專利名稱：一種制備四種茶黃素單體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備茶黃素單體的方法。
背景技術(shù)：
茶黃素類屬于植物酚性色素，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗癌等作用，對動脈粥樣硬 化、腦梗塞、血小板凝聚、高血壓、高血脂癥、脂代謝紊亂等心腦血管系統(tǒng)疾病有較好的預(yù) 防和治療作用，是發(fā)酵茶類三大色素(茶黃素、茶紅素、茶褐素)中功效最顯著、最具科學(xué) 理論依據(jù)、現(xiàn)階段最具開發(fā)應(yīng)用前景的化合物。迄今為止，已從紅茶或兒茶素氧化物中分離 鑒定出25種茶黃素類物質(zhì)，其中以4種在紅茶中含量最高，分別是茶黃素(TF)、茶黃素一 3 —沒食子酸酯(TF-3-G)、茶黃素一3' —沒食子酸酯(TF-3'-G)和茶黃素雙沒食子酸酯(TFDG)。 就不同種類的茶黃素類化學(xué)成分而言，生物活性有較大的差別，雙酯茶黃素(TFDG)生物活 性最高，單酯茶黃素(TF-3-G 、 TF-3'-G)活性次之，非酯茶黃素(TF)活性最弱。實際上， 不同的茶黃素成分有其獨特的性質(zhì)，可能在不同方面有著不同的功效。據(jù)美國Rutgers大學(xué) 2000年研究結(jié)果，茶黃素單沒食子酸酯(TF-3-G 、 TF-3，-G)對WI38VA轉(zhuǎn)化細(xì)胞和Caco-2 結(jié)腸癌細(xì)胞有著最強的抑制活性，它們對致癌基因Cox-2的表達(dá)有著更為強烈的抑制作用。
現(xiàn)有一種用高速逆流色譜法分離得到茶黃素(TF)、茶黃素一3 —沒食子酸酯(TF-3-G) 與茶黃素一3'—沒食子酸酯(TF-3'-G)的混合物(即單酯茶黃素)和茶黃素雙沒食子酸酯 (TFDG)三種物質(zhì)，由于茶黃素一3 —沒食子酸酯(TF-3-G)與茶黃素一3' —沒食子酸酯 (TF-3'-G)為同分異構(gòu)體，分子量相同，無法將兩者分離，上述方法所得到的是兩者的混合 液，而不是單一物；高速逆流色譜進(jìn)樣量少，只適合分離少量的標(biāo)準(zhǔn)品，該方法很難進(jìn)行放 大，無法適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種能從茶黃素提取 物中分離出四種茶黃素單體的方法，可以根據(jù)需要選擇性地生產(chǎn)任何種類的茶黃素單體，以 滿足醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域開發(fā)不同產(chǎn)品的需要；同時也可以使茶黃素提取物的利用得以 大大提高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
為此，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案 一種制備四種茶黃素單體的方法，其步驟如下1) 用水或乙醇水溶液溶解茶黃素提取物，配成茶黃素提取物溶液；2)將茶黃素提取物溶液緩慢
通過裝有聚酰胺材料的層析柱；3)用洗脫溶劑對層析柱進(jìn)行洗脫，依次收集分別含茶黃素、 茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3'-沒食子酸酯和茶黃素雙沒食子酸酯單體的四種洗脫液，所 述的洗脫溶劑為由酯或酮、醇和有機酸組成的混合溶劑4)將四種洗脫液分別濃縮，得到四 種濃縮液；5)采用弱堿性水溶液分別將四種濃縮液的pH值調(diào)至中性后，用有機溶劑萃取得 萃取液，干燥萃取液得茶黃素的四種單體。本發(fā)明采用聚酰胺樹脂和特殊的洗脫溶劑對茶黃 素提取物溶液進(jìn)行分離，特別是能有效地將茶黃素-3 —沒食子酸酯(TF-3-G)與茶黃素-3' 一沒食子酸酯(TF-3'-G)分離開，從而能分離得到高純度的茶黃素(TF)、茶黃素一3 —沒食 子酸酯(TF-3-G)、茶黃素一3' —沒食子酸酯(TF-3'-G)和茶黃素雙沒食子酸酯(TFDG)四種單 體，大大提高了茶黃素提取物的利用率，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
步驟l)中作為原料的茶黃素提取物(也稱茶黃素混合物)，可以是市場上的各種茶黃素 產(chǎn)品，包括20%、 40%、 60%含量的茶黃素產(chǎn)品，例如可從無錫明欣生物工程有限公司、海 南群力藥業(yè)有限公司購得含量20—60%的茶黃素提取物；也可以由茶葉原料經(jīng)氧化轉(zhuǎn)化后提 取得到，其方法一般是用乙酸乙酯萃取含茶黃素的水溶液，干燥乙酸乙酯層萃取液即可得到 茶黃素提取物，該提取物也可以經(jīng)過進(jìn)一步的分離純化處理，以得到各種含量不同的茶黃素 提取物。
步驟2)中，在茶黃素提取物溶液緩慢通過層析柱時，茶黃素成分會被吸附結(jié)合在聚酰 胺材料上。該項操作可以在10 8(TC的溫度下進(jìn)行，亦可采取恒溫控制色譜柱(即層析柱) 的方法進(jìn)行。
所述的制備四種茶黃素單體的方法，所述的酯為乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸甲酯，所述 的酮為丙酮、丁酮、戊酮或甲基異戊酮，所述的醇為甲醇、乙醇或丙醇，所述的有機酸為甲 酸或乙酸；洗脫溶劑中的酯或酮醇有機酸的比例為4~10: 1~3: 1 6。
所述的制備四種茶黃素單體的方法，所述的酯優(yōu)選為乙酸乙酯，所述的酮優(yōu)選為丙酮， 所述的醇優(yōu)選為乙醇，所述的有機酸優(yōu)選為乙酸，所述的洗脫溶劑中的乙酸乙酯或丙酮乙 醇乙酸的比例為4 10: 1~3: 1~6。
所述的制備四種茶黃素單體的方法，所述的聚酰胺材料為20-200目的聚酰胺樹脂。
所述的制備四種茶黃素單體的方法，步驟5)中所述的弱堿性水溶液為碳酸鈉水溶液、 碳酸氫鈉水溶液、氨水溶液或氫氧化鈉水溶液，或者它們的混合溶液；所述的有機溶劑為乙 酸乙酯、乙酸丁酯或己酸乙酯，優(yōu)選為乙酸乙酯。
所述的制備四種茶黃素單體的方法，步驟6)中所述的干燥方法為冷凍干燥、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 或噴霧干燥。
所述的制備四種茶黃素單體的方法，步驟2)中所述層析處理的流速為0.1~5柱床體積/ 小時；步驟3)中所述洗脫溶劑的流速為0.5~8柱床體積/小時，加快洗脫溶劑通過色譜柱， 加快洗脫的過程。洗脫液的液壓可在一定范圍內(nèi)變化，在1X1(^帕 5X1(^帕的壓力范圍內(nèi) 操作。
所述的制備四種茶黃素單體的方法，聚酰胺樹脂使用后，采用堿溶液(如5%NaOH)、 水、酸溶液(如10%乙酸)或有機溶劑進(jìn)行單獨或組合式洗漆以再生聚酰胺樹脂，供重復(fù)使 用。
所述的制備四種茶黃素單體的方法，步驟4)中所用的濃縮方法為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或降膜濃縮。
可用單個色譜柱或多色譜柱系統(tǒng)來實施本發(fā)明方法，還可用在本領(lǐng)域內(nèi)稱為"模擬移動 床色譜法"或"環(huán)形色譜法"的技術(shù)實施本發(fā)明方法。
本發(fā)明具有以下有益效果從茶黃素提取物中能同時分離出高純度的茶黃素、茶黃素一3 一沒食子酸酯、茶黃素一3'—沒食子酸酯和茶黃素雙沒食子酸酯四種單體，從而可以根據(jù)需 要選擇性地生產(chǎn)任何種類的茶黃素單體，以滿足醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域開發(fā)不同產(chǎn)品的需 要；同時也可以使茶黃素提取物的利用得以大大提高，能用于多種保健品的開發(fā)；該方法非 常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


附圖1是實施例1分離得到的茶黃素(TF)的液相分析圖譜。 附圖2是茶黃素(TF)標(biāo)準(zhǔn)樣的液相分析圖譜。
附圖3是實施例1分離得到的茶黃素一3 —沒食子酸酯(TF-3-G)的液相分析圖譜。
附圖4是實施例1分離得到的茶黃素一3'—沒食子酸酯(TF-3'-G)的液相分析圖譜。
附圖5是單酯型茶黃素(TF-3-G 、 TF-3'-G)標(biāo)準(zhǔn)樣的液相分析圖譜。
附圖6是實施例1分離得到的茶黃素雙沒食子酸酯(TFDG)的液相分析圖譜。
附圖7是茶黃素雙沒食子酸酯(TFDG)標(biāo)準(zhǔn)樣的液相分析圖譜。
具體實施例方式
實施例l
以市場上的茶黃素提取物(TF, TF-3-G， TF-3' -G和TFDG四種茶黃素的總含量為40%) 為原料。稱取2g茶黃素提取物，溶于20ml水中作為上柱溶液。
將粒徑為80-100目的聚酰胺樹脂填充到直徑為20 mm、長800 mm的試驗規(guī)模柱中，填充柱床體積為180ml，給該柱裝上加熱套，將樹脂依次用水、5。/。NaOH水溶液、水、10%乙 酸水溶液、水、95%乙醇和水進(jìn)行清洗，以去除含有的各種雜質(zhì)。
將該填充柱在20。C恒溫，加載上柱溶液到聚酰胺樹脂頂部。在20。C溫度下，用乙酸乙酯 乙醇乙酸=6: 2: 3的混合溶劑以2 BV (柱床體積)/小時的恒定流速將各種茶黃素從柱中 洗脫，根據(jù)顏色，可收集到四段洗出液，按先后的順序分別是茶黃素(TF)、茶黃素一3 —沒 食子酸酯(TF—3—G)、茶黃素一3'—沒食子酸酯(TF—3'—G)、茶黃素雙沒食子酸酯(TFDG)。 洗脫液濃縮干燥后，得到四種高純度茶黃素產(chǎn)品。其中茶黃素(TF)純度為98%，茶黃素一 3 —沒食子酸酯(TF—3—G)純度為95%，茶黃素—3'—沒食子酸酯(TF—3'—G)純度為 94%,茶黃素雙沒食子酸酯(TFDG)純度為97%。
樹脂的再生處理，可將樹脂依次用3BV的水、5。/。NaOH水溶液、水、10%乙酸水溶液、 水、95%乙醇和水進(jìn)行清洗。
實施例2
將實施例1中的混合溶劑更換成甲基異戊酮乙醇乙酸=6: 2: 3，重復(fù)實施例1中的 操作，可獲得四段洗出液，干燥后，其中茶黃素(TF)純度為97%，茶黃素一3 —沒食子酸 酯(TF—3—G)純度為93%，茶黃素一3，一沒食子酸酯(TF—3' —G)純度為96%,茶黃素 雙沒食子酸酯(TFDG)純度為98%。
實施例3
以市場上的茶黃素提取物(TF， TF-3-G， TF-3' -G和TFDG四種茶黃素的總含量為60%) 為原料。稱取4g茶黃素提取物，溶于20ml水中作為上柱溶液。
將粒徑為150-200目的聚酰胺樹脂填充到直徑為25mm、長600mm的試驗規(guī)模柱中，填 充柱床體積為215ml，給該柱裝上加熱套，將樹脂依次用水、5%NaOH水溶液、水、10%乙 酸水溶液、水、95%乙醇和水進(jìn)行清洗，以去除含有的各種雜質(zhì)。
將該填充柱在40'C恒溫，加載上柱溶液到聚酰胺樹脂頂部。在4(TC溫度下，通過泵先用 10BV的乙酸乙酯乙醇乙酸=4: 1: 3的混合溶劑以2BV/小時的恒定流速洗脫，再乙酸 乙酯乙醇甲酸=4: 1: 2的混合溶劑以2BV/小時的恒定流速將各種茶黃素從柱中洗脫，
根據(jù)顏色收集洗出液，可收集到四段洗出液，按先后的順序分別是茶黃素(TF)、茶黃素一3 一沒食子酸酯(TF—3—G)、茶黃素一3'—沒食子酸酯(TF—3'—G)、茶黃素雙沒食子酸酯 (TFDG)。洗脫液濃縮后，采用弱堿性水溶液調(diào)節(jié)其pH至中性，干燥后，得到四種高純度 茶黃素產(chǎn)品，其中茶黃素(TF)純度為97%，茶黃素_3 —沒食子酸酯(TF—3—G)純度為 89%，茶黃素一3'—沒食子酸酯(TF—3'—G)純度為87%，茶黃素雙沒食子酸酯(TFDG) 純度為98%。 實施例4
將實施例3中的混合溶劑更換成甲基異戊酮甲醇乙酸=8: 1: 4和甲基異戊酮甲 醇乙酸=9: 2: 2，重復(fù)實施例3中的操作，可獲得四段洗出液，干燥后，其中茶黃素(TF) 純度為97%，茶黃素一3 —沒食子酸酯(TF—3—G)純度為96%，茶黃素一3'—沒食子酸酯 (TF—3'—G)純度為94%，茶黃素雙沒食子酸酯(TFDG)純度為96%。
實施例5
以市場上的茶黃素提取物(TF， TF-3-G， TF-3， -G和TFDG四種茶黃素的總含量為20%) 為原料。稱取8g茶黃素提取物，溶于20ml水中作為上柱溶液。
將粒徑為100-150目的聚酰胺樹脂填充到直徑為25mm、長600mm的試驗規(guī)模柱中，填 充柱床體積為215ml，給該柱裝上加熱套，將樹脂依次用水、5MNaOH水溶液、水、10%乙 酸水溶液、水、95%乙醇和水進(jìn)行清洗，以去除含有的各種雜質(zhì)。
將該填充柱在25'C恒溫，加載上柱溶液到聚酰胺樹脂頂部。在25。C溫度下，通過泵用
IOBV的乙酸乙酯乙醇乙酸=6: 1: 3的混合溶劑以2BV/小時的恒定流速將各種茶黃素
從柱中洗脫，根據(jù)顏色收集洗出液，可收集到四段洗出液，按先后的順序分別是茶黃素(TF)、 茶黃素—3 —沒食子酸酯(TF—3—G)、茶黃素—3，一沒食子酸酯(TF—3， —G)和茶黃素雙 沒食子酸酯(TFDG)。洗脫液濃縮后，采用弱堿性水溶液調(diào)節(jié)其pH至中性，干燥后，得到 四種高純度茶黃素產(chǎn)品。其中茶黃素(TF)純度為96%，茶黃素一3 —沒食子酸酯(TF — 3 一G)純度96%，茶黃素一3，一沒食子酸酯(TF—3，-G)純度為94%，茶黃素雙沒食子酸酯 (TFDG)純度為95%。 實施例6
將實施例5中的混合溶劑更換成乙酸乙酯甲醇乙酸=6: 1: 3，重復(fù)實施例5中的操
作，可獲得四段洗出液，干燥后，其中茶黃素(TF)純度為93%，茶黃素一3 —沒食子酸酯 (TF — 3 —G)純度為94%，茶黃素一3，一沒食子酸酯(TF — 3'-G)純度為93%,茶黃素雙 沒食子酸酯(TFDG)純度為92%。 實施例7
以市場上的茶黃素提取物(TF， TF-3-G， TF-3' -G和TFDG四種茶黃素的總含量為60%) 為原料。稱取2g茶黃素提取物，溶于20ml水中作為上柱溶液。
將粒徑為80-100目的聚酰胺樹脂填充到直徑為20mm、長600mm的試驗規(guī)模柱中，填 充柱床體積為157ml，給該柱裝上加熱套，將樹脂依次用水、5%NaOH水溶液、水、10%乙 酸水溶液、水、95%乙醇和水進(jìn)行清洗，以去除含有的各種雜質(zhì)。
將該填充柱在25'C恒溫，加載上柱溶液到聚酰胺樹脂頂部。在25。C溫度下，通過泵用
IOBV的乙酸乙酯乙醇甲酸=7: 1: 3的混合溶劑以2BV/小時的恒定流速將各種茶黃素 從柱中洗脫，根據(jù)顏色收集洗出液，可收集到四段洗出液，按先后的順序分別是茶黃素(TF)、 茶黃素—3 —沒食子酸酯(TF—3—G)、茶黃素—3'—沒食子酸酯(TF—3'—G)和茶黃素雙 沒食子酸酯(TFDG)。洗脫液濃縮后，采用弱堿性水溶液調(diào)節(jié)其pH至中性，干燥后，得到 四種高純度茶黃素產(chǎn)品。其中茶黃素(TF)純度為96%，茶黃素一3 —沒食子酸酯(TF — 3 —G)純度為95%，茶黃素一3'—沒食子酸酯(TF—3'-G)純度為93%、茶黃素雙沒食子酸 酯(TFDG)純度為97%。 實施例8
將實施例7中的混合溶劑更換成乙酸乙酯甲醇甲酸=8: 2: 3，重復(fù)實施例5中的操 作，可獲得四段洗出液，干燥后，其中茶黃素(TF)純度為95%，茶黃素一3 —沒食子酸酯 (TF—3—G)純度為93%，茶黃素一3' —沒食子酸酯(TF—3，一G)純度為92%,茶黃素雙 沒食子酸酯(TFDG)純度為94%。
本發(fā)明的保護范圍并不限于上述實施例，凡與本發(fā)明的技術(shù)方案相同或等同的技術(shù)內(nèi)容 均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種制備四種茶黃素單體的方法，其步驟如下1)用水或乙醇水溶液溶解茶黃素提取物，配成茶黃素提取物溶液；2)將茶黃素提取物溶液通過裝有聚酰胺材料的層析柱；3)用洗脫溶劑對層析柱進(jìn)行洗脫，依次收集分別含茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3’-沒食子酸酯和茶黃素雙沒食子酸酯單體的四種洗脫液，所述的洗脫溶劑為由酯或酮、醇和有機酸組成的混合溶劑；4)將四種洗脫液分別濃縮，得到四種濃縮液；5)采用弱堿性水溶液分別將四種濃縮液的pH值調(diào)至中性后，用有機溶劑萃取得萃取液，干燥萃取液得茶黃素的四種單體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備四種茶黃素單體的方法，其特征在于所述的酯為乙酸乙酯、 乙酸丙酯或乙酸甲酯，所述的酮為丙酮、丁酮、戊酮或甲基異戊酮，所述的醇為甲醇、乙醇 或丙醇，所述的有機酸為甲酸或乙酸；洗脫溶劑中的酯或酮醇有機酸的比例為4~10: 1~3:1~6。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備四種茶黃素單體的方法，其特征在于所述的酯為乙酸乙酯， 所述的酮為丙酮，所述的醇為乙醇，所述的有機酸為乙酸，所述的洗脫溶劑中的乙酸乙酯或 丙酮乙醇乙酸的比例為4~10: 1~3: 1 6。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備四種茶黃素單體的方法，其特征在于所述的聚酰胺材料為 20-200目的聚酰胺樹脂。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備四種茶黃素單體的方法，其特征在于步驟5)中所述的弱 堿性水溶液為碳酸鈉水溶液、碳酸氫鈉水溶液、氨水溶液或氫氧化鈉水溶液，或者它們的混 合溶液；所述的有機溶劑為乙酸乙酯、乙酸丁酯或己酸乙酯。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備四種茶黃素單體的方法，其特征在于步驟5)中所述的有 機溶劑為乙酸乙酯。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備四種茶黃素單體的方法，其特征在于步驟6)中所述的干 燥方法為冷凍干燥、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或噴霧干燥。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備四種茶黃素單體的方法，其特征在于步驟2)中所述層析 處理的流速為0.1~5柱床體積/小時；步驟3)中所述洗脫溶劑的流速為0.5 8柱床體粉小時。
9、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備四種茶黃素單體的方法，其特征在于所述的聚酰胺樹脂使 用后，采用堿溶液、水、酸溶液或有機溶劑進(jìn)行單獨或組合式洗滌。
10、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備四種茶黃素單體的方法，其特征在于步驟4)中所用的濃 縮方法為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或降膜濃縮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備茶黃素單體的方法?，F(xiàn)有方法無法將茶黃素-3-沒食子酸酯與茶黃素-3’-沒食子酸酯分離。本發(fā)明的技術(shù)方案如下將茶黃素提取物溶液緩慢通過裝有聚酰胺材料的層析柱；用洗脫溶劑對層析柱進(jìn)行洗脫，依次收集分別含茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3’-沒食子酸酯和茶黃素雙沒食子酸酯單體的四種洗脫液，所述的洗脫溶劑為由酯或酮、醇和有機酸組成的混合溶劑；將四種洗脫液分別濃縮，采用弱堿性水溶液分別將四種濃縮液的pH值調(diào)至中性后，用有機溶劑萃取得萃取液，干燥萃取液得茶黃素的四種單體。本發(fā)明能同時分離出茶黃素的四種單體，大大提高了茶黃素提取物的利用率。
文檔編號C07D311/04GK101190909SQ20061015485
公開日2008年6月4日 申請日期2006年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月24日
發(fā)明者江和源, 王川丕, 高晴晴 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所