專利名稱：一種人白細(xì)胞介素21的核苷酸序列及生產(chǎn)成熟的人白細(xì)胞介素21的方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種在原核細(xì)胞中表達成熟的人白細(xì)胞介素21的核苷酸序列，本發(fā)明還涉及利用該核苷酸序列生產(chǎn)成熟的人白細(xì)胞介素21的方法和該序列在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素21(Interleukin 21，IL-21)是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，與白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素15及白細(xì)胞介素4高度同源，具有廣泛的生物學(xué)活性，主要體現(xiàn)在協(xié)同刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞、活化自然殺傷細(xì)胞(NK)，增強機體的特異性和非特異性免疫功能，從而發(fā)揮抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用，是一種有較好開發(fā)前景的新型生物藥物。
白細(xì)胞介素21只有活化的T淋巴細(xì)胞才能分泌。國外的相關(guān)研究都是以抗CD3抗體等價格昂貴的活化劑才能得到白細(xì)胞介素21的轉(zhuǎn)錄和表達。
白細(xì)胞介素21的開放讀碼框編碼產(chǎn)物為162個氨基酸的前體，在其第31位Gly處被酶切后表達131個氨基酸的成熟白細(xì)胞介素21蛋白質(zhì)，其中有2對半胱氨酸殘基參與其空間構(gòu)象的折疊。由于原核細(xì)胞內(nèi)缺乏這種蛋白質(zhì)成熟的切除機制，故在原核表達體系中要想表達具有生物學(xué)活性的白細(xì)胞介素21，必須去除其N端31個氨基酸的編碼基因序列。同時經(jīng)過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素21成熟蛋白質(zhì)編碼基因序列中有三分之一(44/132)的大腸桿菌罕見密碼子，故其很難在大腸桿菌表達體系中表達或表達量很低(低于10％)。國外相關(guān)機構(gòu)表達人白細(xì)胞介素21都是用真核表達系統(tǒng)進行，2003年日本學(xué)者用原核表達體系表達人白細(xì)胞介素21時，并沒有采用原始的人白細(xì)胞介素21基因序列，而是采用了人工合成序列，估計也是基于這種考慮。并且，大腸桿菌表達系統(tǒng)表達產(chǎn)物多存在于細(xì)胞質(zhì)中，有些甚至形成包涵體，喪失其生物學(xué)活性。
通過定點突變的方法可以置換DNA序列中的單個或多個堿基，并且在密碼子簡并性的原則下不改變其編碼產(chǎn)物的氨基酸的序列，得到高效的原核表達體系。目前沒有采用這種方法制備人白細(xì)胞介素21原核表達體系，制備成熟的具有生物活性的人白細(xì)胞介素21。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在原核細(xì)胞中表達成熟的人白細(xì)胞介素21的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)成熟的人白細(xì)胞介素21的方法。
本發(fā)明通過定點突變的方法置換人白細(xì)胞介素21編碼基因序列中原核細(xì)胞罕見密碼子，使其變換為原核細(xì)胞偏好密碼子，從而得到可以在原核細(xì)胞中高效表達的人白細(xì)胞介素21突變編碼基因序列，并制備該序列的高效原核表達系統(tǒng)，從而可以直接獲得成熟的具有生物學(xué)活性的人白細(xì)胞介素21。
本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實現(xiàn)的一種人白細(xì)胞介素21的核苷酸序列，該序列為SEQ ID No.1。
所述核苷酸序列編碼的人白細(xì)胞介素21成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該序列為SEQID No.2。
利用核苷酸序列SEQ ID No.1生產(chǎn)成熟的人白細(xì)胞介素21的方法，該方法通過制備人白細(xì)胞介素21突變編碼基因序列SEQ ID No.1，將該序列導(dǎo)入表達載體，形成重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，培養(yǎng)增殖，誘導(dǎo)，提取，純化，即可得到序列為SEQID No.2的成熟人白細(xì)胞介素21。
所述的方法，其中制備人白細(xì)胞介素21突變編碼基因序列SEQ ID No.1的方法是通過定點突變的方法置換人白細(xì)胞介素21編碼基因序列中原核細(xì)胞罕見密碼子，使其變換為原核細(xì)胞偏好密碼子，從而得到人白細(xì)胞介素21突變編碼基因序列SEQ ID No.1所述的方法，其中重組載體為重組質(zhì)粒rMuhIL-21/pET22b。該重組質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌表達體系中高效表達表達，且表達產(chǎn)物定位于質(zhì)周腔，易于純化，并具有生物學(xué)活性，可以作為生物工程藥物。
所述的方法，其中原核細(xì)胞為大腸桿菌。
所述的核苷酸序列(SEQ ID No.1)或所述的氨基酸序列(SEQ ID No.2)在制備基因工程藥物中的應(yīng)用。所述的基因工程藥物為免疫調(diào)節(jié)劑或抗腫瘤藥物。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次用定點突變的方法獲得原核細(xì)胞(如大腸桿菌)偏好的人白細(xì)胞介素21成熟蛋白質(zhì)編碼的突變核苷酸序列。
本發(fā)明采用pET22b表達體系表達人白細(xì)胞介素21，其表達產(chǎn)物位于質(zhì)周腔內(nèi)，保持了天然構(gòu)象，從而可以直接獲得成熟的具有生物學(xué)活性的人白細(xì)胞介素21。
本發(fā)明構(gòu)建了rMuhIL-21/pET22b，其在大腸桿菌中可以高效表達，產(chǎn)物易于分離純化，產(chǎn)物具有生物學(xué)活性，可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用，是新的基因工程藥物。
本發(fā)明提供的核苷酸序列可以在原核細(xì)胞中直接高效表達出成熟的具有生物學(xué)活性的人白細(xì)胞介素21，該方法適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)人白細(xì)胞介素21，該核苷酸序列及其表達的氨基酸序列可用于制備基因工程藥物。


圖1是本發(fā)明獲得的人白細(xì)胞介素21成熟蛋白質(zhì)編碼核苷酸(gbc)和GenBank原始人白細(xì)胞介素21蛋白質(zhì)編碼核苷酸(ori)比對圖。下劃線者為核苷酸突變。
圖2是本發(fā)明獲得的人白細(xì)胞介素21成熟蛋白質(zhì)氨基酸組成(gbc)和GenBank原始人白細(xì)胞介素21蛋白質(zhì)氨基酸組成(ori)比對圖。下劃線者為氨基酸突變。
圖3是本發(fā)明獲得的人白細(xì)胞介素21成熟蛋白質(zhì)促進人T淋巴細(xì)胞增殖和協(xié)同增殖的實驗結(jié)果圖。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
實施例1人白細(xì)胞介素21成熟蛋白質(zhì)編碼基因及其高效原核表達系統(tǒng)的建立具體操作包括以下步驟1、人T淋巴細(xì)胞的活化及總RNA的提取取正常志愿者外周靜脈血2份，以淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，混合重懸于含10％小牛血清的RLM-1640完全培養(yǎng)基，加入PHA 5μg/106細(xì)胞，培養(yǎng)48小時。收集活化的細(xì)胞。將細(xì)胞離心后加Tritrol 1ml，裂解2min后加200μl氯仿，劇烈混勻，12000rpm離心，吸取水相后以異丙醇沉淀，最后以不含有RNA酶的水溶解，95℃變性后-20℃保存。
2、RT-PCR擴增人白細(xì)胞介素21成熟蛋白基因編碼區(qū)按常規(guī)方法AMV酶，隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(42℃，1hour)。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性2min；94℃，1min；54℃，30sec；72℃，30sec，共35個循環(huán)；最后1個循環(huán)，72℃延伸7min。然后置于4℃終止反應(yīng)并儲存。根據(jù)質(zhì)粒載體和GenBank登錄的IL-21基因序列自行進行引物設(shè)計，上游引物GBup為5’-tgtcgctagctcctggagac tca-3’(SEQ ID No.5)；下游引物GBlow為5’-ccgggatatcctaggagaga tg-3’(SEQ IDNo.6)。上下游引物序列中下劃線部分分別是Nhe I和Hind III酶切位點，擴增出IL-21分子成熟段基因編碼序列。
3、PCR產(chǎn)物的定向克隆PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體(pET22b)分別用Nhe I和Hind III雙酶切，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。紫外分光光度計定量。連接及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化擴增按3∶1(IL-21質(zhì)粒)的摩爾比混合待連接片段和切開的載體，于4℃反應(yīng)12h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，卡那霉素瓊脂平板篩選。取陽性單克隆擴增，PCR初步篩選陽性克隆，并抽提出重組hIL-21/pET22b質(zhì)粒。
重組質(zhì)粒的鑒定酶切電泳鑒定重組質(zhì)粒用Nhe I和Hind III雙酶切，電泳鑒定。
測序鑒定測序引物為T7啟動子(5’-taa tac gac tca cta tag gga ga-3’)。送Invitrogene公司進行自動測序，測得序列為SEQ ID No.3。
根據(jù)以上序列(SEQ ID No.3)，使用生物軟件，得出人白細(xì)胞介素21成熟蛋白質(zhì)的化學(xué)一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)為SEQ ID No.4。
4、hIL-21/pET22b質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達將鑒定過的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，涂于LA平板。挑選單個克隆于2ml液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)接于1L液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約0.6時，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)于37℃振蕩培養(yǎng)。收集誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)物，12％SDS-PAGE電泳鑒定表達情況。結(jié)果顯示目的蛋白質(zhì)無表達。
5、突變基因的獲得自行設(shè)計突變引物，以hIL-21基因為模板，PCR擴增出相應(yīng)突變的片段。最后以GB1(SEQ ID No.7)和GBlow(SEQ ID No.6)為上下游引物(GB15’-tgtcgctagc ccatggatcg tc-3’)，以稀釋的上述產(chǎn)物為模板，擴增出完整的定點突變hIL-21基因(MuhIL-21)。
6、MuhIL-21/pET22b質(zhì)粒的構(gòu)建以Nhe I和Xho I分別酶切MuhIL-21 PCR產(chǎn)物和pET22b質(zhì)粒，純化后以T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α后，PCR篩選陽性克隆后，酶切和測序鑒定其序列，序列結(jié)果為SEQ ID No.1。
根據(jù)以上序列，使用生物軟件，得出突變?nèi)税准?xì)胞介素21成熟蛋白質(zhì)的化學(xué)一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)為SEQ ID No.2。
本發(fā)明中編碼人白細(xì)胞介素21的突變基因序列和GenBank原始報道序列有95個核苷酸突變，具體位置和突變情況如圖1及表1所示。
本發(fā)明中突變?nèi)税准?xì)胞介素21成熟蛋白質(zhì)氨基酸序列和GenBank原始蛋白質(zhì)氨基酸序列只有1個突變，具體位置及突變情況如圖2及表2所示。
表1編碼人白細(xì)胞介素21的突變基因序列和GenBank原始序列核苷酸突變情況

表2突變?nèi)税准?xì)胞介素21成熟蛋白走和GenBank原始蛋白質(zhì)氨基酸突變情況

7、MuhIL-21/pET22b質(zhì)粒的表達將鑒定過的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，涂于LA平板。挑選單個克隆于2ml液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)接于1L液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約0.6時，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)于37℃振蕩培養(yǎng)。收集誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)物，12％SDS-PAGE電泳鑒定表達情況。結(jié)果顯示目的蛋白質(zhì)的表達約占菌體蛋白質(zhì)總量的40％。
8、表達產(chǎn)物的Western Blot鑒定IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)12％SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜以PBST洗滌后，以含5％脫脂奶粉的PBST封閉1h。封閉后的PVDF膜洗滌后分別以hIL-21單抗(羊抗人，1∶200，37℃，2h)和HRP標(biāo)記的二抗(兔抗羊，1∶2000，37℃，1h)孵育?？贵w孵育后洗滌，加DAB和H2O2，避光放置5-10min顯色。結(jié)果顯示表達產(chǎn)物為人白細(xì)胞介素21。
9、rhIL-21蛋白質(zhì)的分離純化挑取MuhIL-21/pET22b單克隆，2ml LA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接到1L培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600約0.6時，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)8h，收集菌體。將上述收集的菌體以PBS重懸后離心去上清。沉淀以高滲緩沖液重懸，0℃滲透30min后，離心收集上清。分別以CM-52纖維素離子交換層析和Sephedax 50凝膠層析柱純化。反相層析檢測結(jié)果顯示純度達到95％。
10、rhIL-21蛋白質(zhì)生物學(xué)活性檢測Ficoll分離正常志愿者抗凝靜脈血中單個核淋巴細(xì)胞(PBMC)，以抗CD3抗體及磁珠包被二抗分離T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。以上述分離的T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以不同濃度的rhIL-21(100ng-10μg)為刺激因子，分單獨刺激組和協(xié)同刺激組。以抗CD3抗體作為增殖實驗的陽性對照和協(xié)同刺激因子，每組設(shè)3復(fù)孔，每孔加入以上所得T細(xì)胞懸液，培養(yǎng)48h后檢測細(xì)胞總數(shù)。結(jié)果顯示rhIL-21可以協(xié)同增強T細(xì)胞增殖活性(見圖3)，說明重組人白細(xì)胞介素21具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性。
11、rhIL-21蛋白質(zhì)抗腫瘤活性檢測Ficoll分離正常志愿者抗凝靜脈血中單個核淋巴細(xì)胞(PBMC)，加入rhIL-21蛋白質(zhì)，使其濃度達到1ug/106細(xì)胞。分別以刺激活化和沒有刺激活化的淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，人肝癌細(xì)胞SMMC-7721為靶細(xì)胞，效靶比50比1，每組設(shè)4復(fù)孔，培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)過程中再分別設(shè)置組別加入或不加rhIL-21蛋白質(zhì)，終濃度為0.1ug/ml。培養(yǎng)結(jié)束以Promega公司的CellTiter-Blue Cell ViabilityAssay試劑盒檢測，結(jié)果以抑瘤活性表示，計算公式如下抑瘤活性＝{(效應(yīng)細(xì)胞組+靶細(xì)胞組)-效靶細(xì)胞組}/靶細(xì)胞組結(jié)果如下表

結(jié)果顯示rhIL-21活化的淋巴細(xì)胞有良好的抗腫瘤細(xì)胞活性。
<110>中國藥科大學(xué)<120>一種人白細(xì)胞介素21的核苷酸序列及生產(chǎn)成熟的人白細(xì)胞介素21的方法和應(yīng)用<160>7<210>1<211>396<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>定點突變的人白細(xì)胞介素21的核苷酸序列<400>
atg gat cgt cac atg att cgt atg cgt cag ctt atc gac atc gtg gat 48Met Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp1 5 10 15cag ttg aaa aac tac gtg aat gac ctg gtc cca gag ttc ctg ccg gcc 96Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala20 25 30ccg gaa gat gtc gag acc aat tgt gag tgg agc gcg ttc tct tgc ttc 144Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe35 40 45cag aaa gcg cag ctt aaa tcc gcc aac acc ggt aac aac gag cgc atc 192Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile50 55 60att aac gtg tcc atc aaa aag ctc aaa cgc aag cca ccg agc aca aat 240Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn65 70 75 80gcg ggg cgc cgc caa aaa cat cgc ctc aca tgc ccc tcc tgc gat tct 288Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser85 90 95tac gaa aaa aaa ccg ccg aaa gag ttc ctg gag cgt ttc aaa tcc ctc 336Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu100 105 110ttg cag aaa atg atc cat cag cat ctg tcc tca cgc act cat ggt tct 384Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser115 120 125gaa gat tcc tga 396Glu Asp Ser130<210>2
<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由定點突變的人白細(xì)胞介素21的核苷酸序列表達的氨基酸序列<400>
Met Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp1 5 10 15Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala20 25 30Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile50 55 60Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn65 70 75 80Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser85 90 95Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu100 105 110Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser115 120 125Glu Asp Ser130<210>3<211>396<212>DNA<213>人白細(xì)胞介素21的核苷酸序列<400>
caa gat cgc cac atg att aga atg cgt caa ctt ata gat att gtt gat 48Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp1 5 10 15cag ctg aaa aat tat gtg aat gac ttg gtc cct gaa ttt ctg cca gct 96Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala20 25 30cca gaa gat gta gag aca aac tgt gag tgg tca gct ttt tcc tgt ttt 144Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe35 40 45cag aag gcc caa cta aag tca gca aat aca gga aac aat gaa agg ata 192Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile50 55 60atc aat gta tca att aaa aag ctg aag agg aaa cca cct tcc aca aat 240Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn
65 70 75 80gca ggg aga aga cag aaa cac aga cta aca tgc cct tca tgt gat tct 288Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser85 90 95tat gag aaa aaa cca ccc aaa gaa ttc cta gaa aga ttc aaa tca ctt 336Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu100 105 110ctc caa aag atg att cat cag cat ctg tcc tct aga aca cac gga agt 384Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser115 120 125gaa gat tcc tga 396Glu Asp Ser130<210>4<211>131<212>PRT<213>人白細(xì)胞介素21的氨基酸序列<400>
Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp1 5 10 15Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala20 25 30Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile50 55 60Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn65 70 75 80Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser85 90 95Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu100 105 110Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser115 120 125Glu Asp Ser130<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工設(shè)計的引物<400>
tgtcgctagc tcctggagac tca 23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工設(shè)計的引物<400>
ccgggatatc ctaggagaga tg 22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工設(shè)計的引物<400>
tgtcgctagc ccatggatcg tc 2權(quán)利要求
1.一種人白細(xì)胞介素21的核苷酸序列，該序列為SEQ ID No.1。
2.權(quán)利要求1所述核苷酸序列編碼的人白細(xì)胞介素21成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該序列為SEQ ID No.2。
3.利用權(quán)利要求1所述核苷酸序列生產(chǎn)成熟的人白細(xì)胞介素21的方法，其特征在于制備人白細(xì)胞介素21突變編碼基因序列SEQ ID No.1，將該序列導(dǎo)入表達載體，形成重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，培養(yǎng)增殖，誘導(dǎo)，提取，純化，即可得到序列為SEQ ID No.2的成熟人白細(xì)胞介素21。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于制備人白細(xì)胞介素21突變編碼基因序列SEQ ID No.1的方法是通過定點突變的方法置換人白細(xì)胞介素21編碼基因序列中原核細(xì)胞罕見密碼子，使其變換為原核細(xì)胞偏好密碼子，從而得到人白細(xì)胞介素21突變編碼基因序列SEQ ID No.1
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于重組載體為重組質(zhì)粒rMuhIL-21/pET22b。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的原核細(xì)胞為大腸桿菌。
7.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列或權(quán)利要求2所述的氨基酸序列在制備基因工程藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的基因工程藥物為免疫調(diào)節(jié)劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的基因工程藥物為抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人白細(xì)胞介素21的核苷酸序列及生產(chǎn)成熟的人白細(xì)胞介素21的方法和應(yīng)用。該核苷酸序列為SEQ ID No.1；該方法通過制備人白細(xì)胞介素21突變編碼基因序列SEQ ID No.1，將該序列導(dǎo)入表達載體，形成重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，培養(yǎng)增殖，誘導(dǎo)，提取，純化，即可得到序列為SEQ ID No.2的成熟人白細(xì)胞介素21。本發(fā)明提供的核苷酸序列可以在原核細(xì)胞中直接高效表達出成熟的具有生物學(xué)活性的人白細(xì)胞介素21，該方法適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)人白細(xì)胞介素21，該核苷酸序列及其表達的氨基酸序列可用于制備基因工程藥物。
文檔編號C07K14/54GK1869230SQ20061004076
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日
發(fā)明者陳國兵, 湯衛(wèi)國, 吳梧桐 申請人:中國藥科大學(xué)