGGATCCATTCCAAACCCTTTGCTGGGATTGGACtprctgcagatatccatcacactgSEQIDNO:6MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQE工HARFRRGSMQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGANSPALYWGAiQLNAMKPDIjQRGSIPNPLLGLD權利要求1.一種在人類患者中誘導針對至少一種抗原的T細胞免疫反應的方法，該方法包括給所述患者施用免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包含表達分枝桿菌Ag85A基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述免疫原性組合物是載體疫苗。3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述T細胞免疫反應是CCR7+反應。4.根據權利要求1至3任一項所述的方法，其中所述非復制或復制受損的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、皰滲病毒、曱病毒屬、黃病毒屬和流感病毒組成的組。5.根據權利要求4所述的方法，其中所述非復制的病毒載體是MVA。6.根據權利要求4所述的方法，其中所述非復制的病毒載體是腺病毒載體。7.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達帶有PK羧基端標簽的Ag85A。8.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達帶有TPA前導序列的Ag85A。9.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達帶有截短的羧基端的Ag85A。10.才艮據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述病毒載體表達SEQIDNO:5的翻i奪產物。11.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述病毒載體進一步表達來自分枝桿菌的至少一種附加抗原基因的翻譯產物。12.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述免疫原性組合物與至少一種附加抗原和/或抗微生物劑一起施用。13.根據權利要求12所述的方法，其中所述至少一種附加抗原和/或抗微生物劑同時、分開或順序施用。14.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述反應是抗原特異性免疫反應。15.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述反應是治療性的或預防性的。16.免疫原性組合物在制備用于通過在患者中誘導T細胞免疫反應而治療或預防所述患者分枝桿菌疾病的藥劑中的用途，所述免疫原性組合物包含表達分枝桿菌Ag85A基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體。17.免疫原性組合物在制備用于通過在患者中誘導T細胞免疫反應而治療或預防所述患者分枝桿菌疾病和至少一種其他疾病的藥劑中的用途，所述免疫原性組合物包含表達分枝桿菌Ag85A基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體和至少一種附加抗原基因的翻譯產物。18.根據權利要求16或17所述的用途，其中所述免疫原性組合物進一步誘導針對衍生所述病毒載體的病毒的T細胞免疫反應。19.包含表達分枝桿菌Ag85A基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的免疫原性組合物在制備用于通過誘導T細胞免疫反應而治療或預防患者至少一種疾病的藥劑中的用途，其中所述藥劑與至少一種附加抗原一起施用。20.抗原在制備用于通過誘導T細胞免疫反應而治療患者疾病的藥劑中的用途，其中所述藥劑與包含表達分枝桿菌Ag85A基因翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體的免疫原性組合物一起施用。21.根據權利要求1至15任一項所述的方法或者權利要求16至20任一項所述的用途，其中所述T細胞反應保護性抵抗疾病，所述疾病選自結核病、麻風病、鳥分枝桿菌感染、非結核分枝桿菌感染、布魯利潰瘍、牛分枝桿菌感染或疾病、天花、猴痘、副結核分枝桿菌感染、炎性腸病、克隆氏病、自身免疫疾病、癌癥和膀胱癌組成的組。22.根據權利要求1至15任一項所述的方法或者權利要求16至20任一項所述的用途，其中所述患者選自兒童，患有HIV感染或AIDS的患者，免疫妥協的患者，或經歷過器官移植的患者組成的組。23.根據權利要求1至15任一項所述的方法或者權利要求16至20任一項所述的用途，其中所述患者之前已經暴露于分枝桿菌。24.根據權利要求23所述的方法，其中所述患者之前已經暴露于結核分枝桿菌。25.根據權利要求23或24所述的方法，其中所述患者潛伏感染了所述分枝桿菌。26.根據權利要求1至15任一項所述的方法或者權利要求16至20任一項所述的用途，其中所述患者已經使用BCG預處理。27.—種載體疫苗，其包含表達核苷酸序列SEQIDNO:4的翻譯產物的非復制或復制受損的病毒載體。28.根據權利要求27所述的載體疫苗，其中所述病毒載體表達另外包括PK羧基端標簽的核苦酸序列SEQIDNO:4的翻譯產物。29.根據權利要求27或28所述的載體疫苗，其中所述病毒載體表達另外包括TPA前導序列的核苷S吏序列SEQIDNO:4的翻譯產物。30.根據權利要求29所述的載體疫苗，其中所述病毒載體表達核苷酸序列SEQIDNO:5的翻譯產物。31.根據權利要求27至30任一項所述的載體疫苗，其中所述非復制或復制受損的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、皰滲病毒、甲病毒屬、黃病毒屬和流感病毒組成的組。32.根據權利要求31所述的載體疫苗，其中所述非復制的病毒載體是MVA。33.根據權利要求31所述的載體疫苗，其中所述非復制的病毒載體是腺病毒載體。34.根據權利要求27至33任一項所述的載體疫苗，其中所述病毒載體還表達來自分枝桿菌的至少一種附加抗原基因的翻譯產物。35.—種誘導針對抗原的CD8和CD4記憶T細胞反應的方法，其使用表達抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體。36.表達抗原或其免疫原性片段的腺病毒載體在制備用于誘導針對所述抗原的CD8和CD4記憶T細胞反應的藥劑中的用途。37.根據權利要求36所述的用途，其中所述藥劑用于治療或預防分枝桿菌疾病。38.根據權利要求35所述的方法或根據權利要求36或37所述的用途，其中所述抗原是Ag85A。全文摘要一種用于產生宿主T細胞免疫反應的方法，該方法包括施用包含非復制或復制受損的病毒載體的載體疫苗，所述病毒載體表達分枝桿菌抗原85A基因的翻譯產物。還提供了載體疫苗及其用途。還提供了使用腺病毒載體誘導針對抗原的CD8和CD4記憶T細胞反應的方法，所述腺病毒載體表達抗原或其免疫原性片段。文檔編號C07K14/35GK101115500SQ200680004501公開日2008年1月30日申請日期2006年1月5日優(yōu)先權日2005年1月5日發(fā)明者安薩·A·帕坦,海倫·麥克什,艾德里安·希爾,莎拉·C·吉爾伯特申請人:埃西斯創(chuàng)新有限公司