專利名稱：一種富含人參單糖皂苷的提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種富含人參單糖皂苷的提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
日本專利昭58-57399公開了人參皂苷Rh2具有治療腫瘤活性。小田島肅夫進(jìn)行了人參皂苷Rh2體外抗癌活性研究，證明其對肝癌、黑色素瘤B16、宮頸癌及肉瘤S180等癌細(xì)胞的增殖有顯著的特異性的抑制作用，并提出抗癌作用機(jī)理，認(rèn)為癌細(xì)胞在其增殖過程中，經(jīng)人參皂苷Rh2作用，使癌細(xì)胞停止在一定的增殖期，并促使其逆轉(zhuǎn)為正常細(xì)胞。
人參皂苷Rh2具有較強(qiáng)的抗癌活性，而且毒性低，因此是一個很好的抗腫瘤藥物。近年來，人們一直在研究人參皂苷Rh2的制備方法，CN1352977A描述了“一種從天然植物中提取治療惡性腫瘤產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝”，CN1225366A描述了“20(S)-人參皂苷Rh2的制備”，CN1293198A描述了“稀有人參皂苷的制備方法”，CN1415304A描述了“一種以20(S)-人參皂苷Rh2為有效成分的抗癌輔助藥物及應(yīng)用”。盡管已經(jīng)有了上述制備Rh2單體的方法，但由于其在人參莖葉、紅參或西洋參莖葉中的含量非常低，是微量成分，因此提取后得到的Rh2單體量少且價高，難以在制藥業(yè)廣泛應(yīng)用。鑒于此本發(fā)明人提供了一種藥效與Rh2相當(dāng)且能夠在制藥業(yè)上廣泛應(yīng)用的富含人參單糖皂苷的提取物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種富含人參單糖皂苷的提取物，其中100％＞人參單糖皂苷≥50％，優(yōu)選100％＞人參單糖皂苷≥80％，更優(yōu)選100％＞人參單糖皂苷≥90％，人參單糖皂苷由Rh2、Rh1和Rk2組成，其比例為1∶0.005～0.8∶0.005～0.8。
本發(fā)明提供了一種制備富含人參單糖皂苷提取物的制備方法。
本發(fā)明還提供了富含人參單糖皂苷的提取物在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的富含人參單糖皂苷的提取物的制備方法為以人參皂苷、西洋參皂苷或三七皂苷為原料，或以上述3種植物藥的莖葉總皂苷為原料，優(yōu)選西洋參莖葉皂苷原料，在反應(yīng)釜中加入6～10倍的多元醇，多元醇可以是甘油或1，2-丙二醇，加熱，在60～80℃時加入上述皂苷，在攪拌條件下加入強(qiáng)堿。油浴電加熱，升溫速度控制約10～15℃/10min，當(dāng)溫度升至195～205℃時，停止加熱，保持10～30分鐘，然后反應(yīng)物加入到5～30倍量水中，邊加邊攪拌，皂苷水解產(chǎn)物形成灰白色沉淀析出，靜置，離心或過濾，用去離子水沖洗至濾液不顯堿性，測提取物pH值在6～10，干燥得堿降解產(chǎn)物。將堿降解產(chǎn)物用無水乙醇、無水甲醇或含水乙醇，也可用甲醇或含水甲醇加熱攪拌溶解，加入硅膠、氧化鋁、硅藻土、活性炭中的任何一種或其混合物拌樣，將拌好的樣干燥，供層析分離用。將硅膠、氧化鋁、硅藻土、活性炭任何一種固定項(xiàng)加到層析柱中，其用量為堿降解產(chǎn)物的10～40倍。拌好的樣裝在層析柱的上部，用含C1～C5的酯類、醇類、鹵素類有機(jī)溶劑或其混和溶劑洗脫，如用氯仿∶甲醇(9∶1)洗脫劑洗脫，收集富含Rh2，Rh1和Rk2的部分，回收溶劑，即得富含人參單糖皂苷的提取物。
人參單糖皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖所示 人參皂苷Rh1人參皂苷Rh2 人參皂苷Rk2本發(fā)明提供的富含人參單糖皂苷的提取物在抗腫瘤方面與人參皂苷Rh2作用相當(dāng)。但制備簡單，更有利于臨床推廣應(yīng)用。
本發(fā)明提供的富含人參單糖皂苷的提取物用于腫瘤的有效劑量為60～240mg/天。
本發(fā)明提供的富含人參單糖皂苷的提取物可以與藥學(xué)上可接受的載體制成藥物組合物，該組合物可以是片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸、軟膠囊、注射液、凍干粉針、乳劑或凍干粉針，該藥物組合物的單元劑量為5-200mg。
具體實(shí)施例方式
制備例1制備富含人參單糖皂苷的提取物稱取甘油50kg，加到反應(yīng)釜中，開攪拌，油浴加熱到65℃，稱取西洋參莖葉總皂苷5kg，氫氧化鈉5.5kg，依次加入反應(yīng)釜中，升溫速度控制約10～15℃/10min，當(dāng)溫度升至195～205℃時，停止加熱，保持20分鐘，然后反應(yīng)物加入到15倍量水中，邊加邊攪拌，皂苷水解產(chǎn)物形成灰白色沉淀析出，靜置，離心，用去離子水洗至濾液不顯堿性，測提取物pH值在6.5，取出，干燥，得堿降解產(chǎn)物3.35kg。
取堿降解產(chǎn)物0.50kg，用無水乙醇加熱溶解，加入硅膠粉，混合拌樣，將拌好的樣干燥，粉碎，過篩，供層析分離用。
稱取200～300目層析硅膠12kg，加到層析柱中，拌好的樣裝在層析柱的上部，用氯仿∶甲醇(9∶1)洗脫劑洗脫，收集富含人參單糖皂苷Rh1，Rh2，Rk2部分，回收溶劑，得富含人參單糖皂苷的提取物126g。高效液相色譜測定，含有人參單糖皂苷70.18％，其中51.23％的Rh2，13.45％的Rh1，5.50％的Rk2。
制備例2制備富含人參單糖皂苷的提取物稱取制備例1中堿降解產(chǎn)物0.50kg，用無水乙醇加熱攪拌溶解，加入氧化鋁粉，混合拌樣，將拌好的樣干燥，粉碎，過篩，供層析分離用。
稱取層析氧化鋁15kg，加到層析柱中，拌好的樣裝在層析柱的上部，用氯仿∶甲醇∶醋酸乙酯(9∶1∶20)洗脫劑洗脫，收集富含人參單糖皂苷Rh1，Rh2，Rk2部分，回收溶劑，得提取物130g。高效液相色譜測定，含有人參單糖皂苷68.67％，其中53.45％的Rh2，11.82％的人參皂苷Rh1和3.40％的人參皂苷Rk2。
制備例3制備富含人參單糖皂苷的提取物稱取制備例1中堿降解產(chǎn)物0.50kg，用無水乙醇加熱攪拌溶解，加入氧化鋁粉，混合拌樣，將拌好的樣干燥，粉碎，過篩，供層析分離用。
稱取層析用硅藻土15kg，加到層析柱中，拌好的樣裝在層析柱的上部，用氯仿∶甲醇∶醋酸乙酯(9∶1∶10)洗脫劑洗脫，收集富含人參單糖皂苷Rh1，Rh2，Rk2部分，回收溶劑，得人參單糖皂苷提取物42g。高效液相色譜測定，含有人參單糖皂苷94.81％，其中93.15％的Rh2，0.54％的人參皂苷Rh1，1.12％的人參皂苷Rk2。
制備例4制備富含人參單糖皂苷的提取物稱取制備例1中堿降解產(chǎn)物0.50kg，用無水乙醇加熱攪拌溶解，加入層析硅膠，混合拌樣，將拌好的樣干燥，粉碎，過篩，供層析分離用。
稱取層析活性炭15kg，加到層析柱中，拌好的樣裝在層析柱的上部，用氯仿∶乙醇∶醋酸乙酯(2∶1∶10)洗脫劑洗脫，收集富含人參單糖皂苷Rh1，Rh2，Rk2部分，回收溶劑，得富含人參單糖皂苷的提取物58g。高效液相色譜測定，含有人參單糖皂苷58.45％，其中23.85％的Rh2，18.20％的人參皂苷Rh1，16.44％的人參皂苷Rk2。
試驗(yàn)例中所用
人參皂苷Rh2取制備例3所得樣品10g，用乙醇重結(jié)晶，得人參皂苷Rh2，HPLC檢測，含量97.2％；人參單糖皂苷提取物按制備例方法制備；昆明種小鼠，100只，體重18～22g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心動物中心提供；細(xì)胞株小鼠肝癌H22、小鼠宮頸癌U14、小鼠黑色素瘤B16、小鼠Lewis肺癌，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物研究所；環(huán)磷酰胺上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)。
試驗(yàn)例1富含人參單糖皂苷的提取物與人參皂苷Rh2對H22肝癌生長的抑制作用比較取已經(jīng)傳代一周生長狀態(tài)良好的H22腹水傳代小鼠，取腹水后，加入三倍體積的注射用生理鹽水稀釋，接種于100只昆明鼠腋下，每只0.2ml。接種第二天按體重隨機(jī)分為10組，分別為模型組、陽性藥組(環(huán)磷酰胺20mg/kg)、人參皂苷Rh2高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組，制備例2樣品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組，制備例3樣品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組和制備例4樣品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組。各藥物均以0.5％羧甲基纖維素鈉混懸后灌胃給藥，給藥體積0.2ml/10g，模型組給予羧甲基纖維素鈉，每天一次，給藥10天。于末次給藥后24小時處死動物，稱體重，剝?nèi)×鼋M織稱重，計(jì)算抑瘤率。

表1.人參皂苷Rh2與人參單糖皂苷提取物對H22肝癌生長的抑制作用(n＝10)

與模型組比較*，P＜0.05；**，P＜0.01。
結(jié)果表明，人參皂苷Rh2和各制備例提取物在10～100mg/kg劑量下均能明顯抑制體內(nèi)H22肝癌的生長，相同劑量的人參單糖皂苷提取物和人參皂苷Rh2各組間沒有顯著差異。
試驗(yàn)例2人參單糖皂苷提取物與人參皂苷Rh2對U14宮頸癌生長的抑制作用比較取已經(jīng)傳代一周生長狀態(tài)良好的U14腹水傳代小鼠，取腹水后，加入三倍體積的注射用生理鹽水稀釋，接種于100只昆明鼠腋下，每只0.2ml。接種第二天按體重隨機(jī)分為10組，分別為模型組、陽性藥組(環(huán)磷酰胺20mg/kg)、人參皂苷Rh2高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組，制備例2樣品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組，制備例3樣品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組和制備例4樣品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組。各藥物均以0.5％羧甲基纖維素鈉混懸后灌胃給藥，給藥體積0.2ml/10g，模型組給予羧甲基纖維素鈉，每天一次，給藥10天。于末次給藥后24小時處死動物，稱體重，剝?nèi)×鼋M織稱重，計(jì)算抑瘤率。

表2.人參單糖皂苷提取物與人參皂苷Rh2對U14宮頸癌生長的抑制作用(n＝10)

與模型組比較*，P＜0.05；**，P＜0.01。
結(jié)果表明，各制備例提取物和人參皂苷Rh2在10～100mg/kg劑量下均能明顯抑制體內(nèi)U14宮頸癌的生長，相同劑量時，人參單糖皂苷提取物和人參皂苷Rh2抑瘤作用各組間沒有明顯差異。
試驗(yàn)例3人參單糖皂苷提取物與人參皂苷Rh2對B16黑色素瘤生長的抑制作用比較取C57BL/6小鼠腋下傳代一周，生長狀態(tài)良好的B16腫瘤，加入五倍體積的注射用生理鹽水，組織勻漿器勻漿，100目不銹鋼網(wǎng)過濾后，接種于100只C57BL/6純系鼠腋下，每只0.2ml。接種第二天按體重隨機(jī)分為10組，分別為模型組、陽性藥組(環(huán)磷酰胺20mg/kg)、人參皂苷Rh2高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組，制備例2樣品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組，制備例3樣品高(100mg/kg)低(10mg/kg)劑量組和制備例4樣品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組。各藥物均以0.5％羧甲基纖維素鈉混懸后灌胃給藥，給藥體積0.2ml/10g，模型組給予羧甲基纖維素鈉，每天一次，給藥10天。于末次給藥后24小時處死動物，稱體重，剝?nèi)×鼋M織稱重，計(jì)算抑瘤率。

表3.人參單糖皂苷提取物與人參皂苷Rh2對B16黑色素瘤生長的抑制作用(n＝10)

與模型組比較*，P＜0.05；**，P＜0.01。
結(jié)果表明，人參單糖皂苷提取物和人參皂苷Rh2在10～100mg/kg劑量下均能明顯抑制體內(nèi)B16黑色素瘤的生長，相同劑量時，人參單糖皂苷提取物和人參皂苷Rh2抑瘤作用未表現(xiàn)出明顯差別。
試驗(yàn)例4人參單糖皂苷提取物與人參皂苷Rh2對Lewis肺癌生長的抑制作用比較取C57BL/6小鼠腋下傳代一周，生長狀態(tài)良好的Lewis肺癌瘤組織，加入五倍體積的注射用生理鹽水，組織勻漿器勻漿，100目不銹鋼網(wǎng)過濾后，接種于100只C57BL/6純系鼠腋下，每只0.2ml。接種第二天按體重隨機(jī)分為10組，分別為模型組、陽性藥組(環(huán)磷酰胺20mg/kg)、人參皂苷Rh2高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組，制備例2樣品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組，制備例3樣品高(100mg/kg)低(10mg/kg)劑量組和制備例4樣品高(100mg/kg)、低(10mg/kg)劑量組。各藥物均以0.5％羧甲基纖維素鈉混懸后灌胃給藥，給藥體積0.2ml/10g，模型組給予羧甲基纖維素鈉，每天一次，給藥10天。于末次給藥后24小時處死動物，稱體重，剝?nèi)×鼋M織稱重，計(jì)算抑瘤率。

表4.人參單糖皂苷提取物與人參皂苷Rh2對Lewis肺癌生長的抑制作用(n＝10)

與模型組比較*，P＜0.05；**，P＜0.01。
結(jié)果表明，各制備例提取物與人參皂苷Rh2在10～100mg/kg劑量下均能明顯抑制體內(nèi)Lewis肺癌的生長，相同劑量時，人參單糖皂苷提取物和人參皂苷Rh2抑瘤作用沒有明顯差別。
權(quán)利要求
1.一種富含人參單糖皂苷的提取物，其中100％＞人參單糖皂苷≥50％，人參單糖皂苷由Rh2、Rh1和Rk2組成，其比例為1∶0.005～0.8∶0.005～0.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取物，其中100％＞人參單糖皂苷≥80％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取物，其中100％＞人參單糖皂苷≥90％。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的提取物的制備方法為以人參皂苷、西洋參皂苷或三七皂苷為原料，或以上述3種植物藥的莖葉總皂苷為原料，在反應(yīng)釜中加入6～10倍的多元醇，加熱，在60～80℃時加入上述皂苷，在攪拌條件下加入強(qiáng)堿；油浴電加熱，升溫速度控制約10～15℃/10min，當(dāng)溫度升至195～205℃時，停止加熱，保持10～30分鐘，然后反應(yīng)物加入到5～30倍量水中，邊加邊攪拌，皂苷水解產(chǎn)物形成灰白色沉淀析出，靜置，離心或過濾，用去離子水沖洗至濾液不顯堿性，測提取物pH值在6～10，干燥得堿降解產(chǎn)物；將堿降解產(chǎn)物用低級醇加熱攪拌溶解，加入硅膠、氧化鋁、硅藻土、活性炭或其組合拌樣，將拌好的樣干燥，供層析分離用；將硅膠、氧化鋁、硅藻土或活性炭任何一種固定項(xiàng)加到層析柱中，其用量為堿降解產(chǎn)物的10～40倍，拌好的樣裝在層析柱的上部，用含C1～C5的酯類、醇類、鹵素類有機(jī)溶劑或其混和溶劑洗脫，收集富含Rh2，Rh1和Rk2的部分，回收溶劑，即得富含人參單糖皂苷的提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，優(yōu)選以西洋參皂苷原料。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，多元醇可以是甘油或1，2-丙二醇，低級醇可以是無水乙醇、甲醇、含水乙醇、或含水甲醇；混合溶劑可以是氯仿∶甲醇(9∶1)。
7.權(quán)利要求1-3任一所述的提取物在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種富含人參單糖皂苷的提取物，其中100％＞人參單糖皂苷≥50％，人參單糖皂苷由Rh2、Rh1和Rk2組成，其比例為1∶0.005～0.8∶0.005～0.8。本發(fā)明還提供了人參單糖皂苷提取物的制備方法和在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK1726944SQ200510081669
公開日2006年2月1日 申請日期2005年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月6日
發(fā)明者姜永濤, 王振華, 范秀玉, 馬雙剛, 陳繼永, 茍海濤, 何杰, 劉軍鋒, 劉珂 申請人:山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司