專利名稱：一種與豬多趾相關(guān)的dna片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及突變和遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種動物肢體異常發(fā)育相關(guān)基因。
技術(shù)背景多指(趾)是動物四肢形成過程中由于錯誤信號引發(fā)的一種肢體畸形，在人、鼠、雞、 豬上時有發(fā)生，而且不同物種間表型相似。目前，在人、鼠、雞的多指(趾)上開展了大量 的研究，并取得了一定的進展，主要表現(xiàn)為對多指(趾)的表現(xiàn)類型、遺傳方式已經(jīng)明確， 定位了多指(趾)基因的染色體區(qū)段(人7q36、 2q31和7pl3;鼠5號染色體上與人7q36 同源的區(qū)斷；雞2p45),克隆了諸如Shh (sonic hedgehog)、 Lrabrl (lamb region 1) /C7orf2 (chromosome 7 open reading frame 2)、 bnbr2、 Hox、 Gli、 EN2 (ENGRAILED2)、 FGF、 FgF 受體、RAR (retinoic acid receptors)、 WNT (wg and int)、 BMP (bone morphogenetic protein) 等大量候選基因，并發(fā)現(xiàn)基因的多種突變形式或剪接類型。在眾多候選基因中，Lmbrl基因是肢體結(jié)構(gòu)形成的必需基因。在人和鼠上，Lmbrl基因活 力的差異可引起相反的肢體異常表型Lmbrl功能獲得性突變可引起附加肢結(jié)構(gòu)的形成，產(chǎn) 生額外肢或額外趾；功能丟失型突變可引起遠肢結(jié)構(gòu)的丟失或趾數(shù)減少。雞Lmbrl基因1244 位堿基C突變T還可引起雞產(chǎn)生五趾(雞通常為四趾)；而且，在屠體體重、半凈膛重、全凈 膛重、胸肉重、腿肉重、腹脂重等屠體性狀中，CT型雞明顯大于CC型雞。因此，在育種群 選擇CT型個體，可提高生長速度，增加屠體產(chǎn)量；此外，雞Lmbrl基因還可作為檢測其發(fā)育 性狀的標記，通過檢測雞Lmbrl基因1244位堿基是C還是T可檢測出其基因型，可作為分子標記輔助選擇，在雞的育種中有巨大的應(yīng)用前景。CN02153389.X在實際生產(chǎn)中，我們發(fā)現(xiàn)豬的多趾絕大多數(shù)為軸前多趾(PPD)，但控制豬多趾基因的研 究尚屬空白。至今尚無較完整的豬Lmbrl基因序列，更沒有發(fā)現(xiàn)正常豬與多趾豬在Lmbrl基 因序列上的差異，因此，不能進行突變位點的基因型與豬屠體性狀間的相關(guān)性分析，進而探 討Lmbrl基因作為豬屠體性狀分子標記輔助選擇的可行性。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種與豬多趾相關(guān)的DNA片段。 本發(fā)明的另一目的在于提供該DNA片段在檢測豬發(fā)育性狀方法中的應(yīng)用。 本發(fā)明實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是一種與豬多趾相關(guān)的DNA片段，該.DNA片段是下列多核苷酸之一(1) 核苷酸序列為SEQNO.l和SEQNO.3的多核苷酸；(2) 編碼氨基酸序列為SEQN0.2和SEQN0.4的多肽的多核苷酸。
本發(fā)明所述的DNA片段之一 (SEQ NO.l)分離于正常豬(CRP配套系B系豬)心臟 組織，序列全長1797bp，包括了豬多趾相關(guān)基因的部分編碼區(qū)(1-1178 bp)和完整3端非 翻譯區(qū)(1179-1797 bp)，編碼氨基酸序列為SEQNO. 2的多肽，其編碼區(qū)與人(NM-002458. 3)、 鼠(NM-020295. 3)、雞(AY251537. 2)的Lmbrl相似性極高，核酸序列相似性分別為90%、 87%、 80%;所編碼的多肽序列相似性分別為96%、 96%、 91%。本發(fā)明所述的DNA片段之二 (SEQN0.3)是從多趾豬(CRP配套系B系豬)心臟組織 中分離出來的，是豬多趾相關(guān)基因中的一個片段，與正?；騍EQNO.l相比，其突變區(qū)域 為755 768bp，在SEQNO.l的相應(yīng)位置為922 934bp。在此區(qū)域，相對于正常豬，多趾豬 共有13處突變G755C、 A756T、 A757G、 T758C、 C759A、 A760G、 C761T 、 T762 G、 A763C、G764T、 A765G、 T767G、 T768A(突變前GAATCACTAGATTT，突變后CTGCAGTGCTGTGA，)。其中，前l(fā)l處突變?yōu)殄e義突變，后2處為無意突變；錯義突變導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列有四個氨基酸發(fā)生變化G突變?yōu)锳、 I突變?yōu)锳、 T突變?yōu)閂、 R突變?yōu)長，無意突變導(dǎo)致閱讀框提 前終止；相對于正常豬SEQNO.l，即缺失部分外顯子16和完整的外顯子17共計246個核苷 酸。本發(fā)明所述的DNA片段發(fā)生上述突變后的cDNA序列為SEQN0.3，全長為1069bp，包括 了部分編碼區(qū)(卜768 bp)和完整3端非翻譯區(qū)(769-1069 bp)，所編碼的多肽序列為SEQ N0.4。本發(fā)明所述的DNA片段的大量制備可通過構(gòu)建克隆載體，以及轉(zhuǎn)化到原核或真核宿主 中進行大量復(fù)制，構(gòu)建載體和轉(zhuǎn)化的方法均為常用的方法，所用的載體和宿主細胞可以是常 用的載體和宿主細胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇，這里就不作詳述。本發(fā)明所述的DNA片段與豬肢體發(fā)育密切相關(guān)，其DNA片段的外顯子16前4個密碼 子發(fā)生錯義突變直接導(dǎo)致豬軸前多趾，本發(fā)明利用該DAN分子在正常豬和多趾豬之間的差異， 提供一種檢測豬發(fā)育性狀的方法，具體是(1) 提取代檢測樣本的總RNA，利用下述引物進行RT-PCR: GSP2: 5'-GAC TTG CCG CTC ATT GAC AAC GAC-3'NUP: 5'-MG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3';(2) 利用下述引物對步驟(1) RT-PCR產(chǎn)物進行PCR。 NGSP2: 5'-CGC CGT GGC TTG TAA CAT TCT CTG C-3' NUP: 5'-MG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3';
(3)然后在1%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。正常豬的產(chǎn)物為1197 bp，多趾豬的產(chǎn)物為 636bp。本發(fā)明獲得了比較完整的豬Lmbrl基因cDNA的序列SEQ NO.l，并發(fā)現(xiàn)了該基因存在兩 種剪接類型與正常剪接類型相比，多趾豬Lmbrl基因存在缺失外顯子16和17共246個核 苷酸的突變剪接類型；同時，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)多趾豬的錯義突變位點，并據(jù)此提供了一種快速、 準確檢測豬發(fā)育性狀的方法，為本發(fā)明所述的DNA片段作為豬屠體性狀分子標記輔助選擇的 可行性奠定了基礎(chǔ)。
具體實施方式
例1本發(fā)明DNA片段的獲得1樣品的采集豬宰殺后，立即采集心、肝、脾、肺、腎、前肢肌肉等組織，切成小塊裝在凍存管中， 立即放于液氮中保存，回實驗室后于-8(TC超低溫冰箱中保存。2豬同源EST的尋找及引物設(shè)計以A/小鼠的多趾候選基因C7orf2/Lmbrl基因的編碼序列作為搜索對象，在NCBI網(wǎng)站進 行BLAST,獲得一段豬的同源EST(CV878120， 724bp)，該序列的6bp-636bp部分與人C7orf2 基因序列((登錄號:NM—022458,共2781bp，其中155bp-1627bp部分為CDS))的497bp-1148bp 部分同源性為88%。以這段EST序列為基礎(chǔ)，使用Primer5.0軟件，設(shè)計RT-PCR和RACE 反應(yīng)的引物。ESTF: 5'-GCC TTG CTC ATT CTC GGG AT-3';ESTR: 5'-TCC CTT TGG CAT CGC TGT T-3';GSP1: 5'-TAT MG CCG ACC GGG GTG CAC AAG A -3';NGSP1: 5'-CCC ACA CCA TCC CGA GAA TGA GCA A-3';GSP2: 5'-GAC TTG CCG CTC ATT GAC MC GAC-3';NGSP2: 5'-CGC CGT GGC TTG TAA CAT TCT CTG C-3';NUP: 5'-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3';3總RNA提取及檢測 . 3.1 RNA提取前的準備工作(1)將研缽、玻璃瓶等洗凈，置于37-C烘干后再用高溫烘箱18(TC烘8h(2) RNase-free水的制備使用RNase-free的玻璃瓶，向超純水中加入DEPC至終濃度0.1% (v/v)放置過夜后，高溫高壓滅菌；(3) 將槍頭、離心管、PCR管等放在0.1M的DEPC水中浸泡過夜，高溫高壓滅菌；(4) 75%乙醇用DEPC處理水配制。3.2 RNA提取步驟(1) 組織研磨將超低溫保存的樣品取出稱量50-100mg心臟組織，迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的 研缽中，用研杵研磨，期間不斷加入液氮，直至研磨至粉末狀；(2) 把研磨好的組織用小勺轉(zhuǎn)移至預(yù)先加有l(wèi)ml RNAiso Reagent的1.5ml離心管中，用力振 蕩混勻，靜置5mim(3) 12000g4。C離心5min;(4) 小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中；(5) 向其中加入1/5體積量RNAiso Reagent的氯仿，用力振蕩，室溫靜置5min;(6) 12000g4。C離心10min;(7) 吸取上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，向其中加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，15-30°C 靜置10min;(8) 12000g4。C離心10min;(9) 小心棄去上清，加入lml75。/。的乙醇，輕輕上下顛倒洗滌，12000g4°C離心5min;(10) 小心棄去乙醇，室溫干燥沉淀2-5min，加入40ul RNase-free水溶解沉淀；3.3 RNA質(zhì)量檢測(1) 電泳檢測取5ul RNA+lul 6xLoading Buffer, 150v電泳15min，觀測條帶情況，拍照保 存；(2) OD值測定打開紫外分光光度計電源和程序，預(yù)熱30min，用DEPC處理水把微量比色 皿洗凈，調(diào)零，取出外面的比色皿，把待測樣品稀釋50倍放于比色皿中(2ulRNA+98ulDEPC 處理水)，測定00260、 OD280、 D260/OD280，記錄分析結(jié)果。4反轉(zhuǎn)錄在PCR管中加入以下試劑For preparation of 5，-RACE-Ready cDNA: RNA樣品3ul、 5，-CDS primerlul、 BD SMART II A oligolul; For preparation of 3'陽RACE-Ready cDNA: RNA樣品 3ul、 3，陽CDS primerlul、 ddH20 lul |混合并短暫離心
70'C孵育2min 冰Jh放置2min 短暫離心使試劑到管底在每個管中加入5xFirst-Strand Buffer 2ul、 DTT (20mM) lul、 dNTPMix (10mM) lul、 BD PowerScript Reverse Transcriptase lul用槍頭輕輕吹打混合，短暫離心42。C孵育90lnin (PCR儀中進行) 加入100ul Tricie-EDTA Buffer稀釋產(chǎn)物2'C水浴7min -2^°(:保存?zhèn)溆?'、-RACE擴增反應(yīng)體系在一滅菌的PCR管中加入以下試劑，最先加入PCR-Grade Water,最后加入 50xBD Advantage 2 Polymerase Mix。PCR-Grade Water 34.5ul1 OxBD Advantage 2 PCR Buffer 5 .OuldNTPMix (lOmM) l.Oul50xBD Advantage 2 Polymerase Mix 1 .Oul3， (5，) -RACE Ready cDNA 2.5ulUPM (10x) 5.0ulGSP l.OulTotal50.0ul反應(yīng)條件94 。C30sec1 5cycles72°C3min」94 。C30sec70。C30sec卜5cycles72 °C3min一94 。C30sec68 。C30sec—25cycles72 。C3min一取5ulPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，若沒有條帶將剩下的PCR產(chǎn)物放回PCR儀中，按照如下條件進行反應(yīng)94°C 30sec ，68。C 30sec ^ 5cycles72 。C 3min -電泳檢測(條件同前)，若仍無目的條帶，則進行巢式PCR。將第一輪PCR產(chǎn)物取5ul，用245ul Tricine-EDTA Buffer稀釋作為巢式PCR的模板。 體系如下PCR-Grade Water 36ul10xBD Advantage 2 PCR Buffer 5.0uldNTPMix(10mM) l.Oul5 0 x BD Advantage 2 Polymerase Mix 1. Oul模板 5.OulNUP l.OulNGSP l.OulTotal50.0ul條件:94°C 30sec 68 °C 30sec 72 。C 3min20cycles取5ul電泳檢測。6中間EST部分PCR擴增PCR體系10xBuffer 2.5ul， dNTP 2.0ul， Mg2+2.0ul， ESTF、 ESTR各0.5ul， Taq酶0.125ul， cDNA2.0ul，加滅菌三蒸水至25ul。 PCR條件95。C預(yù)變性5min, 35個循環(huán)(94。C變性30sec， 55。C退火40sec， 72。C延伸lmin)， 72。C延伸10min。平行做兩個管，分別用734號和741號 豬的cDNA作為模版擴增，其它條件相同。取5ulPCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖電泳檢測。7膠回收純化(1) 電泳用大孔梳子做膠。EB染色，lOxLoading Buffer+PCR產(chǎn)物，盡可能點滿孔；100V 電壓電泳30min;(2) 切膠紫外燈下割下含DNA的瓊脂糖塊，使其盡可能小，且動作要迅速，放入事先稱重 的L5ml離心管中，稱重，計算出瓊脂糖的重量；(3) 溶解按照每100g瓊脂糖加入300uiSl液的比例加入S1液，置5(TC水浴鍋中10min，每 2分鐘顛倒混勻一次，使瓊脂糖塊完全溶化；(4) 目的片斷〈500bp時；加入1/3S1液體積的異丙醇，混勻，5(TC溫浴lmiri后，混勻；目的 片斷〉500bp時，可省略此步；
(5) 將溶化后的Agarose液移入吸附柱，離心30sec，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同 一個收集管中；(6) 在吸附柱中加入500ulWl液，離心15sec，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收 集管中；(7) 在吸附柱中加入500ulWl液，靜置lmin，離心15sec，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放 入同一個收集管中；(8) 離心lmin;(9) 將吸附柱放入一個干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，靜置lmin后， 離心lmin，將回收產(chǎn)物貯存于-2(TC。8感受態(tài)細胞的制備(1) 從-8(TC取出一管DH5a大腸桿菌原種，冰上溶解后，在LB瓊脂板上劃線，37""C恒溫培養(yǎng) 箱中過夜培養(yǎng)(12-16h);(2) 挑取單菌落，接種到100mlLB液體培養(yǎng)基中，37。C搖菌12h左右，至006()()達到0.4-0.5;(3) 將菌液轉(zhuǎn)移至兩個預(yù)冷的50ml離心管中，冰浴10-15min， 4000rpm 4'C離心10min，回收 細菌沉淀；(4) 每管加10ml預(yù)冷的0.1M的CaCl2，重懸細菌沉淀；冰浴10-15mim(5) 4°C 4000rpm離心10min，回收細菌沉淀；(6) 重復(fù)(4)、 (5)步；(7) 每管加2mlCaCl2重懸細菌沉淀，這時的細胞可直接用于轉(zhuǎn)化實驗。加入甘油至濃度20%, 分裝成200ul/份，-80"保存。9連接反應(yīng)計算外源片斷與載體的摩爾比(一般插入片斷摩爾數(shù)載體分子摩爾數(shù)=3~8: 1)。連接 反應(yīng)體系(10ui): PMD18-T Vector 0.5ul， Solution I 5.0ul，外源DNA適量，加滅菌水至 10ul。反應(yīng)條件16。C溫育12h， PCR儀中進行。取5ul連接液轉(zhuǎn)化，其余2(TC保存。10轉(zhuǎn)化(1) 取一支感受態(tài)細胞，冰上溶解，加入5ul連接產(chǎn)物，冰浴30min;(2) 40 'C熱激90sec ，立即冰浴2min;(3) 加入500ulLB液體培養(yǎng)基，—37'C復(fù)活50min，鋪制X-Gal、 Amp、 IPTG平板； (4) 37。C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-19h;(5) 將平板置于4'C放置數(shù)小時，使藍斑更明顯；(6) 挑取白斑，接種于裝有3mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，37'C搖菌12h。11陽性克隆的鑒定及測序挑取白色菌落在裝有3mlLB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h挑取少量菌液，涂于含有一定體積滅菌水的離心管中按照PCR體系加入其它成分PCR后電泳檢測陽性克隆測序例2豬發(fā)育性狀的分子檢測(1) 豬血液總RNA的提??；采集待檢測豬個體的頸靜脈血5毫升，肝素抗凝。分離白細胞后，利用大連寶生物工 程有限公司的總RNA提取試劑(D312),依照說明總RNA。(2) RT-PCR擴增；用SMARTTM RACE cDNAAmplification試劑盒，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總RNA l-3ul、3， -CDS primer 1 ul、加去離子水至5 ul， 70°C2 min，置冰上2 min，加入5 X First-Strand Buffer 2ul、 DTT (20mM) 1 ul、 dNTP (10 mM)l ul、 BD PowerScript Reverse Transcriptase 1 ul ， 42 °C 卯min，加入lOOul Tricine-EDTA Buffer稀釋，72。C水浴7min，得到3 ， -RACE-Ready cDNA。 利用UPM (試劑盒提供)和GSP2 (5' -GAC TTG CCG CTC ATT GAC AAC GAC-3') 進行第一輪PCR。 PCR體系和反應(yīng)條件見試劑盒說明書。將第一輪PCR產(chǎn)物取5ul，用 245ul Tricine-EDTA Buffer稀釋，利用NGSP2 (5' -CGC CGT GGC TTG TAA CAT TCT CTG C-3')和NUP (5' -AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT陽3')進行第二輪PCR。 PCR 體系和反應(yīng)條件見例l。(3) 電泳檢測判定片段大小和豬生長發(fā)育類型的確定將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進行電泳。根據(jù)檢測PCR產(chǎn)物的大小來判定豬生長發(fā) 育的類型。正常豬的產(chǎn)物為1197bp，多趾豬的產(chǎn)物為636bp。SEQUENCE LISTING<110>重慶市畜牧科學(xué)院<120> —種與豬多趾相關(guān)的DNA片段<160> 4<170> Patentln version 3.3<210> 1 <211> 1797 <212>腿<213> CRP配套系B系豬 <400> 1acgcggggat ccatggtttg tggaaccttg cctctctctt ttccaatctt tgtttatttg 60 tattgatgcc ctttgccttt ttctttctgg aatcagaagg UUgccggc ctgaaaaagg 120 gaatccgagc ccgaatttta gaaaccctgg tcatgcttgt tctcctggcc ttgctcattc 180 tcgggatggt gtgggtggcc tcggcgctca ttgacaacga cgcggcgagc atggaatctc 240 tatatgatct ctgggaattc tacctaccgt atttatactc ctgtatatca ttgatgggat 300gtttgttact tctcttgtgc accccggtcg gcctctcccg catgtttacg gtcatggggc 360agctgttggt gaagccagcg atcctggaag acctggatga acagatttac attatcaccc 420tagaggaaga agctctccag agacgactaa atggactgtc ttcatcagtg gaatccaatg 480taatggagtt ggaaca柳a cttgaaaatg taaagactct ta柳caaaa Uagagaggc 540gcaaaaaggc ttcagcatgg gaaagaaatt tggtgtatcc tgctgttatg gttctccttc 600ttattgaaac atccatUcc gtcctcttgg tggcUgtaa cattctctgc ctgttggtgg 660atgaaacagc gatgccaaag ggaacaaggg gacctggaat aggaagtgct tctctUctg 720ctUtggttt tgtgggagct gcacUgaaa tcattttgat tttctatcU atggtgtcct 780ctgttgtcgg tUctatagc ctccgatttt ttggagactt tattcccaag aaggatgaca 840caactatgac aaagatcatt ggcaactgtg tatcgatctt ggtcctgagc tctgcgctgc 900 ctgtgatgtc aagaacactg ggaatcacta gatttgatct acttggagac tttggaaggt 960Uaattggct gggaaatttc tatattgtgt tgtcctacaa Utgcttttt gctgttgtga 1020caaccttgtg tctggtcaga aaattcacct ctgcagtgcg agaagaactt ttcaaggccc 1080tagggcttca taaactccac Uatcaaata cttcgaggga ctc柳aaca gcaaagcctt 1140cggccaacgg gcatcagaaa gcactgactt ggagctgaaa tggttgcagc tgtatttttt 1200cacctcctta aagaggcgaa gggcaccgtt gtgatctgtg ttacaggaag agactgccta 1260gactttgagt ccaggggcgg gtagagaatt ctcctgggcc ccgagccttg gtcacacatg 1320ccccgggaat accgtctgct gcccagtggc gtaagctatg gtgggaagga ctgtgtactc 1380atagUcgct gagagttgct gtgtatctga ttcactgtta cctctcatgg catagttgcc 1440agtgctgaag acacttgtaa cttagattU gccttatagg ctgtatgtac cctcagtttt 1500tttaaacaat ttttttgttt gtttccaaaa atcccttaat acccctgcgc tcctgcgtcc 1560attatggagc tataaatgct ccggtaggga ctccttttgt caccaccctc ttcaggcttc 1620
ggtcacttct gtacatgcca atcgaaaacc tcagacttcg gaaaagtacc atgcagcacc 1680 c柳cccaca gcagcagcat tcatgatgta ggaaccggtc tgcagtgtat catgatctga 1740 cgggcgttca gttattaaat tgtaaataat tcttgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1797<210> 2 <211> 391 <212> PRT<213> CRP配套系B系豬 <400> 2Ala Gly lie His Gly Leu Trp Asn Leu Ala Ser Leu Phe Ser Asn Leu 15 10 15Cys Leu Phe Val Leu Met Pro Phe Ala Phe Phe Phe Leu Glu Ser Glu 20 25 30Gly Phe Ala Gly Leu Lys Lys Gly lie Arg Ala Arg lie Leu Glu Thr 35 40 45Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ala Leu Leu lie Leu Gly Met Val Trp 50 55 60Val Ala Ser Ala Leu lie Asp Asn Asp Ala Ala Ser Met Glu Ser Leu 65 70 75 80Tyr Asp Leu Trp Glu Phe Tyr Leu Pro Tyr Leu Tyr Ser Cys lie Ser 85 90 95Leu Met Gly Cys Leu Leu Leu Leu Leu Cys Thr Pro Val Gly Leu Ser 100 105 110Arg Met Phe Thr Val Met Gly Gin Leu Leu Val Lys Pro Ala lie Leu 115 120 125Glu Asp Leu Asp Glu Gin lie Tyr lie lie Thr Leu Glu Glu Glu Ala 130 135 140Leu Gin Arg Arg Leu Asn Gly Leu Ser Ser Ser Val Glu Ser Asn Val 145 150 155 160Met Glu Leu Glu Gin Glu Leu Glu Asn Val Lys Thr Leu Lys Thr Lys 165 170 175Leu Glu Arg Arg Lys Lys Ala Ser Ala Trp Glu Arg Asn Leu Val Tyr 180 185 190Pro Ala Val Met Val Leu Leu Leu lie Glu Thr Ser lie Ser Val Leu 195 200 205Leu Val Ala Cys Asn lie Leu Cys Leu Leu Val Asp Glu Thr Ala Met 210 215 220Pro Lys Gly Thr Arg Gly Pro Gly lie Gly Ser Ala Ser Leu Ser Ala 225 230 235 240Phe Gly Phe Val Gly Ala Ala Leu Glu lie lie Leu lie Phe Tyr Leu 245 250 255Met Val Ser Ser Val Val Gly Phe Tyr Ser Leu Arg Phe Phe Gly Asp 260 265 270Phe lie Pro Lys Lys Asp Asp Thr Thr Met Thr Lys lie lie Gly Asn 275 280 285Cys Val Ser lie Leu Val Leu Ser Ser Ala Leu Pro Val Met Ser Arg 290 295 300Thr Leu Gly lie Thr Arg Phe Asp Leu Leu Gly Asp Phe Gly Arg Phe305 310 315 320Asn Trp Leu Gly Asn Phe Tyr lie Val Leu Ser Tyr Asn Leu Leu Phe 325 330 335Ala Val Val Thr Thr Leu Cys Leu Val Arg Lys Phe Thr Ser Ala Val 340 345 350Arg Glu Glu Leu Phe Lys Ala Leu Gly Leu His Lys Leu His Leu Ser 355 360 365Asn Thr Ser Arg Asp Ser Glu Thr Ala Lys Pro Ser Ala Asn Gly His 370 375 380Gin Lys Ala Leu Thr Trp Ser 385 390<210> 3 <211> 細 <212>腿<213> CRP配套系B系豬多趾突變株 <400> 3gccttgctca ttctcgggat ggtgtgggtg gcctcggcgc tcattgacaa cgacgcggcg 60 agcatggaat ctctatatga tctctgggaa ttctacctac cgtatttata ctcctgtata 120 tcattgatgg gatgtttgtt acttctcUg tgcaccccgg tcggcctctc ccgcatgttt 180 acggtcatgg ggcagctgtt ggtgaagcca gcgatcctgg aagacctgga tgaacagatt 240 tacattatca ccctagagga agaagctctc cagagacgac taaatggact gtcttcatca 300 gtggaatcca atgtaatgga gttggaacaa gaacttgaaa atgtaa柳c tctta柳ca 360 aaattagaga ggcgcaaaaa ggcttcagca tgggaaagaa aUtggtgta tcctgctgtt 420 atggttctcc Ucttattga aacatccatt tccgtcctct tggtggcttg taacattctc 480 tgcctgttgg tggatgaaac agcgatgcca aagggaacaa ggggacctgg aataggaagt 540gcttctcttt ctgcttttgg ttttgtggga gctgcacUg aaatcatttt gattttctat 600cttatggtgt cctctgttgt cggtttctat agcctccgat UtUggaga ctttattccc 660aagaaggatg acacaactat gacaaagatc attggcaact gtgtatcgat cttggtcctg 720agctctgcgc tgcctgtgat gtcaagaaca ctggctgcag tgctgtgaga ctagaaacta 780cgatttaaaa aaaccctcaa aataccaatg tggacggcag ctaaacaata cgttgctaaa 840caaccagtgg gtctctttga agaaatgaag aaatcaaaga agaaatttta aaatactcta 900gacaaatgaa aatgaaaata cagtgatcca aaatatatgg gattcagcaa aagcaagtat 960aagagggaca tttatagtaa tataagccta tctcaggaaa ca柳aaaat ctcaaatcaa 1020gaatcttacc atatacccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1069<210> 4 <211> 255 <212> PRT<213> 1 GCCTTGCTCA TTCTCGGGAT GGTGTGGGTG GCCTCGGCGC TCATTGACM CGACGCGGCG<400> 4Ala Leu Leu lie Leu Gly Met Val Trp Val Ala Ser Ala Leu lie Asp 15 10 15Asn Asp Ala Ala Ser Met Glu Ser Leu Tyr Asp Leu Trp Glu Phe Tyr 20 25 30Leu Pro Tyr Leu Tyr Ser Cys lie Ser Leu Met Gly Cys Leu Leu Leu 35 40 45Leu Leu Cys Thr Pro Val Gly Leu Ser Arg Met Phe Thr Val Met Gly 50 55 60Gin Leu Leu Val Lys Pro Ala lie Leu Glu Asp Leu Asp Glu Gin lie 65 70 75 80 Tyr lie lie Thr Leu Glu Glu Glu Ala Leu Gin Arg Arg Leu Asn Gly 85 90 95Leu Ser Ser Ser Val Glu Ser Asn Val Met Glu Leu Glu Gin Glu Leu 100 105 110Glu Asn Val Lys Thr Leu Lys Thr Lys Leu Glu Arg Arg Lys Lys Ala 115 120 125Ser Ala Trp Glu Arg Asn Leu Val Tyr Pro Ala Val Met Val Uu Leu 130 135 140Leu lie Glu Thr Ser lie Ser Val Leu Leu Val Ala Cys Asn lie Leu 145 150 155 160Cys Leu Leu Val Asp.Glu Thr Ala Met Pro Lys Gly Thr Arg Gly Pro 165 170 175
Gly lie Gly Ser Ala Ser Leu Ser Ala Phe Gly Phe Val Gly Ala Ala 180 185 190Leu Glu lie lie Leu lie Phe Tyr Leu Met Val Ser Ser Val Val Gly 195 200 205Phe Tyr Ser Leu Arg Phe Phe Gly Asp Phe lie Pro Lys Lys Asp Asp 210 215 220Thr Thr Met Thr Lys lie lie Gly Asn Cys Val Ser lie Leu Val Leu 225 230 235 240Ser Ser Ala Leu Pro Val Met Ser Arg Thr Leu Ala Ala Val Leu 245 250 25權(quán)利要求
1、一種與豬多趾相關(guān)的DNA片段，該DNA片段是下列多核苷酸之一(1)核苷酸序列為SEQ NO.1和SEQ NO.3的多核苷酸；(2)編碼氨基酸序列為SEQ NO.2和SEQ NO.4的多肽的多核苷酸。
2、 權(quán)利要求1所述的豬多趾相關(guān)的DNA片段，其編碼的多肽的氨基酸序列為SEQNO.2 或SEQN0.4。
3、 含有權(quán)利要求1所述的DNA片段的表達載體。
4、 含有權(quán)利要求3所述的表達載體的細胞系。
5、 一種檢測豬發(fā)育性狀的方法，該方法是(1) 提取代檢測樣本的總RNA，利用下述引物進行RT-PCR: GSP2: 5'-GAC TTG CCG CTC ATT GAC AAC GAC-3'，NUP: 5'-AAG CAG TGG TAT CM CGC AGA GT-3';(2) 利用下述引物對步驟(1) RT-PCR產(chǎn)物進行PCR。 NGSP2: 5'-CGC CGT GGC TTG TM CAT TCT CTG C-3'，NUP: 5'-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3';(3) 然后在P/。瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。正常豬的產(chǎn)物為1197 bp，多趾豬的產(chǎn)物為 636bp。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種與豬多趾相關(guān)的DNA片段，該DNA片段是下列多核苷酸之一(1)核苷酸序列為SEQ NO.1和SEQ NO.3的多核苷酸；(2)編碼氨基酸序列為SEQ NO.2和SEQNO.4的多肽的多核苷酸。本發(fā)明所述的DNA片段與豬肢體發(fā)育密切相關(guān)，其DNA片段的外顯子16前4個密碼子發(fā)生錯義突變直接導(dǎo)致豬軸前多趾，因此，本發(fā)明還提供了一種檢測豬發(fā)育性狀的方法，該方法是利用下述引物擴增豬總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5′-CGC CGT GGC TTGTAA CAT TCT CTG C-3′，5′-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3′，正常豬的產(chǎn)物為1197bp，多趾豬的產(chǎn)物為636bp。
文檔編號C12N15/12GK101157923SQ200710121818
公開日2008年4月9日 申請日期2007年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日
發(fā)明者王金勇, 白小青, 趙獻之 申請人:重慶市畜牧科學(xué)院