專利名稱：：胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及表達(dá)a-1，3/4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(a1,3/4-fucosyltransferase,FUT3)基因的胃癌的基因治療藥物，具體涉及耙向胃癌FUT3基因的miRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途，屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：FUT3基因編碼的FUT3酶是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferase，F(xiàn)UTs)家族成員之一，因其既有。1，4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性，又有(！1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性，所以又稱a1,3/4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。它不僅參與路易斯(Lewis)血型抗原I型(包括LewisA和LewisB)和II型(包括LewisX和、LewisY)的生物合成，而且也與唾液酸化的Lewis抗原(SialylLewisA和SialylLewisX，即SLea和SLex)的合成密切相關(guān)。SLea和SLex在許多腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)量異常升高，是血管內(nèi)皮細(xì)胞(E)表面或血小板(P)表面選凝素(selectin)的配體；SLea和SLex抗原作為腫瘤相關(guān)抗原，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞上的表達(dá)水平還與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。大多數(shù)腫瘤患者血清和腫瘤組織中巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活力大大增強(qiáng)，特別表現(xiàn)在肺癌、胃癌、卵巢癌中。腫瘤患者血清中巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活力水平與癌癥的進(jìn)程及病灶的大小有關(guān)。近年來，有學(xué)者致力于改變巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的活性進(jìn)而影響Lewis抗原的表達(dá)，去影響惡性腫瘤細(xì)胞的黏附等惡性行為的研究。通過應(yīng)用分化誘導(dǎo)劑改變肝癌細(xì)胞中FUT7的表達(dá)，下調(diào)SLeX的表達(dá)，從而抑制其轉(zhuǎn)移潛能(LiuF，QiHL,ZhangY，etal.Transfectionofthec-erbB2/neugeneupregulatestheexpressionofsialyLewisX，alpha1,3-fucosyltransferaseVD,andmetastaticpotentialinahumanh印atocarcinomacellline.EurJBiochem，2001Jun;268(12):3501-12)。Weston等通過針對(duì)FUT3的反義核酸來阻斷al,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的黏附和遷移(WestonBW，HillerKM,MaybenJP,ManousosGA,BendtKM，LiuR，CusackJCJr.ExpressionofHumanalpha(l，3)-fucosyltransferaseantisensesequencesinhibitsselectin-mediatedadhesionandlivermetastasisofcoloncarcinomacells.CancerRes.1999May1;59(9):2127-35.)。美國Scripps研究所的華裔科學(xué)家王啟輝(Chi-HueyWong),首先應(yīng)用3種不同的糖基轉(zhuǎn)移酶，酶促合成了SLeX，為抗腫瘤藥物的研制提供了新途徑。以上研究提示，抑制Lewis基因表達(dá)的藥物和方法將會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖，從而達(dá)到抗腫瘤治療的目的?；蚍忾]技術(shù)是基因治療研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一，它包括反義寡核苷酸、反義RNA、核酶、RNA干擾等。miRNA是新興的RNAi技術(shù)，是含量豐富的非編碼小RNA(21-25個(gè)核苷酸)，由Dicer酶切割內(nèi)源性表達(dá)的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)謂A(hairpinRNA,hpRNA)形成。miRNA可以與蛋白因子形成RISC蛋白復(fù)合物，可以結(jié)合并切割特異的m認(rèn)A而引發(fā)RNA沉默。miRNA是一項(xiàng)快速、高效和便于操作的使靶基因失活的新技術(shù)，為將來可控地打開或關(guān)閉某一特定基因奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)還為疾病治療開辟了新途徑。raiRNA是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性的非編碼的單鏈RNA，其長度為21-25nt。在進(jìn)化上具有高度的保守性。這些小的調(diào)控RNA通過兩種作用方式發(fā)揮其生物功能當(dāng)它們與靶mRNA完全或幾乎完全配對(duì)時(shí)，可以引起靶mRNA的剪切反應(yīng)即RNA干擾作用；在不完全配對(duì)的時(shí)候，可以引起靶mRNA的翻譯抑制，在基因調(diào)控中扮演著重要的角色。更重要的是，由于miRNA可以通過含有polll啟動(dòng)子的載體表達(dá)，因而可以具有高度組織特異性，這是其較之siRNA優(yōu)越之處。在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄miRNA,使之表達(dá)可以更好地發(fā)揮特定miRNA的作用。正是基于這一想法，ZENG等(ZengY,CaiX，CullenBR.UseofRNApolymeraseIItotranscribeartificialmicroRNAs[J].MethodsEnzymol,2005，392:371-380.)根據(jù)miRNA230前體設(shè)計(jì)合成靶向熒光素酶(Luc)的miRNA，并使其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特異性表達(dá)。在此基礎(chǔ)上Frank等(StegmeierF,HuG，RicklesRJ，etal.AlentiviralmicroRNAbasedsystemforsingle2copypolymerase112regulatedRNAinterferenceinmammaliancells[J].ProcNatlAcadSciUSA，2005，102(37):13212-13217)構(gòu)建了能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)miRNA的pPRIME載體，用此表達(dá)載體將靶向Rb的miRNA導(dǎo)入細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Rb的mRNA和蛋白表達(dá)均受到抑制。這些研究為miRNA在基因治療中的應(yīng)用提供了良好基礎(chǔ)。目前miRNA已經(jīng)成為重要的實(shí)驗(yàn)工具。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表達(dá)載體構(gòu)建、篩選及其用途的方法。本發(fā)明以利用RNA干涉技術(shù)為主，針對(duì)FUT3基因的不同靶序列，構(gòu)建了兩個(gè)能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)miRNA的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-FUT3_miRl/2，以下簡稱FUT3-miRNA1/2。其示意圖譜見圖l，能高效的特異性的抑制FUT3基因表達(dá)，可用于制備治療FUT3基因調(diào)控的Lewis抗原相關(guān)性胃癌的基因藥物。本發(fā)明的技術(shù)方案如下耙向FUT3基因的miRNAs表達(dá)載體，其特征是，以pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector為載體，針對(duì)FUT3基因編碼區(qū)中、上游的兩段序列，在可較高表達(dá)Lewis血型抗原的的胃腺癌細(xì)胞系KATO-III中發(fā)揮RNA干擾作用。這兩段FUT3特異性RNA干涉靶序列分別為①5'—AACTGCAGCAGGAATCCAGGT—3，，起始于1660位；②5'—AACCCATACAGTGAATCCATT—3'，起始于596位，是用于由FUT3基因調(diào)控的路易斯(Lewis)抗原相關(guān)性胃癌的治療性物質(zhì)，由以下方法制得(1)RNA干涉耙序列的選擇及插入序列的設(shè)計(jì)與合成選擇FUT3基因編碼區(qū)的兩段序列①5'—AACTGCAGCAGGAATCCAGGT—3，、②5'_AACCCATACAGTGAATCCATT—3'，設(shè)計(jì)并分別體外合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸序列，序列如下①RJT3寡核苷酸序列1:正義鏈5'-tgctGACCTGGATTCCTGCTGCAGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACTGCAGGGAATCCAGGT-3'反義鏈5'-cctgACCTGGATTCCCTGCAGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACTGCAGCAGGAATCCAGGTC-3'②FUT3寡核苷酸序列2:正義鏈反義鏈5'-cctgAATGGATTCACTATGGGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACCCATACAGTGAATCCATTC-3'(2)合成的寡核苷酸分別與線性載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-raiR脂AiExpressionVector連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取。首先將步驟(1)合成的兩段寡核苷酸等量混勻，95'C作用4分鐘后慢慢冷卻至室溫，然后將結(jié)合的雙鏈寡核苷酸與線性化的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector質(zhì)粒載體連接，最后轉(zhuǎn)化到0neShotTOP10大腸桿菌，經(jīng)壯觀霉素(Spectinomycin)篩選，并用x-gal和IPTG(異丙基硫代一B—D一半乳糖苷)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選耐藥菌落大量培養(yǎng)。用質(zhì)粒提試劑盒提取純化質(zhì)粒DNA;質(zhì)粒的提取純化按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。(3)質(zhì)粒的鑒定將步驟(2)提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用引物EmGFPForwardsequencingprimer禾口miRNAreversesequencingprimer進(jìn)行PCR鑒定，紫外分光光度計(jì)分析測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，送聯(lián)合基因上海聯(lián)眾基因研究院進(jìn)行插入片斷測(cè)序。本發(fā)明的胃癌靶向FUT3基因的有效miRNAs表達(dá)載體在制備治療分泌FUT3酶的胃癌的基因藥物中的應(yīng)用。為了對(duì)FUT3基因miRNAs表達(dá)質(zhì)粒對(duì)FUT3基因的抑制效果及對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行鑒定，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取總RNA，免疫細(xì)胞化學(xué)法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)法測(cè)定抑制FUT3后對(duì)Lewis抗原水平表達(dá)的影響，RT—PCR法測(cè)定對(duì)FUT3基因表達(dá)的抑制作用，MTT法檢測(cè)抑制FUT3基因后對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響及AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)抑制FUT3基因后腫瘤細(xì)胞凋亡情況。本發(fā)明的針對(duì)FUT3基因構(gòu)建的2種miRNAs表達(dá)質(zhì)粒是可用于FUT3調(diào)控Lewis抗原相關(guān)胃癌的治療物質(zhì)，其中FUT3-miRNA2抑制胃癌細(xì)胞生長并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效率較高，可用于進(jìn)一步研究FUT3基因的功能及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行基因治療研究。本發(fā)明的胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表達(dá)載體的制備方法和生物學(xué)活性的鑒定主要包括如下內(nèi)容一、質(zhì)粒的制備，包括RNA干涉靶序列的選擇及插入模板的設(shè)計(jì)與合成，將上述合成的寡核苷酸分別與線性載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒DNA的提取，質(zhì)粒的鑒定。二、質(zhì)粒生物學(xué)活性的鑒定，包括質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率的計(jì)算、RT—PCR檢測(cè)FUT3基因的表達(dá)、免疫細(xì)胞化學(xué)法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法測(cè)定抑制FUT3后對(duì)Lewis抗原水平表達(dá)的影響、MTT法檢測(cè)抑制FUT3基因后腫瘤細(xì)胞生長情況及A皿exinV/PI雙染色法檢測(cè)抑制FUT3基因后腫瘤細(xì)胞凋亡情況。下面詳細(xì)說明本發(fā)明制備方法中各步驟的具體操作方法1.RNA干涉耙序列的選擇及插入模板的設(shè)計(jì)與合成沿mRNA序列尋找連續(xù)兩個(gè)AA及后面的19個(gè)核苷酸，通過同源性比較，選擇與其他任何基因無同源性的序列即作為潛在的niiRNA耙位點(diǎn)(耙位點(diǎn)不含有3個(gè)以上的相同序列，GC含量在30°/一50%左右)。按照載體試劑盒說明，針對(duì)FUT3基因的編碼序列，為找到具有最佳沉默效果的靶位點(diǎn)，選取兩段靶序列，分別從中上游選擇2個(gè)符合條件的靶位點(diǎn)，分別為①FUT3-11660AACTGCAGCAGGAATCCAGGT②FUT3-2596AACCCATACAGTGAATCCATT設(shè)計(jì)并合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸序列，每一正向單鏈寡核苷酸內(nèi)，21nt的寡核苷酸以正反向組合，以GTTTTGGCCACTGACTGAC為發(fā)夾環(huán)序列間隔，使寡核苷酸形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，每對(duì)寡核苷酸的核心序列反向互補(bǔ)；每對(duì)寡核苷酸兩端分別帶有與線性化載體(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRR脂ExpressionVector)上的miRflankingregion相互補(bǔ)的位點(diǎn)，這是連接線性化載體所必需的。按以上所述，兩個(gè)靶序列設(shè)計(jì)后的寡核苷酸序列如前所述。2.合成的寡核苷酸分別與線性載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取。首先將合成的兩段寡核苷酸等量混勻，95'C作用4分鐘后慢慢冷卻至室溫，然后將結(jié)合的雙鏈寡核苷酸與線性化的pcDNAiM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector質(zhì)粒載體連接，最后轉(zhuǎn)化到OneShotTOP10大腸桿菌，經(jīng)壯觀霉素(Spectinomycin)篩選，并用x-gal和IPTG(異丙基硫代—B—D—半乳糖苷)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選耐藥菌落大量培養(yǎng)。質(zhì)粒的提取純化按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。連接反應(yīng)體系雙寡核苷酸(實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組，10nM)4ylpcDNA6.2-GW/EmGFP-miRVector2ii15Xligationbuffer4p_lDNase/RNase-freewater9jxlT4DNA連接酶(lu/ul)_LLl總體系20y13.質(zhì)粒的鑒定質(zhì)粒DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用引物EmGFPForwardsequencingprimer和miRNAreversesequencingprimer進(jìn)行PCR鑒定，紫外分光光度計(jì)分析測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，送聯(lián)合基因上海聯(lián)眾基因研究院進(jìn)行插入片斷測(cè)序。上述方法所構(gòu)建的質(zhì)粒生物學(xué)活性鑒定方法如下1.胃癌細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染KAT0-m細(xì)胞培養(yǎng)在含10^胎牛血清的DMEM中，置于37。C，5%0)2培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將腫瘤細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板上，每孔約5X105個(gè)細(xì)胞，使每孔細(xì)胞飽和度在轉(zhuǎn)染前達(dá)到90%以上，鋪板時(shí)不使用含抗生素的培養(yǎng)液。種板后24小時(shí)，取質(zhì)粒5ul加入95u1無血清DMEM，輕輕混勻制成100ul溶液，按FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑(Irwitrogen)說明書方法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。劑量配比在其建議范圍內(nèi)選擇設(shè)計(jì)，按照脂質(zhì)體與質(zhì)粒配比分五組，分別為空白對(duì)照組，4ul:2ug組，6yl:2ug組，8ul:2yg組，IOpl:2ng組，分別制備脂質(zhì)體/質(zhì)粒轉(zhuǎn)染復(fù)合物6孔板中加入100iil轉(zhuǎn)染復(fù)合物，來回移動(dòng)培養(yǎng)板，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細(xì)胞充分接觸。于37'C培養(yǎng)6h后，補(bǔ)加新鮮的含10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)孵育。在轉(zhuǎn)染后48h于流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)。2.總RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效應(yīng)的半定量RT-PCR檢測(cè)(1)提取總RNA取轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞KAT0-in，用PBS漂洗2次，按106-107個(gè)細(xì)胞加lmlTrizol(Jnvitrogen)裂解細(xì)胞，裂解液轉(zhuǎn)至l.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200u1氯仿，劇烈振蕩30秒，12000轉(zhuǎn)/分4。C離心5分鐘，小心取上清移至l.5ml大小RNase-free的Ep管，加入與上清等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘后12000轉(zhuǎn)/分4'C離心5分鐘，小心棄上清，70%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀2次，室溫下自然晾干，用ddH20(含l^DEPC)溶解，下續(xù)反應(yīng)。(2)cDNA的合成和PCR反應(yīng)使用Takara公司的RT-PCR試劑盒，先按50。C30min，99。C5min,5。C5min的步驟分別合成cDNA，反應(yīng)總體系為10iU，包括MgCl22ul，10XRTBufferlwl，dNTPs混合物lyl，RNaseInhibitor0.25n1，AMVReverseTranscriptase0.5ii1,OligodT-AdaptorPrimer0.5y1，RNA4.8ii1;然后取cDNA1iil在PCR儀(PE5700)中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94。C2min—個(gè)循環(huán)，94°C30sec，56°C30sec，72°Clmin共30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)總體系為20til，包括5XPCRbuffer5y1，滅菌蒸餾水9.875yl，TaKaRaExTaqHS酶0.125ul,FUT3上、下游引物各lul，內(nèi)參GAPDH上、下游引物各lwl，cDNA1Ul。PC財(cái)廣增產(chǎn)物經(jīng)2X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR引物序列下表。目的基因PCR引物序列及擴(kuò)增片段長度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.蛋白水平驗(yàn)證SLea抗原表達(dá)的變化(1)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞SL^表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)法的主要原理是利用熒光素、生物素或地高辛等標(biāo)記的抗體(或抗原)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)，經(jīng)過化學(xué)呈色反應(yīng)之后，用顯微鏡進(jìn)行觀察，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分或化學(xué)性質(zhì)。我們應(yīng)用高度靈敏的SP(Str印tavidinPeroxidase,過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素)免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48h后的KAT0-III中SLea抗原表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。先將KATO-III以約5X10s個(gè)/ni1的細(xì)胞密度接種在6孔板內(nèi)，37°C，5。％C02下生長24小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)在室溫下用免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(中杉金橋)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞SLe"抗原表達(dá)將對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，37°C5%的二氧化碳孵箱培養(yǎng)2處，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)培育48h后，收獲細(xì)胞用PBS洗兩遍,加破膜劑與固定劑500wl，室溫孵育10分鐘，PBS洗2次，加一抗5"l室溫孵育30分鐘.PBS洗2次，加二抗O.2ul低速混勻，室溫避光20分鐘，PBS洗2次，上機(jī)檢測(cè).4.細(xì)胞的增殖活性變化我們采用的是MTT比色法來測(cè)定細(xì)胞活力，此法原理是MTT易被水溶解，透過細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶能將MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苡谒乃{(lán)紫色甲脂(Formazam)結(jié)晶顆粒，此結(jié)晶可被酸性異丙醇，SDS，DMS0等有機(jī)溶劑溶解，依顏色深淺可通過分光光度計(jì)測(cè)定出各吸光度值，由于結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)量及代謝活性成比例，因此吸光度(A)值的大小可反映活細(xì)胞的數(shù)量及活性，而死亡細(xì)胞沒有線粒體脫氫酶活性，與MTT不起反應(yīng)。將KAT0-m細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞終密度約為2X104/ml，體積100ul，接種后24小時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別培養(yǎng)0h，24h，48h，72h后每孔加入100ylMTT液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心棄去上清液，加入100yl畫S0液，震蕩，待藍(lán)紫色溶解后，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A492。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值平均值/對(duì)照組A值平均值)X100%。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定3孔求平均值，以時(shí)間為橫軸，以抑制率為縱軸繪制曲線。5.細(xì)胞凋亡水平的變化在轉(zhuǎn)染48h后，按以下步驟應(yīng)用AnnexinV-FITC和PI雙染色法檢測(cè)該腫瘤細(xì)胞被抑制后的凋亡情況先用胰酶消化下待測(cè)細(xì)胞，用4C預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，用250ix11X結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1X107ml;取100u1的細(xì)胞懸液加入一個(gè)5ml流式管中，加入5ii1AnnexinV-FITC禾n10u120ug/ml的PI溶液；混勻后于室溫避光孵育15分鐘；在反應(yīng)管中加400UlPBS，上流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)分析。所構(gòu)建質(zhì)粒及生物活性的鑒定結(jié)果如下-1.質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2示，與Marker的條帶比較可見質(zhì)粒DNA位于6557bp和4361bp之間，已知構(gòu)建好的質(zhì)粒大小約為5763bp左右。2.紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果如下表所示各質(zhì)粒濃度如下；各質(zhì)粒的A260/A280比值均在1.80左右，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，確認(rèn)所提質(zhì)粒純度較高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提質(zhì)粒DNA的濃度和多隨<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.PCR鑒定結(jié)果應(yīng)用弓l物EmGFPForwardsequencingprimer禾卩mi腿reversesequencingprimer進(jìn)行PCR鑒定(見圖3)。4.測(cè)序結(jié)果通過測(cè)序(圖4)驗(yàn)證了插入序列與我們合成的寡核苷酸序列完全符合，說明我們成功構(gòu)建了FUT3-miRNA1/2。5.轉(zhuǎn)染率計(jì)算結(jié)果在轉(zhuǎn)染后48h于流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示以脂質(zhì)體/質(zhì)粒載體為8wl:2ug轉(zhuǎn)染效果最好(見圖5所示轉(zhuǎn)染率為53.83%)，且脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的毒性較小，為質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染劑的合適比例。當(dāng)脂質(zhì)體體積更大時(shí)(10y1:2pg),轉(zhuǎn)染率沒有顯著增加。6.RT-PCR結(jié)果轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖6所示，各組均可見FUT3基因的特異性條帶(337bp)和內(nèi)參GAPDH主帶(500bp)，與空白對(duì)照和空載體對(duì)照的條帶比較可發(fā)現(xiàn)FUT3-miRNAl和FUT3-miRNA2的FUT3條帶亮度都有所減弱，其中以FUT3-miRNA2更為明顯，說明該質(zhì)粒抑制FUT3的效率較高。7.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)FUT3-miRNA干擾質(zhì)粒對(duì)SLea表達(dá)水平的影響轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察，空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組的KATOin細(xì)胞膜表面的SLea表達(dá)較多，多數(shù)細(xì)胞均有棕黃色顆粒沉著，黃色顆粒沉著代表SLea抗原表達(dá)陽性，分布較為廣泛、均勻；轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)組KATOm細(xì)胞膜表面上僅見少量的棕黃色顆粒沉著，與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組相比，SLea表達(dá)呈明顯的低表達(dá)(見圖7)。8.流式細(xì)胞儀檢測(cè)FUT3-miRNA干擾質(zhì)粒對(duì)SLea表達(dá)水平的影響轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組KATOIII細(xì)胞膜表面SLea表達(dá)比例分別為52.99%和43.25%，F(xiàn)UT3-miRNAl組為36.56%，F(xiàn)UT3-miRNA2組為25.10%(見圖8)，分析表明經(jīng)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜表面的SLea表達(dá)水平與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組相比均有降低，說明兩種miRNA質(zhì)粒均能降低KATOIII細(xì)胞膜表面的SLea表達(dá)水平。9.細(xì)胞的增殖活性變化(MTT法)結(jié)果轉(zhuǎn)染后分別在0h、24h、48h、72h測(cè)定各孔A492每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定3孔求平均值，計(jì)算抑制率，抑制率^1-實(shí)驗(yàn)組A值平均值/對(duì)照組A值平均值)X100。/。，以時(shí)間為橫軸，以抑制率為縱軸繪制曲線(圖9)?？梢奆UT3-miRNAl/2均能抑制細(xì)胞增值，且FUT3-miRNA2抑制率較高。10.流式凋亡結(jié)果轉(zhuǎn)染后48h，AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)KAT0III凋亡結(jié)果如圖10。實(shí)驗(yàn)組的KATOIII細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，F(xiàn)UT3-miRNAl組的細(xì)胞凋亡率為(30.ll士O.56)%，F(xiàn)UT3-miRNA2組為(43.83±0.47)%，凋亡細(xì)胞中AnnexinV+ZPI+細(xì)胞占較高比例，提示部分細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡，而空白對(duì)照組和空載體組的細(xì)胞凋亡率僅為(4.99±0.07)%和(7.99±3.76)%，與空白對(duì)照組和空載體組相比，實(shí)驗(yàn)各組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(p<0.01)。由此可見，miRNA質(zhì)粒載體能夠誘導(dǎo)KATOIII細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。本發(fā)明的優(yōu)良效果如下本申請(qǐng)發(fā)明人在近幾年國內(nèi)外RNA干涉研究的工作基礎(chǔ)上，針對(duì)FUT3基因，利用RNA干擾技術(shù)結(jié)合基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的2種niiRNAs表達(dá)質(zhì)粒，并通過在胃癌細(xì)胞株KAT0III中表達(dá)FUT3特異性miRNAs分子，特異性的抑制了FUT3基因的表達(dá)，并篩選出抑制率最高的一種miRNA表達(dá)質(zhì)粒，以達(dá)到特異性、有效阻斷FUT3表達(dá)及治療胃癌的目的。/.本發(fā)明構(gòu)建的2種FUT3特異性miRNAs表達(dá)質(zhì)?？捎行б种艶UT3基因的表達(dá)。主要有如下優(yōu)點(diǎn)①本質(zhì)?？稍诖竽c桿菌oneshotT0P10中大量擴(kuò)增，即可不斷獲得表達(dá)miRNAs的載體；②針對(duì)FUT3編碼區(qū)中、上游分別設(shè)計(jì)了RNA干擾的靶位點(diǎn)，從而找到了對(duì)FUT3基因抑制效率較高的位點(diǎn)；③安全性高，無插入突變危險(xiǎn)，亦無免疫毒性反應(yīng)。么本發(fā)明構(gòu)建、篩選的上特異性miRNAs表達(dá)質(zhì)粒針對(duì)FUT3基因，抑制效果明顯。本發(fā)明針對(duì)FUT3基因的miRNAs表達(dá)質(zhì)粒是可用于FUT3相關(guān)胃癌的治療物質(zhì)，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長并能誘導(dǎo)其凋亡，可進(jìn)一步研究FUT3基因的功能及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行基因治療。J.本發(fā)明所采用的miRNA技術(shù)能夠在mRNA和蛋白水平上干擾基因的表達(dá)。miRNA是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性的非編碼的單鏈RNA，其長度為21-25nt。在進(jìn)化上具有高度的保守性，能夠通過與耙mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起耙mRNA的降解或者抑制其翻譯，在基因調(diào)控中扮演著重要的角色。本研究所構(gòu)建的質(zhì)粒miRRNAi表達(dá)載體采用CMV啟動(dòng)子，能夠促進(jìn)目的基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄。該質(zhì)粒首先通過體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的方式合成一個(gè)約70nt的具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)，在特異性核酸內(nèi)切酶Dicer的作用下，生成發(fā)夾狀的單鏈miRNA分子，能與靶序列特異性的結(jié)合，從而降解靶mRNA，阻止其蛋白翻譯，即RNA干擾(RNAinterference,RNAi)。miRNA還可通過與耙mRNA的3，-UTR區(qū)不完全配對(duì)結(jié)合來抑制mRNA的翻譯，進(jìn)一步影響其蛋白水平的表達(dá)。圖1FUT3-miRNA1/2載體圖譜。圖2質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖①A-HindIIIdigestDNAMarker;②陽性對(duì)照；③FUT3-miRNAl;④FUT3-miRNA2;⑤空白對(duì)照。圖3PCR鑒定圖①DL2000DNAMarker;②陽性對(duì)照；③FUT3-miRNAl;④FUT3-miRNA2;⑤陰性對(duì)照。圖4插入片段的基因測(cè)序圖A:質(zhì)粒FUT3-miRNAl測(cè)序圖；B:質(zhì)粒FUT3-miRNA2測(cè)序圖。圖5流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率A:陰性對(duì)照B:轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)組(脂質(zhì)體/質(zhì)粒載體為8yl:2ug)。圖6RT-PCR產(chǎn)物圖①空白對(duì)照；②空載體對(duì)照；③FUT3-miRNAl;FUT3-miRNA2。圖7轉(zhuǎn)染后48h免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)KAT0III細(xì)胞表面SLea表達(dá)A:空載體對(duì)照；B:實(shí)驗(yàn)組。圖8流式細(xì)胞儀檢測(cè)KAT0III細(xì)胞表面SLea表達(dá)A:空白對(duì)照；B:空載體對(duì)照；C:FUT3-miRNAl;D:FUT3-miRNA2。圖9MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后對(duì)KATOIII生長的抑制。圖10轉(zhuǎn)染后48h，AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)KATOIII凋亡情況。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不僅限于此。一、主要試劑1.載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector購自invitrogen公司(Catalogno:K4936-00)。2.工程菌T0P10購自于invitrogen公司(Catalogno:C4040-03)。3.T4連接酶購于invitrogen公司(Catalogno:K4936-00);質(zhì)粒的提取和純化試劑盒(QIApr印SpinMiniprepKit)購自于QIAGEN公司(CatNo:27104);Spectinomycin抗生素購自于Sigma公司(Catalogno:S4014)。4.FUT3特異性PCR引物合成、FUT3特異性miRNA寡核苷酸鏈合成和DNA序列測(cè)定(上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)5.轉(zhuǎn)染試劑FuGENEHDTransfectionReagent(Cat.No.04709705001，Roche)6.TRzolReagent(Cat.No.15596-026，Invitrogen)RT-PCR試劑盒RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0(CodeNo.DRR019A，Takara)7.羊抗鼠熒光二抗R-PE(CatalogNo:1031-09s，SouthernBiotech)8.Mouseanti-sialyllewisa(KM231,IgGl)單抗(CatalogNo.MAB2095,CHEMICON)9.免疫組化染色試劑盒MouseSPKit(目錄號(hào)SP-9002,北京中杉金橋生物技術(shù)公司)10.濃縮型DAB顯色試劑盒(目錄號(hào)ZLI-9032，北京中杉金橋生物技術(shù)公司)11.凋亡試劑AnnexinVRPEKit(目錄號(hào)LHK601，晶美生物工程有限公司)12.預(yù)染蛋白marker(目錄號(hào)SM0671，F(xiàn)ermentas)13.Westernblot檢測(cè)試劑盒(目錄號(hào)54—11一50，KPL)二、主要儀器1.紫夕卜分光光度計(jì)(GeneQuantPro):AmershamBiosciences2.凝膠成像系統(tǒng)(ChemilmagerTM4400):AlphaI畫tech3.生物安全柜(Hfsafel200):上海力申科學(xué)儀器公司4.二氧化碳培養(yǎng)箱(HF90):上海力申科學(xué)儀器公司5.熒光顯微鏡(ECLIPSETE2000-S):Nikon6.CCD(penguinl50CL):美國pixera公司7.臺(tái)式冷凍離心機(jī)(TGL-16G):上海安亭科學(xué)儀器廠8.PCR儀(PE5700):ABI9.全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(AbbottAXSYMSYSTEM):美國雅培公司10.流式細(xì)胞儀(FACSCalibur):BECT0NDICKINSON11.熒光光譜儀(VARIANCARYEclipse):美國VARIAN公司12.全自動(dòng)酶標(biāo)儀(MultiskanMk3):ThermoLabsystems三、質(zhì)粒的制備方法及其生物學(xué)活性鑒定1.RNA干涉靶序列的選擇及插入模板的設(shè)計(jì)與合成1.1選擇靶序列選取兩段靶序列，這兩段序列分別為①AACTGCAGCAGGAATCCAGGT，起始于1660位;②AACCCATACAGTGAATCCATT，起始于596位。另外陽性對(duì)照(miR-lacpositivedscontrololigo)，陰性對(duì)照(超純水代替寡核苷酸)己由載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRExpressionVector試劑盒同時(shí)提供。1.2設(shè)計(jì)寡核苷酸每一正向單鏈寡核苷酸內(nèi)，21nt的寡核苷酸以正反向組合，中間以GTTTTGGCCACTGACTGAC的發(fā)夾環(huán)序列間隔，使寡核苷酸內(nèi)部可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，每對(duì)寡核苷酸的核心序列反向互補(bǔ)，每對(duì)寡核苷酸的兩端分別帶有與線性化載體上的miRflankingregion相匹配的位點(diǎn)，這是連接線性載體所必需的。中間發(fā)夾環(huán)部位可有效的生成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。按照以上所述，兩個(gè)靶序列設(shè)計(jì)后的寡核苷酸序列如下-①FUT3寡核苷酸序列1:正義鏈反義鏈②FUT3寡核苷酸序列2:正義鏈反義鏈5'-cctgAATGGATTCACTATGGGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACCCATACAGTGAATCCATTC-3'2.構(gòu)建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-FUT3-miRRNAi真核表達(dá)載體2.l退火用高壓去離子水重懸FUT3的寡核苷酸干粉至濃度為200uM，上下游序列按下列反應(yīng)體系以l:l混合，95'C水浴4分鐘，室溫孵育反應(yīng)5-IO分鐘。上游鏈(200uM)5u1下游鏈(200uM)110XoligoAnnealingBuffer2u1DNase/RNase-freewater_8y1總體積20li12.2連接將退火產(chǎn)物(濃度50uM)用DNase/RNase-freewater做100倍稀釋，稀釋至濃度為500nM，徹底混勻，再繼續(xù)用DNase/RNase-freewater和10XoligoAnnealingBuffer做50倍稀釋至濃度為10nM，徹底混勻。-2(TC保存。將稀釋好的FUT3雙寡核苷酸1/2分別與pcDNA6,2-GW/EmGFP-miRVector(載體圖譜見圖l)，用T4DNA連接酶連接，同時(shí)載體試劑盒中提供的陽性對(duì)照(miR-lacZpositivedscontrololigo)和陰性對(duì)照(超純水代替寡核苷酸)。室溫孵育5分鐘后將反應(yīng)體系放冰上，準(zhǔn)備做轉(zhuǎn)化。余下的-2(TC保存。連接反應(yīng)體系雙寡核苷酸(實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組，10nM)4ylpcDNA6.2-GW/EmGFP-miRVector2y15Xligationbuffer4iilDNase/RNase-freewater9u1T4DNA連接酶(ltt1)_Uil總體系20ul2.3轉(zhuǎn)化①取感受態(tài)細(xì)胞(TOP10chemicallycompetentE.colicells)6管(50yl/每EP管)，冰上融化10min.②分別加入各連接產(chǎn)物3u1混勻，冰上放置30min,每隔5min輕輕搖動(dòng)EP管。③42'C水浴中放置30秒，勿晃動(dòng)。迅速取出置于冰中，靜置2min.每管加入250y1的37。C預(yù)熱的S0C培養(yǎng)基，37。C振搖(約225轉(zhuǎn))1小時(shí)左右。⑤取不同體積菌液(50u1-200p1)涂布于含有壯觀霉素(終濃度為50ug/ml)的LB平板上，37°。培養(yǎng)12-16小時(shí)。2.4陽性重組子小量擴(kuò)增與分離純化①挑選上述含壯觀霉素的LB平板中的單個(gè)克隆，種在4ml含壯觀霉素(終濃度為50ug/ml)的LB液中，37'C振搖(約170轉(zhuǎn))14-16小時(shí)。每組都分別挑選5個(gè)克隆。②實(shí)驗(yàn)組各取lml菌液送上海英俊生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行插入片段測(cè)序。另用甘油保存余下菌液，置-80。C保存?zhèn)溆?。③取出測(cè)序正確的菌種，劃線接種在含壯觀霉素的LB平板上，37'C孵育14-16小時(shí)。挑單個(gè)菌落接種在4ml含壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37'C振搖(約170轉(zhuǎn))14-16小時(shí)。質(zhì)粒的小量提取取3ml菌液按QIApr印SpinMinipr印Kit(QIAGEN)說明書提取質(zhì)粒。1)收集菌液與離心管中，室溫下10000rpm離心5min;收集菌體，重懸于250"1的細(xì)胞懸浮液P1;2)加入250u1堿裂解液P2,蓋緊管口，顛倒旋轉(zhuǎn)離心管4-6次以混勻，室溫靜置5min;3)加入350iil緩沖液N3，立即溫和顛倒離心管510次，室溫下13000rpm離心IOmin;4)將上清液小心移入吸附柱，室溫下IOOOOrpm離心1min，倒掉收集管的液體，將吸附柱放于同一收集管中；5)在吸附柱中加入750u1洗滌液PE，室溫10000rpm離心1min，倒掉收集管中液體，重復(fù)洗滌一遍；6)倒掉收集管中液體，講吸附柱放入同一收集管中。室溫IOOOOrpm離心1min，去除殘留洗液；7)將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，在吸附模中央加入50Ul洗脫液EB，靜置lmin，室溫離心lmin;8)質(zhì)粒保存在一70'C3.質(zhì)粒DNA的檢測(cè)3.1瓊脂凝膠電泳分析配制0.8%瓊脂糖凝膠(含O.5ug/ml溴化乙錠)，取lul質(zhì)粒DNA進(jìn)行電泳，檢測(cè)提取的質(zhì)粒DNA。3.2應(yīng)用弓l物EmGFPForwardsequencingprimer禾口miRNAreversesequencingprimer進(jìn)行PCR鑒定。PCR的反應(yīng)體系如下Mg2'1.5ulTag酶0.1u110Xbuffer2uldNTP0.4n1引物lulDNA菌液1u1^_14tU總體系20u1反應(yīng)條件94°C4min;94°C30sec，55°C30sec，72°C30sec，35個(gè)循環(huán)；72°C3min3.3紫外分光光度計(jì)分析取lul質(zhì)粒DNA用69ul超純水稀釋，在自動(dòng)紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)A260nm和A280nm處的吸光值，以測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度。4.胃癌細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染KATO-III細(xì)胞培養(yǎng)在含10^胎牛血清的DMEM中，置于37。C，5%(]02培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將腫瘤細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板上，每孔約5X105個(gè)細(xì)胞，使每孔細(xì)胞飽和度在轉(zhuǎn)染前達(dá)到90%以上，鋪板時(shí)不使用含抗生素的培養(yǎng)液。種板后24小時(shí)，取質(zhì)粒5ul加入95n1無血清DMEM，輕輕混勻制成100ul溶液，按FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)說明書方法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。劑量配比在其建議范圍內(nèi)選擇設(shè)計(jì)，按照脂質(zhì)體與質(zhì)粒配比分五組，分別為空白對(duì)照組，4"1:2wg組，6iil:2iig組，8"l:2Ug組，10IX1:2ug組，分別制備脂質(zhì)體/質(zhì)粒轉(zhuǎn)染復(fù)合物6孔板中加入100ul轉(zhuǎn)染復(fù)合物，來回移動(dòng)培養(yǎng)板，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細(xì)胞充分接觸。于37'C培養(yǎng)6h后，補(bǔ)加新鮮的含10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)孵育。在轉(zhuǎn)染后48h于流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)。5.總RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效應(yīng)的半定量RT-PCR檢測(cè)5.1提取總RNA取轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞KATO-m，用PBS漂洗2次，按106—107個(gè)細(xì)胞加lmlTrizol(Invitrogen)裂解細(xì)胞，裂解液轉(zhuǎn)至l.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200u1氯仿，劇烈振蕩30秒，12000轉(zhuǎn)/分4。C離心5分鐘，小心取上清移至l.5ml大小RNase-free的Ep管，加入與上清等體積的異丙醇，室溫放置5分鐘后12000轉(zhuǎn)/分4'C離心5分鐘，小心棄上清，70%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀2次，室溫下自然晾干，用ddH20(含l^DEPC)溶解，下續(xù)反應(yīng)。5.2cDNA的合成和PCR反應(yīng)使用Takara公司的RT-PCR試劑盒，先按50。C30min，99。C5rain,5。C5min的步驟分別合成cDNA，反應(yīng)總體系為10ul，包括MgCl22wl，10XRTBuffer1u1，dNTPs混合物1u1，RNaseInhibitor0.25u1，AMVReverseTranscriptase0.5u1，OligodT-AdaptorPrimer0.5u1，RNA4.8u1;然后取cDNA1yl在PCR儀(PE5700)中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94。C2min—個(gè)循環(huán)，94°C30sec，56°C30sec，72°Clmin共30個(gè)循環(huán)，反應(yīng)總體系為20nl，包括5XPCRbuffer5ix1，滅菌蒸餾水9.875nl,TaKaRaExTaqHS酶0.125pl，F(xiàn)UT3上、下游引物各lul,內(nèi)參GAPDH上、下游引物各lul，cDNA1ul。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR引物序列下表。目的基因PCR引物序列及擴(kuò)增片段長度<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>_I下坊字5'caccagtggatgcagggat3'___6.蛋白水平驗(yàn)證SLea抗原表達(dá)的變化6.1免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞S1^抗原表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)法的主要原理是利用熒光素、生物素或地高辛等標(biāo)記的抗體(或抗原)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)，經(jīng)過化學(xué)呈色反應(yīng)之后，用顯微鏡進(jìn)行觀察，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分或化學(xué)性質(zhì)。我們應(yīng)用高度靈敏的SP(Str印tavidinPeroxidase,過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素)免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48h后的KAT0-III中Lewis抗原表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。先將KATO-III以約5X105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種在6孔板內(nèi)，37°C，5%0)2下生長24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48h在室溫下用免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒(中杉金橋)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。6.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞SLea抗原表達(dá)將對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，37。C5%的二氧化碳孵箱培養(yǎng)24h，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)培育48h后，收獲細(xì)胞用PBS洗兩遍，加破膜劑與固定劑500u1,室溫孵育10分鐘，PBS洗2次，加一抗5Pl室溫孵育30分鐘.PBS洗2次，加二抗O.2ul低速混勻，室溫避光20分鐘，PBS洗2次，上機(jī)檢測(cè).7.細(xì)胞的增殖活性變化我們采用的是MTT比色法來測(cè)定細(xì)胞活力，此法原理是MTT易被水溶解，透過細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶能將MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苡谒乃{(lán)紫色甲脂(Formazam)結(jié)晶顆粒，此結(jié)晶可被酸性異丙醇，SDS，DMSO等有機(jī)溶劑溶解，依顏色深淺可通過分光光度計(jì)測(cè)定出各吸光度值，由于結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)量及代謝活性成比例，因此吸光度(A)值的大小可反映活細(xì)胞的數(shù)量及活性，而死亡細(xì)胞沒有線粒體脫氫酶活性，與MTT不起反應(yīng)。將KATO-III細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞終密度約為2X104/ml，體積lOOul,接種后24小時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別培養(yǎng)0h，24h，48h，72h后每孔加入100ii1MTT液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心棄去上清液，加入100ul匿S0液，震蕩，待藍(lán)紫色溶解后，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A492。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組八值平均值/對(duì)照組A值平均值)X100y。。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定3孔求平均值，以時(shí)間為橫軸，以抑制率為縱軸繪制曲線。8.細(xì)胞凋亡水平的變化在轉(zhuǎn)染48h后，按以下步驟應(yīng)用AnnexinV-FITC和PI雙染色法檢測(cè)該腫瘤細(xì)胞被抑制后的凋亡情況先用胰酶消化下待測(cè)細(xì)胞，用4'C預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，用250yIIX結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1X107ml;取100ul的細(xì)胞懸液加入一個(gè)5ml流式管中，加入5u1AnnexinV-FITC禾n10ul20yg/ral的PI溶液；混勻后于室溫避光孵育15分鐘；在反應(yīng)管中加400ulPBS，上流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)分析。四、結(jié)果1.質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2示，與Marker的條帶比較可見質(zhì)粒DNA位于6557bp和4361bp之間，已知構(gòu)建好的質(zhì)粒大小約為5763bp左右。2.紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果如下表所示各質(zhì)粒濃度如下；各質(zhì)粒的A260/A280比值均在1.80左右，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，確認(rèn)所提質(zhì)粒純度較高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3.PCR鑒定結(jié)果應(yīng)用弓l物EmGFPForwardsequencingpriraer禾口miRNAreversesequencingprimer進(jìn)行PCR鑒定(見圖3)。4.測(cè)序結(jié)果通過測(cè)序(圖4)驗(yàn)證了插入序列與我們合成的寡核苷酸序列完全符合，說明我們成功構(gòu)建了FUT3-miRNA1/2。5.轉(zhuǎn)染率計(jì)算結(jié)果在轉(zhuǎn)染后48h于流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示以脂質(zhì)體/質(zhì)粒載體為8ul:2yg轉(zhuǎn)染效果最好(見圖5所示轉(zhuǎn)染率為53.83%)，且脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的毒性較小，為質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染劑的合適比例。當(dāng)脂質(zhì)體體積更大時(shí)(10ul:g)，轉(zhuǎn)染率沒有顯著增加(圖略)。6.RT-PCR結(jié)果轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖6所示，各組均可見FUT3基因的特異性條帶(337bp)和內(nèi)參GAPDH主帶(500bp)，與空白對(duì)照和空載體對(duì)照的條帶比較可發(fā)現(xiàn)FUT3-miRNAl和FUT3iiRNA2的FUT3條帶亮度都有所減弱，其中以FUT3-miRNA2更為明顯，說明該質(zhì)粒抑制FUT3的效率較高。7.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)FUT3-miRNA干擾質(zhì)粒對(duì)SLea表達(dá)水平的影響轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察，空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組的KATOIII細(xì)胞膜SLea表面的表達(dá)較多，多數(shù)細(xì)胞均有棕黃色顆粒沉著，黃色顆粒沉著代表SLea抗原表達(dá)陽性，分布較為廣泛、均勻；轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)組KATOIII細(xì)胞膜表面上僅見少量的棕黃色顆粒沉著，與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組相比，SLea表達(dá)呈明顯的低表達(dá)(見圖7)。8.流式細(xì)胞儀檢測(cè)FUT3-miRNA干擾質(zhì)粒對(duì)SLea表達(dá)水平的影響轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組KAT0III細(xì)胞膜表面SLea表達(dá)比例分別為52.99%和43.25%，F(xiàn)UT3-miRNAl組為36.56%，F(xiàn)UT3-miRNA2組為25.10%(見圖8)，分析表明經(jīng)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜表面的SLea表達(dá)水平與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組相比均有降低，說明兩種miRNA質(zhì)粒均能降低KATOIII細(xì)胞膜表面的SLea表達(dá)水平。9.細(xì)胞的增殖活性變化(MTT法)結(jié)果轉(zhuǎn)染后分別在0h、24h、48h、72h測(cè)定各孔A492每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定3孔求平均值，計(jì)算抑制率，抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值平均值/對(duì)照組A值平均值)X10(F。，以時(shí)間為橫軸，以抑制率為縱軸繪制曲線(如圖9)?？梢奆UT3-miRNA1/2均能抑制細(xì)胞增值，且FUT3-miRNA2抑制率較高。10.流式凋亡結(jié)果轉(zhuǎn)染后48h，AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)KAT0III凋亡結(jié)果如圖10。實(shí)驗(yàn)組的KATOm細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，F(xiàn)UT3-miRNAl組的細(xì)胞凋亡率為(30.11±0.56)%，F(xiàn)UT3-miRNA2組為(43.83±0.47)%，凋亡細(xì)胞中Annexin丫+/1+細(xì)胞占較高比例，提示部分細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡，而空白對(duì)照組和空載體組的細(xì)胞凋亡率僅為(4.99±0.07)%和(7.99±3.76)%，與空白對(duì)照組和空載體組相比，實(shí)驗(yàn)各組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(p〈0.Ql)。由此可見，miRNA質(zhì)粒載體能夠誘導(dǎo)KATOIII細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。序列表〈110>汪運(yùn)山，濟(jì)南市第四人民醫(yī)院〈120>胃癌靶向RJT3基因的miRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途<歸6<170>PatentIn3.1<210〉1<211>21〈212〉DNA5'—AACTGCAGCAGGAATCCAGGT—3，21〈210〉2〈211>21<212〉DNA5'—AACCCATACAGTGAATCCATT—3'21〈210〉3<211〉64〈212〉DNA<210〉4〈211>64〈212〉腿5'-cctgACCTGGATTCCCTGCAGTTGTCAGTCAGTGGCCMAACMCTGCAGCAGGAATCCAGGTC-3'64〈210〉5<211>64<212〉DNA5'-tgctGAATGGATTCACTGTATGGGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACCCATAGTGMTCCATT-3'64<210〉6<211>64〈212〉畫5'-cctgAATGGATTCACTATGGGTTGTCAGTCAGTGGCCMAACMCCCATACAGTGAATCCATTC-3'6權(quán)利要求1.靶向FUT3基因的miRNAs表達(dá)載體，其特征是，以pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector為載體，針對(duì)人α-1，3/4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT3)基因編碼區(qū)中、上游的兩段序列，在較高表達(dá)路易斯(Lewis)血型抗原的胃癌細(xì)胞系KATO-III中發(fā)揮RNA干擾作用，這兩段FUT3特異性RNA干涉靶序列分別為①5’-AACTGCAGCAGGAATCCAGGT-3’，起始于1660位；②5’-AACCCATACAGTGAATCCATT-3’，起始于596位，是用于由FUT3基因調(diào)控的Lewis抗原相關(guān)性胃癌的治療性物質(zhì)，由以下方法制得(1)RNA干涉靶序列的選擇及插入序列的設(shè)計(jì)與合成選擇FUT3基因編碼區(qū)的兩段序列①5’-AACTGCAGCAGGAATCCAGGT-3’、②5’-AACCCATACAGTGAATCCATT-3’，設(shè)計(jì)并分別體外合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸序列，序列如下①FUT3寡核苷酸序列1正義鏈5’-tgctGACCTGGATTCCTGCTGCAGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACTGCAGGGAATCCAGGT-3’反義鏈5’-cctgACCTGGATTCCCTGCAGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACTGCAGCAGGAATCCAGGTC-3’②FUT3寡核苷酸序列2正義鏈5’-tgctGAATGGATTCACTGTATGGGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACCCATAGTGAATCCATT-3’反義鏈5’-cctgAATGGATTCACTATGGGTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAACCCATACAGTGAATCCATTC-3’(2)將上述合成的寡核苷酸分別與線性載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的提取將步驟(1)合成的兩段寡核苷酸等量混勻，95℃作用4分鐘后慢慢冷卻至室溫，然后將結(jié)合的雙鏈寡核苷酸與線性化的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector質(zhì)粒載體連接，最后轉(zhuǎn)化到OneShotTOP10大腸桿菌，經(jīng)壯觀霉素(Spectinomycin)篩選，并用x-gal和IPTG(異丙基硫代-B-D-半乳糖苷)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選耐藥菌落大量培養(yǎng)，用質(zhì)粒提試劑盒提取純化質(zhì)粒DNA；(3)質(zhì)粒的鑒定將步驟(2)提取的質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用引物EmGFPForwardsequencingprimer和miRNAreversesequencingprimer進(jìn)行PCR鑒定，紫外分光光度計(jì)分析測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度和純度，并進(jìn)行插入片斷測(cè)序，以確定合成的寡核苷酸是否已正確轉(zhuǎn)入pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector質(zhì)粒中。2.權(quán)利要求1的靶向FUT3基因的miRNAs表達(dá)載體在制備治療分泌FUT3酶的胃癌的基因藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及胃癌靶向FUT3基因的miRNAs表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選及其用途，以pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miRRNAiExpressionVector為載體，針對(duì)FUT3基因編碼區(qū)中、上游的兩段序列，在可較高表達(dá)Lewis血型抗原的胃腺癌細(xì)胞系KATO-III中發(fā)揮RNA干擾作用。這兩段FUT3特異性RNA干涉靶序列分別為①5’-AACTGCAGCAGGAATCCAGGT-3’，起始于1660位；②5’-AACCCATACAGTGAATCCATT-3’，起始于596位，是用于由FUT3基因調(diào)控的路易斯(Lewis)抗原相關(guān)性胃癌的治療性物質(zhì)。文檔編號(hào)A61P35/00GK101338321SQ200810138989公開日2009年1月7日申請(qǐng)日期2008年8月18日優(yōu)先權(quán)日2008年8月18日發(fā)明者宋玉和,岳慶祝,汪運(yùn)山,辛永紅,郟雁飛,燕鄭申請(qǐng)人:汪運(yùn)山;濟(jì)南市第四人民醫(yī)院