專利名稱：一種適于規(guī)模化生產(chǎn)的小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥提取技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NerveGrowth Factor，NGF)的制備方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve Growth Factor，NGF)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一不僅對(duì)中樞及外周神經(jīng)的正常神經(jīng)細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)因子作用，而且具有調(diào)節(jié)損傷神經(jīng)修復(fù)機(jī)能的生物活性分子。神經(jīng)生長(zhǎng)因子在臨床上有重大的應(yīng)用價(jià)值，目前的適應(yīng)癥主要包括各種外周神經(jīng)病、視神經(jīng)損傷、脊椎損傷、顱腦損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺氧和缺血造成的損傷及早老性癡呆等。NGF可以從雄性小鼠的頜下腺、人胎兒腦髓、人胎盤及蛇毒等組織中提取，也可以通過基因工程的方法制備。其中，基因工程表達(dá)的NGF是發(fā)展趨勢(shì)，但由于神經(jīng)生長(zhǎng)因子須在CHO細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)中才有較好的生物活性，技術(shù)難度大，形成工業(yè)化生產(chǎn)尚有相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。而人胎兒腦髓、人胎盤及蛇毒等組織都存在來源困難、批間次差異大、回收低、成本高的缺陷。我們選用雄性小鼠的頜下腺作為原材料來源，不僅來源方便、得率高，而且由于小鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心專門提供，每批出據(jù)檢測(cè)報(bào)告，保證了原材料的質(zhì)量穩(wěn)定性、避免了鼠源污染的可能。
現(xiàn)有的小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，具體步驟為小鼠頜下腺經(jīng)高速勻漿后，勻漿液于4°C靜置30min后，12000rpm離心30min，收集上清液，對(duì)pH6.8，20mmol/L PB溶液(pH6.8的磷酸鹽緩沖液)透析16h，透析液上CM-52柱(I柱)，收集流穿液對(duì)水透析16h，酸化解離液上CM-52柱(II柱)，收集目的蛋白峰，上樣于含0.15mol/LNaCl的pH7.2，20mmol/L的PB溶液平衡的Superdex75prep grade凝膠過濾柱，收集洗脫峰，為小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液。
此制備過程中所采用的是羧甲基纖維素陽離子層析介質(zhì)(CM-52)，此介質(zhì)在使用過程中由于流速太慢，柱床高度會(huì)隨緩沖液濃度及pH改變，而且不能承受0.1M以上NaOH在位清洗，重生效果差，若用于規(guī)模化生產(chǎn)，就會(huì)影響生產(chǎn)效率。另外，現(xiàn)有技術(shù)中，小鼠頜下腺勻漿液及I柱流穿液均需透析24h，使生產(chǎn)周期過長(zhǎng)，增加了蛋白被污染的可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)效率高、采用超濾替代透析以及使用高流速、高載量的離子交換凝膠Sepharose XL(SP XL)和Sepharose Fast Flow(SP FF)來制備小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子、適于規(guī)?；a(chǎn)的小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的純化方法。
具體操作方法如下(1)小鼠頜下腺經(jīng)高速勻漿后，勻漿液于4℃靜置30min后，12000rpm離心30min，收集上清液，選用截留分子量為10K的中空纖維柱超濾上清液至pH6.8，20mmol/L PB溶液中。
(2)超濾液上樣于pH6.8，20mmol/L PB溶液平衡好的Sepharose XL柱(瓊脂糖凝膠SP XL柱)(I柱)層析，收集流穿液。
(3)流穿液對(duì)截留分子量為10K的中空纖維柱超濾至純水中，酸化解離。
(4)酸化解離液上Sepharose Fast Flow柱(瓊脂糖凝膠SP FF柱)(II柱)層析，洗脫后，收集目的蛋白峰，上樣于含0.15mol/L氯化鈉溶液的pH7.2，20mmol/L的PB溶液平衡的Superdex 75 prep grade凝膠過濾柱，收集目的蛋白，得小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)原液。
本發(fā)明方法與原有的方法相比大大縮短了生產(chǎn)周期。
步驟(1)與步驟(2)中所采用的中空纖維柱，內(nèi)有在超濾過程中起決定作用的是超濾膜。中空纖維超濾膜是以高分子材料采用特殊工藝制成的不對(duì)稱半透膜，呈中空毛細(xì)管狀，微孔密布管壁。在壓力的作用下能使小分子物質(zhì)透過膜成為超濾液，其它的高分子物質(zhì)，膠體，超微粒子，細(xì)菌等則被膜面阻擋成為濃縮液，從而達(dá)到物質(zhì)的分離，濃縮和提純之目的。超濾分離對(duì)于極稀溶液中分離溶質(zhì)具有廣泛的適應(yīng)性，與其它分離過程相比，有如下特點(diǎn)1、超濾過程在常溫低壓下進(jìn)行，能耗低，不需加熱，無熱效應(yīng)及相態(tài)變化，不需加入任何其它物質(zhì)即可達(dá)到分離、濃縮、純化及分級(jí)等目的，故特別適用于1)熱敏性物質(zhì)(生物制品、菌體、蛋白質(zhì)等)的分離濃縮。2)極稀溶液的濃縮回收。3)恒體積恒濃度下的脫鹽純化。2、超濾膜耐化學(xué)侵蝕，PH適應(yīng)范圍廣。
步驟(2)中采用瓊脂糖凝膠Sepharose XL為一柱，有以下特點(diǎn)a、介質(zhì)載體為剛性材料，粒度為90μm，流速快，蛋白結(jié)合量大，線速度可達(dá)到300～500cm/小時(shí)，對(duì)粗提液處理速度快。b、該介質(zhì)再生效果好?；钚苑逑疵摵?，用強(qiáng)堿溶液進(jìn)行在位清洗，可以有效清洗出吸附在介質(zhì)上的色素。c、該介質(zhì)裝填十分容易不需特殊設(shè)備，可以按比例放大適合工業(yè)化生產(chǎn)。
步驟(4)中采用瓊脂糖凝膠Sepharose Fast Flow柱作為二柱，具有高流速、高載量、高化學(xué)穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，配合有效的在位清洗，可反復(fù)重生上千次。
本發(fā)明通過使用超濾替代透析，大大縮短了生產(chǎn)周期。采用SP XL及SP FF柱取代傳統(tǒng)的CM-52柱，流速快，載量高，并且可以在位清洗，提高了生產(chǎn)效率，適用于規(guī)?；a(chǎn)。


圖1為本發(fā)明步驟(2)中超濾液過Sepharose XL柱(瓊脂糖凝膠SP XL柱)層析的色譜圖，其中峰1A代表流穿液。
圖2為本發(fā)明步驟(3)中酸化解離液過Sepharose Fast Flow柱(瓊脂糖凝膠SPFF柱)層析的色譜圖，其中小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子目的蛋白峰在組分2A中被洗脫出來。
圖3為本發(fā)明目的蛋白峰過Superdex 75 prep grade柱(凝膠柱)過濾的色譜圖，純的小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子分布在峰3A中。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合通過實(shí)施例，結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述。
實(shí)施例一種適于規(guī)模化生產(chǎn)的小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的純化方法，具體操作方法如下1.頜下腺處理取出冷凍的雄性小鼠頜下腺，融化后，加入5倍預(yù)冷的高壓滅菌水，放入勻漿器中勻漿。勻漿后，勻漿液于4℃靜置30min后，12000rpm離心30min，收集上清液，選用截留分子量為10K的中空纖維柱超濾上清液至pH6.8，20mmol/L PB溶液中。
2.Sepharose XL(SP XL)(瓊脂糖凝膠SP XL柱)層析將超濾后的上清液上樣于pH6.8，20mmol/L PB溶液平衡好的Sepharose XL陽離子交換柱(XK 26/50，Amersham Biosciences公司)上，流速10ml/min，收集流穿液，見圖1。
3.流穿液酸化解離選用截留分子量為10K的中空纖維柱超濾，將流穿液超濾至純水中。根據(jù)超濾液的總量，按比例加入pH4.0，lmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液，至終濃度為50mmol/L，同時(shí)加入分析純氯化鈉(NaCl)至終濃度為0.4mol/L，4℃放置10min，10,000rpm離心40min，取上清液。
4.Sepharose Fast Flow(SP FF)(瓊脂糖凝膠SP FF柱)層析將酸化解離后上清液上樣于含0.4mol/L NaCl溶液的pH4.0，50mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡后的SP FF柱，流速10ml/min。上樣完畢，依次用含0.4mol/L NaCl溶液的pH4.0，50mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖；pH4.0，50mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖；pH9.0，50mmol/L三羧甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-Cl)洗柱及洗脫雜蛋白，然后用含0.4mol/LNaCl溶液的pH9.0，50mmol/LTris-Cl緩沖液洗脫并收集目的蛋白，見圖2。
5.Superdex 75 prep grade柱(凝膠柱)過濾將收集到的目的蛋白直接上樣于含0.15mol/L氯化鈉溶液的pH7.2，20mmol/L的PB溶液平衡后的Superdex 75 prep grade凝膠過濾柱(XK26/100)，流速8ml/min，收集目的蛋白即得小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液，見圖3。
權(quán)利要求
1.一種適于規(guī)?；a(chǎn)的小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的純化方法，包括將雄性小鼠頜下腺經(jīng)高速勻漿后，勻漿液于4℃靜置30min后，12000rpm離心30min，收集上清液，其特征在于(1)、選用截留分子量為10K的中空纖維柱超濾上清液至pH6.8，20mmol/L PB溶液，即pH6.8的磷酸鹽緩沖液中；(2)、將超濾后的上清液上樣于pH6.8，20mmol/L PB溶液平衡好的Sepharose XL上層析，流速10ml/min，收集流穿液；(3)、選用截留分子量為10K的中空纖維柱超濾流穿液至純水中，酸化解離后，在離心機(jī)中10,000rpm離心40min，得到酸化解離后的上清液；(4)、將酸化解離后的上清液上樣于含0.4mol/L NaCl的pH4.0，50mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡后的Sepharose Fast Flow柱上層析，流速10ml/min；上樣完畢，依次用含0.4mol/L NaCl的pH4.0，50mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖；pH4.0，50mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖；pH9.0，50mmol/L三羧甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，洗柱及洗脫雜蛋白，然后用含0.4mol/L NaCl的pH9.0，50mmol/L三羧甲基氨基甲烷—鹽酸緩沖液洗脫，收集目的蛋白峰；(5)、將收集目的蛋白峰直接上樣于含0.15mol/L氯化鈉溶液，pH7.2，20mmol/L的PB溶液平衡后的Superdex 75 prep grade柱，流速8ml/min，收集目的蛋白，即為小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液。
全文摘要
本發(fā)明涉及小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法。所要解決的問題是提供一種適于規(guī)模化生產(chǎn)的小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的純化方法。特點(diǎn)是將勻漿、離心后小鼠頜下腺上清液，采用截留分子量為10K的中空纖維柱超濾上清至pH6.8，20mmol/L磷酸鹽緩沖液中，超濾液上樣于Sepharose XL柱層析，再用截留分子量為10K的中空纖維柱超濾至純水中，超濾液酸解后，上樣于Sepharose FF柱層析，收集目的蛋白，上樣于Superdex 75prepgrade柱，收集目的蛋白，得小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子原液。本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比大大縮短了生產(chǎn)周期；提高了生產(chǎn)效率，適用于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/34GK1850858SQ20061004063
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月18日
發(fā)明者陳薇, 于穎群, 付玲, 王傳生, 徐曉紅, 黃小楓 申請(qǐng)人:安徽金大陸生物制藥有限公司