專利名稱：用作溶桿菌素衍生物的?；捧ル念惖闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及九酯肽類(nonadepsipeptides)和它們的制備方法，還涉及它們在制備用于治療和/或預(yù)防疾病、特別是細菌感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。
細菌細胞壁是通過許多酶合成的(細胞壁生物合成)并且對微生物的生存和繁殖是必要的。該大分子的結(jié)構(gòu)，還有涉及它的合成的蛋白質(zhì)，在細菌內(nèi)是高度保守的。由于它的關(guān)鍵本性和一致性，細胞壁生物合成是新抗生素理想的攻擊點(D.W.Green，The bacterial cell wall as a source ofantibacterial targets，Expert Opin.Ther.Targets，2002，6，1-19)。
萬古霉素和青霉素是細菌細胞壁生物合成的抑制劑并且代表該作用原理的抗生素功效的成功實例。它們已經(jīng)在臨床上使用了數(shù)十年，用于治療細菌感染，特別是革蘭氏陽性病原體的細菌感染。由于耐抗生素微生物的不斷出現(xiàn)，例如耐甲氧西林的葡萄球菌(staphylococci)、耐青霉素的肺炎雙球菌(pneumococci)和耐萬古霉素的腸球菌(enterococci)(F.Baquero，Gram-positive resistancechallenge for the development of new antibiotics，J.Antimicrob.Chemother.，1997，39，Suppl A1-6；A.P.Johnson，D.M.Livermore，G.S.Tillotson，Antimicrobial susceptibility of Gram-positive bacteriawhat′scurrent，what′s anticipated？，J.Hosp.Infect.，2001，(49)，Suppl A3-11)和最近也首次出現(xiàn)的耐萬古霉素的葡萄球菌(B.Goldrick，F(xiàn)irst reported case ofVRSA in the United States，Am.J.Nurs.，2002，102，17)，這些物質(zhì)正日益喪失它們的治療功效。
本發(fā)明描述了一類新的對于已知類別的抗生素沒有交叉抗性的細胞壁生物合成抑制劑。
在US 4,754,018中將天然產(chǎn)物溶桿菌素和一些衍生物描述為具有抗菌活性。在EP-A-196 042和JP 01132600中也描述了溶桿菌素的分離和抗菌活性。WO 04/099239描述了具有抗菌活性的溶桿菌素衍生物。
在O’Sullivan，J.等，J.Antibiot.1988，41，1740-1744，Bonner，D.P.等，J.Antibiot.1988，41，1745-1751，Shoji，J.等，J.Antibiot.1988，41，713-718和Tymiak，A.A.等，J.Org.Chem.1989，54，1149-1157中還描述了溶桿菌素和片野菌素(katanosin)A的抗菌活性。
本發(fā)明的一個目的是提供具有可比較的或改善的抗菌活性和更好的耐受性的備選化合物，例如更低的中毒性腎損害、和更好的體內(nèi)分布，即更好的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)諸如，例如增加自由級分(fu)，該化合物用于人和動物中細菌疾病的治療。
本發(fā)明涉及下式的化合物 其中R1表示氫，并且R2表示2，2-二甲基丁-1-基，2-乙基-2-甲基丁-1-基，2，2-二乙基丁-1-基，2，2-二甲基戊-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，或R1表示三氟甲基，并且R2表示2，2-二甲基丙-1-基，2，2-二甲基丁-1-基，2-乙基-2-甲基丁-1-基，2，2-二乙基丁-1-基，2，2-二甲基戊-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，和它們的鹽，它們的溶劑合物和它們的鹽的溶劑合物。
本發(fā)明的化合物是式(I)的化合物和它們的鹽、溶劑合物、所述鹽的溶劑合物和前藥，由式(I)包括并且具有下面所提到的分子式的化合物、和它們的鹽、溶劑合物、所述鹽的溶劑合物和前藥，以及由式(I)包括并且如下面例舉性實施方案提到的化合物、和它們的鹽、溶劑合物、所述鹽的溶劑合物和前藥，只要在由式(I)包括并且下面提到的化合物還不是鹽、溶劑合物、所述鹽的溶劑合物和前藥。
取決于它們的結(jié)構(gòu)，本發(fā)明的化合物可以以立體異構(gòu)體形式(對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體)存在。本發(fā)明因此涉及所述對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體和它們的相應(yīng)混合物。可以以已知的方式將立體異構(gòu)純的組分從對映異構(gòu)體和/或非對映異構(gòu)體這樣的混合物離析出。
如果本發(fā)明的化合物可以以互變異構(gòu)形式存在，本發(fā)明包括全部互變異構(gòu)形式。
用于本發(fā)明目的的優(yōu)選鹽是本發(fā)明化合物的生理可接受的鹽。然而，也包括自身不適用于藥物應(yīng)用然而可以用于本發(fā)明化合物離析或純化的實例的鹽，或混合鹽?；禧}是指為了本發(fā)明目的的加成鹽，其包括兩種或多種不同的酸或堿，諸如，三氟乙酸鹽-甲磺酸鹽。
本發(fā)明化合物的生理可接受的鹽包括無機酸、羧酸和磺酸的酸加成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸(naphthalenedisulfonic acid)、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、馬來酸和苯甲酸的鹽。
本發(fā)明化合物的生理可接受的鹽也包括通常的堿的鹽諸如，例如并優(yōu)選，堿金屬鹽(例如鈉和鉀鹽)、堿土金屬鹽(例如鈣和鎂鹽)和從氨或具有1至16個C原子的有機胺衍生的銨鹽，諸如，例如并優(yōu)選，乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二異丙基胺、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環(huán)己胺、二甲氨基乙醇、普魯卡因、二芐基胺、N-甲基嗎啉、精氨酸、賴氨酸、1，2-乙二胺和N-甲基哌啶。
用于本發(fā)明目的的溶劑合物指通過與溶劑分子的配位作用以固態(tài)或液態(tài)形成配合物的本發(fā)明化合物的那些形式。水合物是特定形式的溶劑合物，其中與水發(fā)生所述配位作用。
優(yōu)選式(I)的化合物，其中R1表示氫，并且
R2表示2，2-二甲基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，或者R1表示三氟甲基，并且R2表示2，2-二甲基丙-1-基，2，2-二甲基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，和它們的鹽，它們的溶劑合物和它們的鹽的溶劑合物。
還優(yōu)選式(I)的化合物，其中R1表示氫，并且R2表示2，2-二甲基丁-1-基，2-乙基-2-甲基丁-1-基，2，2-二乙基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，和它們的鹽，它們的溶劑合物和它們的鹽的溶劑合物。
還優(yōu)選式(I)的化合物，其中R1表示氫，并且R2表示2，2-二甲基丁-1-基，2-乙基-2-甲基丁-1-基，2，2-二乙基丁-1-基，2，2-二甲基戊-1-基或三甲基甲硅烷基甲基。
特別優(yōu)選化合物3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)-溶桿菌素 或者它的鹽，它的溶劑合物或它的鹽的溶劑合物之一。
本發(fā)明還涉及制備式(I)化合物的方法，其中將下式的化合物
與下式的化合物反應(yīng) 其中R1和R2具有如上所述的含義，并且X1表示鹵素，優(yōu)選溴、氯或氟，或者是羥基。
如果X1是鹵素，則所述反應(yīng)一般發(fā)生在惰性溶劑中，當合適時存在堿，優(yōu)選在大氣壓下在-30℃至50℃的溫度范圍內(nèi)。
惰性溶劑是，例如，四氫呋喃、二氯甲烷、吡啶、二噁烷或二甲基甲酰胺；優(yōu)選二氯甲烷或二甲基甲酰胺。
堿是，例如，三乙胺、二異丙基乙胺或N-甲基嗎啉；優(yōu)選二異丙基乙胺。
如果X1是羥基，所述反應(yīng)一般在脫水劑存在下發(fā)生在惰性溶劑中，當合適時在堿存在下，優(yōu)選在大氣壓下在-30℃至50℃的溫度范圍內(nèi)。
惰性溶劑是，例如，鹵代烴諸如二氯甲烷或三氯甲烷，烴諸如苯、硝基甲烷、二噁烷、二甲基甲酰胺或乙腈。同樣可以采用這些溶劑的混合物。特別優(yōu)選二氯甲烷或二甲基甲酰胺。
在這里適合的脫水劑是，例如，碳二亞胺諸如，例如，N，N′-二乙基-，N，N，′-二丙基-，N，N′-二異丙基-，N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺，N-(3-二甲基氨基異丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-環(huán)己基碳二亞胺-N‘-丙氧基甲基-聚苯乙烯(PS-碳二亞胺)或羰基化合物諸如羰基二咪唑，或1，2-噁唑鎓化合物諸如2-乙基-5-苯基-1，2-噁唑鎓-3-硫酸鹽或2-叔-丁基-5-甲基異噁唑鎓高氯酸鹽，或酰氨基化合物諸如2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氫喹啉，或丙烷膦酸酐，或氯甲酸異丁酯，或雙(2-氧代-3-噁唑烷基)磷酰氯或苯并三唑氧基-三(二甲基-氨基)鏻六氟磷酸鹽，或鄰-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)，2-(2-氧代-1-(2H)-吡啶基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TPTU)或鄰-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)，或1-羥基苯并三唑(HOBt)，或苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)，或N-羥基琥珀酰亞胺，或其和堿的混合物。
堿是，例如，堿金屬碳酸鹽，諸如，例如，碳酸鈉或碳酸鉀，或碳酸氫鹽，或有機堿諸如三烷基胺，例如，三乙胺、N-甲基嗎啉、N-甲基哌啶、4-二甲基氨基吡啶或二異丙基乙胺。
優(yōu)選利用HATU或利用EDC在HOBt存在下進行所述縮合。
式(III)的化合物任選含有保護基，以便在這些情況下式(II)化合物與式(III)化合物的反應(yīng)之后根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法用三氟乙酸除去所述保護基。
例如可以通過堿的加入和隨后的所述化合物的萃取或沉淀，或者通過用技術(shù)人員已知的方法用色譜法分離，獲得式(I)化合物的鹽的游離堿，所述方法特別是通過利用聚合物-結(jié)合的堿諸如，例如，聚合物-結(jié)合的碳酸氫鹽。
本發(fā)明還涉及用于制備根據(jù)權(quán)利要求1的式(I)化合物或它們的溶劑合物的方法，其中通過加入堿將所述化合物的鹽或所述化合物鹽的溶劑合物轉(zhuǎn)化成所述化合物。
可以從溶桿菌素(實施例1A)通過雙Edmann降解法合成式(II)的化合物，如實驗部分中實施例2A中所描述。
式(III)的化合物是已知的或可以通過已知的方法從相應(yīng)的原材料合成。
可以通過下列合成方案說明本發(fā)明化合物的制備。
合成方案 本發(fā)明的化合物顯示不能被預(yù)測的有價值的藥理學(xué)和藥物代謝動力學(xué)效果的譜。它們顯示抗菌的效果。
它們因此適用于用作治療和/或預(yù)防人和動物中疾病的藥物。
本發(fā)明的化合物特征在于與溶桿菌素相比更低的中毒性腎損害。
本發(fā)明的化合物特征在于與溶桿菌素相比更好的藥物代謝動力學(xué)。雖然藥理學(xué)活性是相同的或改善的，但是它們在體內(nèi)顯示更好的分布，導(dǎo)致更低的治療劑量和更寬的治療性治療窗。
本發(fā)明的化合物在血漿中具有比溶桿菌素更高的自由級分(fu)。
所述九酯肽類作為細菌細胞壁生物合成的抑制劑。
本發(fā)明的制劑針對細菌和類細菌的微生物是特別有效的。它們因此特別適于由這些病原體在人和獸醫(yī)學(xué)中所引起的局部和全身感染的預(yù)防和化學(xué)治療。
原則上，可以將本發(fā)明的制劑用于針對擁有細菌細胞壁(胞壁質(zhì)球囊)或有關(guān)酶系統(tǒng)的全部細菌和類細菌的微生物，例如下列病原體或下列病原體的混合物革蘭氏陰性球菌(淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae))還有革蘭氏陰性桿菌諸如腸桿菌科(enterobacteriaceae)，例如大腸桿菌(Escherichia coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)(弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、C.divernis)、沙門氏菌屬(Salmonella)和志賀氏桿菌屬(Shigella)；此外還有腸桿菌屬(Enterobacter)(產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)、成團腸桿菌(E.agglomerans)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、沙雷氏菌屬(Serratia)(粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens))、普羅威登斯菌屬(Providencia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)，還有不動桿菌屬(Acinetobacter)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)和衣原體(Chlamydia)。而且，所述抗菌譜包括嚴格厭氧菌諸如，例如，脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)，消化球菌屬(Peptococcus)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)的代表，還有梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)；此外還有分枝桿菌屬(mycobacteria)，例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosus)。本發(fā)明的化合物顯示對于革蘭氏陽性球菌的特別顯著的效果，例如葡萄球菌(Staphylococci)(金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、肉葡萄球菌(S.carnosus))、腸球菌屬(enterococci)(糞腸球菌(E.faecalis)、屎腸球菌(E.faecium))和鏈球菌屬(streptococci)(無乳鏈球菌(S.agalactiae)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)、化膿鏈球菌(S.pyogenes))。
上述病原體列表將僅通過實例說明決不作為限制性的?？梢蕴岬降挠商岬降牟≡w或混合感染所引起并且可以通過本發(fā)明的制劑防止、改善或治愈的疾病例如在人中的感染性疾病，例如，無并發(fā)癥的和并發(fā)的尿路感染，無并發(fā)癥的皮膚和表皮感染，并發(fā)的皮膚和軟組織感染，醫(yī)院中獲得性肺炎和作為門診患者、醫(yī)院的肺炎，慢性支氣管炎的急性惡化和繼發(fā)細菌感染，急性中耳炎，急性鼻竇炎，鏈球菌咽炎，細菌性腦膜炎，無并發(fā)癥的淋球菌和非-淋球菌尿道炎/宮頸炎，急性前列腺炎，心內(nèi)膜炎，無并發(fā)癥的和并發(fā)的腹內(nèi)感染，婦科感染，盆腔炎疾病，細菌性陰道病，急性和慢性骨髓炎，急性細菌性關(guān)節(jié)炎，發(fā)熱性中性白細胞減少患者(febrile neutropenicpatients)中的經(jīng)驗療法，還有菌血癥(bacteraemias)，MRSA感染，急性傳染性腹瀉，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)感染，手術(shù)后的感染，牙原性感染(odontogenic infections)，眼科感染，手術(shù)后的感染(包括門靜脈周膿腫、創(chuàng)傷感染、膽道感染，乳腺炎和急性闌尾炎)，囊性纖維化病和支氣管擴張癥。
除人之外，還可以在其它物種中治療細菌感染?？梢蕴岬降膶嵗秦i腹瀉、腸源性毒血癥(enterotoxaemia)、敗血癥、痢疾、沙門氏菌病、子宮炎-乳腺炎-乳泌缺乏綜合征(agalactiae syndrome)、乳腺炎；反芻動物(牛、綿羊、山羊)腹瀉、敗血癥、支氣管性肺炎、沙門氏菌病、巴斯德菌病、生殖器感染；馬支氣管性肺炎、關(guān)節(jié)病、分娩的和分娩后感染、沙門氏菌??；狗和貓支氣管肺炎、腹瀉、皮炎、耳炎、尿路感染、前列腺炎；家禽(小雞、火雞、鵪鶉、鴿子、觀賞鳥類及其它)大腸桿菌感染、慢性呼吸道疾病、沙門氏菌病、巴斯德菌病、鸚鵡熱。
它同樣可以在飼養(yǎng)和撫養(yǎng)生產(chǎn)性和觀賞用魚類中治療細菌病，所述抗菌譜從而在上述病原體上還延伸到病原體諸如，例如，巴斯德菌屬(Pasteurella)、布魯氏菌屬(Brucella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、李斯特菌屬(Listeria)、丹毒絲菌屬(Erysipelothris)、棒狀桿菌(Corynebacteria)、疏螺旋體屬(Borellia)、密螺旋體(Treponema)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、立克次氏體(Rickettsia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的化合物用于治療和/或預(yù)防疾病，特別是細菌感染性疾病的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的化合物用于治療和/或預(yù)防疾病，特別是上述疾病的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的化合物用于生產(chǎn)治療和/或預(yù)防疾病、特別是上述疾病的藥物的應(yīng)用。
優(yōu)選將本發(fā)明的化合物用于生產(chǎn)適于預(yù)防和/或治療細菌疾病的藥物。
本發(fā)明還涉及利用抗菌有效量的本發(fā)明化合物治療和/或預(yù)防疾病的方法，所述疾病特別是上述疾病。
本發(fā)明還涉及包含至少一種本發(fā)明化合物和至少一種或多種另外的活性化合物的藥物，特別是用于治療和/或預(yù)防上述疾病。組合用的優(yōu)選活性化合物是抗菌活性的化合物，其具有不同的活性譜，特別是補充的活性譜，和/或?qū)τ诒景l(fā)明的化合物是協(xié)同作用的。
本發(fā)明的化合物可以全身和/或局部起作用。為此目的，可以將它們以適合的方式施用，諸如，例如，經(jīng)口地、腸胃外地、經(jīng)肺地、經(jīng)鼻地、舌下地、舌地、含服地、直腸地、皮膚地、透過皮膚地、結(jié)膜地、經(jīng)耳地或作為植入物或支架。
可以將本發(fā)明的化合物以適于這些給藥途徑的形式施用。
適于口服是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)起作用并且快速和/或以修改方式遞送本發(fā)明化合物的給藥形式，并且其含有結(jié)晶和/或無定形和/或溶解形式的本發(fā)明化合物，諸如，例如，片劑(無涂層的或包衣片劑，例如具有延遲溶解或者是不可溶的并且控制本發(fā)明化合物釋放的腸溶衣或涂層)，快速在口腔中崩解的片劑或薄膜/糯米紙囊劑，薄膜/凍干物(lyophilisates)，膠囊(例如硬或軟明膠膠囊)，糖衣片劑，顆粒劑，微型藥片，粉末，乳劑，混懸劑，氣溶膠或溶液。
腸胃外給藥的發(fā)生可以避免吸收步驟(例如，靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、心臟內(nèi)、脊髓內(nèi)或腰椎內(nèi))，或包含吸收(例如，肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)皮或腹膜內(nèi))。適合于腸胃外給藥的給藥形式特別是，用于注射和輸注的，以溶液、混懸液、乳劑、凍干物或無菌粉末存在的制劑。
適合于其它給藥途徑的實例是用于吸入的藥物形式(特別是粉末吸氣器，噴霧器)，滴鼻劑，溶液，噴霧劑；可以通過舌、舌下或頰施用的片劑，薄膜/糯米紙囊劑或膠囊；栓劑，用于眼和耳的制劑，陰道膠囊，水性混懸液(洗劑，振搖混合物)，親脂性混懸液，軟膏劑，乳膏劑，透皮治療系統(tǒng)(諸如，例如，貼片)，乳，糊劑，泡沫，撲粉，植入物或支架。
可以將本發(fā)明的化合物轉(zhuǎn)化成為列出的給藥形式。其可以以本身已知的方式通過混合以惰性、非毒性的藥用的賦形劑來進行。這些賦形劑包括，特別是，載體(例如微晶纖維素，乳糖，甘露醇)，溶劑(例如液體聚乙二醇)，乳化劑和分散劑或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉，聚氧基失水山梨糖醇油酸酯)，粘合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮)，合成的和天然的聚合物(例如白蛋白)，穩(wěn)定劑(例如抗氧化劑諸如抗壞血酸)，顏料(例如無機顏料諸如氧化鐵)或味道和/或氣味矯正劑。
本發(fā)明還涉及包含至少一種本發(fā)明化合物的藥物，通常連同一種或多種惰性的、非毒性的、藥學(xué)上可接受的賦形劑，并且涉及其用于上述目的的用途。
通常已經(jīng)證明有利的是，在靜脈內(nèi)給藥上施用約為0.001至100mg/kg體重的量，優(yōu)選約0.1至10mg/kg體重的量，以實現(xiàn)有效的結(jié)果，并且在口服上所述劑量是約0.01至50mg/kg體重，優(yōu)選0.5至10mg/kg體重。
然而當適當時不同于所述的量可以是必要的，特別是作為體重、給藥途徑、對于所述活性成分的個體行為、制劑類型和進行給藥的時間或時間間隔的函數(shù)。因而，在某些情形中以少于前述最少量進行的施用可以是充分的，而在其它情形中，必須超過提及的上限。在更大量的施用的情形中，可以推薦將這些分成一天內(nèi)的多個單獨劑量。
在下述測試和實施例中的百分比數(shù)據(jù)是重量百分比，除非另外指出；份是重量份。液體/液體溶液的溶劑比率、稀釋比率和濃縮數(shù)據(jù)在每種情形中都是基于體積。
A.實施例縮寫aq. 水性的area(峰)面積BHI 腦心浸液Boc 叔-丁氧羰基br. 寬信號(在NMR光譜中)calc. 計算的conc. 濃縮的D 雙峰(在NMR光譜中)DCI 直接化學(xué)電離(在MS中)DCM 二氯甲烷
DIEAN，N-二異丙基乙胺DMAP4-N，N-二甲基氨基吡啶DMSO二甲亞砜DMF N，N-二甲基甲酰胺EA 乙酸乙酯(乙酸乙基酯)EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(也是EDCI)EDCxHCl 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽EI 電子碰撞電離(MS中)ESI 電噴霧電離(MS中)ESIneg ESI質(zhì)譜法中的陰離子掃描ESIpos ESI質(zhì)譜法中的陽離子掃描Ex. 實施例h 小時HATU鄰-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N‘，N‘-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽HOBt1-羥基苯并三唑HPLC高壓、高效液相色譜法HR 高分辨率i.v.真空LC-MS 偶聯(lián)液相色譜-質(zhì)譜法LDA 二異丙基氨基化鋰m 中間(在UV和IR光譜中)m 多重峰(在NMR光譜中)MALDI 基體-輔助的激光脫附/電離MIC 最低抑制濃度min 分鐘m.p.熔點MRSA耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌MS 質(zhì)譜
NCCLS 國家臨床實驗室標準委員會(NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards)neg. 陰性的NMM N-甲基嗎啉NMR 核磁共振光譜法p.a. 分析級(pro analysi)Pd鈀Pd-C 披鈀碳pos. 正的PTFE 聚四氟乙烯quant.定量的RP-HPLC 反相HPLCRT室溫Rt保留時間(HPLC中)s 強(在UV和IR光譜中)s 單峰(在NMR光譜中)sat. 飽和的TBTU 鄰-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽TCTU 鄰-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽TFA 三氟乙酸TFE 2，2，2-三氟乙醇THF 四氫呋喃TLC 薄層色譜TOF 飛行時間UV紫外線vis 可見的VRSA 耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌w 弱(在UV和IR光譜中)
Z，Cbz 芐氧基羰基參考文獻對于肽和環(huán)化酯肽(cyclodepsipeptides)的命名法，參考1.A Guide to IUPAC Nomenclature of Organic Compounds(Recommendations 1993)，1993，Blackwell Scientific publications.
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一般的GC-MS，LC-MS，HR-MS，HPLC和凝膠色譜方法方法1(TOF-HR-MS)利用Micromass LCT儀器(毛細管電壓3.2KV，錐形電壓(cone voltage)42V，源極溫度120℃，去溶劑化溫度280℃)記錄TOF-HR-MS-ESI+光譜。將輸液泵(Harvard Apparatus)用于為此目的的進樣。將亮氨酸腦磷脂(encephalin)(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)充當標準。
方法2(制備的HPLC)儀器Gilson Abimed HPLC；UV檢測器210nm；雙泵系統(tǒng)；柱Waters Symmetry-PrepTMC18，7μm，300×19mm；洗脫液A水中的0.2％三氟乙酸，洗脫液B乙腈；流速25ml/min；柱溫RT；0min 20％B，斜面0-10min 70％B，斜面10-10.1min 20％B，15min 20％B。
方法3(Sephadex LH-20上的凝膠色譜)在無壓力情況下在SephadexLH-20(Pharmacia)上進行凝膠色譜分離。根據(jù)UV活性(254nm的UV檢測器，Knauer)進行分級(ISCO Foxy 200級分收集器)，柱尺寸32×7cm(1000-100μmol規(guī)模)；30×4cm(100-10μmol規(guī)模)；25×2cm(10-1μmol規(guī)模)。將尺寸80×30的柱用于從1mmol至11mmol的規(guī)模。在此情況下，手動并且無上游UV檢測器的情況下收集級分。將所述級分通過HPLC指定(方法9)。
方法4(制備的HPLC；Kromasil，乙酸)儀器Gilson Abimed HPLC；UV檢測器210nm；雙泵系統(tǒng)；柱Kromasil-100A C18，5μ-m；250×20mm；流速25ml/min；洗脫液A水/0.25-0.5％乙酸，洗脫液B乙腈；梯度0-3min 5％B，3-30min 5-100％B，30-38min 100％B，然后是所述色譜柱的再生。
方法5(LC-MS)儀器Micromass Quattro LCZ mit HPLC Agilent系列1100；柱Phenomenex Synergi 2μHydro-RP Mercury 20mm×4mm；洗脫液A1l的水+0.5ml的50％甲酸，洗脫液B1l的乙腈+0.5ml的50％甲酸；梯度0.0min 90％A→2.5min 30％A→3.0min 5％A→4.5min5％A；流速0.0min 1ml/min，2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；爐50℃；UV檢測208-400nm。
方法6(LC-MS)MS儀器型號Micromass ZQ；HPLC儀器型號Waters Alliance 2795；柱Phenomenex Synergi 2μHydro-RP Mercury 20mm×4mm；洗脫液A1l的水+0.5ml的50％甲酸，洗脫液B1l乙腈+0.5ml的50％甲酸；梯度0.0min 90％A→2.5min 30％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；流速0.0min 1ml/min，2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；爐50℃；UV檢測210nm。
方法7(LC-MS)MS儀器型號Micromass ZQ；HPLC儀器型號HP 1100series；UV DAD；柱Phenomenex Synergi 2μHydro-RP Mercury 20mm×4mm；洗脫液A1l水+0.5ml 50％甲酸，洗脫液B1l乙腈+0.5ml 50％甲酸；梯度0.0min 90％A→2.5min 30％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；流速0.0min 1ml/min，2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；爐50℃；UV檢測210nm。
方法8(分析的HPLC)HPLC儀器型號HP 1050系列；UV DAD1100系列；柱Kromasil C18，60×2mm，3.5μm；洗脫液A水/0.5％高氯酸，洗脫液B乙腈；梯度0-0.5min 2％B，0.5-4.5min 2-90％B，4.5-9.0min 90％B，9.0-9.2min 90-2％B，9.2-10.0min 2％B；流速0.75ml/min，爐30℃，UV檢測210nm。
方法9(分析的HPLC，Agilent Zorbax C8)儀器具有DAD(G1315B)，雙泵(G1312A)，自動進樣器(G1313A)，溶劑脫氣裝置(G1379A)和柱溫控器(G1316A)的Agilent 1100；柱Agilent Zorbax Eclipse XDB-C84.6×150×5mm；洗脫液A0.05％70％水中的高氯酸；洗脫液B乙腈；梯度0-1min 10％B，斜面，4-5min 90％B，斜面，5.5min 10％B；流速2.00ml/min；柱溫30℃。
方法10(Sephadex LH-20上的凝膠色譜)在無壓力下在SephadexLH-20(Pharmacia)上進行凝膠色譜分離。根據(jù)UV活性(254nm的UV檢測器，Knauer)進行分級(ISCO Foxy 200餾分收集器)，柱尺寸32×7cm(1000-100μmol規(guī)模)；30×4cm(100-10μmol規(guī)模)；25×2cm(10-1μmol規(guī)模)。
方法11(制備的HPLC Symmetry)儀器Gilson Abimed HPLC；雙泵系統(tǒng)；柱SymmetryPrepTMC18，Waters，7μm；300mm×19mm；洗脫液A水/0.2％三氟乙酸，洗脫液B乙腈；梯度0-10min 15-65％B，然后是色譜柱的再生；流速25ml/min；UV檢測210nm。
方法12(制備的HPLC Kromasil)儀器Gilson Abimed HPLC；雙泵系統(tǒng)；柱Kromasil C18，5μm，100，250×20mm；洗脫液A水中0.05％的三氟乙酸，洗脫液B乙腈中0.05％的三氟乙酸；梯度0-3min10％B，斜面，30-38min 90％B，38-45min 10％B；流速20ml/min；UV檢測210nm。
方法13(制備的HPLC Waters Symmetry)儀器Gilson AbimedHPLC；雙泵系統(tǒng)；柱Waters Symmetry-PrepTMC18，7μm，300×19mm；洗脫液A水中的0.05％三氟乙酸，洗脫液B0.05％乙腈中的三氟乙酸；梯度0-3min 10％B，斜面，30-38min 90％B，38-45min 10％B；流速20ml/min；UV檢測210nm。
方法14(制備的HPLC)儀器Gilson Abimed HPLC；雙泵系統(tǒng)；柱Waters Symmetry-PrepTMC18，7μm，300×19mm；洗脫液A水/0.2％三氟乙酸，洗脫液B乙腈；梯度0-10min 25-65％B，然后是色譜柱的再生；流速25ml/min；UV檢測210nm。
方法15(手性HPLC Daicel Chiralpak)Agilent 1100 HPLC；柱DaicelChiralpak AD-H 5μm；250×20mm；恒溶劑75％異己烷，25％的2-丙醇，含0.2％三氟乙酸和1％水；流速1.0ml/min；爐25℃；UV檢測器212nm。
方法16(制備的HPLC)儀器Gilson Abimed HPLC；雙泵系統(tǒng)；柱YMC ODS-AQ 5μm，250×30mm；洗脫液A水中0.05％的三氟乙酸，洗脫液B乙腈中0.05％的三氟乙酸；梯度0-3min 10％B，斜面，30-38min90％B，38-45min 10％B；流速50ml/min；UV檢測器210nm。
方法17(GC-MS)儀器Micromass GCT，GC6890；柱RestekRTX-35MS，30m×250μm×0.25μm；梯度60℃(保持0.30min)，50℃/min→120℃，16℃/min→250℃，30℃/min→300℃(保持1.7min)；用氦的恒定流速0.88ml/min；爐60℃；入口250℃。
方法18(HPLC)HPLC儀器型號HP 1100系列；UV DAD柱ZorbaxEclipse XBD-C8(Agilent)，150mm×4.6mm，5μm；洗脫液A5ml的HClO4/l水，洗脫液B乙腈；梯度0-1min 10％B，1-4min 10-90％B，4-5min 90％B；流速2.0ml/min；爐30℃；UV檢測210和254nm。
方法19(HPLC)柱Kromasil RP-18，60mm×2mm，3.5μm；洗脫液A5ml的HClO4/l水，洗脫液B乙腈；梯度0min 2％B，0.5min 2％B，4.5min 90％B，9min 90％B；流速0.75ml/min；爐30℃；UV檢測210nm。
方法20(HPLC)柱Kromasil RP-18，250mm×4mm，5μm；洗脫液A5ml的HClO4/l水，洗脫液B乙腈；梯度0min 5％B，10min 95％B；流速1ml/min；爐40℃；UV檢測210nm。
方法21(HPLC)柱Kromasil RP-18，250mm×4mm，5μm；洗脫液A2ml的HClO4/l水，洗脫液B乙腈；恒溶劑45％B，55％A；流速1ml/min；爐40℃；UV檢測210nm。
方法22(LC-MS)MS儀器型號Micromass ZQ；HPLC儀器型號HP 1100系列；UV DAD；柱Grom-Sil 120ODS-4HE 50×2mm，3.0μm；洗脫液A水/0.025％甲酸/l，洗脫液B乙腈/0.025％甲酸；梯度0-2.9min0-70％B，2.9-3.1min 70-90％B，3.1-4.5min 70-90％B；爐50℃，流速0.8ml/min，UV檢測210nm。
方法23(HPLC)HPLC儀器型號HP 1050系列；UV DAD 1100系列；柱SymmetryPrepTMC18，Waters，50×2.1mm，3.5μm；洗脫液A水/0.05％三氟乙酸，洗脫液B乙腈；梯度0-9min 0-100％B，9-11min100％B，11-12min 100-0％B，然后是色譜柱的再生；爐40℃，流速0.4ml/min，UV檢測210nm。
方法24(定量的19F-NMR光譜法)將近似10mg的精確稱重的樣品物質(zhì)和近似20mg精確稱重的1，4-二溴四氟苯溶解在吡啶中并且通過19F-NMR光譜法測量。將δ-74(TFA)和-132.0(1，4-二溴四氟苯)積分并比較。將TFA含量表述為所述樣品物質(zhì)的TFA質(zhì)量百分比。
方法25(離子色譜法)具有抑制器系統(tǒng)和電導(dǎo)率檢測器的離子色譜法；前柱A SUPP 4/5Guard，分離柱A SUPP 5 4.0×250mm；洗脫液水中的3.2mM碳酸鈉和2.4mM碳酸氫鈉；流速0.7ml/min。將所述樣品溶解在甲醇中(20％的最終樣品體積)，在超聲波浴中處理3min并用水補足。將所述樣品通過無離子的乙酸纖維素過濾器(孔徑0.45μm)過濾并注入。對外標(0.5mg/l-10mg/l)定量。
起始化合物實施例1AD-亮氨酰-N1-{(3S，6S，12S，15S，18R，21S，24S，27S，28R)-6-[(1S)-2-氨基-1-羥基-2-氧乙基]-18-(3-{[氨基(亞氨基)甲基]氨基}丙基)-12-[(1S)-1-羥乙基]-3-(羥甲基)-24-[(1R)-1-羥基-2-甲基丙基]-21-異丁基-15-[(1S)-1-甲基丙基]-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧代-28-苯基-1-氧雜-4，7，10，13，16，19，22，25-八氮雜環(huán)八念烷-27-基}-L-亮氨酰胺(leucinamide)雙三氟乙酸鹽(溶桿菌素)
發(fā)酵培養(yǎng)基YM酵母-麥芽瓊脂D-葡萄糖(4g/l)，酵母提取物(4g/l)，麥芽提取物(10g/l)，1升的離子交換樹脂水(Lewatit water)。在滅菌(121℃下20分鐘)之前將pH調(diào)節(jié)至7.2。
HPM甘露糖醇(5.4g/l)，酵母提取物(5g/l)，肉蛋白胨(3g/l)。
工作保藏將凍干的菌株(ATCC 53042)在50ml的YM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
燒瓶發(fā)酵用2ml所述工作保藏接種1升錐形瓶中的150ml的YM培養(yǎng)基或100ml的HPM培養(yǎng)基并且使其在28℃在240rpm的振蕩器上生長30-48小時。
30l的發(fā)酵將300ml的燒瓶發(fā)酵(HPM培養(yǎng)基)用于接種無菌的30l營養(yǎng)培養(yǎng)基溶液(每升1ml消泡劑SAG 5693)。將該培養(yǎng)在28℃，300rpm并用0.3vvm的無菌空氣通氣生長21小時。用1M鹽酸將pH在pH＝7.2保持恒定?？傆?，在培養(yǎng)周期期間加入880ml的1M鹽酸。
主要培養(yǎng)(200l)將1l錐形瓶中的15×150ml的YM培養(yǎng)基用2ml的工作保藏接種并使其在振蕩器上在28℃和240rpm生長48小時。將2250ml的該培養(yǎng)物用于接種無菌的200l營養(yǎng)培養(yǎng)基溶液(YM)(每升1ml消泡劑SAG 5693)并使其在28℃，150rpm和用0.3vvm無菌空氣通氣下生長18.5小時。
每小時取樣(50ml)以檢驗所述發(fā)酵過程。將1ml的甲醇(0.5％三氟乙酸)加入到2ml的該培養(yǎng)液并且將所述混合物通過0.45μm過濾器過濾。將30μl的該懸浮液通過HPLC(方法18和方法19)分析。
在18.5小時后，將主要培養(yǎng)的培養(yǎng)液在17000rpm分成上清液和沉淀物。
離析利用濃縮的三氟乙酸或氫氧化鈉溶液將所述上清液(183l)調(diào)節(jié)到pH6.5-7并且裝載到Lewapol柱(OC 1064，60l容量)上。隨后用純水、水/甲醇1∶1并隨后用純甲醇(含有0.1％三氟乙酸)進行洗脫。將該有機相真空濃縮成11.5l的殘留水殘液。
將殘留的水相結(jié)合到硅膠C18并分離(MPLC，Biotage Flash 75，75×30cm，KP-C18-WP，15-20μm，流速30ml/min；洗脫液含有0.1％三氟乙酸的乙腈/水；梯度10％，15％和40％乙腈)。將含有實施例1A主要量的40％乙腈相真空濃縮并隨后冷凍干燥(～13g)。將該固體混合物首先在制備的HPLC(方法7)上，隨后通過Sephadex LH-20(5×70cm，乙腈/水1∶1，在每個情況下含有0.05％三氟乙酸)上的凝膠過濾和進一步的制備HPLC(方法20)分離成1.2g的部分。
該過程提供2250mg的實施例1A。
將所述沉淀物吸收在4l的丙酮/水4∶1中，加入2kg的C鹽，將所述混合物利用三氟乙酸調(diào)節(jié)到pH＝6，攪拌并離心。將所述溶劑真空濃縮，并且將殘余物冷凍干燥。將獲得的凍干物(89.9g)吸收在甲醇中，過濾，濃縮并在硅膠(方法21)上分離。然后將實施例1A通過凝膠過濾(SephadexLH-20，5×68cm，水/乙腈9∶1(含有0.05％三氟乙酸)，流速2.7ml/min，級分大小13.5ml)純化而得到純物質(zhì)。
該過程得到447mg的實施例1A。
HPLC(方法18)Rt＝6.19minMS(ESIpos)m/z＝1277(M+H)+1H NMR(500.13MHz，d6-DMSO)δ＝0.75(d，3H)，0.78(d，6H)，0.80(t，3H)，0.82(d，3H)，0.90(d，3H)，0.91(d，3H)，0.92(d，3H)，0.95(d，3H)，0.96(d，3H)，1.05(m，1H)，1.19(d，3H)，1.25(m，2H)，1.50(m，4H)，1.51(m，2H)，1.55(m，1H)，1.61(m，1H)，1.65(m，1H)，1.84(m，1H)，1.85(m，1H)，1.86(m，1H)，1.89(m，1H)，1.95(m，1H)，2.75(m，2H)，3.40(m，1H)，3.52(m，2H)，3.53(dd，1H)，3.64(m，2H)，3.66(m，1H)，3.68(dd，1H)，3.73(m，2H)，4.00(dd，1H)，4.02(br.，1H)，4.13(br.，1H)，4.32(dd，1H)，4.39(t，1H)，4.55(m，1H)，4.75(dd，1H)，5.19(t，1H)，5.29(d，1H)，5.30(br.，1H)，5.58(m，2H)，6.68(m，3H)，6.89(d，1H)，6.93(m，3H)，6.94(br.，1H)，6.98(d，1H)，7.12(br.，1H)，7.20(br.，2H)，7.23(m，2H)，7.42(m，2H)，7.54(d，1H)，7.58(d，1H)，8.32(br.，1H)，9.18(br.，1H)，9.20(m，2H)，9.50(br.，1H).
13C-NMR(125.77MHz，d6-DMSO)δ＝10.3，15.3，19.0，19.2，19.6，20.0，20.9，22.0，22.4，23.0，23.2，24.3，24.4，25.0，25.4，26.0，27.8，30.9，35.4，39.5，40.8，40.9，41.6，44.1，51.5，52.7，55.9，56.2，56.4，57.9，58.8，60.2，61.1，62.6，70.1，71.6，71.7，75.5，128.1，128.6，136.7，156.8，168.2，170.1，170.4，171.2，171.5，171.9，172.2，172.4，173.7.
根據(jù)文獻(T.Kato，H.Hinoo，Y.Terui，J.Antibiot.，1988，61，719-725)中描述的指定進行所述信號的指定(assignment)。
實施例2A脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素雙三氟乙酸鹽(Edman2.0降解產(chǎn)物)
在氬氣氣氛下將溶桿菌素雙三氟乙酸鹽(60.0g，39.88mmol)溶解在吡啶(840ml)中。然后加入異硫氰酸苯酯(32.35g，239.28mmol，6當量)，并且將反應(yīng)混合物在37℃攪拌7h。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在浴溫度為40℃下蒸餾出所述溶劑。將殘余物與甲基叔丁基醚(1400ml)混合并劇烈攪拌30min。然后將混合物通過玻璃粉(glass frit)(孔寬度3,13cm直徑)抽吸過濾。將中間產(chǎn)物(Edman0.5降解產(chǎn)物)以粗收率為72g離析并在無后加工(workup)情況下進一步反應(yīng)。
為此目的，在氬氣氣氛下將粗產(chǎn)物溶解在三氟乙酸(1026ml)中并在RT攪拌30min。然后將所述溶液在浴溫度為20℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上真空濃縮。將殘余物吸收在甲基叔丁基醚(1400ml)中并劇烈攪拌直到產(chǎn)生粉末狀無定形固體。將其在玻璃粉(孔寬度3,18cm直徑)上通過真空過濾收集。然后將所述固體用二乙醚(1400ml)攪拌并再次通過過濾收集。用2份的二氯甲烷(每份900ml)重復(fù)相同的程序。將所述粗產(chǎn)物真空干燥。獲得58g的粗脫(1-D-亮氨酰)溶桿菌素雙三氟乙酸鹽(Edman1.0降解產(chǎn)物)。
在無進一步后加工的情況下在氮氣氣氛下將所述粗產(chǎn)物溶解吡啶(1080ml)中。然后加入異硫氰酸苯酯(107g，0.80mol，20當量)并將所述反應(yīng)混合物在37至40℃攪拌7h。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在浴溫度為40℃下蒸餾出所述溶劑。將所述殘余物與甲基叔丁基醚(1400ml)混合并劇烈攪拌。然后將所述混合物在玻璃粉(孔寬度3,13cm直徑)上用抽吸過濾。以粗收率為65g離析所述中間產(chǎn)物(Edman1.5降解產(chǎn)物)并且，在油泵真空下干燥以后，將中間產(chǎn)物在氬氣氣氛下直接溶解在三氟乙酸(1240ml)中并在RT攪拌30min。然后將所述溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在浴溫度為20℃下真空濃縮。將所述殘余物吸收在甲基叔丁基醚(1400ml)中并劇烈攪拌直到產(chǎn)生粉末狀無定形固體。將粉末狀無定形固體在玻璃粉(孔寬度3,18cm直徑)上通過真空過濾收集。然后將所述固體首先用二乙醚(1400ml)并然后用二氯甲烷(1400ml)攪拌并且每次通過過濾收集。獲得55g的粗產(chǎn)物。將所述粗產(chǎn)物通過制備的HPLC(方法14)純化。獲得28.55g(理論的56％)的標題混合物。
HPLC/UV-Vis(方法23)Rt＝4.71min，λmax(定性的)＝220nm(s)，255-270(w)。
LC-MS(方法22)Rt＝1.65min；MS(ESIpos.)m/z(％)＝526(100)[M+2H]2+，1051(15)[M+H]+。
實施例3A(2Z)-2-{[(芐氧基)羰基]氨基}-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)丙烯酸甲酯 將6-三氟甲基吡啶-3-甲醛(4.85g，27.70mmol)和{[(芐氧基)羰基]氨基}(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(9.17g，27.70mmol，1.0當量)溶解在THF(70ml)中并冷卻至-70℃。在-70℃，將N，N，N，N-四甲基胍(6.38g，55.39mmol，6.95ml，2.0當量)緩慢逐滴加入并然后將所述混合物在-70℃攪拌4h并隨后在RT攪拌12h。將所述反應(yīng)混合物濃縮并然后用乙酸乙酯(2×100ml)從水萃取，并用飽和鹽水洗滌合并的有機相并經(jīng)過硫酸鈉干燥。在真空濃縮后將粗產(chǎn)物色譜分離(硅膠，洗脫液甲苯然后是甲苯/乙酸乙酯10∶1)。獲得6.93g(理論的66％)的標題化合物。
HPLC/UV-Vis(方法8)Rt＝4.60min。
HPLC/UV-Vis(方法9)Rt＝4.54min。
1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ＝3.74(s，3H，OMe)，5.10(s，2H，CH2)，7.27(s，1H，PyrH)，7.33-7.38(m，5H，ArH)，7.94(d，J＝8.5Hz，1H，PyrH)，8.27(d，J＝8.5Hz，1H，PyrH)，8.93(s，1H，β-CH)，9.51(s，1H，NH)。
LC-MS(方法7)Rt＝2.44min；MS(ESIpos.)m/z(％)＝381(100)[M+H]+；MS(ESIneg.)m/z(％)＝379(100)[M-H]-。
HR-TOF-MS(方法1)C18H16N2O4F3[M+H]+計算值381.1062，實測的381.1065。
實施例4AN-[(芐氧基)羰基]-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯 將來自實施例3A的化合物(10.15g，26.69mmol)溶解在甲醇p.a.(100ml)中。利用針，使氬氣通過約5min并然后加入(+)-1，2-雙[(2S，5S)二乙基-phospholano]苯(環(huán)辛二烯)銠(I)三氟化物(289mg，400μmol，0.015當量)。在氫壓力為4巴和在RT下將氫化進行12h。然后過濾通過硅藻土(甲醇)，接著是洗出液的濃縮。將粗產(chǎn)物色譜分離(硅膠，洗脫甲苯/乙酸乙酯5∶1)。獲得9.9g(理論的97％)的標題化合物。20Na＝-24(在甲醇中c＝0.093)。
HPLC/UV-Vis(方法8)Rt＝4.50min。
HPLC/UV-Vis(方法9)Rt＝4.49min。
1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ＝2.99(dd，J＝3.5，11.0Hz，1H，β-CH)，3.22(dd，J＝3.5，11.0Hz，1H，β-CH)，3.66(s，3H，OMe)，4.40(m，1H，α-CH)，4.97(s，2H，CH2)，7.23(m，2H)，7.29-7.33(m，3H)，7.83(d，J＝6.5Hz，1H)，7.93-7.98(m，2H)，8.65(s，1H，NH)。
LC-MS(方法7)Rt＝2.40min；MS(ESIpos.)m/z(％)＝383(100)[M+H]+；MS(ESIneg.)m/z(％)＝273(100)，381(50)[M-H]-。
HR-TOF-MS(方法1)C18H18N2O4F3[M+H]+計算值383.1219，實測的383.1223。
實施例5A3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯 將來自實施例4A的化合物(9.90g，25.89mmol)溶解在甲醇(100ml)中。利用針，使氬氣通過大約5min并然后加入披鈀碳(10％，990mg)。在4巴的氫壓力和RT下進行12h的氫化。然后通過硅藻土的過濾，接著是濃縮并在油泵真空下干燥。收率5.8g(理論的)標題化合物。19.9Na＝+3(甲醇中c＝0.186)。
HPLC/UV-Vis(方法8)Rt＝3.34min。
HPLC/UV-Vis(方法9)Rt＝3.22min。
IRνmax(NaCl，cm-1)3415，1734，1339，1136，1087。
1H-NMR(500MHz，d6-DMSO)δ＝2.85(dd，J＝5.5，13.5Hz，1H，β-CH)，3.01(dd，J＝5.5，13.5Hz，1H，β-CH)，3.61(s，3H，OMe)，3.63-3.69(m，1H，α-CH)，7.82(d，J＝7.5Hz，1H)，7.93(d，J＝7.5Hz，1H)，8.61(s，1H)。
LC-MS(方法7)Rt＝1.74min；MS(ESIpos.)m/z(％)＝249(100)[M+H]+。
HR-TOF-MS(方法1)C12H15N3O2F3[M+CH3CN+H]+計算值290.1116，實測的290.1122。
實施例6AN-(叔丁氧基羰基)-3-(叔丁基)-D-丙氨酰-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯 在-30℃將N-甲基嗎啉(12.92g，127.72mmol，14.04ml，5當量)和HATU(9.71g，25.54mmol，1當量)緩慢加入到無水DMF(240ml)中的來自實施例5A的化合物(6.34g，25.54mmol)和N-(叔丁氧基羰基)-3-叔-丁基-D-丙氨酸(6.27g，25.54mmol，1.0當量)溶液。將所述反應(yīng)混合物緩慢(約3h)溫熱到RT，通過HPLC(方法9)觀察到完全的轉(zhuǎn)化。加入磷酸二氫鉀(34.76g，255.44mmol，10當量)，并且將所述反應(yīng)混合物攪拌20min并且然后過濾，用乙酸乙酯稀釋并用飽和的碳酸氫鈉水溶液(10ml)稀釋。將有機相用硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將粗產(chǎn)物通過快速色譜分離純化(硅膠，10∶1至2∶1環(huán)己烷/乙酸乙酯梯度)，產(chǎn)生9.74g(理論的73％)的標題化合物。19.9Na＝+7.0(甲醇中c＝0.044)。
HPLC/UV-Vis(方法8)Rt＝4.89min。
HPLC/UV-Vis(方法9)Rt＝4.75min。
IRνmax(NaCl，cm-1)2959，1742，1655，1520，1336，1160，1136，1087，1050，1027。
1H-NMR(500MHz，d6-DMSO)δ＝0.74(s，9H，tBu)，0.97-1.00(m，1H，β-CH2)，1.20-1.25(m，1H，β-CH2)，1.35(s，9H，OtBu)，2.99-3.05(m，1H，β-CH2)，3.23-3.26(m，1H，β-CH2)，3.66(s，3H，OMe)，3.94(m，1H，α-CH)，4.60(m，1H，α-CH)，6.82(d，J＝8.5Hz，1H，NH)，7.78(d，J＝8.0Hz，1H，PyrH)，7.94(d，J＝8.0Hz，1H，PyrH)，8.34(d，J＝8.5Hz，1H，NH)，8.64(s，1H，PyrH)。
LC-MS(方法7)Rt＝2.67min；MS(ESIpos.)m/z(％)＝476(100)，[M+H]+；MS(ESIneg.)m/z(％)＝400(80)，474(40)[M-H]-。
HR-TOF-MS(方法1)C22H33N3O5F3[M+H]+計算值476.2372，實測的476.2364。
實施例7AN-叔-丁氧基羰基-3-叔-丁基-D-丙氨酰-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酸 在-20℃將水(20ml)中的氫氧化鋰水合物的溶液(1.16g，2.5當量，48.37mmol)加入到THF(360ml)和水(100ml)中的來自實施例6A的化合物(9.2g，1.0當量，19.35mmol)的溶液。將反應(yīng)混合物溫熱(約1.5h)至+15℃，通過HPLC(方法9)觀察到完全的轉(zhuǎn)化。為了后加工，加入磷酸二氫鉀(26.33g，10當量，193.5mmol)(大約pH 7)。將反應(yīng)混合物過濾并真空濃縮。將粗產(chǎn)物通過凝膠色譜法純化(方法10，流動相甲醇/丙酮4∶1)，產(chǎn)生4.72g(理論的53％)產(chǎn)物。20Na＝+51.3(甲醇中c＝0.402)。
HPLC/UV-Vis(方法8)Rt＝4.63min。
HPLC/UV-Vis(方法9)Rt＝4.55min。
IRνmax(NaCl，cm-1)3305，2959，1663，1519，1336，1173，1134，1086。
1H-NMR(500MHz，d6-DMSO)δ＝0.77(s，9H，tBu)，1.06-1.13(m，1H，β-CH2)，1.23-1.26(m，1H，β-CH2)，1.34(s，9H，OtBu)，3.01(tapp，J＝11.0Hz，1H，ββ-CH2)，3.23(br d，J＝11.0Hz，1H，ββ-CH2)，3.94(t，J＝8.0Hz，1H，αα-CH)，4.42(br s，1H，αα-CH)，6.90(d，J＝8.5Hz，1H，NH)，7.74(d，J＝7.5Hz，1H，PyrH)，7.86(d，J＝7.5Hz，1H，PyrH)，8.00(br s，1H，NH)，8.56(s，1H，PyrH)。
LC-MS(方法7)Rt＝2.42min；MS(ESIpos.)m/z(％)＝406(100)，462(85)[M+H]+；MS(ESIneg.)m/z(％)＝460(100)[M-H]-。
HR-TOF-MS(方法1)C21H31N3O5F3[M+H]+計算值462.2216，實測的462.2203。
實施例8AN-叔-丁氧基羰基-3-叔-丁基-D-丙氨酰-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素三氟乙酸鹽 在-30℃將N-甲基嗎啉(2.77g，3.01ml，5當量，27.38mmol)和HATU(4.37g，2.1當量，11.50mmol)緩慢加入到無水DMF(119ml)中的來自實施例2A的化合物(7.00g，1.0當量，5.48mmol)和實施例7A的化合物(3.03g，1.2當量，6.57mmol)的溶液。將反應(yīng)混合物緩慢溫熱(約1h)至RT，通過HPLC/UV-Vis(方法9)觀察到完全的轉(zhuǎn)化。將所述反應(yīng)用磷酸二氫鉀(7.45g，10.0當量，54.76mmol)猝滅。將反應(yīng)混合物通過凝膠色譜法純化(方法10，流動相甲醇/丙酮4∶1)，產(chǎn)生12.63g(定量的)產(chǎn)物。
HPLC/UV-Vis(方法8)Rt＝4.78min。
HPLC/UV-Vis(方法9)Rt＝4.35min。
LC-MS(方法7)Rt＝2.28min；MS(ESIpos.)m/z(％)＝697(100)[M+2H]2+，1493(15)[M+H]+；MS(ESIneg.)m/z(％)＝745(100)[M-2H]2-，1491(5)[M-H]-。
HR-TOF-MS(方法1)C67H104N16O19F3[M+H]+計算值1493.7616，實測的1493.7594。
實施例9A和實施例10A(2S)-N-(叔丁氧基羰基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙氨酸和(2R)-N-(叔丁氧基羰基)-3-(三甲基甲硅烷基)丙氨酸根據(jù)M.Merget，K.Günther，M.Bernd，E.Günther，R.Tacke，J.Organomet.Chem.2001 628，183-194進行合成。通過手性相上的制備的HPLC進行對映異構(gòu)體的分離手性相Gilson Abimed HPLC；柱DaicelChiralpak AD-H 5μm；250×20mm；洗脫液A異己烷，洗脫液B0.2％乙酸/1％水/2-丙醇；恒溶劑；流速15ml/min；UV檢測器212nm。通過與N-(叔丁氧基羰基)-L-3-三甲基甲硅烷基丙氨酸(2R化合物，MercachemAMR 39.260)真實樣品的HPLC比較指定同分異構(gòu)體。
實施例9AN-(叔丁氧基羰基)-D-3-三甲基甲硅烷基丙氨酸(2S化合物)
手性HPLC(方法15)Rt＝4.16min，e.e.＞99％。D20＝+1.1(甲醇中c＝0.83)實施例10AN-(叔丁氧基羰基)-L-3-三甲基甲硅烷基丙氨酸(2R化合物) 手性HPLC(方法15)Rt＝9.27min，e.e.＞99％。D20＝-1.6(甲醇中c＝0.66)實施例11AN-(叔丁氧基羰基)-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯 類似于B.Neises，W.Steglich，Org.Synth.1985，63，183-187進行制備。
在氬氣下將(2S)-N-(叔丁氧基羰基)-3-(吡啶-3-基)丙氨酸(25.00g，93.88mmol)溶解在300ml的二氯甲烷中。加入甲醇(11.4ml，9.02g，281mmol，3當量)和DMAP的小晶體。然后將混合物冷卻至0℃。加入EDC(19.80g，103mmol，1.1當量)。5min.后，除去冰浴并且將所述混合物在RT下攪拌1h。然后將混合物真空濃縮，并將殘余物用乙酸乙酯混合并用飽和的碳酸氫鈉溶液萃取。將水相用乙酸乙酯反萃取一次，并然后將合并的有機相用0.5M檸檬酸洗滌并然后再次用飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌。將有機相經(jīng)過硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮。在油泵真空下干燥時結(jié)晶的清澈油狀物保留。收率23.60g(理論的90％)。
HPLC/UV-Vis(方法9)Rt＝3.28min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.21min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝281(100)[M+H]+。
1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ＝1.30(s，9H)，2.86(m，1H)，3.04(m，1H)，3.63(s，3H)，4.22(m，1H)，7.28-7.39(m，2H)，7.69(d，1H)，8.43(m，2H)。
實施例12A3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯雙三氟乙酸鹽 將來自實施例11A的化合物(11.8g，42.09mmol)溶解在二氯甲烷中的三氟乙酸(160ml；30％溶液)中并在RT攪拌30min。然后將混合物真空濃縮。將殘余物吸收到少量水中并冷凍干燥。然后將凍干物與甲苯混合并在真空下濃縮。最后將產(chǎn)物在油泵真空下干燥至恒重。收率17.15g(定量的)。
HPLC/UV-Vis(方法9)Rt＝0.88min。
LC-MS(方法7)Rt＝0.46min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝181(100)[M+H]+。
1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ＝2.79(dd，1H)，2.92(dd，1H)，3.60(s，3H)，3.63(m，1H)，7.30(m，1H)，7.62(d，1H)，8.41(m，2H)。
實施例13AN-(叔丁氧基羰基)-3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯 在0℃將來自實施例9A的化合物(10.31g，39.4mmol)和來自實施例12A的化合物(16.10g，39.4mmol，1當量)溶解在DMF(186ml)中。然后加入N-甲基嗎啉(17.34ml，16.00g，4當量)和HATU(22.49g，59.16mmol，1.5當量)。將混合物在RT攪拌兩小時。加入叔丁基甲基醚，并且用飽和的碳酸鈉溶液洗滌。將水相用叔丁基甲基醚反萃取一次，并且然后將合并的有機相用1M檸檬酸水溶液洗滌并再次用飽和的碳酸鈉溶液洗滌，經(jīng)過硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮。進行通過硅膠的過濾(環(huán)己烷/乙酸乙酯2∶1)。收率14.1g(理論的84％)。
HPLC/UV-Vis(方法9)Rt＝3.91min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.90min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝424(100)[M+H]+。
1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ＝-0.09(s，9H)，0.56-0.75(m，2H)，1.47(s，9H)，2.90(dd，1H)，3.09(dd，1H)，3.62(s，3H)，3.98(m，1H)，4.49(m，1H)，6.68(d，1H)，7.26(dd，1H)，7.61(m，1H)，8.20(d，1H)，8.40(m，2H)。
實施例14AN-(叔丁氧基羰基)-3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸
將來自實施例13A的化合物(7.4g，17.56mmol)吸收在THF/水(6∶4)中并冷卻至0℃，并且加入一水合氫氧化鋰(1.47g，35.13mmol，2當量)。將所述混合物在0℃攪拌。一小時后，加入另外當量(0.74g)的一水合氫氧化鋰，并且繼續(xù)攪拌一小時。在真空中蒸餾出大部分THF，并且用兩部分甲基叔丁基醚洗滌水相并然后通過加入檸檬酸調(diào)節(jié)到pH 4。固體沉淀。將混合物用三部分的乙酸乙酯萃取，由此所述固體溶解。將合并的有機相經(jīng)過硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將粗產(chǎn)物通過凝膠色譜法純化(方法3，流動相甲醇)。收率6.67g(理論的93％)。
HPLC/UV-Vis(方法9)Rt＝3.73min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.68min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝410(40)[M+H]+。
1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ＝-0.090(s，9H)，0.56-0.75(m，2H)，1.35(s，9H)，2.90(dd，1H)，3.09(dd，1H)，3.98(m，1H)，4.41(m，1H)，6.70(d，1H)，7.26(dd，1H)，7.60(m，1H)，8.00(d，1H)，8.37(m，2H)。
實施例15AN-(叔丁氧基羰基)-3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素三氟乙酸鹽
將來自實施例2A的化合物(3.00g，2.35mmol)和來自實施例14A的化合物(1.44g，3.52mmol，1.5當量)溶解在DMF(50ml)中并冷卻至0℃。然后首先加入DMF中4.7ml(4.7mmol，2當量)的4-甲基嗎啉溶液。緊接其后，加入HATU(1.52g，3.99mmol，1.7當量)并將所述混合物在0℃攪拌15min。然后逐滴加入DMF中另外4.7ml(4.7mmol，2當量)的4-甲基嗎啉溶液。然后將所述混合物在RT攪拌2h。將所述粗產(chǎn)物進行凝膠色譜分離(方法3)。在沒有精制的情況下將所述產(chǎn)物進一步反應(yīng)。收率3.6g(理論的82％)。
HPLC(方法9)Rt＝3.90min。
LC-MS(方法7)Rt＝2.00min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝721.8(100)[M+2H]2+；1442.1(5)[M+H]+。
備選方法將來自實施例2A的化合物(14.00g，10.95mmol)和來自實施例14A的化合物(5.38g，13.14mmol，1.2當量)溶解在DMF(280ml)中并冷卻至-20℃。然后加入N-甲基嗎啉(5.54g，6.02ml，5當量)并隨后加入HATU(6.66g，17.52mmol，1.6當量)。將所述混合物緩慢溫熱至RT并攪拌過夜(約16h)。然后在攪拌時加入磷酸二氫鉀(14.91g，10當量)，并將攪拌繼續(xù)30分鐘。將粗產(chǎn)物進行凝膠色譜分離(方法3，流動相甲醇)。在沒有精制的情況下使所述產(chǎn)物進一步反應(yīng)。收率14.35g(理論的61％)。
實施例16A2，2-二甲基-1-丁醛 將2，2-二甲基-1-丁醇(4.0g，39mmol)溶解在二氯甲烷(136ml)中，并加入氧化鋁(7.98g，78mmol，2當量)和氯鉻酸吡啶(pyridiniumchlorochromate)(16.88g，78mmol，2當量)。將混合物在RT攪拌1h并然后通過硅膠層過濾。將濾液謹慎濃縮，并在大氣壓下蒸餾所述殘余物(沸點102℃(990毫巴))。收率2.97g(理論的75％)。
GC-MS(方法17)Rt＝2.21min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝99.9(5)[M]+；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.83(t，3H)，1.03(s，6H)，1.51(q，2H)，9.42(s，1H)。
實施例17A(2Z)-2-{[(芐氧基)羰基]氨基}-4，4-二甲基己-2-烯酸甲酯 將來自實施例16A的化合物(2.55g，25.46mmol)和{[(芐氧基)羰基]氨基}(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(8.43g，25.46mmol)溶解在50ml的THF中并冷卻至0℃。逐滴加入N，N，N`，N`-四甲基胍，并且然后將所述混合物首先在0℃攪拌15min并然后在RT攪拌5天。將約20g的硅膠加入到所述混合物，將其濃縮并色譜分離(凝膠Biotage 40M，ZIF-SIM，環(huán)己烷/乙酸乙酯87∶13)。收率1.20g(理論的13％)。
HPLC(方法9)Rt＝3.71min。
MS(DCI)m/z(％)＝323.3(100)[M+NH4]。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝0.83(m，3H)，1.13(s，6H)，1.49(q，2H)，3.75(br s，3H)，5.72(br s，1H)，6.58(br s，1H)，5.12(s，2H)，7.36(m，5H)。
實施例18AN-[(芐氧基)羰基]-4，4-二甲基-D-正亮氨酸甲酯 將來自實施例17A的化合物(1.2g，粗產(chǎn)物，3.26mmol)溶解在乙醇p.a.(60ml)中。利用針，將氬氣通過約5min，并且然后加入(+)-1，2-雙[(2R，5R)-二乙基phospholano]苯(環(huán)辛二烯)銠(I)三氟化物(28mg，0.04mmol，0.012當量)并在超聲波浴中溶解。在3巴的氫壓力和RT下將氫化進行24h。將混合物濃縮并色譜分離(硅膠Biotage 25M，環(huán)己烷/乙酸乙酯9∶1)。收率920mg(理論的92％)。
HPLC(方法9)Rt＝4.96min。
LC-MS(方法7)Rt＝2.76min；MS(ESIpos.)m/z(％)＝308(25)[M+H]+。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ＝0.80(t，3H)，0.86(s，6H)，1.29(q，2H)，1.41(dd，1H)，1.73(dd，1H)，3.72(s，3H)，4.40(m，1H)，5.02(d，1H)，5.11(m，2H)，7.35(m，5H)。
實施例19AN-[(芐氧基)羰基]-4，4-二甲基-D-正亮氨酸
將來自實施例18A的化合物(915mg，2.98mmol)溶解在THF(12ml)中。將所述溶液冷卻至0℃并然后加入在水中的3.7ml(7.4mmol，2.5當量)的2M一水合氫氧化鋰溶液并劇烈攪拌1h。然后逐滴加入檸檬酸(1M)直到所述反應(yīng)是酸性的，并用乙酸乙酯萃取所述混合物。將有機萃取液經(jīng)過硫酸鈉干燥，濃縮并色譜分離(方法16)。收率434mg(理論的50％)。
HPLC(方法9)Rt＝4.54min。
LC-MS(方法7)Rt＝2.44min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝294(20)[M+H]+。
1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ＝0.80(t，3H)，0.83(s，6H)，1.21(q，2H)，1.53(dd，1H)，1.60(dd，1H)，3.99(m，1H)，5.02(s，2H)，7.35(m，5H)，7.58(d，2H)，12.52(br s，1H)。
實施例20AN-[(芐氧基)羰基]-4，4-二甲基-D-正亮氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸甲酯 將來自實施例19A的化合物(430mg，1.47mmol)和來自實施例12A的化合物(809mg，1.47mmol，1當量)在0℃溶解在DMF(5ml)中并然后加入4-甲基嗎啉(644μl，5.86mmol，4當量)和HATU(836mg，2.20mmol，1.5當量)。將所述混合物在RT攪拌三小時。加入乙酸乙酯，并用飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌。將水相用乙酸乙酯萃取一次，并然后將合并的有機相用1M檸檬酸水溶液洗滌并再次用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)過硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮。將所述殘余物色譜分離(方法16)。收率496mg(理論的74％)。
HPLC(方法9)Rt＝3.94min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.85min；MS(ESIpos.)m/z(％)＝456(100)[M+H]+。
1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ＝0.80(m，9H)，1.10(m，3H)，1.30(dd，1H)，2.91(dd，1H)，3.12(dd，1H)，3.30(s，3H)，4.02(m，1H)，4.51(m，1H)，5.01(d，1H)，5.06(d，1H)，7.22(dd，1H)，7.30(m，5H)，7.63(m，1H)，8.40(m，2H)。
實施例21AN-[(苯氧基)羰基]-4，4-二甲基-D-正亮氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酸
將來自實施例20A的化合物(490mg，1.08mmol)溶解在THF(5ml)中。將溶液冷卻至0℃并然后加入1.35ml(2.7mmol，2.5當量)在水中的2M一水合氫氧化鋰溶液并劇烈攪拌1h。然后將檸檬酸(在水中1M)逐滴加入直到所述反應(yīng)是酸性的，并用乙酸乙酯萃取所述混合物。將有機萃取液經(jīng)過硫酸鈉干燥并濃縮。收率484mg(quant.)。
HPLC(方法9)Rt＝3.76min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.88min；MS(ESIpos.)m/z(％)＝442(100)[M+H]+。
1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)δ＝0.70(m，9H)，1.14(m，3H)，1.30(dd，1H)，2.64(d，1H)，2.75(d，1H)，2.89(dd，1H)，3.11(dd，1H)，4.03(m，1H)，4.45(m，1H)，4.98(d，1H)，5.05(d，1H)，7.22(dd，1H)，7.30(m，5H)，7.61(m，1H)，8.40(m，2H)。
實施例22AN-[(芐氧基)羰基]-4，4-二甲基-D-正亮氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)-溶桿菌素三氟乙酸鹽
將來自實施例2A的化合物(0.28g，0.22mmol)和來自實施例21A的化合物(148mg，0.33mmol，1.5當量)溶解在DMF(4ml)中并冷卻至0℃。然后首先加入0.47ml(0.44mmol，2當量)在DMF中的1M的N-甲基嗎啉的溶液。緊接其后加入HATU(141mg，0.37mmol，1.7當量)并在0℃攪拌混合物15min。然后逐滴加入另外0.44ml(0.47mmol，2當量)的在DMF中的1M 4-甲基嗎啉的溶液。然后將所述混合物在RT攪拌過夜。在SephadexLH 20上純化所述混合物(方法3，流動相甲醇)。將粗產(chǎn)物用制備的HPLC純化(方法13)。收率149mg(理論的43％)。
HPLC(方法9)Rt＝3.93min。
LC-MS(方法7)Rt＝2.13min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝737.4(100)[M+2H]2+，1473(2)[M+H]+。
例舉性實施方案實施例13-叔-丁基-D-丙氨酰-3-(6-三氟甲基吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)-溶桿菌素雙三氟乙酸鹽
在RT將三氟乙酸(150ml)緩慢逐滴加入到來自實施例8A的化合物(10.3g，1.0當量，4.48mmol，粗產(chǎn)物)在二氯甲烷中的溶液(150ml)。將反應(yīng)混合物在RT攪拌(10min)，通過HPLC(方法9)觀察到完全轉(zhuǎn)化。將反應(yīng)混合物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮并用制備的HPLC(方法11)純化，由此獲得3.48g(理論的48％)產(chǎn)物。
HPLC/UV-Vis(方法8)Rt＝4.03min。
HPLC/UV-Vis(方法9)Rt＝3.64min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.69min；MS(ESIpos.)m/z(％)＝697(100)[M+2H]2+，1393(5)[M+H]+；MS(ESIneg.)m/z(％)＝695(100)[M-2H]2-，1391(20)[M-H]-。
19F-NMR(400MHz，d5-吡啶)δ＝-67(Ar-CF3)，-74(CF3COOH)，-132(1，4-二溴-四氟苯作為參照)。TFA含量14.3重量％。
HR-MS(方法1)C62H96N16O17F3[M+H]+計算值1393.7091，實測的1393.7119。
實施例23-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)-溶桿菌素三氟乙酸鹽
將來自實施例15A的化合物(9.12g，4.93mmol，粗產(chǎn)物)吸收在二氯甲烷中的三氟乙酸(65ml；30％溶液)中。將混合物在RT攪拌20min。將溶劑蒸餾出。將殘余物在油泵真空下干燥并然后用色譜分離純化(方法14)。收率5.54g(理論的67％)。
HPLC(方法9)Rt＝3.32min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.41min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝671.7(100)[M+2H]2+。
HR-TOF-MS(方法1)C60H97N16O17Si[M+H]+計算值1341.6987，實測的1341.7019。
1H-NMR(500MHz，d5-吡啶)δ＝-0.172(s，9H)，0.611(d，J＝6.9Hz，3H)，0.881(d，J＝7.9Hz，3H)，0.948(d，J＝6.3Hz，3H)，0.954-0.997(m，6H)，1.135(d，J＝6.0Hz，3H)，1.208(m，2H)，1.361(d，J＝5.4Hz，3H)，1.439(m，1H)，1.497(m，1H)，1.953(m，2H)，2.04(m，1H)，2.154(m，3H)，2.372(m，3H)，3.111(m，1H)，3.266(m，1H)，3.563(d，J＝14.95Hz，1H)，3.726(dd，J＝12.2，14.95Hz，1H)，3.840(d，J＝9.6Hz，1H)，3.960(m，1H)，4.152(m，1H)，4.198(m，1H)，4.278(m，1H)，4.382(m，1H)，4.488(m，1H)，4.565(dd，J＝9.5，9.6Hz，1H)，4.628(m，1H)，4.630(m，1H)，4.779(d，J＝12.2Hz，1H)，5.069(m，1H)，5.159(dd，J＝9.3Hz，1H)，5.264(m，1H)，5.362(s，1H)，5.98(d，J＝9.9Hz，1H)，6.351(dd，J＝8.5Hz，J＝8.7Hz，1H)，7.169(m，1H)，7.246(m，1H)，7.382(d，J＝9.9Hz，1H)，7.512(m，2H)，7.583-7.614(m，2H)，7.728(m，2H)，7.90(d，J＝8.7Hz，1H)，8.126(m，3H)，8.341(m，1H)，8.576(d，J＝3.6Hz，1H)，8.695(m，2H)，8.793(m，1H)，9.139(br s，1H)，9.715(m，1H)，10.957(br s，1H)，11.268(br s，1H).
13C-NMR(126MHz，d5-吡啶)δ＝-1.8，11.08，15.84，18.8，18.8，19.79，20.89，20.93，21.65，23.38，24.78，26.57，26.88，28.80，31.04，34.06，36.84，40.95，41.25，44.38，50.94，52.82，55.99，56.10，56.74，58.40，59.10，60.34，60.72，62.33，62.55，70.72，72.06，75.58，75.65，123.66，128.25，128.95，129.80，132.39，136.77，137.18，149.17，158.11，162.15，162.41，162.70，162.96，169.01，169.69，170.21，172.57，173.27，173.44，173.66，174.07，174.36，175.34，175.56。
19F-NMR(400MHz，d5-吡啶)δ＝-74(CF3COOH)，-132(1，4-二溴四氟苯作為參照)。TFA含量19.3重量％。
通過單晶X-射線結(jié)構(gòu)分析證實所述結(jié)構(gòu)。
實施例33-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)-溶桿菌素三甲磺酸鹽
將3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素三-三氟乙酸鹽(447mg，0.27mmol)溶解在22ml的水中。加入甲磺酸(70％)。將混合物劇烈攪拌并然后冷凍干燥。將凍干物吸收在水(3.4ml)中，并加入70％的甲磺酸鈉溶液(0.9ml)。將所述混合物在RT攪拌10min。然后用離心除去產(chǎn)物。獲得472mg的粗產(chǎn)物。
將從數(shù)個批次合并的粗產(chǎn)物(總共1053mg，0.63mmol)懸浮在水(5ml)中并在RT攪拌4天。重復(fù)離心，并將獲得的固體真空干燥。獲得575mg(理論的55％)產(chǎn)物。
HPLC(方法9)Rt＝3.30min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.49min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝671.8(100)[M+2H]2+，1342.1(5)[M+H]+。
1H-NMR(500MHz，d5-吡啶)δ＝-0.170(s，9H)，0.702(d，J＝6.3Hz，3H)，0.867(d，J＝6.1Hz，3H)，0.972(d，J＝6.2Hz，3H)，0.966-1.069(m，9H)，1.186(d，J＝6.5Hz，3H)，1.315(m，2H)，1.448-1.501(m，6H)，2.010(m，1H)，2.084(m，3H)，2.180-2.365(m，4H)，2.540(m，1H)，3.082(s，9H)，3.166(m，1H)，3.325(m，1H)，3.623(d，J＝14.05Hz，1H)，3.865(dd，J＝13.7，14.05Hz，1H)，3.967-3.986(m，2H)，4.257(m，1H)，4.339(m，2H)，4.410(m，1H)，4.566(m，1H)，4.591-4.686(m，2H)，4.75(d，1H，J＝12.1Hz，1H)，4.859(m，1H)，5.086(m，1H)，5.229(m，1H)，5.348(m，1H)，5.375(s，1H)6.02(d，J＝10.0Hz，1H)，6.403(m，1H)，7.068(d，J＝9.8Hz，1H)，7.222(m，3H)，7.544(m，3H)，7.625(m，1H)，7.681(m，1H)，7.830(d，J＝7.6Hz，1H)，7.921(d，J＝9.35Hz，1H)，8.071(m，2H)，8.188(br s，1H)，8.285(br s，1H)，8.420(d，J＝8.4Hz，1H)，8.614(d，J＝4.0Hz，1H)，8.701(m，1H)，8.874(br s，1H)，10.175(m，1H)，10.279(m，1H)，10.941(br s，1H)。
19F-NMR(吡啶，400MHz，方法24)δ-74.0(s，TFA，0.20)，-132.0(s，1，4-二溴四氟苯，1000.0)，TFA＝0.02重量％。
備選方法將32g的Dowex 1X8-400(HCl形式)裝填到柱(35mm直徑)中。將約60ml的1M氫氧化鈉溶液接著是60ml的HPLC水放到所述柱上。接著用60ml的1M甲磺酸老化并隨后用近似100ml水洗滌直到洗出液具有中性反應(yīng)。(Macherey & Nagel Tritest)。然后將2.00g(1.19mmol)的3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素三(三氟乙酸鹽)(實施例2)溶解在90ml水中，并裝載所述溶液并緩慢洗脫。將所述柱用約20ml水洗滌。將含有產(chǎn)物的洗出液合并并進行微濾(孔徑大小0.20μm)和冷凍干燥。將所述柱再老化并再生。從2000mg(1.19mmol)的實施例2獲得1.79g(1.10mmol，理論的92％)的實施例3。
實施例44，4-二甲基-D-正亮氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素三(三氟乙酸鹽)
將來自實施例22A的化合物(149mg，0.09mmol)溶解在甲醇/含有0.05％三氟乙酸(10ml)中。加入活性炭上的鈀(10％；20mg)并然后用大氣壓的氫并在RT下總共進行氫化2.5h。將粗產(chǎn)物過濾除去所述晶體，并將濾液濃縮。將殘余物用色譜分離(方法13)純化。收率68mg(理論的46％)。
HPLC(方法9)Rt＝3.29min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.49min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝671.0(100)[M+2H]2+，1340(5)[M+H]+。
HR-TOF-MS(方法1)C62H98N16O17[M+H]+計算值1339.7369，實測的1339.7368。
實施例5(比較例)3-叔-丁基-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素三(三氟乙酸鹽)
實施例6(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素三-鹽酸鹽 將32g的Dowex 1X8-400(HCl形式)裝填到柱(35mm直徑)中。將約60ml的1M氫氧化鈉溶液接著是60ml的HPLC水放到所述柱上。接著用60ml的1M鹽酸老化并隨后用近似100ml水洗滌直到洗出液具有中性反應(yīng)。(Macherey & Nagel Tritest)。然后將2.00g(1.19mmol)的3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素三(三氟乙酸鹽)(實施例2)溶解在90ml水中，并裝載所述溶液并緩慢洗脫。將所述柱用約20ml水洗滌。將含有產(chǎn)物的洗出液合并并進行微濾(孔徑大小0.20μm)和冷凍干燥。將所述柱再老化并再生。從2000mg(1.19mmol)的實施例2獲得1.54g(1.06mmol，理論的89％)的實施例6。
HPLC(方法9)Rt＝3.30min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.47min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝671.5(100)[M+2H]2+，1341.4(20)，[M+H]+。
離子色譜(方法25)Cl-(calc.)＝7.43％，Cl-實測的＝7.1％；TFA(實測的)＜0.1％。
1H-NMR(500MHz，d5-吡啶)δ＝-0.170(s，9H)，0.580(d，J＝6.3Hz，3H)，0.772(d，J＝5.7Hz，3H)，0.920(d，J＝5.8Hz，3H)，0.974-0.985(m，6H)，1.147(d，J＝6.4Hz，3H)，1.250-1.358(m，2H)，1.411(d，J＝5.7Hz，3H)，1.468(m，1H)，1.604(m，1H)，1.959-2.049(m，3H)，2.154-2.228(m，3H)，2.380(m，3H)，2.935(m，1H)，3.120(m，1H)，3.300(m，1H)，3.607(d，J＝14.9Hz，1H)，3.762(dd，J＝14.7Hz，1H)，3.882(d，J＝9.1Hz，1H)，3.938(m，1H)，4.204(m，1H)，4.253(m，1H)，4.389(m，1H)，4.465(m，1H)，4.589-4.661(m，4H)，4.806(d，J＝12.1Hz，1H)，5.027(m，1H)，5.202(dd，J＝9.4Hz，1H)，5.289(m，1H)，5.390(s，1H)，6.000(d，J＝9.5Hz，1H)，6.394(dd，J＝9.0Hz，1H)，7.173(m，2H)，7.428(m，1H)，7.54(d，J＝7.0Hz，1H)，7.664-7.973(m，3H)，7.767(d，J＝8.6，1H)，7.918-7.973(m，3H)，8.038(br s，2H)，8.098(br s，1H)，8.185(br s，1H)，8.253(d，J＝8.6Hz，1H)，8.582(m，1H)，8.684(d，J＝9.8Hz，1H)，8.741(br s，1H)，8.782(m，1H)，9.928(br s，1H)，10.272(d，J＝8.3Hz，1H)，10.886(br s，1H)，11.135(br s，1H)。
19F-NMR(吡啶，400MHz，方法24)TFA＜檢測限。
實施例7(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素三-L-乳酸鹽
將32g的Dowex 1X8-400(HCl形式)裝填到柱(35mm直徑)中。將約60ml的1M氫氧化鈉溶液接著是60ml的HPLC水放到所述柱上。接著用60ml的1M乳酸老化(conditioning)并隨后用近似100ml水洗滌直到洗出液具有中性反應(yīng)。(Macherey & Nagel Tritest)。然后將2.00g(1.19mmol)的3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素三(三氟乙酸鹽)(實施例2)溶解在90ml水中，并裝載所述溶液并緩慢洗脫。將所述柱用約20ml水洗滌。將含有產(chǎn)物的洗出液合并并進行微濾(孔徑大小0.20μm)和冷凍干燥。將所述柱再老化并再生。從2000mg(1.19mmol)的實施例2獲得1903mg(1.18mmol，理論的99％)的實施例7。
HPLC(方法9)Rt＝3.29min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.38min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝671.7(100)[M+2H]2+，1341.8(20)，[M+H]+。
1H-NMR(500MHz，d5-吡啶)δ＝-0.170(s，9H)，0.754(d，J＝6.3Hz，3H)，0.836(d，J＝6.1Hz，3H)，0.922(d，J＝6.2Hz，3H)，0.922-0.957(m，6H)，1.054(d，J＝6.4Hz，3H)，1.190(m，2H)，1.416(d，J＝5.8Hz，3H)，1.439-1.662(m，4H)，1.529(d，J＝7.0Hz，3H)，1.598(d，J＝6.5Hz，3H)，1.669(d，J＝6.9Hz，3H)，1.923-2.280(m，9H)，3.057(m，1H)，3.266(m，1H)，3.564(d，J＝14.5Hz，1H)，3.761(dd，J＝13.7Hz，1H)，3.840(m，1H)，4.049(m，1H)，4.109(m，1H)，4.164(m，1H)，4.202(m，1H)，4.410(m，1H)，4.484(m，1H)，4.616(dd，J＝6.7，13.6Hz，1H)，4.656(m，1H)，4.669(dd，J＝7.0，13.9Hz，1H)，4.780(d，J＝13.0Hz，1H)，4.921(m，1H)，5.144(dd，J＝9.6Hz，1H)，5.281(m，1H)，5.363-5.426(m，3H)5.362(s，1H)，5.989(d，J＝9.8Hz，1H)，6.323(m，1H)，7.122(m，1H)，7.180(m，1H)，7.381(m，1H)，7.596(m，1H)，7.671-7.925(m，6H)，8.036(br s，1H)，8.208(m，3H)，8.412(m，1H)，8.551(d，J＝3.6Hz，1H)，8.714(m，2H)，8.794(m，1H)，10.298(br s，1H)，10.938(br s，1H)。
19F-NMR(吡啶，400MHz，方法24)TFA＜檢測限。
實施例8(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素三-D-酒石酸鹽
離子交換劑的老化將5g的DOWEX 1X8 400(HCl鹽)用1M氫氧化鈉溶液洗滌直到洗出液具有堿性反應(yīng)。接著用2柱體積的水洗滌并然后用1M的D-酒石酸洗滌直到洗出液具有酸性反應(yīng)。接著用水洗滌直到洗出液是中性的(Macherey & Nagel Tritest)。
然后將100mg(59μmol)的實施例2溶解在10ml的水中并裝載到所述柱上。隨后用數(shù)個部分的約10ml的水進行洗滌。前體僅很少溶解并且部分保留在所述柱上。將含有產(chǎn)物的洗出液級分合并并冷凍干燥。獲得57mg(31μmol，理論的52％)產(chǎn)物。1H-NMR光譜積分指示(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素D-酒石酸的化學(xué)計量為1∶3。
HPLC(方法9)Rt＝3.29min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.37min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝671.7(100)[M+2H]2+，1341.9(20)，[M+H]+。
1H-NMR(500MHz，d5-吡啶)δ＝-0.172(s，9H)，0.597(d，J＝6.3Hz，3H)，0.776(d，J＝5.7Hz，3H)，0.924(d，J＝5.8Hz，3H)，0.954-0.997(m，6H)，1.173(d，J＝5.7Hz，3H)，1.303(m，2H)，1.434(d，J＝5.7Hz，3H)，1.468(m，1H)，1.632(m，1H)，1.972(m，2H)，2.051(1H，m)，2.174(m，3H)，2.402(m，3H)，3.129(m，1H)，3.305(m，1H)，3.602(d，J＝15.2Hz，1H)，3.799(dd，J＝14.6Hz，1H)，3.893(d，J＝12.3Hz，1H)，3.967(m，1H)，4.228(m，1H)，4.276(m，1H)，4.409(m，1H)，4.468(m，1H)，4.578-4.669(m，4H)，4.791(d，Jα，β＝11.5Hz，1H)，5.044(m，1H)，5.226(dd，J＝9.4Hz，1H)，5.190(m，1H)，5.362(s，1H)，5.417(s，6H)，5.997(d，J＝9.7Hz，1H)，6.403(dd，J＝8.9Hz，1H)，7.182(m，1H)，7.551-8.210(m，13H)，8.589(d，J＝3.6Hz，1H)，8.711(d，J＝10.0Hz，1H)，8.782(m，2H)，9.902(br s，1H)，10.358(m，1H)，10.882(br s，1H)，11.093(br s，1H)。
實施例9(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素 將結(jié)合聚合物的碳酸氫鹽PL-HCO3(Polymer Labs，容量1.8mmol/g)裝填到柱上。將396mg(相當于12當量的碳酸氫鹽)的樹脂用于反應(yīng)100mg(59μmol)的實施例2的化合物。將樹脂用吡啶洗滌。然后將吡啶(0.75ml)中的實施例2(100mg，59μmol)的溶液放到所述柱上并緩慢洗脫。首先用另外的吡啶(2ml)并然后用水(約2ml)洗滌所述柱。合并全部洗出液并在油泵真空下無熱量輸入的情況下濃縮。將玻璃態(tài)的殘余物溶解在數(shù)滴水并立即冷凍。獲得作為無色無定形粉末的標題化合物。
HPLC(方法9)Rt＝3.30min。
LC-MS(方法7)Rt＝1.49min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝671.8(100)[M+2H]2+，1341.9(10)，[M+H]+，MS(ESIneg)m/z(％)＝669.9(100)[M-2H]2-，1340.0(100)M-H]-。
19F-NMR(吡啶，400MHz，方法24)TFA 2.9％。
實施例10(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素甲磺酸鹽三氟乙酸鹽 可以在RT通過將實施例3從摻TFA的水中再結(jié)晶(所述溶液的緩慢蒸發(fā))獲得作為結(jié)晶物質(zhì)的標題化合物。
LC-MS(方法6)Rt＝1.41min，MS(ESIpos.)m/z(％)＝671.9(100)[M+2H]2+，1342.1(10)，[M+H]+，MS(ESIneg)m/z(％)＝669.9(100)[M-2H]2-，1340.1(80)M-H]-。
HR-TOF-MS(方法1)C60H97N16O17Si[M+H]+計算值1341.6982，實測的1341.7006。
通過單晶X-射線結(jié)構(gòu)分析證實所述結(jié)構(gòu)和鹽的形式。
B.生理活性的評價可以在下列測定中顯示本發(fā)明化合物的體外活性最低抑制濃度(MIC)的測定根據(jù)NCCLS準則在液體稀釋試驗中測定MIC。將金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)133、屎腸球菌(E.faecalis)27159、糞腸球菌(E.faecium)4147和肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)G9a的過夜培養(yǎng)物在1∶2的稀釋系列中與所述的測試物質(zhì)溫育。用Isosensitest培養(yǎng)基(Difco，Irvine/USA)中每ml細胞數(shù)為105微生物進行MIC測定，除肺炎鏈球菌在含有10％牛血清的BHI肉湯(Difco，Irvine/USA)中以每ml細胞數(shù)為106微生物以外。將所述培養(yǎng)在37℃溫育18-24小時，肺炎鏈球菌在10％CO2的存在下。
將不再有可見的細菌生長發(fā)生的每種情況中的最低物質(zhì)濃度定義為MIC。MIC的值以μg/ml報道。
在表A中顯示了本發(fā)明化合物的典型體外活性數(shù)據(jù)和fu數(shù)據(jù)表A
可以在下列動物模型中顯示本發(fā)明化合物對于細菌感染治療的適合性用金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)133的全身感染將金黃色葡萄球菌(S.aureus)133的細胞在BHI肉湯(Oxoid，New York/USA)中過夜生長。將過夜的培養(yǎng)物在新鮮BHI肉湯中1∶100稀釋并溫育3小時。將當時在對數(shù)生長期中的細胞離心出并用緩沖的生理鹽水洗滌兩次。然后將鹽水中的細胞懸浮液光度測定地調(diào)節(jié)到50單位的消光(extinction)。在稀釋步驟(1∶15)后，將所述懸浮液與10％粘蛋白溶液1∶1混合。腹膜內(nèi)給藥0.25ml/20g小鼠的該感染溶液(相當于1×106微生物/小鼠)。在感染后30分鐘在腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)發(fā)生治療。將雌性CFW1小鼠用于感染實驗。在6天的時期內(nèi)記錄所述動物的存活率。
可以在下列動物模型中顯示本發(fā)明化合物關(guān)于腎耐受性的性質(zhì)用于確定腎中毒作用的小鼠模型在多次具體劑量給藥后，通過小鼠腎的組織病理學(xué)檢查來分析九酯肽類的腎中毒副作用。為此，用溶解在水溶液中或加入Solutol的物質(zhì)，每天或者靜脈內(nèi)(i.v.)或者腹膜內(nèi)(i.p.)處理5-6個動物。通過腎的蘇木精和曙紅(H&E)染色的石蠟切片的光學(xué)顯微鏡評價來確定腎中毒的作用。任選進行一種‘高碘酸Schiff’(PAS)反應(yīng)用于糖蛋白的更好目測。對于每一個動物，將腎中毒的作用半定量地限定為管形嗜堿粒細胞增多(basophila)和退化/再生發(fā)生的嚴重程度(嚴重程度0＝無效；1＝最小作用；2＝輕度作用；3＝中度作用；4＝急性損傷)。管形退化/再生和發(fā)病率(影響的動物的數(shù)目)的平均嚴重程度是對于每一動物組或衍生物計算的。同樣列出了超出此程度的腎改變，諸如管形膨脹和壞死還有壞死材料的累積。
用于確定腎中毒效果的大鼠模型在多個具體劑量給藥后，通過大鼠腎的組織病理學(xué)檢查九酯肽類的腎中毒副作用。為此，用溶解在鹽水或Ringer’s乳酸鹽溶液中的物質(zhì)每天靜脈內(nèi)(i.v.)處理5個動物。通過腎的蘇木精和曙紅(H&E)染色的石蠟切片的光學(xué)顯微鏡評價確定腎中毒的效果。任選進行一種‘高碘酸Schiff’(PAS)反應(yīng)用于糖蛋白的更好目測。對于每一個動物，將腎中毒的效果半定量限定為管形嗜堿粒細胞增多和退化/再生發(fā)生的嚴重程度(嚴重程度0＝無效；1＝最小效果；2＝輕度效果；3＝中度效果；4＝急性損害)。管形退化/再生和發(fā)病率(影響的動物的數(shù)目)的平均嚴重程度是對于每一動物組或衍生物計算的。同樣列出了超出此程度的腎改變，諸如管形膨脹和壞死還有壞死材料的積累。
經(jīng)由Transil確定自由級分的原理這里描述的用于確定測試物質(zhì)的自由級分(fu)的方法分成2部分a)通過將所述測試物質(zhì)溫育在Transil緩沖液(pH 7.4)分散體中并隨后測定在所述分散體中和在緩沖液上清液中的濃度確定Transil/緩沖液分配比(MA緩沖液)。
b)通過將所述測試物質(zhì)溫育在Transil血漿分散體中并隨后測定在所述分散體中和在血漿中的濃度確定Transil/血漿分配比(MA血漿)。
所述兩個分配比的商得到fu。
在物質(zhì)是高度蛋白質(zhì)-結(jié)合的情況下，通常用等滲壓的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)稀釋所述血漿并然后用Transil懸浮。以類似于fu的測定進行該稀釋的蛋白質(zhì)溶液中的fu′(稀釋的血漿中的自由級分)的測定。由fu′和稀釋因子計算未稀釋血漿中的自由級分。
關(guān)于該方法，也可以比較Schuhmacher，Joachim；Kohlsdorfer，Christian；Buehner，Klaus；Brandenburger，Tim；Kruk，Renate，“High-throughputdetermination of the free fraction of drugs strongly bound to plasmaproteins.“Journal of Pharmaceutical Sciences 2004，93，816-830。
在Transil和緩沖液之間的分配之后測定測試物質(zhì)的膜親和性(MA緩沖液)全部溫育在適合的玻璃容器中進行，例如玻璃小瓶、磨口連接的試管?？傮w積通常是0.5-5ml，并且Transil體積是10-100μl。如果期望所述膜親和性高，則可以將Transil分散體用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋達到20倍，例如用Dulbecco’s PBS。將pH 7.4的磷酸鹽緩沖液提供在溫育容器中，并且在充分混合后吸入Transil。例如以200ng/ml，n＝6的濃度吸入所述測試物質(zhì)。有機溶劑的比例應(yīng)當是≤2％。即，將所述混合物在室溫下在小型振蕩器上以大約45°的角度，以大約400rpm溫育30min。通過取至少一個等分部分，例如，100μl，測定100％值，并且將殘留的混合物在約1800g離心約10min。從每個樣品取至少2個等分部分(例如100μl)的上清液用于濃度測定。
未稀釋的或稀釋血漿中MA血漿的測定總溫育體積和加入Transil的體積取決于期望的自由級分?？傮w積通常是0.5-1ml，并且Transil體積是10-100μl。如果所述自由級分非常低，則將要研究物種的血漿用等滲的緩沖溶液pH 7.4稀釋例如10-400倍，并然后加入Transil。隨后步驟如上關(guān)于測定MA緩沖液值所述。
經(jīng)由超濾測定自由級分的原理通過半透膜過濾要研究物種的血漿。測量濾液中物質(zhì)的濃度，并且從那里計算自由級分fU。使用來自Millipore/Amicon的Centrifree微分配系統(tǒng)。超濾膜具有排阻大小為30 000Da。將濃度約為1μg/ml的所述物質(zhì)摻入1ml血漿。溶劑的比例應(yīng)當是＜2％。在室溫下溫育30分鐘后，將所述血漿移液到超濾系統(tǒng)中并在1800g離心10分鐘。測量超濾液中物質(zhì)的濃度(Cu，未結(jié)合的物質(zhì)濃度)和離心前血漿中物質(zhì)濃度(C；總物質(zhì)濃度)。通過公式fu(％)＝Cu/C*100計算自由級分。
C.藥物組合物的例舉性實施方案本發(fā)明的化合物可以以下列方式轉(zhuǎn)化成藥物制劑片劑組成100mg實施例1的化合物，50mg乳糖(一水合物)，50mg玉米淀粉(天然的)，10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 25)(BASF，Ludwigshafen，德國)和2mg硬脂酸鎂。
片劑重量212mg。直徑8mm，曲率半徑12mm。
制備將活性成分、乳糖和淀粉的混合物用水中的5％PVP溶液(m/m)造粒。將所述粒劑干燥然后與硬脂酸鎂混合5分鐘。將該混合物用常規(guī)壓片機擠壓(參見上面用于片劑的形式)。用于壓縮的壓縮力指標是15kN。
可以口服給藥的混懸劑組成1000mg實施例1的化合物，1000mg乙醇(96％)，400mg的Rhodigel(來自FMC的黃原膠，賓夕法尼亞，USA)和99g水。
10ml的口服混懸劑對應(yīng)于100mg本發(fā)明化合物的單一劑量。
制備將Rhodigel懸浮在乙醇中，并將所述活性化合物加入到所述懸浮液。攪拌的同時加入水。將所述混合物攪拌約6h直到Rhodigel的溶脹是完全的。
可以靜脈內(nèi)給藥的溶液劑組成100-200mg實施例1的化合物，15g聚乙二醇400和250g注射用水。
制備在攪拌下將實施例1的化合物和聚乙二醇400溶解在水中。通過過濾(孔徑0.22μm)將所述溶液消毒并在無菌條件之下分配到熱滅菌的輸液瓶中。將后者用輸注塞和卷曲帽封閉。
權(quán)利要求
1.下式的化合物， 其中R1表示氫，并且R2表示2，2-二甲基丁-1-基、2-乙基-2-甲基丁-1-基、2，2-二乙基丁-1-基、2，2-二甲基戊-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，或R1表示三氟甲基，并且R2表示2，2-二甲基丙-1-基、2，2-二甲基丁-1-基、2-乙基-2-甲基丁-1-基、2，2-二乙基丁-1-基、2，2-二甲基戊-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，或它的鹽、它的溶劑合物或它的鹽的溶劑合物中的一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其特征在于R1表示氫，并且R2表示2，2-二甲基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基，或R1表示三氟甲基，并且R2表示2，2-二甲基丙-1-基、2，2-二甲基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其特征在于R1表示氫，并且R2表示2，2-二甲基丁-1-基、2-乙基-2-甲基丁-1-基、2，2-二乙基丁-1-基或三甲基甲硅烷基甲基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其具有下列結(jié)構(gòu)3-(三甲基甲硅烷基)-D-丙氨酰-3-(吡啶-3-基)-L-丙氨酰-脫(1-D-亮氨酰-2-L-亮氨酰)溶桿菌素， 或它的鹽、它的溶劑合物或它的鹽的溶劑合物中的一種。
5.制備根據(jù)權(quán)利要求1的式(I)化合物的方法，其特征在于將下式的化合物 與下式的化合物反應(yīng)， 其中R1和R2具有權(quán)利要求1中指出的含義，并且X1表示鹵素，優(yōu)選溴、氯或氟，或者羥基。
6.用于治療和/或預(yù)防疾病的根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的化合物在制備用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的化合物在制備用于治療和/或預(yù)防細菌感染的藥物中的應(yīng)用。
9.藥物，其含有與惰性的、非毒性的藥用賦形劑組合的根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的化合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物，其用于治療和/或預(yù)防細菌感染。
11.用于在人和動物中控制細菌感染的方法，其中施用抗菌有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的至少一種化合物、根據(jù)權(quán)利要求9的藥物或根據(jù)權(quán)利要求7或8獲得的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及九酯肽類(溶桿菌素衍生物)，其生產(chǎn)方法，和它們在制備用于治療和/或預(yù)防疾病、特別是細菌感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。所述新的溶桿菌素衍生物它們與天然物質(zhì)的區(qū)別在于含有3－(3－吡啶基)－丙氨?；鶊F的N－末端肽鏈。
文檔編號C07K5/00GK101056887SQ200580037113
公開日2007年10月17日 申請日期2005年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者弗朗茨·馮努斯鮑姆, 尼娜·布呂納, 賴納·恩德曼, 昌塔爾·菲爾斯特納, 埃爾克·哈特曼, 霍爾格·保爾森, 雅克·拉戈, 吉多·席費爾, 約阿希姆·舒馬赫爾, 尼爾斯·斯文施特魯普, 約阿希姆·泰爾塞, 索尼婭·安勞夫, 邁克-亞歷山大·布呂寧 申請人:艾庫里斯有限及兩合公司