專利名稱：乙肝病毒s抗原的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能識別乙肝病毒(HBV)s抗原(HBs抗原)的新穎表位的探針與利用該探針檢測HBV或HBs抗原的方法。
背景技術(shù)：
主要通過檢測病毒或病毒相關(guān)組分(蛋白質(zhì)或核酸)或通過檢測病毒感染后活體產(chǎn)生的特異性抗體來診斷病毒感染。
一般通過確認存在HBs抗原或HBc抗體來獲知HBV感染。乙肝病毒e抗原(HBe抗原)的含量、該抗原的抗體含量或HBV的DNA(HBV-DNA)含量可作為HBV感染與HBV攜帶者的臨床狀態(tài)或?qū)︻A(yù)后和治療效果判斷的指標來檢測。
在構(gòu)成HBV病毒顆粒(HBV顆粒)的抗原中，HBs抗原是感染性HBV顆粒表面的主要組成型包膜蛋白，其錨定在包裹了含HBV-DNA的核心顆粒的源自肝細胞的脂雙層中。感染了HBV的患者血液中由HBs抗原構(gòu)成的非感染性小球形顆?；蚬軤铑w粒。該小球形顆粒在血液中含量最豐富，每一個或幾個HBV顆粒可觀察到約1000個小球形顆粒。目前可購得的大多數(shù)HBs抗原檢驗試劑主要檢測小球形顆粒形式的HBs抗原。
HBs抗原是由226個氨基酸殘基(氨基酸號1-226)構(gòu)成，穿過脂雙層4次的膜蛋白。雖然HBs抗原的跨膜結(jié)構(gòu)的模型尚未完全闡明，Howard等(Howard等，《病毒性肝炎與肝臟疾病》(Viral Hepatitis and Liver Disease)，(ZuckermanAJ，Alan R編)，第1094-1101頁，Liss Inc.，紐約，1988)提出HBs抗原由以下部分構(gòu)成脂雙層外，由HBs抗原的N末端1-11位構(gòu)成的(ER腔側(cè))區(qū)；由12-28位構(gòu)成，穿過脂雙層的疏水性跨膜區(qū)域；脂雙層內(nèi)由29-80位構(gòu)成的區(qū)域；由81-97位構(gòu)成的疏水性跨膜區(qū)域；由98-156位構(gòu)成的親水性ER腔區(qū)域；與157-226位構(gòu)成的兩個疏水性跨膜區(qū)域(

圖1)。
常規(guī)方法檢測HBs抗原所用的主要共有“a”決定子位于氨基酸110-156位，其包含在位于ER腔側(cè)的98-156位氨基酸中，即病毒顆粒的表面。據(jù)報道此共有“a”決定子由其中存在至少4個表位的復(fù)雜高級結(jié)構(gòu)構(gòu)成(岡本宏明，Nippon Rinsho，Bunshi Kan-En Uirusubyogaku，Kiso-Rinsho-Yobo(日本臨床，分子肝炎病毒學(xué)，基礎(chǔ)臨床預(yù)防)，下卷，甲型、乙型、丁型、戊型肝炎病毒，第212-222頁，1995年10月26日出版)。
HBV是DNA病毒，但已知HBV可發(fā)生與RNA病毒相當?shù)耐蛔?，因為在病毒增殖期間，其DNA復(fù)制為RNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶從此RNA合成DNA。因此，據(jù)估計，感染了HBV的個體中會發(fā)生具有各種突變的突變體。當給這種個體中的HBV施加外部選擇壓力，例如中和抗體時，會發(fā)生對壓力敏感的HBV病毒株減少的現(xiàn)象，而對壓力耐受或不敏感的突變體增加。近年來，逐漸成問題的所謂“逃避突變體”是在該主要共有的“a”決定子中發(fā)生氨基酸取代、缺失或插入，從而該突變體可通過逃避識別突變前的“a”決定子的抗體來維持其感染能力。
發(fā)生逃避突變體的相關(guān)問題是此突變體可維持持久的感染能力，因為它能規(guī)避通過接種利用突變前的“a”決定子的疫苗所誘導(dǎo)的抗體。
另一問題是常規(guī)HBs抗原檢測方法不能檢測此逃避突變體。在共有“a”決定子上具有突變的逃避突變體一般與針對野生型HBV的共有“a”決定子的單克隆抗體具有較低的反應(yīng)性，因此，常規(guī)HBs抗原檢測方法所用的、針對野生型共有“a”決定子的單克隆抗體不能識別逃避突變型HBV的HBs抗原，從而不能發(fā)現(xiàn)實際發(fā)生的HBV感染。例如，據(jù)報道145Arg突變體，即其中145位的氨基酸從野生型的Gly改變?yōu)锳rg的突變體，與針對共有“a”決定子的單克隆抗體的反應(yīng)性顯著降低(岡本宏明，Nippon Rinsho，Bunshi Kan-EnUirusubyogaku，Kiso-Rinsho-Yobo(日本臨床，分子肝炎病毒學(xué)，基礎(chǔ)臨床預(yù)防)，下卷，甲型、乙型、丁型戊型肝炎病毒，第212-222頁，1995年10月26日出版)。實際上，據(jù)報道，在用常規(guī)HBs抗原檢測試劑進行的HBV篩選測試中呈HBs抗原陰性的輸血導(dǎo)致了HBV感染(Thiers等，Lancet，ii，1273-1276，1988)。
在HBV急性感染中，報道了HBV感染的患者在感染最初階段是HBs抗原陽性，然后轉(zhuǎn)變?yōu)镠Bs抗原陰性同時變?yōu)镠bs抗體陽性的現(xiàn)象?；颊咦?yōu)镠Bs抗體陽性的原因在于患者體內(nèi)產(chǎn)生針對HBs抗原的共有“a”決定子的抗體。該患者針對共有“a”決定子的抗體與HBs抗原測試試劑所用的單克隆抗體所識別的共有“a”決定子的同一區(qū)域相結(jié)合，從而導(dǎo)致兩種抗體間發(fā)生競爭，通過競爭降低了HBs抗原測試試劑的靈敏度，進而阻止了測試試劑對HBV的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題常規(guī)HBs抗原測試試劑利用針對野生型HBV的共有“a”決定子的單克隆抗體，故其不能檢測在共有“a”決定子上具有突變的逃避突變體，當將以此測試試劑判斷為陰性的血液用于輸血時，可能導(dǎo)致HBV感染。本發(fā)明的目的是開發(fā)一種能檢測這種HBV逃避突變體的探針與利用此探針檢測HBs抗原的方法。
本發(fā)明的另一目的是開發(fā)一種不被針對共有“a”決定子的患者抗體所阻止，即使在受感染患者的HBs抗體陽性樣品中也能檢測HBs抗原的探針，以及利用此探針檢測HBs抗原的方法。
解決問題的方法本發(fā)明人利用抗體作為探針成功地解決了上述問題，所述抗體能識別位于由SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位。
即，本發(fā)明涉及的探針能識別位于對應(yīng)于乙肝病毒s抗原中26-80位氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位，具體地說該探針能識別位于SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位。
本發(fā)明也涉及檢測乙肝病毒或乙肝病毒抗原的方法，所述方法包括利用上述探針。
在本說明書中，226個氨基酸殘基構(gòu)成的HBs抗原中部分氨基酸序列的位置以指定該抗原的N-末端氨基酸殘基為數(shù)字1來表示。在HBV基因的S區(qū)域中有Pre-S1、Pre-S2和S基因來編碼由389-400個氨基酸殘基構(gòu)成，受Pre-S1基因+Pre-S2基因+S基因控制的大S蛋白；由281個氨基酸殘基構(gòu)成，受Pre-S2基因+S基因控制的中等S蛋白；由226個氨基酸殘基構(gòu)成，受S基因控制的小S蛋白(三田村圭二，Nippon Rinsho，Bunshi Kan-En Uirusubyogaku，Kiso-Rinsho-Yobo(日本臨床，分子肝炎病毒學(xué)，基礎(chǔ)臨床預(yù)防)，下卷，第13-27頁，1995年10月26日出版)。除非另有說明，本文所用的術(shù)語“HBs抗原”一般表示小S蛋白。然而，本發(fā)明的檢測方法也可檢測所有大S蛋白、中等S蛋白與小S蛋白，因此該方法檢測的乙肝病毒s抗原(HBs抗原)包含以上3種蛋白。
本發(fā)明探針能識別SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位，通常是能特異性識別該表位的多克隆抗體或單克隆抗體。該抗體的具體例子是雜交瘤細胞株1C10、4A3或6G6產(chǎn)生的單克隆抗體，這些細胞株在2004年9月9日由日本，茨城縣，Tsukuba市，東1丁目1番地1，中央第6的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心以登錄號FERM ABP-10115、ABP-10116和ABP-10117保藏。
SEQ ID NO1所示的氨基酸序列對應(yīng)于HBs抗原的26-80位的氨基酸序列，即HBs抗原脂雙層內(nèi)的親水性區(qū)域。此表位位于HBV病毒顆粒、小球形顆?；蚬軤铑w粒內(nèi)，與位于ER腔側(cè)、含HBs抗原共有“a”決定子的區(qū)域不同，該表位不經(jīng)受選擇壓力，例如能誘導(dǎo)逃避突變體的中和抗體。因此，與常規(guī)方法所用的共有“a”決定子相比，以上表位中的突變幾乎不經(jīng)受選擇壓力，利用本發(fā)明表位，很少或從不發(fā)生只有特定突變體占據(jù)優(yōu)勢從而造成只有不與HBs抗原檢測試劑發(fā)生反應(yīng)的突變體增加的情況。
當利用本發(fā)明的探針檢測HBs抗原時，其幾乎不受患者針對HBs抗原的抗體干擾。這可能是因為本發(fā)明探針所識別的表位處于HBV顆粒、小球形顆粒與管狀顆粒的內(nèi)部，因而與HBs抗原的共有“a”決定子相比，此表位不易在感染HBV的患者體內(nèi)起到免疫原的作用，因此抑制了患者產(chǎn)生針對該表位的抗體。
通過利用本發(fā)明的探針，即使在共有“a”決定子上具有突變的逃避突變體中，亦可能可靠地檢測HBs抗原。
為利用本發(fā)明探針檢測樣品的HBV顆粒、小球形顆粒或管狀顆粒中的HBs抗原，位于脂雙層內(nèi)部或球形或管狀顆粒中的HBs抗原26-80位的氨基酸序列上的表位應(yīng)處于可與該探針接觸的狀態(tài)。
本發(fā)明的另一方面是檢測樣品中HBV或HBs抗原的方法，所述方法包括向樣品中加入能使脂雙層或蛋白質(zhì)凝聚物變性的變性劑，通常是蛋白質(zhì)變性劑，例如表面活性劑、離液離子等，特別是表面活性劑從而能用本發(fā)明探針檢測樣品中的HBs抗原。
在本發(fā)明中，利用變性劑使HBV顆粒、小球形顆粒與管狀顆粒變性，從而使由HBs抗原26-80位的氨基酸序列構(gòu)成的它們的內(nèi)部區(qū)域，即存在于HBs抗原的脂雙層內(nèi)部的親水性區(qū)域與外部相接觸。本文可用的變性劑是能破壞HBV顆粒的脂雙層并斷裂小球形顆粒和管狀顆粒中HBs抗原問的鍵(凝聚)但不使本發(fā)明探針失活的變性劑，通?？捎弥T如十二烷基硫酸鈉的表面活性劑。
本發(fā)明也提供檢測HBV病毒的方法，所述方法包括利用本發(fā)明的探針、變性劑與能特異性識別除HBs抗原以外的HBV抗原的探針，以及具有這種構(gòu)成的檢測HBV的試劑，即該試劑包括本發(fā)明的探針、變性劑與能特異性識別除HBs抗原以外的HBV抗原的探針。
通過與本發(fā)明的探針聯(lián)用的某探針檢測除HBs抗原以外的HBV抗原，例如HBcr抗原(WO02/14871)，可將因只檢測HBs抗原而錯誤判斷為HBV陰性的HBV患者樣品可靠地判斷為HBV陽性。
如上所述，已知HBs抗原能以與RNA病毒相當?shù)母哳l率發(fā)生突變。因此，突變型HBs抗原也可由不同于HBs抗原26-80位的氨基酸序列中SEQ ID NO1所示氨基酸序列的序列構(gòu)成。
然而，即使具有這種突變的HBs抗原，如果確定了其氨基酸序列，也能根據(jù)本說明書的內(nèi)容在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達與純化。得到針對這種純化的突變型HBs抗原的探針，將其用于檢測HBs抗原。因此，在本發(fā)明中，對應(yīng)于HBs抗原26-80位的氨基酸序列的序列不限于識別SEQ ID NO1所示氨基酸序列上表位的探針或利用所述探針的檢測方法。
本發(fā)明的作用利用本發(fā)明的探針與利用該探針檢測HBV或HBs抗原的方法，能高度敏感性地檢測在HBs抗原的共有“a”決定子上具有突變、不能用常規(guī)HBs抗原檢測方法檢測的逃避突變體等，從而可高度可靠地判斷HBV感染。即使如果針對HBs抗原的共有“a”決定子的患者抗體抑制了HBs抗原的檢測，采用本發(fā)明的檢測方法也能可靠地判斷HBV感染。
即使患者的抗體與本發(fā)明的探針競爭并抑制了HBs抗原的檢測，通過聯(lián)用酸化劑或堿化劑與變性劑預(yù)處理能可靠地判斷HBV感染。
聯(lián)用本發(fā)明的探針與能識別另一HBV抗原的探針來同時檢測HBs抗原與另一HBV抗原，能更可靠地檢測HBV感染。
附圖簡述圖1闡述了HBs抗原的二級結(jié)構(gòu)。
實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的探針可以是能特異性識別對應(yīng)于HBs抗原26-80位的氨基酸序列(例如SEQ ID NO1所示氨基酸序列)構(gòu)成的肽上表位的任何探針，通?？捎冕槍乖?，例如上述肽或HBs抗原產(chǎn)生的抗體，特別是單克隆抗體。
可通過利用編碼該肽的基因的重組基因技術(shù)或化學(xué)合成制備SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽，采用本身已知的各種方法或儀器等可得到這種制備工藝。
可通過從HBV患者血清中分離病毒基因，經(jīng)PCR擴增該目標基因來制備含有編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的核苷酸序列的基因片段。利用源自PCR期間加入的接頭的限制性酶切位點或源自基因片段所插入的質(zhì)粒的限制性酶切位點，可將該基因克隆入表達載體。
將此表達載體轉(zhuǎn)化入宿主，例如大腸桿菌中，培養(yǎng)大腸桿菌得到位于脂雙層內(nèi)部的HBs(26-80)抗原。采用諸如超聲破碎細胞、離心與各種層析技術(shù)的常規(guī)技術(shù)可實現(xiàn)從經(jīng)培養(yǎng)得到的微生物中收集與純化目標蛋白質(zhì)的方法。即，當采用上述方法有效地表達目標蛋白質(zhì)時，許多蛋白質(zhì)在微生物中形成內(nèi)含體。利用此特征，可在生理條件(例如生理鹽水)下將這些微生物懸浮在緩沖液中，然后超聲破碎細胞，離心破碎的微生物物質(zhì)回收不可溶組分。用6M脲提取回收的不可溶組分，凝膠過濾得到高純度的trpE-HBs(26-80)抗原，然后將其用作免疫原。
可通過單用上述HBs(26-80)抗原或多肽(下文稱為本發(fā)明抗原)或?qū)⑴cBSA、KLH等偶聯(lián)的本發(fā)明抗原與佐劑(例如完全弗氏佐劑)的混合物周期性免疫動物，例如大鼠、家兔、山羊或綿羊，然后收集其血清來制備本發(fā)明的探針，例如多克隆抗體。為獲得具有特異性識別位點的多克隆抗體，有可利用目標區(qū)域中的部分肽作為免疫原的方法。
熟知利用雜交瘤制備單克隆抗體。例如，單用本發(fā)明抗原或其與BSA、KLH等的偶聯(lián)物作為與佐劑(例如完全弗氏佐劑)的混合物周期性免疫動物，例如BALB/c小鼠。當血液中的抗體滴度增加時，在最后一次免疫中將本發(fā)明抗原給予尾靜脈，無菌切下脾臟，將脾細胞與合適的小鼠骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤?？刹捎肒ohler和Milstein的方法(Nature，256495-497，1975)實施此方法。
在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)采用上述方法得到的雜交瘤，然后選擇并克隆產(chǎn)生能與本發(fā)明抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體的雜交瘤細胞。為克隆產(chǎn)生抗體的雜交瘤，不只可采用有限稀釋也能采用軟瓊脂方法(Eur J Immuno1.，6511-519，1976)。可在培養(yǎng)基或小鼠腹腔中培養(yǎng)此雜交瘤從而在培養(yǎng)基或腹水中制備單克隆抗體。
可采用例如蛋白A的柱層析的方法純化血清中的多克隆抗體或培養(yǎng)基或腹水中制備的單克隆抗體。可采用，例如利用載體固定的抗原的親和層析方法處理多克隆抗體，從而只純化能與特定抗原反應(yīng)的抗體，也可以類似方式得到不與特定抗原反應(yīng)的抗體。
除了單克隆抗體與多克隆抗體，可制備用作探針的分子。例如，Hoogenboon的綜述(Trends in Biotechnology，1562-70，1997)詳述了重組抗體。
本發(fā)明所用的變性劑可以是能破壞HBV顆粒的脂雙層結(jié)構(gòu)并斷裂小球形顆粒和管狀顆粒中HBs抗原間的鍵(凝聚)的任何變性劑。例如，可利用脲、酸化劑與堿化劑，表面活性劑特別有效。表面活性劑包括非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑與陰離子表面活性劑，以上任一種只要能破壞脂雙層的結(jié)構(gòu)就可用。例如，非離子表面活性劑，如吐溫20與Nonidet P-40能有效地破壞脂雙層結(jié)構(gòu)從而使本發(fā)明的表位暴露，雖然它們的表面活性不是很強。
認為陰離子表面活性劑，例如SDS與Sarcosyl具有強表面活性，這種表面活性劑也能使本發(fā)明的表位暴露。用強表面活性劑處理可能破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象表位，因而在某些情況中識別構(gòu)象表位的抗體不能與抗原結(jié)合；在此情況中，可利用能識別HBs抗原的線性表位的探針來檢測抗原。
變性劑的作用不只能有效地釋放存在于樣品中的HBs抗原，也能使單克隆抗體易于和HBs抗原結(jié)合。
在本發(fā)明中，特別優(yōu)選利用能特異性地與用上述表面活性劑變性的抗原相結(jié)合的探針。當將抗體用作探針時，該抗體應(yīng)是能與通過上述變性處理而暴露和變性的本發(fā)明表位相結(jié)合的探針。
例如，當利用具有強表面活性的具體表面活性劑時，需要選擇針對利用該表面活性劑而暴露和變性的表位的單克隆抗體。因此，需要用已用表面活性劑變性處理過的、對應(yīng)于HBs抗原26-80位的氨基酸(序列)構(gòu)成的肽(例如，SEQID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽)免疫動物，也需要用所述肽選擇抗體。
為篩選抗體，將經(jīng)變性處理的肽抗原固定在固相上，在含有表面活性劑的溶液中篩選與該抗原反應(yīng)的單克隆抗體，從而得到適合于免疫測定的本發(fā)明抗體。由于篩選溶液含有表面活性劑，可得到能耐受表面活性劑的變性作用的單克隆抗體。
可采用免疫測定，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶免疫斑點測定、放射性免疫測定與基于凝集的試驗或其它熟知的免疫測定來檢測樣品中經(jīng)變性處理的HBs抗原。當利用標記的抗體檢測時，可使用標記物諸如熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)或酶。
例如，當采用根據(jù)ELISA夾心反應(yīng)原理的方法來檢測樣品中的HBs抗原時，所述方法包括以下步驟。首先，將能識別位于脂雙層內(nèi)部的表位的抗體等與固體支持物(例如，微滴定孔的內(nèi)壁)結(jié)合。然后，用牛血清白蛋白等封閉以防止非特異性反應(yīng)。向此支持物加入用表面活性劑等處理過的樣品，從而使固定于其上的抗體捕獲HBs抗原。針對捕獲的HBs抗原的標記抗體等可與該HBs抗原反應(yīng)來檢測。待與固體支持物結(jié)合的抗體可以是能與位于脂雙層內(nèi)部的表位結(jié)合的任何抗體。標記的抗體可以是能與HBs抗原結(jié)合的任何抗體。它們的組合是隨意的，可選擇能實現(xiàn)高選擇性與高特異性的組合。
上述可用的固體支持物包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯微滴定板、試管、毛細管、珠(乳膠顆粒、紅細胞、金屬化合物等)、膜(脂質(zhì)體等)與過濾器等?？蓹z測其中的本發(fā)明HBs抗原的樣品包括生物學(xué)體液，例如全血、血漿、血清、尿、唾液與腦脊液以及組織，例如肝臟組織。
將樣品中的HBs抗原處理為適合于和探針，例如單克隆抗體(發(fā)生)結(jié)合反應(yīng)的狀態(tài)而不涉及復(fù)雜過程的方法對本發(fā)明很重要。即，溶解樣品所含HBs抗原的脂雙層從而使原來不暴露于病毒顆粒表面的表位變得暴露是重要的。
實施例以下實施例是為說明本發(fā)明，而不是要限制本發(fā)明的范圍。
實施例1trpE-HBs(26-80)抗原的表達與純化(A)構(gòu)建表達TrpE-HBs(26-80)抗原的質(zhì)粒采用以下方法構(gòu)建HBs(26-80)區(qū)域的表達質(zhì)粒。將100μl HBV患者的血清與100μl DNA提取物[10μl 1M Tris-HCl(pH 8.4)，8μl 250mM EDTA，40μl 10％SDS，8μl 5M NaCl，10μl 20mg/ml蛋白酶K，1μl tRNA(5μg/μl)，與23μl無菌水]混合，54℃培育30分鐘。將樣品與200μl苯酚/氯仿(1/1)溶液混合，然后15Krpm離心5分鐘得到上清液，向上清液中加入150μl異丙醇與7μl 5M NaCl，-20℃靜置1小時。4℃，15Krpm離心5分鐘后，用70％乙醇洗滌沉淀物，然后再4℃以15Krpm離心5分鐘。風干沉淀物，溶解于20μl無菌水得到HBV DNA溶液。
5μl此HBV DNA溶液利用兩種引物(即，5’-GAATTCCTCACAATACCACAGAGTCTA-3’(SEQ ID NO2)和5’-GGATCCTTAAAAACGCCGCAGACACATCCAGCG-3’(SEQ ID NO3))進行PCR。利用GeneAmpTM(Perkin Elmer Cetus制造的DNA擴增試劑試劑盒)以95℃1分鐘DNA變性、55℃1分鐘退火與72℃1分鐘DNA合成為條件進行PCR，采用0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，玻璃粉方法(glass powder method)(GeneClean)純化得到的DNA片段。37℃，用20μl限制性酶切反應(yīng)溶液[50mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl，15 U EcoRI酶與15 U BamHI酶]消化0.5μg該擴增的HBs(26-80)基因片段1小時，然后進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳來純化約180-bp的EcoRI-BamHI片段。
然后，在37℃用20μl限制性酶反應(yīng)溶液[50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl，15 U EcoRI酶與15 U BamHI酶]消化0.5μg DNA(即表達載體pATtrpE)1小時，再向反應(yīng)溶液中加入39μl水，接著將溶液在70℃加熱處理5分鐘，向其中加入1μl(250 U/μl)細菌堿性磷酸酶(BAP)，37℃培育1小時。
苯酚提取該反應(yīng)溶液，乙醇沉淀得到的水相，干燥沉淀物。將0.5μg所得的EcoRI-BamHI-處理的載體DNA與上述180-bp HBs(26-80)片段加入1μl(350U/μl)T4連接酶與5μl 10×連接酶緩沖液[660 mM Tris-HCl(pH7.5)，66mMMgCl2，100mM二硫蘇糖醇，1mM ATP]制備的混合物中，然后用水調(diào)節(jié)至50μl，16℃培育過夜進行連接反應(yīng)。為獲得表達質(zhì)粒pATtrpE-HBs(26-80)，利用此連接反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101。
采用氯化鈣方法[Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159-162，(1970)]制備用于轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌菌株。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布在含有25μg/ml氨芐西林的LB平板(1％胰蛋白胨，0.5％NaCl，1.5％瓊脂)上，37℃培育過夜。利用鉑接種環(huán)將平板上出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化的細菌菌落轉(zhuǎn)移至含有25μg/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃培育過夜。
離心1.5ml轉(zhuǎn)化的細菌培養(yǎng)液收集細菌，采用堿方法[Manniatis等，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，(1982)]進行質(zhì)粒DNA的少量制備。37℃，用20μl限制性酶切反應(yīng)溶液[50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl，15 U EcoRI酶和15 UBamHI酶]消化1μg得到的質(zhì)粒DNA1小時，然后采用瓊脂糖凝膠電泳分離pATtrpE-HBs(26-80)表達質(zhì)粒得到約180-bp EcoRI-BamHI片段。
(B)TrpE-HBs(26-80)抗原的表達與純化將含有表達質(zhì)粒pATtrpE-HBs(26-80)的大腸桿菌HB 101菌株接種在含有50μg/ml氨芐西林的3ml 2YT培養(yǎng)液中(1.6％胰蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl)，然后在37℃培養(yǎng)9小時。將1ml此培養(yǎng)液接種入含有50μg/ml氨芐西林的100ml M9-CA培養(yǎng)液(0.6％Na2HPO4，0.5％KH2PO4，0.5％NaCl，0.1％NH4Cl，0.1mM CaCl2，2mM MgSO4，0.5％酪蛋白氨基酸，0.2％葡萄糖)中，然后在37℃培養(yǎng)。當OD600達到0.3時，加入吲哚-丙烯酸至終濃度為40mg/l，再培養(yǎng)16小時。以5 Krpm離心此培養(yǎng)液10分鐘收集微生物。
將微生物懸浮在20ml緩沖液A[50 mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，30mM NaCl]中，再次離心得到2.6g表達微生物。將得到的微生物懸浮在10ml緩沖液A中，然后超聲破碎大腸桿菌膜，再離心得到含有trpE-HBs(26-80)融合抗原的不可溶組分。
將此不可溶組分溶解于含有8M脲、10mM二硫蘇糖醇與1mM EDTA的3ml PBS中，有6M脲存在下經(jīng)Sephacryl S300HR柱凝膠過濾，從而使trpE-HBs(26-80)融合抗原達到幾乎均質(zhì)。
實施例2制備雜交瘤用6M脲溶解以上述方法制備的多肽[trpE-HBs(26-80)]，然后用含有0.15M NaCl的10mM磷酸緩沖液(pH7.3)(PBS)將其稀釋至終濃度為0.2-1.0mg/ml，與等體積的弗氏佐劑混合后以10-20μg的劑量腹膜內(nèi)給予4-6周齡的BALB/c小鼠。
以與上述相同的方式每2-4周進行加強免疫，將溶解在PBS中的10μgHBs給予尾靜脈進行最終免疫。
最終免疫后3天時，無菌取出小鼠的脾臟，然后用剪刀與金屬篩網(wǎng)使其破碎為單個細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次。用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞株Sp2/Oag14三次，將細胞以1∶5的比例與脾細胞混合。以200×g離心5分鐘后，棄去上清液，輕緩混合下將含有50％聚乙二醇(PEG)4000(Merck)的1ml RPMI-1640培養(yǎng)基緩慢加入細胞團中，然后再加入10ml RPMI-1640培養(yǎng)基以實現(xiàn)細胞融合。
離心(200×g，5分鐘)得到的融合細胞以除去PEG，融合懸浮在含有10％胎牛血清和次黃嘌呤、氨基蝶呤與胸腺嘧啶(HAT)的RPMI-1640培養(yǎng)液中，涂布到96-孔細胞培養(yǎng)板上。培養(yǎng)約10天只使雜交瘤增殖后，采用ELISA方法選擇產(chǎn)生目標抗體的克隆從而得到產(chǎn)生具有所需反應(yīng)特異性的單克隆抗體的雜交瘤。
采用有限稀釋將得到的雜交瘤制成單克隆從而得到產(chǎn)生抗體的雜交瘤。得到的雜交瘤分別命名為6G6、4A3和1C10。這些雜交瘤細胞在2004年9月9日由國際專利生物保藏單位(IPOD)，日本的國立高級工業(yè)科學(xué)與技術(shù)研究所(AIST)保藏。
實施例3單克隆抗體的制備與分析采用實施例2所述方法得到的各雜交瘤植入已給予降植烷的BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，獲得在腹水中產(chǎn)生的單克隆抗體。
利用蛋白A瓊脂糖柱通過親和層析純化含有單克隆抗體的IgG組分。
利用TrpE-HBs(26-80)抗原與由20個氨基酸構(gòu)成的各個合成肽分析所得的各單克隆抗體的靶表位，結(jié)果(如表1所示)發(fā)現(xiàn)這些單克隆抗體識別位于脂雙層內(nèi)部的HBs抗原表位(氨基酸號26-80)，所述合成肽根據(jù)源自HBs區(qū)域的序列合成。

表1

利用抗-小鼠Ig同種型抗體采用同種分型試劑盒(Zymed)鑒定各單克隆抗體的(亞)類。結(jié)果如表2所示，6G6和4A3的亞類是IgGl、κ，1C10的亞類是IgG2a、κ。
能識別存在于本發(fā)明氨基酸號31-70區(qū)域中的抗原表位的抗體未見報道，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體6G6、4A3和1C10各自識別新穎的表位。
表2

實施例4檢驗利用表面活性劑的檢測方法用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)將抗-HBs抗原的單克隆抗體6G6稀釋至6μg/ml的終濃度，然后以每孔80μl的體積移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。將微滴定板置于4℃過夜，用含有0.15M NaCl的0.35ml10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)洗滌兩次，然后加入含有0.5％酪蛋白-Na的0.35ml10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)(下文稱為封閉溶液)，再于室溫培育2小時。
除去封閉溶液后，向各孔加入含有0.15M NaCl、1％BSA和0.5％酪蛋白-Na的40μl 100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)(其中加入了終濃度為4％或8％的各種表面活性劑)與40μl檢測樣品，然后在室溫反應(yīng)1小時，用0.35 ml洗滌溶液洗滌5次后，加入80μl用過氧化物酶(POD)標記的單克隆抗體(5C3)，混合物在室溫反應(yīng)30分鐘。用0.35 ml洗滌溶液洗滌各孔6次，其與80μl底物(鄰苯二胺，下文稱為OPD)溶液在室溫反應(yīng)30分鐘后，向各孔加入80μl 2N硫酸溶液，然后檢測其在波長為492nm處的吸光度(OD492)，以其在630nm處的吸光度用作參比值。
采用各種表面活性劑時檢測HBS陽性血清的結(jié)果見表3。當利用不含表面活性劑的緩沖液檢測HBs抗原陽性血清時，不能檢測HBs抗原，但當利用含有各種表面活性劑(陰離子、陽離子、兩性與非離子表面活性劑)的緩沖液檢測時可獲得足夠的信號從而能清楚地檢測HBs抗原。因此這說明可以利用各種表面活性劑使表位暴露于外部來檢測存在于HBs抗原脂雙層內(nèi)部的新穎表位。
用過氧化物酶標記的單克隆抗體5C3是通過表達由1-226位氨基酸序列構(gòu)成的抗原(即全長HBs抗原)，然后純化此重組抗原并用它免疫小鼠獲得的一種單克隆抗體。證實如此獲得的抗體5C3能與以上重組HBs抗原結(jié)合。然而，當根據(jù)HBs抗原1-226位的氨基酸序列合成各自由20個氨基酸構(gòu)成，彼此有10個氨基酸重疊的合成肽并通過與實施例3相同的方法檢驗它們與抗體5C3的結(jié)合(情況)時，抗體5C3不與任何合成肽反應(yīng)。因此，據(jù)估計抗體5C3不識別HBs抗原的氨基酸序列的線性表位，而識別其構(gòu)象表位。
表3


實施例5檢測HBs抗原陰性樣品采用實施例4的改進方法檢測HBs抗原陰性但懷疑感染了HBs的樣品中的HBs抗原。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)將抗-HBs抗原的單克隆抗體6G6稀釋至6μg/ml的終濃度，然后以每孔100μl的體積移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。將微滴定板置于4℃過夜，用含有0.15M NaCl的0.35ml10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)洗滌兩次，然后加入含有0.5％酪蛋白鈉與3％蔗糖的0.35ml 10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)(封閉溶液)，將混合物置于室溫2小時。
除去封閉溶液后，向各孔加入含有0.15M NaCl、10mM EDTA-2Na、0.2％proclin、1％BSA、0.1％酪蛋白鈉、3％馬血清、2％小鼠血清和10％Brij 35的50μl 100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)與50μl檢測樣品，室溫反應(yīng)1小時，用0.35ml洗滌溶液洗滌5次后，加入100μl用過氧化物酶(POD)標記的單克隆抗體(5C3)，混合物在室溫反應(yīng)30分鐘。
反應(yīng)后，用0.35ml洗滌溶液洗滌各孔6次，其與100μl底物(鄰苯二胺，下文稱為OPD)溶液在室溫反應(yīng)30分鐘后，向樣品中加入2N硫酸溶液，然后檢測樣品在波長為492 nm處的吸光度(OD492)，以其在630nm處的吸光度作參比值。
所用的樣品購自IIC日本；采用Abbott Laboratories的CLIA方法檢測HBs抗原與抗-HBs抗體；采用Gen-Probe Incorporated的TMA方法檢測HBN-DNA。
表4

表4所示的5份樣品通過TMA方法(檢測)為HBV-DNA-陽性。這些樣品通過Abbott Laboratories的CLIA方法也(檢測)為HBs抗體陽性，認為它們是來自感染了HBV患者的血清。然而，第2、3和5號樣品通過Abbott Laboratories的HBsAg CLIA方法，即常規(guī)的HBs抗原檢測方法判斷為陰性。
當通過本發(fā)明方法判斷這些HBs抗原陰性樣品時，在第2和5號樣品中檢測到HBs抗原。HBcrAg檢測方法能檢測到由本發(fā)明檢測方法與AbbottLaboratories的HBsAg CLIA方法判斷為HBs抗原陰性的第3號樣品，同時檢測HBs抗原與HBcr抗原可用于更精確地檢測HBV抗原。
實施例61)酸化劑的濃度將各種濃度的50μl鹽酸水溶液加入50μL HBV抗原陰性樣品或3份含有抗-HBs抗體的HBV抗原陽性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過以下方法檢驗作為檢測樣品的50μL混合物溶液。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)將抗-HBs抗原的單克隆抗體6G6稀釋至6μg/ml的終濃度，然后以每孔100μl的體積移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。將微滴定板于4℃培育過夜。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)洗滌微滴定板兩次，然后加入含有0.5％酪蛋白鈉的350μl 10mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.1)，培育微滴定板2小時。除去封閉溶液后，向各孔加入含有中和抗體的100μl反應(yīng)緩沖液與每種經(jīng)樣品處理方法得到的各種檢測樣品，室溫振蕩反應(yīng)2小時，用含有0.05％吐溫20的350μl 10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)(洗滌溶液)洗滌6次后，加入100μl用過氧化物酶(POD)標記的單克隆抗體(5C3)，混合物在室溫反應(yīng)30分鐘。用洗滌溶液洗滌各孔6次，然后與100μl底物(鄰苯二胺，下文稱為OPD)溶液培育30分鐘后，向各孔中加入100μl 2N硫酸溶液，然后檢測其在波長為492nm處的吸光度(OD492)，以其在630nm處的吸光度作參比值。表中所示的鹽酸濃度是樣品與處理試劑混合后處理期間的濃度。
即使將含有抗-HBs抗體的HBs抗原陽性樣品(#990493、#990640、#990650)與不含鹽酸的溶液在室溫培育10分鐘，也幾乎檢測不到HBs抗原活性。處理時從0.05 N的鹽酸濃度開始檢測到HBs抗原活性，在0.25-1.0N的濃度處出現(xiàn)峰值(表5)。
表5

實施例72)有酸化劑存在下的各種表面活性劑將溶解于1.0N鹽酸水溶液的每種30μL各種表面活性劑加入30μL HBV抗原陰性樣品或HBs抗原陽性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過1)所述的方法檢驗作為檢測樣品的50μL混合物溶液(表6-9)。表中所示的鹽酸濃度與表面活性劑濃度是樣品與處理試劑混合后處理期間的濃度。
如表6-9所示，3份樣品中至少1份顯示反應(yīng)性高于各樣品判斷標準的表面活性劑判斷為有效的表面活性劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將各種表面活性劑與酸化劑，例如鹽酸或硫酸一起加入時，利用表面活性劑的HBs抗原陽性樣品中HBs抗原的免疫反應(yīng)性增加。判斷為有效的表面活性劑是在其分子中具有直鏈烷基和叔胺或季銨鹽的兩性或陽離子表面活性劑。
非離子表面活性劑，例如Triton X100和Bridj 35也檢測為有效的。具有固醇骨架的表面活性劑，例如CHAPS未顯示反應(yīng)性增加。此外，也檢測了陰離子表面活性劑，例如SDS和N-月桂酰肌氨酸鈉與脫氧膽酸，但這些表面活性劑在有酸化劑存在時溶解性不佳，因而不能對它們作出檢測。
向酸化劑中加入在分子中具有直鏈烷基與叔胺或季銨鹽的兩性或陽離子表面活性劑能提高檢測靈敏度。將在處理溶液中存在酸化劑時有效的這種表面活性劑用于不存在酸化劑的處理溶液中時，其檢測靈敏度顯著降低。從上述可知，靈敏度增加的原因是酸化劑使作為HBs抗原檢測抑制因素的抗-HBs抗體失活，而加入表面活性劑使位于樣品中HBs抗原的脂雙層內(nèi)部的表位暴露于外部，因而顯著提高其與6G6的反應(yīng)性。
表6陽離子(TAC型)

表7陽離子(TAB型)
表8兩性
表9非離子


實施例83)有酸化劑存在下的蛋白變性劑將溶解于1.0N鹽酸水溶液的30μL蛋白變性劑(脲或鹽酸胍)加入30μLHBV抗原陰性樣品或3份HBs抗原陽性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過1)所述的方法檢驗作為檢測樣品的50μL混合物溶液。表10顯示了各HBs抗原陽性樣品的免疫反應(yīng)性。表10所示鹽酸濃度與蛋白變性劑濃度是樣品與處理試劑混合后處理期間的濃度。
樣品顯示在有酸化劑存在下利用蛋白變性劑的免疫反應(yīng)性高于只有酸化劑時的免疫反應(yīng)性；即，用脲使免疫反應(yīng)性增加約1.5-3倍，用鹽酸胍使免疫反應(yīng)性增加約2-3倍。用酸化劑處理時，血清蛋白等可能變性從而造成沉淀或者在一些情況中變得混濁進而阻礙了移液過程，沉淀物往往是得到假陽性結(jié)果的主要原因。由于目標抗原摻入這種沉淀物中，也可能降低靈敏度。發(fā)現(xiàn)在處理時加入濃度為0.5M或更高的脲或鹽酸胍可顯著減少這種沉淀物形成，在處理時加入濃度為1.5-4M的脲與濃度為2-3.5M的鹽酸胍此作用尤其更好。
表10

實施例94)有酸化劑存在下檢驗還原劑將作為還原劑的二硫蘇糖醇、鹽酸2-巰基乙胺或鹽酸2-二乙基氨基乙硫醇溶解于1.0N鹽酸水溶液，將此30μL混合溶液加入30μL HBV抗原陰性樣品(正常血漿)或3份HBs抗原陽性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過1)所述的方法檢驗作為檢測樣品的50μL混合物溶液(表11)。
本文所用的還原劑濃度是其在樣品處理期間的濃度。甚至當還原劑加入HBV抗原陰性樣品中時，未檢測到其信號有變化，但在一份HBs抗原陽性樣品(#990640)中，利用濃度為1-5mM的二硫蘇糖醇時檢測到有30％或更高的增幅。
表11還原劑


實施例105)堿化劑的濃度將50μL各種濃度的氫氧化鈉水溶液加入50μL HBV抗原陰性樣品或三份含有抗-HBs抗體的HBV抗原陽性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后在室溫培育10分鐘，按照以下檢測方法檢測作為檢測樣品的50μL混合物溶液。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)將抗-HBs抗原的單克隆抗體6G6稀釋至6μg/ml的終濃度，然后以每孔100μl的體積移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。將微滴定板于4℃培育過夜。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)洗滌微滴定板兩次，然后加入含有0.5％酪蛋白鈉的350μl 10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.1)，培育微滴定板2小時。除去封閉溶液后，向各孔加入含有中和抗體的100μl反應(yīng)緩沖液與經(jīng)各種樣品處理方法得到的各檢測樣品，室溫振蕩反應(yīng)2小時，用含有0.05％吐溫20的350μl 10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)(洗滌溶液)洗滌6次后，加入100μl用生物素標記的單克隆抗體(HBs124)?；旌衔镌谑覝胤磻?yīng)30分鐘。用洗滌溶液洗滌各孔6次，然后向其中加入100μl POD標記的親和素D，混合物在室溫反應(yīng)30分鐘。用洗滌溶液洗滌各孔6次后，向其中加入100μl底物(鄰苯二胺，下文稱為OPD)溶液，培育30分鐘，向各孔中加入2N硫酸溶液后，檢測其在波長為492nm處的吸光度(OD492)，以其在630nm處的吸光度作參比值。表中所示的氫氧化鈉濃度是樣品與處理試劑混合物后處理期間的濃度。
生物素標記的單克隆抗體HBs124是如實施例1所述通過表達與純化全長HBs抗原(即，由1-226位氨基酸序列構(gòu)成的抗原)，用該重組抗原免疫小鼠得到的單克隆抗體。證實抗體HBs124與以上重組HBs抗原結(jié)合。然而，當根據(jù)HBs抗原1-226位的氨基酸序列合成各由20個氨基酸構(gòu)成，彼此有10個氨基酸重疊的合成肽并通過與實施例3相同的方法檢驗它們與抗體HBs124的結(jié)合(情況)時，抗體HBs124不與任何合成肽反應(yīng)。因此，據(jù)估計抗體HBs124不識別HBs抗原的氨基酸序列的線性表位，而識別其構(gòu)象表位。
甚至通過在不含氫氧化鈉的溶液中室溫培育含有抗-HBs抗體的HBV陽性樣品(#990493，#990640，#990650)10分鐘未檢測到HBs抗原活性，但用濃度為0.25-1N的氫氧化鈉處理檢測到HBs抗原的信號有增加(表12)。
表12

實施例116)有堿化劑存在下的各種表面活性劑濃度將溶解于1.0N氫氧化鈉水溶液的30μL各種表面活性劑加入30μL HBV抗原陰性樣品或三份HBs抗原陽性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過5)所述的方法檢驗作為檢測樣品的50μL混合物溶液(表13-17)。表中所示的氫氧化鈉水溶液與表面活性劑濃度是樣品與處理試劑混合后處理期間的濃度。
如表13-17所示，3份樣品中至少1份顯示反應(yīng)性高于各樣品判斷標準的表面活性劑判斷為有效的表面活性劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將各種表面活性劑與堿化劑，例如氫氧化鈉一起加入時，利用表面活性劑的HBs抗原陽性樣品中HBs抗原的免疫反應(yīng)性增加。判斷為有效的表面活性劑包括陰離子表面活性劑，例如十二烷基硫酸鈉或N-月桂酰肌氨酸鈉與在其分子中具有直鏈烷基和叔胺或季銨鹽的兩性或陽離子表面活性劑。
非離子表面活性劑，例如Triton X100、吐溫20和Bridj 35與具有固醇骨架的表面活性劑，例如CHAPS也檢測為有效的。
向堿化劑中加入陰離子表面活性劑或在分子中具有直鏈烷基與叔胺或季銨鹽的兩性或陽離子表面活性劑能提高檢測靈敏度。將在處理溶液中存在堿化劑時有效的這種表面活性劑用于不存在堿化劑的處理溶液中時，未發(fā)現(xiàn)增加檢測靈敏度。認為通過聯(lián)用堿化劑與表面活性劑，作為HBs抗原檢測抑制因素的抗-HBs抗體失活，樣品中HBs抗原的脂雙層內(nèi)部的表位暴露于外部，從而顯著提高其與6G6的反應(yīng)性。
表13陰離子
表14陽離子(TAC型)

表15陽離子(TAB型)

表16兩性
表17非離子

實施例127)有堿化劑存在下的蛋白變性劑將溶解于1.0N氫氧化鈉水溶液的30μL蛋白變性劑(脲或鹽酸胍)加入30μL HBs抗原陰性樣品或三份HBs抗原陽性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過5)所述的方法檢驗作為檢測樣品的50μL混合物溶液。表18顯示了各HBs抗原陽性樣品的免疫反應(yīng)性。表18所示的氫氧化鈉濃度與蛋白變性劑濃度是樣品與處理試劑混合后處理期間的濃度。
三份HBs抗原陽性樣品顯示在有堿化劑存在下利用蛋白變性劑的免疫反應(yīng)性高于只有堿化劑時的免疫反應(yīng)性；即，用脲使免疫反應(yīng)性增加至少約8倍，用鹽酸胍使免疫反應(yīng)性增加至少約4.5倍。如果只用堿化劑處理，血清蛋白等在中和時可能變性從而造成沉淀或者在一些情況中變得混濁，進而阻礙了移液過程，沉淀物往往是得到假陽性結(jié)果的主要原因。由于目標抗原摻入這種沉淀物中，也可能降低靈敏度。發(fā)現(xiàn)在處理時加入濃度為1M或更高的脲或鹽酸胍可顯著減少這種沉淀物形成，在處理時加入濃度為2-4M的脲與濃度為2-3M的鹽酸胍此作用尤其更好。
表18

實施例138)有堿化劑存在下檢驗還原劑將作為還原劑的二硫蘇糖醇、鹽酸2-巰基乙胺、鹽酸2-二乙基氨基乙硫醇、2-巰基乙醇或鹽酸三(2-羧乙基)膦溶解于1.0N氫氧化鈉，將此30μL溶液加入30μL HBV抗原陰性樣品或三份HBs抗原陽性樣品(#990493、#990640、#990650)，然后室溫培育10分鐘，通過5)所述的方法檢驗作為檢測樣品的50μL混合物溶液(表19)。
本文所用的還原劑濃度是其在樣品處理期間的濃度。甚至通過加入還原劑，HBV抗原陰性樣品幾乎不顯示信號有變化，但所有三份HBs抗原陽性樣品顯示，分別利用濃度為20mM的鹽酸2-巰基乙胺、鹽酸二乙基氨基乙硫醇與2-巰基乙醇使信號增加約2-3倍。鹽酸三(2-羧乙基)膦更有效，2mM濃度時信號增加1.5倍，10mM時信號增加15倍或更多。
表19還原劑

序列表<110>株式會社先端生命科學(xué)研究所(Advanced Life Science Institute，INC.)<120>乙肝病毒s抗原的檢測方法<130>SAP-729-PCT<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>55<212>PRT<213>乙肝病毒<400>1Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe1 5 10 15Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr20 25 30Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg35 40 45Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe50 55<210>2<211>27<212>DNA<213>乙肝病毒<400>2gaattcctca caataccaca gagtcta 27<210>3<211>33<212>DNA<213>乙肝病毒<400>3ggatccttaa aaacgccgca gacacatcca gcg3權(quán)利要求
1.一種探針，其識別位于由對應(yīng)于乙肝病毒s抗原中26-80位的氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位。
2.一種探針，其識別位于由SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成的肽上的表位。
3.如權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于，所述探針能識別乙肝病毒s抗原并可利用作為抗原的肽而獲得，所述肽由對應(yīng)于用變性劑變性的乙肝病毒s抗原中26-80位的氨基酸序列或SEQ ID NO1所示氨基酸序列構(gòu)成。
4.一種檢測乙肝病毒或乙肝病毒s抗原的方法，所述方法包括利用權(quán)利要求1-3中任一項所述的探針。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述方法在有變性劑存在下進行。
6.如權(quán)利要求4或5所述的檢測方法，其特征在于，所述變性劑是表面活性劑。
7.如權(quán)利要求4或5所述的檢測方法，其特征在于，通過用含有(1)酸化劑與(2)作為變性劑的表面活性劑和/或蛋白變性劑的處理試劑處理，以使乙肝病毒s抗原解離以及結(jié)合乙肝病毒s抗原的抗體滅活。
8.如權(quán)利要求4或5所述的檢測方法，其特征在于，通過用含有(1)堿化劑與(2)作為變性劑的表面活性劑和/或蛋白變性劑的處理試劑處理，以使乙肝病毒s抗原解離以及結(jié)合乙肝病毒s抗原的抗體滅活。
9.如權(quán)利要求4或5所述的檢測方法，其特征在于，通過用含有(1)堿化劑與(2)作為變性劑的表面活性劑和/或蛋白變性劑和/或還原劑的處理試劑處理，以使乙肝病毒s抗原解離以及結(jié)合乙肝病毒s抗原的抗體滅活。
10.如權(quán)利要求4-6中任一項所述的檢測方法，其特征在于，還利用除乙肝病毒s抗原以外的乙肝病毒抗原的探針。
11.一種用于檢測乙肝病毒s抗原的試劑，所述試劑包含權(quán)利要求1-3中任一項所述的探針以及變性劑。
12.一種用于檢測乙肝病毒s抗原的試劑，所述試劑包含權(quán)利要求1-3中任一項所述的探針、除乙肝病毒s抗原以外的乙肝病毒抗原的探針以及變性劑。
全文摘要
[問題]要提供一種可用于檢測HBV或HBs抗原的探針，利用此探針能檢測樣品中可能存在的乙肝病毒(HBV)的逃避突變體；與利用此探針的方法。[解決問題的方法]一種探針，其能識別位于包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的肽上的；以及利用此探針檢測乙肝病毒或乙肝病毒s抗原的方法。
文檔編號C07K14/02GK101023098SQ20058003144
公開日2007年8月22日 申請日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日
發(fā)明者槇昇, 福田泰之, 木村達治, 大植千春, 草野修 申請人:株式會社先端生命科學(xué)研究所