專利名稱：白菜育性相關(guān)基因BcMF6及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白菜育性相關(guān)基因BCMF6及其分離方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
cDNA-AFLP方法可以用于分析同一基因表達(dá)上的差異，獲得與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的標(biāo)記探針。結(jié)合文庫篩選、染色體步移、RACE技術(shù)等實(shí)驗(yàn)手段，能夠得到與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的全長基因序列。本發(fā)明采用cDNA-AFLP技術(shù)對‘矮腳黃’白菜(Brassciacampestris L.ssp.chinensis Makino var.communis Tsen et Lee cv.Aijiaohuang)核不育兩用系表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)可育株系與不育株系的表達(dá)差異主要存在于花藥，配合RACE技術(shù)分離獲得與花藥發(fā)育相關(guān)基因BCMF6，但其確切的生物學(xué)功能還不清楚。在后基因組時代，基因組研究的重點(diǎn)已經(jīng)從基因序列的獲得轉(zhuǎn)移到基因具體功能的分析，而反義遺傳學(xué)已成為分析基因功能的重要手段。為了明確BCMF6在花粉育性決定過程中的作用，有必要采用反義遺傳學(xué)的方法和手段對其功能進(jìn)行分析，為闡明植物雄性不育發(fā)生的分子機(jī)制提供依據(jù)，進(jìn)而為人工創(chuàng)建不育材料提供理論指導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種白菜育性相關(guān)基因BCMF6及其分離方法。
本發(fā)明提供的白菜育性相關(guān)基因BCMF6，其特征在于具有SEQ ID No.1的序列；包含3個內(nèi)含子和4個外顯子，內(nèi)含子的長度依次為81bp、95bp和127bp；最大ORF從第115位堿基開始，1308位堿基終止，1194個堿基編碼398個氨基酸，該氨基酸具有SEQ ID No.5的序列。
本發(fā)明提供的白菜育性相關(guān)基因BCMF6的分離方法，其特征在于包括以下步驟1)可育株系特異BCMF-A4T17基因片段的獲得設(shè)計(jì)兩條AFLP引物A4和T17，用A4和T17引物對‘矮腳黃’白菜核雄性不育兩用系的不育株系與可育株系的表達(dá)差異進(jìn)行cDNA-AFLP分析，將能在可育株系的中蕾、大蕾和開放花中特異表達(dá)，而在不育株系中完全不表達(dá)的基因片段命名為BCMF-A4T17；2)將差異片段BCMF-A4T17進(jìn)行回收、克隆和測序，得到大小為357bp，具有SEQID No.2序列的BCMF-A4T17基因片段；3)根據(jù)BCMF-A4T17基因片段的序列，設(shè)計(jì)兩條特異引物SP1和SP2，將SP1和SP2分別與3’RACE錨定引物進(jìn)行配合，以反轉(zhuǎn)錄的可育中蕾的雙鏈cDNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得與BCMF-A4T17片段相關(guān)基因的cDNA的3’末端序列，該序列具有SEQ ID No.3的序列；4)根據(jù)BCMF-A4T17基因片段的序列，設(shè)計(jì)兩條特異引物SP3和SP4，將SP3和SP4與5’RACE錨定引物通過嵌套式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，獲得與BCMF-A4T17片段相關(guān)基因的cDNA的5’末端序列，該序列具有SEQ ID No.4序列；5)將三次測序結(jié)果拼接，得到與BCMF-A4T17片段相關(guān)基因的全長序列，基因全長為1514bp，并將其命名為BCMF6基因，該基因具有SEQ ID No.1的序列。
本發(fā)明步驟1)中，所設(shè)計(jì)的引物A4GAC TGC GTA CCTAAT GG；T17GAT GAG TCCAGA CCG ACA。
本發(fā)明步驟3)中，所設(shè)計(jì)的特異引物SP15’-GTT GAG TCG TAC TTG GGAAGG C-3’；SP25’-TTG AGT ACA ACA ACC GTG GAC CAG G-3’。
本發(fā)明步驟4)中，所設(shè)計(jì)的特異引物SP35’-GAC TCC AAC ACT CCT TCC CAC-3’；SP45’-CGT CAA AGA TAC CAC CTC C-3’。
本發(fā)明的有益效果在于從白菜中獲得了一個新的多聚半乳糖醛酸酶基因，表達(dá)分析表明其與花粉的育性決定存在密切的關(guān)系，其在花粉發(fā)育的晚期即花粉成熟和萌發(fā)過程中起作用。對其功能的轉(zhuǎn)基因研究表明，其表達(dá)與花藥的絨氈層存在密切的聯(lián)系，且其表達(dá)模式可能是配子體表達(dá)模式。當(dāng)其表達(dá)受到抑制時花粉數(shù)量減少，花粉發(fā)育異常，花粉萌發(fā)率降低，花粉畸形。這對理解多聚半乳糖醛酸酶基因在花粉發(fā)育和花粉育性決定過程中所起的作用有重要的參考價(jià)值，并為人工創(chuàng)造雄性不育系提供了理論依據(jù)。


圖1是BCMF6在pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6菜心轉(zhuǎn)基因KanR植株開放花表達(dá)情況的northern雜交檢測；圖2是BcMF6反義載體菜心轉(zhuǎn)基因植株花器官與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ栈ㄆ鞴俚谋容^，其中A圖和B圖為BcMF6基因反義載體轉(zhuǎn)基因植株花器官；C為非轉(zhuǎn)基因菜心的花器官；D為反義載體轉(zhuǎn)基因植株花器官和對照花器官的比較；圖3是BcMF6菜心轉(zhuǎn)基因植株的花粉萌發(fā)，其中A，pBI35S-AMF6(×160)；B，pBIA9-AMF6(×160)；C，35S-pBI121空載體(×160)；D，A9-pBI121空載體(×160)；圖4是BcMF6反義載體菜心轉(zhuǎn)基因植株花粉的環(huán)境電鏡掃描觀察，其中A，pBI35S-AMF6(×1000)；B，pBIA9-AMF6(×1000)；C，35S-pBI121空載體(×500)；D，A9-pBI121空載體(×500)。
具體實(shí)施例方式
1.白菜育性相關(guān)基因BCMF6的分離方法，包括以下步驟
1)可育株系特異BCMF-A4T17基因片段的獲得設(shè)計(jì)兩條AFLP引物A4和T17，用AFLP引物A4和T17組合對‘矮腳黃’白菜核雄性不育兩用系的不育株系與可育株系的表達(dá)差異進(jìn)行cDNA-AFLP分析，其中將能在可育株系的中蕾、大蕾和開放花中特異表達(dá)，而在不育株系中完全不表達(dá)的基因片段命名為BCMF-A4T17。其中A4GAC TGCGTA CCT AAT GG；T17GAT GAG TCC AGA CCG ACA；2)BCMF-A4T17基因片段的回收、克隆與測序用針尖將上述BCMF-A4T17特異條帶挑一點(diǎn)作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為A4和T17；PCR產(chǎn)物電泳檢測表明，BCMF-A4T17基因片段片段長度為350 bp左右；克隆到pGEM-T Easy載體(購自Promega公司)，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證并測序，結(jié)果得出該片段大小為357bp，具有SEQID No.2的序列，將該重組質(zhì)粒命名為pBCMF-A4T17；3)與BCMF-A4T17片段相關(guān)的基因的cDNA的3’末端的獲得根據(jù)BCMF-A4T17基因片段的序列，設(shè)計(jì)兩條特異引物SP1和SP2，其中，SP1引物最后一個堿基與SP2引物的第一個堿基相差75個堿基，以3’RACE錨定引物分別與SP1和SP2組合，以反轉(zhuǎn)錄的可育中蕾的雙鏈cDNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明，第二輪產(chǎn)物分子量低于第一輪產(chǎn)物分子量，第二輪PCR產(chǎn)物的長度為1000bp左右，回收3’RACE第二輪PCR的電泳條帶，克隆到pGEM-T Easy載體并測序，結(jié)果表明3’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的序列長度為980bp，去掉3’RACE錨定引物20bp，實(shí)際擴(kuò)增到960bp，其中含有25個T的寡聚核苷酸序。獲得的BCMF-A4T17片段相關(guān)的基因的cDNA的3’末端具有SEQ ID No.3的序列。其中SP15’-GTT GAG TCG TAC TTG GGAAGG C-3’；SP25’-TTG AGT ACA ACA ACC GTG GACCAG G-3’；3’RACE錨定引物5’-GAG GCG GCC GAC ATG TTT TT-3’；4)與BCMF-A4T17片段相關(guān)基因的cDNA的5’末端的獲得根據(jù)BCMF-A4T17基因片段的序列，設(shè)計(jì)5’RACE的特異引物SP3和SP4，其中SP3引物最后一個堿基與SP4第一個堿基相差99個堿基，與5’RACE錨定引物通過嵌套式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，回收并測序，結(jié)果表明5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的序列長度為501bp，去掉5’RACE錨定引物和錨定序列共40bp，實(shí)際擴(kuò)增到461bp。獲得的BCMF-A4T17片段相關(guān)的基因的cDNA的5’末端具有SEQ ID No.4序列。其中SP35’-GAC TCC AAC ACT CCT TCC CAC-3’；SP45’-CGT CAA AGA TACCAC CTC C-3’；5’RACE錨定引物5’-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3’；5)與BCMF-A4T17片段相關(guān)的基因BCMF6的cDNA的全長序列的拼接將三次測序結(jié)果拼接，得到與BCMF-A4T17片段相關(guān)基因的全長序列，基因全長為1514bp，我們將其命名為BCMF6基因，該基因具有SEQ ID No.1的序列。
本發(fā)明分離得到的白菜育性相關(guān)基因BCMF6的特點(diǎn)1)BCMF6的ORF及其氨基酸序列的確定通過BLAST分析比較，BCMF6基因的cDNA全長序列與白菜多聚半乳糖醛酸酶基因(Brassica campestris polygalacturonase)mRNA同源性高達(dá)87％；利用序列綜合分析軟件DNAStar對BCMF6基因ORF進(jìn)行分析，結(jié)果表明該基因最大ORF為1194bp，起始密碼子ATG位于第115位，終止密碼子為TAA，位于第1308位。ATG上游-3位核苷酸分別為A，+4位為核苷酸為G，這是一個典型的Kozak結(jié)構(gòu)。利用DNA Star軟件將ORF翻譯成氨基酸，其編碼398個氨基酸，該氨基酸具有SEQ IDNo.5的序列；2)BCMF6的DNA序列的確定根據(jù)BCMF6的cDNA的全長序列，在其最大ORF框外設(shè)計(jì)擴(kuò)增DNA全長的上游引物SP5和下游引物SP6，以白菜可育株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果表明，其DNA擴(kuò)增全長在1600bp左右，表明BcMF6的DNA序列中含有內(nèi)含子。對所獲DNA擴(kuò)增序列進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化，PCR和酶切驗(yàn)證、測序，結(jié)果表明BcMF6基因DNA序列全長為1576個堿基，減去兩端酶切位點(diǎn)堿基6個和保護(hù)堿基3個，實(shí)際長度為1558bp。對BcMF6的DNA和cDNA全長序列比較分析表明，該基因序列包含3個內(nèi)含子和4個外顯子，內(nèi)含子的長度依次為81bp、95bp和127bp。其外顯子-內(nèi)含子交接點(diǎn)處序列都遵守GT-AG規(guī)律，是典型的剪接體識別序列。該序列具有SEQ ID No.6。其中SP5GTAGGATCCATTGTAATCCCCAGTAAC；SP6GCATCTAGAGTGTATTGGTTATCGCA。
BCMF6基因的功能分析1)BCMF6基因的反義表達(dá)載體的構(gòu)建選取BcMF6基因的cDNA的編碼區(qū)長為477-bp的一段作為構(gòu)建BcMF6基因反義表達(dá)載體的反義片段，根據(jù)pBI121表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)分別帶有Sma 1引物SP7和帶有BamH I酶切位點(diǎn)的引物SP8。用mmc突變體的野生型的cDNA做為模板，按下述PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行BcMF6反義片段的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系cDNA模板0.5μL，10×PCR緩沖溶液5μL，25 m mol·L-1的Mg2+4μL，SP7引物(20m mol·L-1)1μL，SP8引物(20μmol·L-1)1μL，10m mol·L-1dNTPs 1μL，Taq酶(5U·μL-1)0.5μL，加水到總體積50μL。PCR程序94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用VITAGENE公司的DNA凝膠回收試劑盒回收、連接到pGEM-T easy載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、藍(lán)白斑篩選陽性克隆、PCR和酶切鑒定正確后，送上海博亞生物公司測序。
將已鏈接到T-Easy載體的BcMF6反義鏈質(zhì)粒和帶有CaMV35S啟動子、擬南芥A9啟動子的pBI121空載體用BamH I和Sma I在37℃雙酶切3～4h。1.0％的瓊脂糖凝膠中電泳分離后，切下含目的片段的膠塊，VITAGENE公司的DNA凝膠回收試劑盒回收。將酶切回收過的反義片段與經(jīng)過同樣酶酶切回收的pBI121大片段用T4連接酶定向連接，從而完成BcMF6基因帶有CaMV35S啟動子、擬南芥A9啟動子的pBI121反義表達(dá)載體的構(gòu)建，分別命名為pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6。
2)BCMF6基因的反義表達(dá)載體菜心轉(zhuǎn)基因植株的功能分析將構(gòu)建好的表達(dá)載體pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化到白菜的近緣物種菜心中，得到菜心KanR植株。對菜心KanR植株進(jìn)行分子檢測和Southern雜交檢測后，對其花粉的形態(tài)進(jìn)行電鏡掃描觀察、花粉的體外萌發(fā)率進(jìn)行檢測及對BCMF6基因表達(dá)進(jìn)行northern雜交檢測，其結(jié)果如下i用BcMF6基因的cDNA序列為探針，對pBI35S-AMF6、pBIA9-AMF6菜心轉(zhuǎn)基因KanR植株在開放花中的表達(dá)進(jìn)行Northern雜交檢測，結(jié)果表明pBI35S-AMF6、pBIA9-AMF6菜心轉(zhuǎn)基因KanR植株開放花的BcMF6表達(dá)都低于對照(見圖1)，這表明BcMF6的反義表達(dá)載體已抑制了其表達(dá)。
ii對BcMF6反義載體pBI35S-AMF6、pBIA9-AMF6的菜心轉(zhuǎn)基因KanR植株花器官與非轉(zhuǎn)基因菜心花器官的比較可以看出，轉(zhuǎn)基因菜心的花器官花絲比對照小一點(diǎn)，而且花藥不飽滿，花粉數(shù)量少(見圖2)，這也表明了菜心轉(zhuǎn)基因植株的花粉受到BcMF6的反義表達(dá)載體的抑制導(dǎo)致其花粉數(shù)量下降。
iii對BcMF6反義載體的菜心轉(zhuǎn)基因KanR植株的花粉萌發(fā)試驗(yàn)表明，pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6的花粉萌發(fā)率明顯低于對照，對其花粉萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6的花粉萌發(fā)率相近分別是48.67％和36.88％，都顯著低于相應(yīng)空載體轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏拿劝l(fā)率(見圖3。這表明BcMF6反義載體pBI35S-AMF6和pBIA9-AMF6抑制了其菜心轉(zhuǎn)基因植株的花粉的萌發(fā)，使萌發(fā)率顯著降低。
iv對BcMF6反義載體pBI35S-AMF6、pBIA9-AMF6的菜心轉(zhuǎn)基因KanR植株的花粉電鏡掃描結(jié)果表明，pBI35S-AMF6菜心轉(zhuǎn)基因植株既有形態(tài)正常的花粉，也含有發(fā)育不正常的花粉，其表現(xiàn)為花粉皺縮，發(fā)育不飽滿，明顯小于正常的花粉，統(tǒng)計(jì)分析表明其畸形率為54.18％，與其花粉萌發(fā)率相近；對pBIA9-AMF6花粉電鏡掃描結(jié)果表明，pBIA9-AMF6菜心轉(zhuǎn)基因植株有相當(dāng)部分的花粉表現(xiàn)為萌發(fā)溝提前愈合，花粉壁塌陷，統(tǒng)計(jì)分析表明花粉畸形率為52.36％，高于其花粉萌發(fā)率(見圖4)。
綜上所述，對BcMF6反義載體pBI35S-AMF6、pBIA9-AMF6的菜心轉(zhuǎn)基因KanR植株的Northern雜交檢測、花器官觀察、花粉萌發(fā)率和花粉形態(tài)電鏡掃描結(jié)果都表明了BcMF6為一可能在花粉的成熟和萌發(fā)過程中起作用的基因。同時也表明了BcMF6基因的表達(dá)與花藥的絨氈層存在密切的聯(lián)系，其表達(dá)可能是配子體表達(dá)模式，因?yàn)橹挥写蠹s一半的花粉會受到反義RNA的抑制。
上述實(shí)施用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列信息<110>浙江大學(xué)<120>白菜育性相關(guān)基因BcMF6及其分離方法<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1514<212>DNA<213>Brassica sp.
<400>1ataaataaga aaaatatttt ttttcaaata ctaataataa taaaactagt ggattacaaa 60atatataaac aaaaataata attgtaatcc ccagtaacta aaaaaaatca tataatgggt 120gtacattttg gaatatccgt attatttgtt gtttgtttgc taggtttatc agcaaatgct 180aaagatttca caatcactgc tcctccaggt tctgatatcg ccagcttatt gttgaaagca 240ttcaatgagg catgccagtt cccgaccagg agtagcgtat tgatccctaa aggtgaatac 300aagcttcggc aaatagagat gatgggtcca tgcaaagctc ccataaggat tactcttcaa 360ggcactgtga aagctgacgg aaacgttaac gggaatgact actgggtcgc tttccgcagg 420attaatgggt ttaagttgaa cggaggtggt atctttgacg gtgaaggtaa cgctgcatgg 480agggctaata attgccacaa aatggcatta actcagtgca agaaactccc tatcagcata 540cggtttgatt tcgtgactga cgctaagata agaggcataa cctcgttgga ttcaaagaac 600ttccacatta acgcgctcgg agcaaggaac ctgacattgg aagaaatcac gatcattgcc 660cctgaagaga gacccaacac cgatggaatc cacgtgggaa ggagtgctgg agtccagatc 720atcaactcaa acatcaaaac aggagatgac tgcatctcta ttggagacgg gacgagagac 780cttcttgtcg aaagagttac atgcggtccg ggacatggaa tcagtattgg aagcctcgga 840ttatacgtga aggaggaaga cgtcactggc atcagggtcg taaactccac cctcataaac 900actgacaatg gtgtaaggat caagacatgg ccgtctgcag cttgctccac caccgcctcg 960ggtatccatt ttgagaatat tatcctcaag aacgttacca accctatcct catcgaccaa 1020gagtactgcc cctggaaccg atgcaacaag aacaaaccat caacaatcaa gctggtggac 1080
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<400>2gtttaagttg aacggaggtg gtatctttga cggtgaaggt aacgctgcat ggagggctaa 60taattgccac aaaatggcat taactcagtg caagaaactc cctatcagca tacggtttga120tttcgtgact gacgctaaga taagaggcat aacctcgttg gattcaaaga acttccacat180taacgtgctc ggagcaagga acatgacatt ggaagaaatc acgatcattg cccctgaaga240gagtcccaac accgatggaa tccacgtggg aaggagtgtt ggagtccaga tcatcaactc300aaacatcaaa acaggagatg actgcatctc tattggagac gggacgagag accttct 357<210>3<211>980<212>DNA<213>Brassica sp.
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<400>5
Met Gly Val His Phe Gly Ile Ser Val Leu Phe Val Val Cys Leu Leu1 5 10 15Gly Leu Ser Ala Asn Ala Lys Asp Phe Thr Ile Thr Ala Pro Pro Gly20 25 30Ser Asp Ile Ala Ser Leu Leu Leu Lys Ala Phe Asn Glu Ala Cys Gln35 40 45Phe Pro Thr Arg Ser Ser Val Leu Ile Pro Lys Gly Glu Tyr Lys Leu50 55 60Arg Gln Ile Glu Met Met Gly Pro Cys Lys Ala Pro Ile Arg Ile Thr65 70 75 80Leu Gln Gly Thr Val Lys Ala Asp Gly Asn Val Asn Gly Asn Asp Tyr85 90 95Trp Val Ala Phe Arg Arg Ile Asn Gly Phe Lys Leu Asn Gly Gly Gly100 105 110Ile Phe Asp Gly Glu Gly Asn Ala Ala Trp Arg Ala Asn Asn Cys His115 120 125Lys Met Ala Leu Thr Gln Cys Lys Lys Leu Pro Ile Ser Ile Arg Phe130 135 140Asp Phe Val Thr Asp Ala Lys Ile Arg Gly Ile Thr Ser Leu Asp Ser145 150 155 160Lys Asn Phe His Ile Asn Ala Leu Gly Ala Arg Asn Leu Thr Leu Glu165 170 175Glu Ile Thr Ile Ile Ala Pro Glu Glu Arg Pro Asn Thr Asp Gly Ile180 185 190His Val Gly Arg Ser Ala Gly Val Gln Ile Ile Asn Ser Asn Ile Lys195 200 205Thr Gly Asp Asp Cys Ile Ser Ile Gly Asp Gly Thr Arg Asp Leu Leu210 215 220Val Glu Arg Val Thr Cys Gly Pro Gly His Gly Ile Ser Ile Gly Ser225 230 235 240Leu Gly Leu Tyr Val Lys Glu Glu Asp Val Thr Gly Ile Arg Val Val245 250 255
Asn Ser Thr Leu Ile Asn Thr Asp Asn Gly Val Arg Ile Lys Thr Trp260 265270Pro Ser Ala Ala Cys Ser Thr Thr Ala Ser Gly Ile His Phe Glu Asn275 280 285Ile Ile Leu Lys Asn Val Thr Asn Pro Ile Leu Ile Asp Gln Glu Tyr290 295 300Cys Pro Trp Asn Arg Cys Asn Lys Asn Lys Pro Ser Thr Ile Lys Leu305 310 315 320Val Asp Ile Ser Phe Lys Tyr Ile Arg Gly Thr Ser Gly Asn Lys Asp325 330 335Ala Val Lys Leu Leu Cys Ser Lys Gly Phe Pro Cys Lys Asn Val Gln340 345 350Ile Gly Asp Ile Asp Ile Lys Tyr Thr Gly Ala Asp Gly Pro Ala Thr355 360 365Phe Gln Cys Ser Asn Val Ser Pro Thr Leu Met Gly Thr Gln Val Pro370 375 380Lys Ala Cys Ser Ser Pro Val Thr Lys Leu Pro Gly Gln385 390 395<210>6<211>1793<212>DNA<213>Brassica sp.
<400>6gataaataag aaaaatattt tttttcaaat actaataata ataaaactag tggattacaa 60aatatataaa caaaaataat aattgtaatc cccagtaact aaaaaaaatc atataatggg120tgtacatttt ggaatatccg tattatttgt tgtttgtttg ctaggtttat cagcaaatgc180taaagatttc acaatcactg ctcctccagg ttctgatatc accagcgtaa gttcacaacc240aacctttgac ttgacattag ttttctcgtt ctccaagcaa ggttaaaatc ttttgggatc300gatgcagtta ttgttgaaaa cattcaatga ggcatgccag ttcccgacca ggagtagcgt360attgatccct aaaggtgaat acaagcttcg gcaaatagag atgatgggtc catgcaaagc420tcccataagg attactcttc aaggcactgt gaaagctgac gaaaacgtta acgggaatga480
ctactgggtc gctttccgca ggattaatgg gtttaagttg aacggaggtg gtatctttga 540cggtgaaggt aacgctgcat ggagggctat aatcgccaca aaatggcatt aactcagtgc 600aagaaactcc ctatcgtacg tgtctatcta tctctatgtt tacataataa atccgttaaa 660tataaaacag ttttgttaat ttgtttatgt tttgtgtcat tttttaacag agcatacggt 720ttgatttcgt gactgacggc taaagataag aggcataacc tcgttggaat ccaaagaacc 780tccacattaa cgtgctcgga gcaaggaaca tgacattgga agaaatcacg atcattgccc 840tgaagagagt cccaacaccg atggaatcca cgtgggaagg agtgtggagt ccagatcatc 900aactcaaaca tcaaaacagg agatgactgc atctctattg gagacgggac gagagacctt 960cttgtcgaaa gagttacatg cggtccggga catggaatca gtattggaag cctcggacta 1020tacgtgaagg aggaagacgt cactggcatc agggtcgtaa actccaccct cataaacact 1080gacaatggtg taaggatcaa gacatggccg tctgcagctt gctccaccac cgcctcgggt 1140atccattttg agaatattat cctcaagaac gttaccaacc ctatcctcat cgaccaagag 1200tactgcccct ggaaccgatg caacaagaac gtgagtacac ttttcaagaa aatttaaatg 1260atcatagttt ttctatgaga tatgcataga tcaatccatg ggaactgctt tcattggatg 1320atgactccaa gacgtttttt ttgttgtttg tttgtagaaa ccatcaacaa tcaagctggt 1380ggacataagc ttcaagcata tcagaggaac atcagggaac aaagacgccg ttaagctttt 1440gtgcagcaag ggatttccgt gcaagaacgt gcagattggt gacattgaca ttaagtacac 1500cggagccgat ggtccagcga cattccaatg ctccaacgta tctcccacgt tgatgggaac 1560tcaggtctct aaagcatgta gcagcccagt gactaagcta ccaggccagt aagaaatctc 1620gatgcgataa ccaatacaca atctaaaatg tacaatccat aatgtatgtt atattctttc 1680atttgatttt gctagtaaaa tacctattct ttttgctaaa gatgcgtttt gctagctata 1740tttgtataca tgcagcatct gagaaaaaat ataataattg ttaactaagt act 179權(quán)利要求
1.白菜育性相關(guān)基因BCMF6，其特征在于具有SEQ ID No.1的序列；包含3個內(nèi)含子和4個外顯子，內(nèi)含子的長度依次為81bp、95bp和127bp；最大ORF從第115位堿基開始，1308位堿基終止，1194個堿基編碼398個氨基酸，該氨基酸具有SEQ ID No.5的序列。
2.權(quán)利要求1所述的白菜育性相關(guān)基因BCMF6的分離方法，其特征在于包括以下步驟1)可育株系特異BCMF-A4T17基因片段的獲得設(shè)計(jì)兩條AFLP引物A4和T17，用A4和T17引物對‘矮腳黃’白菜核雄性不育兩用系的不育株系與可育株系的表達(dá)差異進(jìn)行cDNA-AFLP分析，將能在可育株系的中蕾、大蕾和開放花中特異表達(dá)，而在不育株系中完全不表達(dá)的基因片段命名為BCMF-A4T17；2)將差異片段BCMF-A4T17進(jìn)行回收、克隆和測序，得到大小為357 bp，具有SEQID No.2序列的BCMF-A4T17基因片段；3)根據(jù)BCMF-A4T17基因片段的序列，設(shè)計(jì)兩條特異引物SP1和SP2，將SP1和SP2分別與3’RACE錨定引物進(jìn)行配合，以反轉(zhuǎn)錄的可育中蕾的雙鏈cDNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得與BCMF-A4T17片段相關(guān)基因的cDNA的3’末端序列，該序列具有SEQ ID No.3的序列；4)根據(jù)BCMF-A4T17基因片段的序列，設(shè)計(jì)兩條特異引物SP3和SP4，將SP3和SP4與5’RACE錨定引物通過嵌套式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，獲得與BCMF-A4T17片段相關(guān)基因的cDNA的5’末端序列，該序列具有SEQ ID No.4序列；5)將三次測序結(jié)果拼接，得到與BCMF-A4T17片段相關(guān)基因的全長序列，基因全長為1514bp，并將其命名為BCMF6基因，該基因具有SEQ ID No.1的序列。
3.按權(quán)利要求2所述的分離白菜育性相關(guān)基因BCMF6的方法，其特征在于步驟1)所設(shè)計(jì)的引物A4GAC TGC GTA CCT AAT GG；T17GAT GAG TCC AGA CCG ACA。
4.按權(quán)利要求2所述的分離白菜育性相關(guān)基因BCMF6的方法，其特征在于步驟3)所設(shè)計(jì)的特異引物SP15’-GTT GAG TCG TAC TTG GGAAGG C-3’；SP25’-TTG AGT ACAACAACC GTG GAC CAG G-3’。
5.按權(quán)利要求2所述的分離白菜育性相關(guān)基因BCMF6的方法，其特征在于步驟4)所設(shè)計(jì)的特異引物SP35’-GAC TCC AAC ACT CCT TCC CAC-3’；SP45’-CGT CAAAGA TACCAC CTC C-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及白菜育性相關(guān)基因BCMF6及其分離方法，以‘矮腳黃’白菜隱性雄性不育兩用系為材料，采用cDNA－AFLP方法對白菜可育株系和不育株系的時空表達(dá)特征進(jìn)行分析，分離與育性基因相關(guān)的差異表達(dá)基因BcMF6；通過RACE技術(shù)獲得其cDNA全長序列，進(jìn)而獲得其DNA全長序列，并對全長序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；構(gòu)建了其反義RNA表達(dá)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化到白菜的近緣物種菜心，對BcMF6基因的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明BcMF6為一個在花粉的成熟和萌發(fā)過程中起作用的多聚半乳糖醛酸酶基因，其表達(dá)與花藥的絨氈層存在密切的聯(lián)系，且其表達(dá)模式可能是配子體表達(dá)模式，參與花粉育性的決定，當(dāng)其表達(dá)受到抑制后，引起花粉畸形、敗育。
文檔編號C07K14/415GK1995349SQ200610155398
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者張強(qiáng), 曹家樹, 黃鸝, 余小林 申請人:浙江大學(xué)