專利名稱：去糖人參皂苷提取方法及其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從西洋參中提取去糖人參皂苷的方法，以及去糖人參皂苷在制備預防和治療腫瘤疾病的藥物中的應用。
背景技術(shù)：
西洋參，又名北美人參、花旗參(Panax puinpuefolius L.)，為多年生宿根性草本植物。西洋參性寒、味苦、有益肺陰、清虛火、生津止渴之功效，具有很高的使用和藥用價值。它向來被公認為是一種強身補品，有幫助恢復疲勞、手術(shù)和乏力以及治療老年衰退等作用?，F(xiàn)代化學和藥理實驗研究證實西洋參的根部及地上莖葉部分含有多種生理活性成分，其中主要是西洋參皂苷和三萜類化合物。三萜類化合物與人參皂苷結(jié)構(gòu)相似，其它成分有揮發(fā)油、多糖、蛋白質(zhì)、核酸、肽類、氨基酸、甾醇類、黃酮類、維生素、微量元素等。西洋參皂苷是西洋參中主要的有效成分，也是生理活性最顯著的物質(zhì)，使用人參皂苷產(chǎn)生了許多有益的藥理作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是運用各種現(xiàn)代化學和藥理手段，從西洋參中提取具有治療腫瘤疾病的去糖人參皂苷。
去糖人參皂苷提取工藝流程是將干燥的西洋參根及莖葉粉碎后，并用其8倍量(干重)的95％乙醇提取4次，每次2小時，收集全部提取液，在60℃下減壓回收。將回收的乙醇提取物用1mol/L的氫氧化鈉溶液進行堿降解，溫度為120℃，維持4小時，常溫冷卻后，用6mol/L的硫酸溶液中和至pH為7再過濾。將濾液過大孔吸附柱，用水和80％乙醇依次洗脫，減壓濃縮80％醇洗液，得80％醇洗物，加入95％乙醇抽提，使其充分溶解后過濾。濾液經(jīng)減壓濃縮、真空干燥，得到干燥粉，將干燥粉溶于無水乙醇，使其充分溶解，再過反相高效液相色譜柱，依次用蒸餾水和無水乙醇進行洗脫，將乙醇洗脫液經(jīng)減壓回收、干燥得白色皂苷干性物質(zhì)，即為去糖人參皂苷。
實驗研究證明去糖人參皂苷特別是其中的二醇人生皂苷元，對多種癌細胞顯示出相似的細胞毒性，引起癌細胞快速凋亡，包括人類惡性膠質(zhì)瘤(SF120)、前列腺癌(LNCaP)、乳腺癌(MCF7)、以及大鼠黑色素瘤(B16)；可增強Gemcitabine對胰腺癌細胞的殺傷作用，因此是有效的治療腫瘤藥物；可使多藥耐藥腫瘤細胞對紫杉醇產(chǎn)生超敏化。
本發(fā)明對去糖人參皂苷進行了抗腫瘤的評價實驗。
(一)去糖人參皂苷對各種癌細胞的抑制作用1、實驗目的評價黑乳海參多糖對K-562，SHG-44，HCT-8，PC-3M，A-549等細胞株生長的影響。
2、實驗方法人類惡性膠質(zhì)瘤(SF120)、前列腺癌(LNCaP)、乳腺癌(MCF7)、以及小鼠黑色素瘤(B16)。IC50大約處在20-30M之間。在人類胃癌Kato III，肺癌細胞H460和H838，以及肺間皮瘤內(nèi)也取得相似的結(jié)果(資料未在此出示)。細胞核裂解證據(jù)表明，在濃度為40至80μM間，二醇人參皂甙元(aPPD)在數(shù)小時內(nèi)誘發(fā)細胞凋亡(圖5)。
(二)去糖人參皂苷增強Gemcitabine對胰腺癌細胞的殺傷作用1、實驗目的評價去糖人參皂苷增強Gemcitabine對胰腺細胞的殺傷作用的影響。
2、實驗結(jié)果與二醇人參皂甙元(aPPD)一樣，科爾興可以和傳統(tǒng)化療藥物一起應用。

圖17展示了一個兩類藥物合用的例子。胰腺癌細胞Capan-1是一個對第一線化療藥物Gemcitabine非常耐藥的細胞株。在用1μM的Gemcitabine處理癌細胞24小時后，78％的細胞仍然存活。不過，這種細胞卻對科爾興相當敏感。當單獨用濃度為20μg/mL的科爾興處理時，在24小時后僅有38％的細胞存活。但是，當將1μM的Gemcitabine和20μg/mL的科爾興聯(lián)合應用時，僅有8％的細胞在24小時后存活下來(P＜0.001)。這些結(jié)果表明，科爾興可以顯著地增強Gemcitabine對化療藥物耐藥的胰腺癌細胞的作用。
(三)去糖人參皂苷可使多藥耐藥腫瘤細胞對紫杉醇產(chǎn)生超敏化。
1、實驗目的評價去糖人參皂苷使多藥耐藥腫瘤細胞對紫杉醇產(chǎn)生超敏化的影響。
2、實驗方法將20或30μg/mL的二醇人參皂苷元(appD)與多種濃度的紫杉醇放在一起，處理人乳腺癌細胞MDA435/LCC6，自然分株(MDA435/LCC6W，L6W)和耐藥性分株(MDA435/LCC6M，L6M)，并在24小時后，計算IC50。
3、實驗結(jié)果如表1所示，紫杉醇對藥物敏感的L6W細胞和p-gp表達的L6M子細胞的IC50分別為248nM和631nM。因而抗藥指數(shù)為IC50(L6M)/IC50(L6M)＝2.54。當與20μg/mL的二醇人參皂苷元(appD)合用時，紫杉醇對L6W和L6M的IC50分別變?yōu)?5nM和0.15nM，相應的耐藥指數(shù)為0.002，遠遠小于1。其倒指數(shù)表明，在用二醇人參皂苷元(appD)處理之后，p-gp陽性細胞對紫杉醇的敏感度比p-gp陰性的母細胞強500多倍。當與30μg/mL的二醇人參皂苷元(appD)合用時，相應的耐藥指數(shù)遠小于0.001，這一現(xiàn)象被科學家們稱之為多藥耐藥相關(guān)化療敏感度增強作用。
表1 二醇人參皂苷元(appD)使多約耐約腫瘤細胞對紫杉醇產(chǎn)生超敏化的結(jié)果

具體實施例方式
實施例一取干燥的西洋參根及莖葉300kg，粉碎機粉碎，粒徑要小于100目，水漂沈過濾，濾渣用其8倍量(干重)的95％乙醇提取4次，每次2小時，收集全部提取液，在60℃下減壓回收。將回收的乙醇提取物用1200L的1mol/L的氫氧化鈉溶液進行堿降解，溫度為120℃，維持4小時，常溫冷卻后，用6mol/L的硫酸溶液中和至pH為7再過濾。將濾液過大孔吸附柱，用2000L的水和1000L的80％乙醇依次洗脫，減壓濃縮80％醇洗液，得33kg的80％醇洗物，加入1000L的95％乙醇抽提，使其充分溶解后過濾。濾液經(jīng)減壓濃縮得到約30kg的濃縮膏，真空干燥，得到20kg的干燥粉，將干燥粉溶于600L的無水乙醇，使其充分溶解，再過反相高效液相色譜柱，依次用2000L蒸餾水和2000L無水乙醇進行洗脫，將乙醇洗脫液經(jīng)減壓回收、干燥得1kg白色皂苷干性物質(zhì)，即為去糖人參皂苷。
實施例二稱取去糖人參皂苷1000g，加入10L無水食用乙醇溶解攪勻，完全溶解后加入13kg氧化蓖麻油，攪勻，緩慢加入注射用標準蒸餾水至100L，灌裝，滅菌，用于治療各種實體癌癥。
權(quán)利要求
1.一種從西洋參根及莖葉中提取去糖人參皂苷(主要成分為二醇人參皂苷元、三醇人參皂苷元、人參皂苷Rh2)的方法，其特征在于將經(jīng)清洗的西洋參粉末用乙醇提取，提取液經(jīng)過堿降解，過大孔吸附色譜柱，分別用水和乙醇洗脫，乙醇洗脫部分用95％乙醇抽提，然后減壓回收干燥，得干燥的95％乙醇提取物；最后將提取物溶于無水乙醇，乙醇液經(jīng)過工業(yè)制備級反相高效液相色譜層析，得到醇洗脫液，減壓干燥，所得干燥洗脫物，再經(jīng)粉碎、研磨、過篩，即得到白色的去糖人參皂苷。
2.按權(quán)利要求1所述的西洋參根及其莖、葉，其特征在于，取自2-5年生栽培西洋參的根及莖、葉經(jīng)清洗干燥備用。
3.按權(quán)利要求1所述的將西洋參粉末用乙醇提取，其特征在于，用3-10倍量的65-95％乙醇提取2-6次，每次2個小時。
4.按權(quán)利要求1所述的西洋參乙醇提取液堿降解，其特征在于，用1mol/L氫氧化鈉水溶液，在120℃下攪拌使其最大限度溶解，維持該溫度2-6小時，最后用6mol/L的硫酸溶液中和至pH為7。
5.按權(quán)利要求1所述的過大孔吸附色譜柱，其特征在于，濕法裝柱濕法上樣，并用水和80％乙醇依次洗脫，收集80％乙醇洗脫液。
6.按權(quán)利要求1所述的將80％乙醇洗脫部分用95％乙醇抽提，其特征在于，抽提操作中，應少量多次加入95％乙醇，使其充分溶解。
7.按權(quán)利要求1所述的減壓回收干燥，其特征在于，在60℃下進行，溫度不能過高，防止破壞其中的化學成分，同時也防止由于減壓和溫度高而產(chǎn)生大量的泡沫。
8.按權(quán)利要求1所述的工業(yè)制備級反相高效液相色譜洗脫，其特征在于，依次用蒸餾水和無水乙醇進行洗脫。
9.按權(quán)利要求1所述的去糖人參皂苷在制備抗腫瘤藥物和抗腫瘤增敏作用藥物中的應用。
10.按權(quán)利要求1所述的去糖人參皂苷在制備增加人體免疫力制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從西洋參根及其莖、葉中提取純化去糖人參皂苷的方法，其工藝流程是將經(jīng)清洗的西洋參粉末用乙醇提取，提取液經(jīng)過堿降解，過大孔吸附色譜柱，樹脂洗脫液用95％乙醇抽提，減壓回收干燥，得干燥的95％乙醇提取物；將提取物溶于無水乙醇，乙醇液經(jīng)過工業(yè)制備級反相高效液相色譜柱層析，依次用水和乙醇溶液洗脫，得到醇洗脫液，減壓回收，干燥，粉碎、研磨、過篩，得到白色的去糖人參皂苷。實驗研究證明，去糖人參皂苷對腫瘤細胞和動物腫瘤模型表現(xiàn)出高度的抑制作用，促進癌細胞分化，誘導癌細胞凋亡，可以增強Gemcitabine對胰癌細胞的殺傷作用。其可制備成新的抗腫瘤藥物和抗腫瘤增敏劑。
文檔編號C07J9/00GK1985865SQ20061015546
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日
發(fā)明者巫軍 申請人:巫軍