專利名稱：糖基化免疫球蛋白以及含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糖基化免疫球蛋白以及一種含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種免疫球蛋白或其片段，其通過(guò)修飾特定的氨基酸殘基而額外地糖基化，以及一種糖基化融合蛋白，其通過(guò)將糖基化免疫球蛋白或其片段與至少一種生物活性蛋白或其一部分鏈接而形成。
背景技術(shù)：
免疫粘附素(或免疫球蛋白融合蛋白)是類似抗體的分子，其通過(guò)將免疫球蛋白的片段(例如，F(xiàn)c部分)與受體的配體結(jié)合區(qū)或粘附分子融合而形成。本領(lǐng)域已知的典型免疫粘附素具有抗體結(jié)構(gòu)，其中，以受體的配體結(jié)合區(qū)取代參與抗原識(shí)別的可變區(qū)，同時(shí)保留Fc部分。長(zhǎng)期以來(lái)，已有大量的專利說(shuō)明了融合蛋白，其中，將生理活性蛋白的特定區(qū)域鏈接到抗體上(美國(guó)專利第5,521,288、5,844,095、6,046,310、6,090,914、6,100,383和6,225,448號(hào))。
與不含免疫球蛋白的分子相比，免疫粘附素具有以下優(yōu)點(diǎn)1)融合蛋白對(duì)配體的總親合力增加，因?yàn)槠渚哂卸畚镄问降亩r(jià)；2)由于分子穩(wěn)定性增加，融合蛋白以未受破壞的形式更長(zhǎng)時(shí)間地存在于血清中；3)通過(guò)免疫球蛋白重鏈的Fc(可結(jié)晶片段)部分來(lái)活化效應(yīng)細(xì)胞；以及4)通過(guò)方便的方法來(lái)分離和純化融合蛋白，例如，使用蛋白質(zhì)A。
例如，如果以腫瘤壞死因子(以下簡(jiǎn)稱“TNF”)作為細(xì)胞因子，為了抑制與TNF有關(guān)的炎癥反應(yīng)，可以使用腫瘤壞死因子受體(以下簡(jiǎn)稱“TNFR”)，如PCT申請(qǐng)公開(kāi)第WO92/16221和WO95/34326號(hào)中所述，或者可以使用TNFR-免疫球蛋白(Ig)融合蛋白，如美國(guó)專利第5,447,851號(hào)以及PCT申請(qǐng)公開(kāi)第WO94/06476號(hào)中所述。根據(jù)許多報(bào)告，TNFR-Ig融合蛋白對(duì)TNF的親合力比TNFR的天然單體形式或非Ig融合形式要高得多(Lesslauer W.等人，Eur.J.Immunol.，1991年，第21卷，第2883頁(yè)；Ashkenazi A.等人，PNAS USA，1991年，第88卷，第10535頁(yè)；Peppel K.等人，J.Exp.Med.，1991年，第174卷，第1483頁(yè)；MohlerK.M.等人，J.Immunol，1993年，第151卷，第1548頁(yè))。
對(duì)于使用Ig融合蛋白來(lái)抑制TNF作用或控制免疫反應(yīng)的情況，Ig融合結(jié)構(gòu)中作為TNF受體、CD2和CTLA4的功能區(qū)的細(xì)胞外區(qū)的多價(jià)或多聚物形式預(yù)計(jì)可以提高融合結(jié)構(gòu)的功效。當(dāng)TNF受體細(xì)胞外區(qū)和Ig重鏈的一種單體融合蛋白(重鏈融合蛋白)與TNF受體細(xì)胞外區(qū)和Ig輕鏈的另一種單體融合蛋白(輕鏈融合蛋白)同時(shí)在一個(gè)細(xì)胞系中表達(dá)時(shí)，通過(guò)重鏈和輕鏈之間的相互作用來(lái)產(chǎn)生二聚融合蛋白。二聚融合蛋白具有像活體內(nèi)形式那樣平行排列的兩個(gè)有效區(qū)，并且與單體融合結(jié)構(gòu)相比，具有顯著提高的功效(Scallon BJ.等人，Cytokine，1995年，第7卷，第759頁(yè))。
但是，由于以下問(wèn)題，這種二聚物形式的Ig融合蛋白難以工業(yè)化應(yīng)將單獨(dú)融合至Ig重鏈和輕鏈的兩個(gè)基因共同引入宿主細(xì)胞；當(dāng)在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)兩種不同的融合蛋白時(shí)，其產(chǎn)率極大地降低；而且，由于并非所有表達(dá)的重鏈融合蛋白和輕鏈融合蛋白都參與二聚物的形成，因此融合重鏈融合蛋白和輕鏈融合蛋白的二聚物在技術(shù)上難以從與單體重鏈融合蛋白或輕鏈融合蛋白的混合物中分離出來(lái)。
在這方面，本發(fā)明人構(gòu)建了一種串聯(lián)體蛋白，其中，使用重組DNA技術(shù)將生物活性蛋白的可溶區(qū)的C-末端鏈接到相同或不同生物活性蛋白的可溶區(qū)的N-末端。而且，本發(fā)明人制備了一種對(duì)二聚蛋白進(jìn)行編碼的DNA結(jié)構(gòu)，其中，單體蛋白的兩個(gè)分子(其中，將參與免疫反應(yīng)的蛋白的串聯(lián)體鏈接到免疫球蛋白Fc片段的鉸鏈區(qū))在鉸鏈區(qū)二硫化鍵結(jié)，并根據(jù)DNA結(jié)構(gòu)使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生串聯(lián)體鏈接的二聚融合蛋白。
如上所述，已經(jīng)嘗試改進(jìn)免疫球蛋白融合蛋白的功效和制備方法，但幾乎所有努力都未能增加免疫球蛋白融合蛋白的穩(wěn)定性。
在這方面，如韓國(guó)專利申請(qǐng)第2002-0045921號(hào)中所述，本發(fā)明人提出了一種通過(guò)將糖基化基序添加到蛋白的功能區(qū)與免疫球蛋白Fc區(qū)之間的連接區(qū)域來(lái)增加蛋白穩(wěn)定性的方法。但是，當(dāng)在功能區(qū)附近糖基化免疫粘附素時(shí)，蛋白無(wú)法正確折疊或者降低了功能。

發(fā)明內(nèi)容
在這方面，本發(fā)明人通過(guò)將額外的糖基化基序引入免疫球蛋白融合蛋白的免疫球蛋白(特別是Fc部分)而構(gòu)建了一種糖基化融合蛋白，并且發(fā)現(xiàn)，該糖基化融合蛋白在活體內(nèi)的作用時(shí)間比不含糖基化基序的形式更長(zhǎng)，從而得到了本發(fā)明。
因此，一方面，本發(fā)明提供了一種糖基化免疫球蛋白或其片段，其中，將含有一種或多種氨基酸修飾的免疫球蛋白變異體額外地糖基化，所述氨基酸修飾選自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所組成的群組。
另一方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA，其中，將含有一種或多種氨基酸修飾的免疫球蛋白變異體額外地糖基化，所述氨基酸修飾選自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所組成的群組。
又一方面，本發(fā)明提供了一種糖基化融合蛋白，其通過(guò)將(a)糖基化免疫球蛋白或其片段與(b)至少一種生物活性蛋白或其一部分鏈接而形成，其中，將具有已修飾的氨基酸序列以形成一個(gè)或多個(gè)Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白變異體額外地糖基化。
另一方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)糖基化融合蛋白進(jìn)行編碼的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通過(guò)將(a)糖基化免疫球蛋白或其片段與(b)至少一種生物活性蛋白或其一部分鏈接而形成，其中，將具有已修飾的氨基酸序列以形成一個(gè)或多個(gè)Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白變異體額外地糖基化。
另一方面，本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，其含有對(duì)糖基化融合蛋白進(jìn)行編碼的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通過(guò)將(a)糖基化免疫球蛋白或其片段與(b)至少一種生物活性蛋白或其一部分鏈接而形成，其中，將具有已修飾的氨基酸序列以形成一個(gè)或多個(gè)Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白變異體額外地糖基化。
另一方面，本發(fā)明提供了一種使用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述重組表達(dá)載體含有對(duì)糖基化融合蛋白進(jìn)行編碼的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通過(guò)將(a)糖基化免疫球蛋白或其片段與(b)至少一種生物活性蛋白或其一部分鏈接而形成，其中，將具有已修飾的氨基酸序列以形成一個(gè)或多個(gè)Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白變異體額外地糖基化。
另一方面，本發(fā)明提供了一種制備糖基化融合蛋白的方法，其包括培養(yǎng)一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞使用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，所述重組表達(dá)載體含有對(duì)糖基化融合蛋白進(jìn)行編碼的DNA分子，所述糖基化融合蛋白通過(guò)將(a)糖基化免疫球蛋白或其片段與(b)至少一種生物活性蛋白或其一部分鏈接而形成，其中，將具有已修飾的氨基酸序列以形成一個(gè)或多個(gè)Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白變異體額外地糖基化；以及將糖基化融合蛋白從培養(yǎng)物中分離出來(lái)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種含有糖基化融合蛋白的醫(yī)藥組合物，所述糖基化融合蛋白通過(guò)將(a)糖基化免疫球蛋白或其片段與(b)至少一種生物活性蛋白或其一部分鏈接而形成，其中，將具有已修飾的氨基酸序列以形成一個(gè)或多個(gè)Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白變異體額外地糖基化。


通過(guò)下面結(jié)合附圖進(jìn)行的詳細(xì)描述，可以更清楚地理解本發(fā)明的上述和其他目的、特點(diǎn)和其他優(yōu)點(diǎn)。所附圖形包括圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白的糖基化位點(diǎn)；圖2是顯示根據(jù)本發(fā)明的糖基化CTLA4-IgG融合蛋白的表達(dá)水平的曲線圖；圖3是顯示根據(jù)本發(fā)明的糖基化CTLA4-IgG融合蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果的曲線圖；圖4是顯示在使用融合蛋白進(jìn)行腹腔內(nèi)注射的老鼠中，根據(jù)本發(fā)明的糖基化CTLA4-IgG融合蛋白的血清水平隨時(shí)間的變化的曲線圖。
具體實(shí)施例方式
按照國(guó)際生物化學(xué)學(xué)會(huì)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)縮寫，本文中用于表示氨基酸的單個(gè)大寫字母表示以下氨基酸A丙胺酸；B天冬酰胺酸或天門冬氨酸；C半胱氨酸；D天門冬氨酸；E谷氨酸；
F苯基丙氨酸；G甘氨酸；H組織氨基酸；I異亮氨酸；K賴氨酸；L亮氨酸；M蛋氨酸；N天冬酰胺酸；P脯氨酸；Q谷氨酸鹽；R精氨酸；S絲氨酸；T蘇氨酸；V纈氨酸；W色氨酸；Y酪氨酸；以及Z谷氨酸鹽或谷氨酸。
本文所使用的符號(hào)“(表示一種氨基酸的大寫字母)(氨基酸位置)(表示另一種氨基酸的大寫字母)”表示，在給定蛋白質(zhì)的指定氨基酸位置，以后一種氨基酸取代前一種氨基酸。例如，M179N表示以天冬酰胺酸取代給定蛋白質(zhì)(例如，IgG)的第179個(gè)位置的蛋氨酸殘基。氨基酸位置從成熟野生型蛋白的N-末端開(kāi)始編號(hào)。
術(shù)語(yǔ)“糖基化”表示一種通過(guò)附加糖鏈來(lái)修飾由作為宿主細(xì)胞的真核細(xì)胞所產(chǎn)生的蛋白的方法。已知附加糖鏈會(huì)影響蛋白質(zhì)的特性以及蛋白質(zhì)的活體內(nèi)穩(wěn)定性和功能。有兩種糖基化。O-鏈接糖基化將低聚糖鏈鏈接到絲氨酸和/或蘇氨酸殘基。N-鏈接糖基化將低聚糖鏈鏈接到天冬酰胺酸殘基。具體地說(shuō)，N-鏈接糖基化發(fā)生于特定氨基酸序列Asn-X-Ser/Thr(X是不包括脯氨酸的任何氨基酸)。
在本發(fā)明中，對(duì)免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA序列在一個(gè)或多個(gè)核苷處突變，以形成一個(gè)額外的糖基化位點(diǎn)，O-鏈接或N-鏈接糖基化發(fā)生于這個(gè)位點(diǎn)，并且在宿主細(xì)胞中表達(dá)已突變的DNA，以允許自發(fā)糖基化。一方面，根據(jù)本發(fā)明的糖基化免疫球蛋白或其片段通過(guò)突變對(duì)免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA序列以添加和/或增加發(fā)生N-鏈接糖基化的Asn-X-Ser/Tbr序列(糖基化基序)而構(gòu)建。
本發(fā)明中經(jīng)過(guò)修飾以具有糖基化基序的“免疫球蛋白”是B細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白分子，并用作專門識(shí)別各種抗原的抗原受體。這些分子具有Y形結(jié)構(gòu)，其由兩個(gè)相同的輕鏈(L鏈)和兩個(gè)相同的重鏈(H鏈)組成，其中，通過(guò)若干二硫化鍵將四個(gè)鏈組合在一起，在鉸鏈區(qū)的H鏈之間包括二硫橋。L和H鏈包含可變和恒定的區(qū)域。根據(jù)H鏈的恒定區(qū)域的特點(diǎn)，將免疫球蛋白(Ig)分成五種同型A(IgA)、D(IgD)、E(IgE)、G(IgG)和M(IgM)。這五種子型具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物特性。這些免疫球蛋白全都可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾。
由于免疫粘附素一般包含免疫球蛋白的片段，即Fc部分，優(yōu)選地，將本發(fā)明中的糖基化基序引入免疫球蛋白的Fc部分。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白的Fc部分”指沒(méi)有抗原鍵結(jié)活性并且容易結(jié)晶的片段，其包括鉸鏈區(qū)和CH2及CH3區(qū)，以及負(fù)責(zé)鍵結(jié)抗體與效應(yīng)材料和細(xì)胞的部分。
在本發(fā)明中，優(yōu)選地，通過(guò)修飾免疫球蛋白的位置160、195、243、265、299、331和346的一種或多種氨基酸殘基(所有這些氨基酸殘基都在免疫球蛋白的Fc部分)而產(chǎn)生糖基化基序。因此，一方面，本發(fā)明提供了一種糖基化免疫球蛋白或其片段，其含有一種或多種氨基酸修飾，所述氨基酸修飾選自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所組成的群組，以及一種對(duì)糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的基因。具體地說(shuō)，提供了表1中所列的糖基化免疫球蛋白或其片段，其含有一種或多種上述氨基酸修飾的組合。
表1根據(jù)本發(fā)明的糖基化免疫球蛋白或其片段

另一方面，本發(fā)明提供了一種糖基化融合蛋白，其通過(guò)將(a)糖基化免疫球蛋白或其片段與(b)至少一種生物活性蛋白或其一部分鏈接而形成，其中，將具有已修飾的氨基酸序列以形成一個(gè)或多個(gè)Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白變異體額外地糖基化。在一優(yōu)選方面，免疫球蛋白的片段包括Fc部分，而生物活性蛋白的該部分包括可溶性細(xì)胞外區(qū)。
一方面，糖基化融合蛋白具有單體結(jié)構(gòu)，其中，通過(guò)將(a)糖基化免疫球蛋白或其片段與(b)至少一種生物活性蛋白或其一部分鏈接來(lái)形成單多肽，其中，將具有已修飾的氨基酸序列以形成一個(gè)或多個(gè)Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白變異體額外地糖基化。生物活性蛋白的該部分優(yōu)選地包括該生物活性蛋白的可溶性細(xì)胞外區(qū)?？梢酝ㄟ^(guò)鉸鏈區(qū)的二硫化鍵來(lái)鏈接這種單體糖基化融合蛋白的兩個(gè)分子，以形成二聚物結(jié)構(gòu)。
另一方面，糖基化融合蛋白具有單體結(jié)構(gòu)，其中，通過(guò)將(a)糖基化免疫球蛋白或其片段與(b)第一生物活性蛋白或其一部分，以及(c)第二生物活性蛋白或其一部分以串聯(lián)體的形式鏈接來(lái)形成單多肽，其中，將具有已修飾的氨基酸序列以形成一個(gè)或多個(gè)Asn-X-Ser/Thr序列的免疫球蛋白變異體額外地糖基化。第一和第二生物活性蛋白可以相同，也可以不同。生物活性蛋白的該部分優(yōu)選地包括該生物活性蛋白的可溶性細(xì)胞外區(qū)?？梢酝ㄟ^(guò)鉸鏈區(qū)的二硫化鍵來(lái)鏈接這種單體糖基化融合蛋白的兩個(gè)分子，以形成二聚物結(jié)構(gòu)。
在根據(jù)本發(fā)明的糖基化融合蛋白的一優(yōu)選方面，免疫球蛋白變異體包括一種或多種氨基酸修飾并且被糖基化，所述氨基酸修飾選自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所組成的群組。在一更優(yōu)選的方面，免疫球蛋白變異體包括SEQ ID NO16至SEQ ID NO23的氨基酸序列的任何一種，并且在最優(yōu)選的方面，包括SEQ ID NO19的氨基酸序列。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“生物活性蛋白”指一般具有生理或醫(yī)藥活性的蛋白、肽或多肽，其在形成免疫粘附素之后保留其一部分天然活性。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“生物活性”的含義不限于生理或醫(yī)藥活性。舉例來(lái)說(shuō)，某些免疫粘附素(例如含有酶的免疫粘附素)可以在有機(jī)溶劑中催化反應(yīng)。
蛋白、肽或多肽的非限制性例子包括血色素、血清蛋白(例如，血液因子，包括因子VII、VIII和因子TK)、免疫球蛋白、細(xì)胞因子(例如，白細(xì)胞介素)、α-、β-和γ-干擾素、集落刺激因子(例如，G-CSF和GM-CSF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)以及磷脂酶活化蛋白(PLAP)。其他典型的生物或治療蛋白包括胰島素、植物蛋白(例如，植物血凝素和篦麻毒素)、腫瘤壞死因子(TNF)及其突變等位基因、生長(zhǎng)因子(例如，組織生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，如TGFα或TGFβ)、激素(例如，卵泡刺激激素、甲狀腺刺激激素、抗利尿激素、色素聚集或分散激素以及甲狀旁腺激素、黃體生成激素釋放激素及其衍生物)、降血鈣素、降血鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、腦啡肽、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、紅細(xì)胞生成素、丘腦下部釋放因子、泌乳刺激素、絨毛膜促性腺激素、組織纖溶酶原活化劑、生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)以及胸腺體液因子(THF)。某些蛋白(例如白細(xì)胞介素、干擾素或集落刺激因子)可以使用DNA重組技術(shù)以非糖基化的形式產(chǎn)生。本發(fā)明中，可以將非糖基化蛋白用作生物活性材料。
另外，可用于本發(fā)明的生物活性材料包括多肽的任何在活體內(nèi)具有生物活性的部分。生物活性材料的例子包括肽或多肽、抗體的片段、單鏈鍵結(jié)蛋白(參見(jiàn)美國(guó)專利第4,946,778號(hào))、鍵結(jié)分子(包括抗體的融合多肽或其片段)、多克隆抗體、單克隆抗體以及催化抗體。生物活性材料的其他例子包括過(guò)敏原蛋白，例如豚草屬、抗原E、蜜蜂毒或螨的過(guò)敏原。
另外，可用于本發(fā)明的生物活性材料包括酶。酶的例子包括碳水化合物特異性酶、蛋白酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和連接酶。具體地說(shuō)，酶的非限制性例子包括天門冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、過(guò)氧化物歧化酶、內(nèi)毒素酶、過(guò)氧化氫酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷脫磷酸酶、酪氨酸酶和膽紅素氧化酶。碳水化合物特異性酶的例子包括葡糖氧化酶、葡糖腦苷脂酶、牛乳糖、葡糖腦苷脂酶和葡萄糖苷酸酶。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“可溶性細(xì)胞外區(qū)”指暴露于嵌入膜蛋白(穿透含有磷脂的細(xì)胞膜)的細(xì)胞外區(qū)的部分，其中，嵌入膜蛋白含有一種或多種主要由疏術(shù)性氨基酸所組成的穿膜區(qū)。這種細(xì)胞外區(qū)主要包含親水性氨基酸、其一般位于蛋白折疊結(jié)構(gòu)的表面，因此可以溶解于水環(huán)境。在大多數(shù)細(xì)胞表面受體蛋白中，細(xì)胞外區(qū)用于鍵結(jié)特定配體，而細(xì)胞內(nèi)區(qū)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要作用。
一方面，根據(jù)本發(fā)明的糖基化融合蛋白可以通過(guò)制備對(duì)免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA序列來(lái)制備，其經(jīng)修飾以包含糖基化位點(diǎn)并鏈接另一種對(duì)生物活性蛋白或其一部分進(jìn)行編碼的DNA序列。另一方面，糖基化融合蛋白可以如下制備首先制備對(duì)免疫球蛋白或其片段以及生物活性蛋白或其一部分進(jìn)行編碼的DNA序列(融合基因)，并使融合基因突變，以便可以糖基化免疫球蛋白或其片段。這兩種方法的唯一不同之處是用作模板的DNA序列，并且基本上與本領(lǐng)域中用于編碼蛋白變異體的DNA序列的制備方法相同。因此，在下文中，本發(fā)明打算將重點(diǎn)放在免疫球蛋白或其片段(實(shí)質(zhì)上將糖基化基序引入其中)的修飾方法上。
根據(jù)本發(fā)明的對(duì)糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA序列可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的各種方法來(lái)制備。這些方法包括但不限于低聚核苷酸介導(dǎo)誘變和盒式誘變。
具體地說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明的對(duì)糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA序列優(yōu)選地通過(guò)低聚核苷酸介導(dǎo)誘變來(lái)制備。這種技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的，并且Zoller M.等人對(duì)此進(jìn)行了說(shuō)明(Zoller M.等人，Nuc.Ac.Res.USA，1982年，第10卷，第6487-6500頁(yè))。簡(jiǎn)要地說(shuō)，對(duì)糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA序列可以通過(guò)將模板DNA(例如，攜帶對(duì)非修飾或天然免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA的質(zhì)粒)和針對(duì)所需的修飾編碼的低聚核苷酸雜交而制備。雜交后，可以通過(guò)DNA聚合酶合成與DNA模板互補(bǔ)的第二完整鏈，并且第二鏈可以針對(duì)所需的修飾編碼。
一般來(lái)說(shuō)，上述方法中所使用的低聚核苷酸由大約25種核苷所組成。可以采用較短的低聚核苷酸，但最佳的低聚核苷酸在已修飾的密碼子的左區(qū)和右區(qū)都包含12至15種與模板互補(bǔ)的核苷。這些低聚核苷酸可有效地與模板DNA雜交。這些低聚核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)來(lái)合成(Crea等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1978年，第75卷，第5765卷)。
一方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA序列，其攜帶一種氨基酸修飾(表1中的IgG)。該DNA序列可以通過(guò)使用對(duì)免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA作為模板并使用修飾編碼合成低聚核苷酸作為引物來(lái)執(zhí)行PCR而制備。引物與雙鏈DNA模板在加熱期間變性所產(chǎn)生的互補(bǔ)單鏈DNA雜交。DNA聚合酶以互補(bǔ)于模板的方式沿5′至3′方向逐一將核苷添加到修飾編碼引物的3′-OH。新合成的鏈包含修飾編碼引物，因而產(chǎn)生對(duì)所需修飾進(jìn)行編碼的基因。在PCR的擴(kuò)充步驟中將新合成的鏈用作模板DNA，從而擴(kuò)增對(duì)修飾進(jìn)行編碼的基因。
另一方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA序列，其具有兩種或多種氨基酸修飾。將兩種或多種需要修飾的氨基酸在多肽上相互緊密間隔時(shí)，所有所需的修飾都在一個(gè)低聚核苷酸中進(jìn)行編碼，因而得以同時(shí)實(shí)現(xiàn)。因此，具有兩種或多種氨基酸修飾的突變免疫球蛋白或其片段可以通過(guò)用于制備攜帶一個(gè)核苷修飾的突變免疫球蛋白或其片段的相同方法來(lái)制備，但使用含有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾的低聚核苷酸作為引物。
將兩個(gè)或多個(gè)需要修飾的氨基酸隔開(kāi)(在兩個(gè)需要修飾的氨基酸之間存在10個(gè)以上氨基酸的情況下)時(shí)，無(wú)法在一個(gè)低聚核苷酸中編碼所有所需的修飾。因此，應(yīng)采用不同的方法。一種方法是為每種氨基酸修飾制備單獨(dú)的低聚核苷酸。將這些低聚核苷酸同時(shí)退火到單鏈模板DNA上時(shí)，新合成的二級(jí)單鏈DNA編碼所有所需的氨基酸修飾。本發(fā)明中所使用的另一種方法包括兩個(gè)誘變實(shí)驗(yàn)。在初步誘變中，使用天然DNA作為模板，將一種含有所需氨基酸修飾的低聚核苷酸退火到模板上，因而產(chǎn)生異源雙鏈DNA。在二次誘變中，將異源雙鏈DNA用作模板。該模板已攜帶至少一種修飾。將一種具有另一氨基酸修飾的低聚核苷酸退火到模板上時(shí)，所得的DNA對(duì)初步和二次修飾進(jìn)行編碼。
盒式誘變也是用于制備根據(jù)本發(fā)明的對(duì)糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA的優(yōu)選方法。這種方法基于Well J.等人所述的技術(shù)(Well J.等人，Biochem.，1990年，第29卷，第8509-8517頁(yè))。起始材料是一種含有對(duì)需要修飾的免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的基因的質(zhì)粒(或另一載體)。當(dāng)特定的限制酶位點(diǎn)只存在于需要修飾的位置時(shí)，優(yōu)選地使用盒式誘變。但是，并非必須這樣做。如果這種限制酶位點(diǎn)不存在，則可以通過(guò)低聚核苷酸介導(dǎo)誘變將其引入對(duì)免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的基因的適當(dāng)位置。將限制酶位點(diǎn)引入質(zhì)粒中之后，通過(guò)使用限制酶進(jìn)行處理而將質(zhì)粒線性化?？梢允褂猛环椒▉?lái)合成具有DNA序列的雙鏈低聚核苷酸，所述DNA序列含有所需的突變并且位于限制酶位點(diǎn)之間。使用同一技術(shù)來(lái)個(gè)別地合成和雜交這兩個(gè)鏈。這種雙鏈低聚核苷酸一般稱為“盒”。“盒”應(yīng)采用具有與線性質(zhì)粒的兩端相容的3′-和5′-端的形式來(lái)制備，因而可以直接與質(zhì)粒共軛。通過(guò)上述過(guò)程，質(zhì)粒最終含有對(duì)所需的糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA。
另外，可以通過(guò)化學(xué)方法來(lái)制備根據(jù)本發(fā)明的對(duì)糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA序列。具體地說(shuō)，可以通過(guò)使用低聚核苷酸合成儀的化學(xué)方法來(lái)合成這種DNA序列。根據(jù)糖基化免疫球蛋白或其片段的氨基酸序列，并且優(yōu)選地通過(guò)使用產(chǎn)生糖基化免疫球蛋白或其片段的宿主細(xì)胞選擇優(yōu)選的密碼子，來(lái)制備低聚核苷酸。
對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的對(duì)糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA序列，遺傳密碼中的簡(jiǎn)并性(其表示一種氨基酸通過(guò)多個(gè)密碼子來(lái)指定)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。因而，有多個(gè)具有簡(jiǎn)并性的DNA序列對(duì)根據(jù)本發(fā)明的糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼，并且其全都屬于本發(fā)明的范圍。
或者，可以按照以下方式來(lái)制備根據(jù)本發(fā)明的糖基化融合蛋白。制備對(duì)融合蛋白進(jìn)行編碼的DNA序列(下稱“融合基因”)，并將其插入包括一個(gè)或多個(gè)表達(dá)調(diào)控序列的載體中，所述表達(dá)調(diào)控序列通過(guò)可操作地鏈接到融合基因而調(diào)節(jié)融合基因的表達(dá)。接著，通過(guò)所得到的重組表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主。在適合融合基因表達(dá)的條件下，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化子或轉(zhuǎn)染子。從所得到的培養(yǎng)物中回收通過(guò)融合基因編碼的實(shí)質(zhì)上純凈的糖基化融合蛋白。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“載體”指用作媒劑的DNA分子，其能夠?qū)⑼庠椿蚍€(wěn)定地帶入宿主細(xì)胞。為了可以投入應(yīng)用，載體應(yīng)該是可以復(fù)制的，具有將自身引入宿主細(xì)胞的系統(tǒng)，并具有可選擇的標(biāo)記。
另外，本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指攜帶可操作鏈接的外源基因以在宿主細(xì)胞中表達(dá)的環(huán)狀DNA分子。被引入宿主細(xì)胞時(shí)，重組表達(dá)載體能夠以高復(fù)制數(shù)量復(fù)制，而不管宿主染色體DNA，并且能夠產(chǎn)生異質(zhì)DNA。如本領(lǐng)域中一般所知，為了增加宿主細(xì)胞中已轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)水平，應(yīng)將基因可操作地鏈接到被選作表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列。優(yōu)選地，表達(dá)調(diào)節(jié)序列和外源基因可以在含有可選標(biāo)記和復(fù)制原點(diǎn)的單個(gè)表達(dá)載體中攜帶。如果將真核細(xì)胞用作表達(dá)系統(tǒng)，則表達(dá)載體應(yīng)進(jìn)一步包括可用于真核宿主細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)記。
為了表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的對(duì)糖基化融合蛋白進(jìn)行編碼的DNA序列(即融合基因)，可以采用各種表達(dá)載體。優(yōu)選地，由于應(yīng)將免疫球蛋白或其片段糖基化，所以應(yīng)使用適合真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體。可用于真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體包含從SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和細(xì)胞巨化病毒等衍生的表達(dá)調(diào)控序列。具體地說(shuō)，載體的例子包括pCDNA3.1(+)/Hyg(美國(guó)加利福尼亞州Carlsbad市Invitrogen公司)和pCI-neo(美國(guó)加利福尼亞州La Jolla市Stratagen公司)?？捎糜诮湍傅谋磉_(dá)載體包括2μ質(zhì)粒及其異構(gòu)體、POT1載體(美國(guó)專利第4,931,373號(hào))和pPICZA、B或C(Invitrogen)。可用于昆蟲(chóng)細(xì)胞的表達(dá)載體包括pVL 941、pBluebac 4.5和pMelbac(Invitrogen)。但是，本發(fā)明不限于這些例子。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)調(diào)控序列”指對(duì)表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白而言必需或有利的核苷序列。每個(gè)調(diào)控序列可以是融合蛋白本身的或外來(lái)的。表達(dá)調(diào)控序列的非限制性例子包括前導(dǎo)序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或上游活化序列、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。
為了表達(dá)本發(fā)明的融合基因，可以將各種表達(dá)調(diào)控序列中的任何一種插入本發(fā)明所使用的表達(dá)載體中。適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引導(dǎo)蛋白表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列的例子包括SV40以及腺病毒的早期和晚期啟動(dòng)子、MT-1(金屬硫因基因)啟動(dòng)子、人類細(xì)胞巨化病毒即刻早期基因啟動(dòng)子(CMV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子和人泛素C(UbC)啟動(dòng)子。另外，為了改進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平，可以將合成基因內(nèi)區(qū)插入融合基因的5′-非翻譯區(qū)。適合在昆蟲(chóng)細(xì)胞中引導(dǎo)蛋白表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列的例子包括多角體蛋白啟動(dòng)子、P10啟動(dòng)子、棒狀病毒39K延遲早期基因啟動(dòng)子和SV40多腺苷酸化序列。適合在酵母中引導(dǎo)蛋白表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列的例子包括酵母α接合系統(tǒng)的啟動(dòng)子、酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)啟動(dòng)子和ADH2-4c啟動(dòng)子。適合在真菌細(xì)胞中引導(dǎo)蛋白表達(dá)的表達(dá)調(diào)控序列的例子包括ADH3啟動(dòng)子和終止子。
術(shù)語(yǔ)“可操作地鏈接”指本發(fā)明的融合基因以功能關(guān)系與調(diào)控序列一起排列的狀態(tài)。也就是說(shuō)，將基因和調(diào)控序列鏈接起來(lái)，以便在適當(dāng)?shù)姆肿?例如，轉(zhuǎn)錄活化蛋白)與調(diào)控序列鍵結(jié)時(shí)，引起基因的表達(dá)。例如，當(dāng)前置序列或分泌前導(dǎo)序列促進(jìn)成熟蛋白的分泌時(shí)，就說(shuō)是可操作地鏈接到蛋白的編碼序列。在調(diào)節(jié)編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，啟動(dòng)子與編碼序列可操作地鏈接。當(dāng)存在于允許翻譯編碼序列的位置時(shí)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地鏈接到編碼序列。一般來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“可操作地鏈接”指鏈接的核苷序列相互接觸。如果是分泌前導(dǎo)序列，該術(shù)語(yǔ)指其接觸編碼序列并存在于編碼序列的閱讀框內(nèi)。但是，增強(qiáng)子不一定與編碼序列接觸。核苷序列的鏈接可以通過(guò)在方便的限制酶識(shí)別位點(diǎn)的連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。沒(méi)有限制酶識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，可以使用低聚核苷酸接頭或連接子，其通過(guò)傳統(tǒng)的方法來(lái)合成。
另一方面，可以使用具有外源DNA的高引入效率以及引入DNA的高表達(dá)水平的宿主細(xì)胞。具體地說(shuō)，應(yīng)使用能夠糖基化本發(fā)明的融合蛋白的真核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。適當(dāng)?shù)慕湍杆拗骷?xì)胞的例子包括釀酒酵母和漢森酵母的菌株。適當(dāng)?shù)恼婢拗骷?xì)胞的例子包括木霉、鐮刀霉和曲霉菌種屬。適當(dāng)昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞的例子包括Sf9或Sf21等Lepidoptora細(xì)胞系。適當(dāng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的例子包括CHO細(xì)胞系、COS1或COS7等COS細(xì)胞系、BHK細(xì)胞系或老鼠細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞系以及組織培養(yǎng)的植物細(xì)胞和人類細(xì)胞。
可以通過(guò)基本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書中所述的方法將本發(fā)明的融合基因或含有該融合基因的重組表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞(例如，Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(1986))。所述引入宿主細(xì)胞的優(yōu)選方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、顯微注射、陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電致孔、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、劃痕標(biāo)記、彈道引入和感染。
在本發(fā)明的制備方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法，在適合產(chǎn)生多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。例如，可以通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵，在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵桶中，采用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，在允許表達(dá)和/或分離多肽的條件下，培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域中熟知的程序，在含有碳和氮源以及無(wú)機(jī)鹽的適當(dāng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可以向商業(yè)供應(yīng)商購(gòu)買，并且可以根據(jù)公布的組合物(例如，美國(guó)典型微生物菌種保藏中心目錄)來(lái)制備。如果將融合蛋白分泌到培養(yǎng)基中，則其可以從培養(yǎng)基直接回收。如果不分泌融合蛋白，則其可以從細(xì)胞溶解產(chǎn)物回收。
可使用本領(lǐng)域中熟知的幾種用于分離多肽的方法的任何一種來(lái)回收本發(fā)明的糖基化融合蛋白。例如，可以通過(guò)傳統(tǒng)方法(包括但不限于離心分離、過(guò)濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀)從培養(yǎng)基中回收多肽。而且，多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的多種方法來(lái)進(jìn)行純化，包括但不限于色譜法(例如，離子交換、親合力、疏水性和尺寸排阻)、電泳、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取。
另一方面，本發(fā)明提供了一種含有根據(jù)本發(fā)明的糖基化融合蛋白的醫(yī)藥組合物。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“治療”指疾病或障礙的完全治愈、抑制或緩解。因此，本文所使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效劑量”指足以達(dá)到以上藥物效果的劑量。在本發(fā)明中，治療有效劑量可以根據(jù)配制方法、給藥方式、病人的年齡、體重和性別、疾病的嚴(yán)重性、膳食、給藥持續(xù)時(shí)間、給藥途徑、排泄率和反應(yīng)敏感度而變化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易確定并開(kāi)出能夠達(dá)到所需治療效果的劑量。
另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白，要用本發(fā)明的醫(yī)藥組合物治療的疾病可以通過(guò)改變蛋白的類型而改變。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的糖基化CTLA4-Ig融合蛋白適用其通過(guò)抑制T-細(xì)胞的作用而顯示治療效果的疾病，例如，關(guān)節(jié)炎或牛皮癬等自身免疫性疾病、各種骨頭移植(包括骨髓移植)以及靜脈曲張。而且，可以在癌癥的治療中使用具有用于各種與癌癥相關(guān)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體的融合蛋白，因?yàn)槠渚哂懈倪M(jìn)的治療功效，原因是其增加了受體的血清水平并阻擋了血管發(fā)生因子。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中所使用的載體包括醫(yī)藥領(lǐng)域常用的載體、佐劑和媒劑，其統(tǒng)稱為“醫(yī)藥可接受載體”。可用于本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中的非限制性醫(yī)藥可接受載體包括離子交換樹(shù)脂、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(例如，人類血清白蛋白)、緩沖劑(例如，磷酸鈉、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物)、水、鹽或電解液(例如，魚(yú)精蛋白硫酸鹽、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉和鋅鹽)、硅膠、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、以纖維素為主的基質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、多芳基化合物、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物、聚乙二醇和羊毛脂。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以經(jīng)由任何常用的途徑給藥，但條件是其能夠到達(dá)所需的組織。因此，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以局部、腸胃外、眼內(nèi)、經(jīng)皮、直腸內(nèi)和腔內(nèi)的途徑給藥，并且可以配制成溶液、懸浮液等。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括皮下、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)腔內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、心臟內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)和頭顱內(nèi)注射或滴注技術(shù)。
一方面，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以配制為水溶液用于腸胃外給藥。優(yōu)選地，可以采用適當(dāng)?shù)木彌_溶液，例如Hank溶液、Ringer溶液或生理緩沖鹽水?？梢杂媚軌蛟黾討腋∫赫承缘奈镔|(zhì)來(lái)補(bǔ)充水注射懸浮液，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和右旋糖苷。另外，活性成分的懸浮液(例如，油注射懸浮液)包括親油溶劑或載體，例如，脂肪油(例如，芝麻油)和合成脂肪酸酯(例如，油酸乙酯、甘油三酸酯或脂質(zhì)體)。也可以將多價(jià)陽(yáng)離子非脂氨基聚合物用作媒劑。視情況，懸浮液可以含有適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑或藥物，以增加成分的溶解度，并獲得高濃度的成分。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物優(yōu)選地采用無(wú)菌可注射制劑的形式，例如，無(wú)菌可注射水性或油性懸浮液?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域熟知的方法，使用適當(dāng)?shù)姆稚⒒驖駶?rùn)劑(例如，Tween 80)以及懸浮劑來(lái)配制這種懸浮液。無(wú)菌可注射制劑也可以是無(wú)毒腸胃外可接受稀釋液或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或懸浮液，例如1，3-丁二醇中的溶液?？山邮艿拿絼┖腿軇┌ǜ事洞?、水、Ringer溶液和等張氯化鈉溶液。另外，傳統(tǒng)上，可以將無(wú)菌的不揮發(fā)性油用作溶劑或懸浮媒劑?；诖四康?，可以采用任何溫和的不揮發(fā)性油，包括合成的單甘油酯或雙甘油酯。另外，可以在可注射制劑的制備中使用脂肪酸，例如，油酸及其甘油酯衍生物，例如，醫(yī)藥上可接受的自然油(例如，橄欖油或蓖麻油)，特別是其聚氧乙烯化衍生物。
主要使用過(guò)濾器過(guò)濾除去細(xì)菌，并與消毒劑混合或結(jié)合輻射，來(lái)對(duì)上述水溶性組合物進(jìn)行消毒。可以將消毒后的組合物硬化，例如通過(guò)冷凍干燥，以獲得硬化的產(chǎn)物，并且基于實(shí)用性的考慮，將硬化后的組合物溶解于已消毒的水中或已消毒的稀釋溶液中。
為了增加室溫下的穩(wěn)定性，減少低溫下高成本貯藏的需要，并延長(zhǎng)有效期，可以將本發(fā)明的醫(yī)藥組合物凍干。冷凍干燥方法可以包括冷凍、第一次干燥和第二次干燥的步驟。冷凍之后，在壓力下加熱組合物，以蒸發(fā)掉水分。在第二次干燥步驟，從干燥的產(chǎn)物中除去殘留的水。
根據(jù)本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的每日有效劑量一般為每千克體重約10μg至約500μg，優(yōu)選地每千克體重約20μg至約300μg，并且最佳地每千克體重約50μg至約200μg。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白，需要向病人給藥的醫(yī)藥組合物的具體數(shù)量可以根據(jù)多個(gè)因素變化，包括但不限于所需的生物活性、病人的癥狀和藥物抗性。
通過(guò)以下例子，可以更好地理解本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白，以下例子只是為了說(shuō)明本發(fā)明而提供的，本發(fā)明的范圍不限于這些例子。
示例表2與CTLA4-Ig的制備中所使用的引物有關(guān)的信息


示例1A.對(duì)CTLA4的可溶性細(xì)胞外區(qū)進(jìn)行編碼的DNA片段的制備通過(guò)PCR來(lái)制備對(duì)CTLA4的可溶性細(xì)胞外區(qū)進(jìn)行編碼的DNA片段，其中使用具有限制酶的識(shí)別序列、EcoRI和用于CTLA4的前導(dǎo)序列的編碼序列的一種引物(SEQ ID NO1)，以及具有PstI識(shí)別序列和針對(duì)CTLA4的可溶性細(xì)胞外區(qū)的3′端編碼的反義序列的另一種引物(SEQ ID NO2)。PCR中的cDNA模板通過(guò)反向轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、使用從健康成人的單核細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞)提取的mRNA來(lái)制備。使用Tri-Reagent mRNA分離試劑盒(美國(guó)MRC)來(lái)分離mRNA。首先，使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.2)將2×107人類T淋巴細(xì)胞清洗三次，并使用1ml Tri-Reagent通過(guò)重復(fù)吸液進(jìn)行細(xì)胞溶解。通過(guò)用力搖動(dòng)將細(xì)胞溶解產(chǎn)物與0.2ml氯仿混合，在室溫下保持15分鐘，并以15,000rpm的轉(zhuǎn)速在4℃下離心分離15分鐘。將上層清液轉(zhuǎn)移到1.5-ml試管中，與0.5ml異丙醇混合，并以15,000rpm的轉(zhuǎn)速在4℃下離心分離15分鐘。除去上層清液后，使用1ml以75％乙醇-25％DEPC處理的三重蒸餾水(TDW)清洗顆粒。將試管顛倒兩到三次，并以15,000rpm的轉(zhuǎn)速在4℃下離心分離15分鐘。完全除去上層清液之后，將RNA顆粒風(fēng)干，以除去剩余的乙醇，并溶解于50μl經(jīng)DEPC處理的TDW。
B.對(duì)IgG1的Fc區(qū)域進(jìn)行編碼的DNA片段的制備對(duì)IgG1的Fc區(qū)域進(jìn)行編碼的DNA片段通過(guò)PCR來(lái)制備，其中使用了具有PstI識(shí)別序列和針對(duì)IgG1Fc的5′端編碼的序列的一種引物(SEQ ID NO3)，以及具有XbaI識(shí)別序列和針對(duì)IgG1Fc的3′端編碼的反義序列的另一種引物(SEQ ID NO4)。PCR中的cDNA模板通過(guò)RT-PCR、使用從病人的末稍血細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)提取的mRNA來(lái)制備，所述病人患有未知病因的發(fā)燒癥狀，并且正在恢復(fù)中。在與A部分的示例1相同的條件下，使用相同的試劑來(lái)執(zhí)行RT-PCR。
C.對(duì)非糖基化CTLA4-IgG進(jìn)行編碼的基因的制備對(duì)CTLA4的可溶性細(xì)胞外區(qū)進(jìn)行編碼的DNA片段以及對(duì)IgG1的Fc區(qū)進(jìn)行編碼的DNA片段使用PstI消化并使用T4 DNA連接酶連接。連接后的DNA含有前導(dǎo)序列，以在表達(dá)后促進(jìn)蛋白分泌。如此產(chǎn)生的融合基因片段使用EcoRI和XbaI消化，并插入pBluescript KS II(+)(美國(guó)Stratagene)的EcoRl/Xbal位點(diǎn)，其中，pBluescript KS II(+)是一種市售的克隆載體。通過(guò)DNA序列來(lái)標(biāo)識(shí)整個(gè)編碼區(qū)(SEQ ID NO7)。從融合基因表達(dá)的融合蛋白稱為“CTLA4-IgG”，其預(yù)測(cè)氨基酸序列用SEQ ID NO8表示。
示例2糖基化CTLA4-IgG融合蛋白的制備為了將糖基化基序引入IgG1的Fc區(qū)，按照以下方式制備了具有核苷序列的七種引物，所述核苷序列包含引起氨基酸取代的突變?cè)赟EQ ID NO5的核苷序列中，以AAC(Asn，N)取代478-480密碼子(ATG，Met)、以AAC(Asn，N)取代583-585密碼子(GCC，Ala)、以AAC(Asn，N)取代727-729密碼子(ACC，Thr)、以AAC(Asn，N)取代793-795密碼子(GAG，Glu)、以ACC(Thr，T)取代895-897密碼子(TAC，Tyr)、以ACC(Thr，T)取代991-993密碼子(TTQ，Phe)并以AAC(Asn，N)取代1036-1038密碼子(CAG，Gln)。下表3中給出了與這些引物有關(guān)的信息。
表3與糖基化CTLA4-Ig的制備中所使用的引物有關(guān)的信息


本發(fā)明的糖基化融合蛋白通過(guò)PCR來(lái)制備，其中使用了示例1中制備的攜帶CTLA4-hIgG-編碼DNA的克隆載體作為模板，并使用表3中所列的低聚核苷酸作為引物。
具體地說(shuō)，按照以下方式制備每種糖基化融合蛋白。
(1)CTLA4-hIgG-G1(G1變異體)使用引物(SEQ ID NO9)產(chǎn)生一種糖基化基序，該引物設(shè)計(jì)成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)取代位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc區(qū)的478-480核苷(ATG，Met)。
(2)CTLA4-hIgG-G2(G2變異體)使用引物(SEQ ID NO12和13)產(chǎn)生兩種糖基化基序，所述引物設(shè)計(jì)成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)和ACC(Thr，T)取代分別位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc區(qū)的793-795核苷(GAG，Glu)和895-897核苷(TAC，Tyr)。
(3)CTLA4-hIgG-G3(G3變異體)使用引物(SEQ ID NO13和14)產(chǎn)生兩種糖基化基序，所述引物設(shè)計(jì)成具有核苷序列，其以ACC(Thr，T)和ACC(Thr，T)取代分別位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc區(qū)的895-897核苷(TAC，Tyr)和991-993核苷(TTC，Phe)。
(4)CTLA4-hIgG-G4(G4變異體)使用引物(SEQ ID NO9、12和13)產(chǎn)生三種糖基化基序，所述引物設(shè)計(jì)成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)和ACC(Thr，T)取代分別位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc區(qū)的478-480核苷(ATG，Met)、793-795核苷(GAG，Glu)和895-897核苷(TAC，Tyr)。
(5)CTLA4-hIgG-G5(G5變異體)使用引物(SEQ ID NO9、12、13和14)產(chǎn)生四種糖基化基序，所述引物設(shè)計(jì)成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、ACC(Thr，T)和ACC(Thr，T)取代分別位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc區(qū)的478-480核苷(ATG，Met)、793-795核苷(GAG，Glu)、895-897核苷(TAC，Tyr)和991-993核苷(TTC，Phe)。
(6)CTLA4-hIgG-G6(G6變異體)使用引物(SEQ ID NO9、10、12、13和14)產(chǎn)生五種糖基化基序，所述引物設(shè)計(jì)成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、ACC(Thr，T)和ACC(Thr，T)取代分別位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc區(qū)的478-480核苷(ATG，Met)、583-585核苷(GCC，Ala)、793-795核苷(GAG，Glu)、895-897核苷(TAC，Tyr)和991-993核苷(TTC，Phe)。
(7)CTLA4-hIgG-G7(G7變異體)使用引物(SEQ ID NO9、10、11、12、13和14)產(chǎn)生六種糖基化基序，所述引物設(shè)計(jì)成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、ACC(Thr，T)和ACC(Thr，T)取代分別位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc區(qū)的478-480核苷(ATG，Met)、583-585核苷(GCC，Ala)、727-729核苷(ACC，Thr)、793-795核苷(GAG，Glu)、895-897核苷(TAC，Tyr)和991-993核苷(TTC，Phe)。
(8)CTLA4-hIgG-G8(G8變異體)使用引物(SEQ ID NO9、10、11、12、13、14和15)產(chǎn)生七種糖基化基序，所述引物設(shè)計(jì)成具有核苷序列，其以AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、AAC(Asn，N)、ACC(Thr，T)、ACC(Thr，T)和AAC(Asn，N)取代分別位于IgG(SEQ ID NO5)的Fc區(qū)的478-480核苷(ATG，Met)、583-585核苷(GCC，Ala)、727-729核苷(ACC，Thr)、793-795核苷(GAG，Glu)、895-897核苷(TAC，Tyr)、991-993核苷(TTC，Phe)和1036-1038核苷(CAG，Gln)。
如下執(zhí)行PCR。將1μl CTLA4-hIgG DNA(2.2ng)、1.25 U Pfu DNA聚合酶(美國(guó)Stratagene)、4U Pfu DNA連接酶(美國(guó)Stratagene)、1μl用于Pfu DNA連接酶的10x反應(yīng)緩沖液、1μl每種引物(10pM)和2μl dNTP(每種10mM)添加到PCR試管中，并將三重蒸餾水添加到最終的20μl體積中。PCR條件包括94℃下3分鐘、61℃下1分鐘以及65℃下1分鐘的兩個(gè)周期，然后是94℃下1分鐘、61℃下1分鐘以及65℃下7分鐘的29個(gè)周期，接下來(lái)是在65℃下執(zhí)行15分鐘的最后伸長(zhǎng)。對(duì)如此獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，以確定是否成功地插入糖基化基序。
示例3A.糖基化CTLA4-IgG融合蛋白的表達(dá)和純化為了在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢K-I細(xì)胞(CHO-K1，ATCC CCL-61，卵巢，中國(guó)倉(cāng)鼠Cricetulus giseus)中表達(dá)糖基化CTLA4-IgG融合蛋白，將含有CTLA4-hIgG融合基因(將糖基化基序插入其中)的pBluescript KS II(+)質(zhì)粒DNA從已轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中分離出來(lái)，并以EcoRI和XbaI消化。將如此獲得的CTLA4-hIgG融合基因插入動(dòng)物表達(dá)載體pCRTM3(美國(guó)Tnvitrogen)的EcoRI/XbaI位點(diǎn)。所得到的表達(dá)載體稱為pCT4Ig-G2至G8質(zhì)粒。其中，2004年5月17日，根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，將pCT4Ig-G2重組表達(dá)載體存放于韓國(guó)微生物菌種保藏中心(KCCM)，登記號(hào)為KCCM10572。
B.融合蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)染和評(píng)估將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢K-I細(xì)胞(CHO-K1)種植于六孔組織培養(yǎng)板(美國(guó)Nunc)上，密度為每孔1-3×105個(gè)細(xì)胞，并在含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至50-80％匯合。在無(wú)血清的DMEM中，將pCT4Ig-G2至G8質(zhì)粒的任一者的1-2μg DNA與2-25μl Lipofectamine(美國(guó)Gibco BRL)混合，并在室溫下孵化15-45分鐘，以形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。然后，將所得到的復(fù)合物添加到六孔板中。在五個(gè)小時(shí)的孵化期之后，將細(xì)胞重新放入含有20％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并進(jìn)一步培養(yǎng)18-24小時(shí)。然后，在補(bǔ)充了3mg/ml Geneticin(美國(guó)Gibco BRL公司的G418)的含10％FBS的DMEM中，將細(xì)胞培養(yǎng)三周。選擇并分離所形成的集落，然后繁殖分離出的集落。
通過(guò)ELISA，使用過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG(美國(guó)KPL)來(lái)評(píng)估是否表達(dá)了融合基因。如下執(zhí)行ELISA。首先，用0.1M碳酸氫鈉將1mg/ml的羊抗人IgG稀釋為1∶2000，并將100μl的稀釋液均等分配到96孔柔性板(美國(guó)Falcon)。用保鮮膜密封之后，在4℃下將板孵化16小時(shí)以上，以使板的底部涂上抗體。然后，用漂洗液(1x含有0.1％Tween-20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))將板清洗三次，并將100μl稀釋緩沖液(48.5ml 1×PBS、1.5ml FBS、50μl Tween-20)添加到每個(gè)孔中。將20μd培養(yǎng)上層清液添加到第一個(gè)孔中，并使用微量吸液管連續(xù)稀釋。而且，像試樣一樣稀釋作為陽(yáng)性對(duì)照物的0.01μg/μl人類IgG(美國(guó)Sigma)以及作為陰性對(duì)照物的非轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞的培養(yǎng)液。完成稀釋之后，用箔將96孔柔性板(美國(guó)Falcon)包起來(lái)，在37℃下孵化1小時(shí)30分鐘，并用漂洗液清洗三次。用稀釋緩沖液將過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG(美國(guó)KPL)稀釋為1∶5000，并將100μl稀釋液添加到每個(gè)孔中，用箔包起來(lái)，并在37℃下孵化一個(gè)小時(shí)。完成反應(yīng)之后，使用TMB微孔過(guò)氧化物酶底物系統(tǒng)(美國(guó)KPL)對(duì)板進(jìn)行顯色。在630nm下，使用酶標(biāo)儀(日本Bio-RAD，Model 550)測(cè)量吸光率，以確定是否表達(dá)了融合基因以及融合基因的表達(dá)水平(圖2)。如圖2所示，G1變異體以最高水平表達(dá)，接下來(lái)是G2、G4、G0和G3變異體。發(fā)現(xiàn)G5、G6、G7和G8變異體很少表達(dá)。
示例4蛋白質(zhì)印跡分析用免疫沉淀反應(yīng)純化所表達(dá)的蛋白，并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。首先，將50μl蛋白質(zhì)A瓊脂糖微球放入1.5-ml試管，與100μl緩沖液A(0.05M硼酸、4MNaCl、pH9.0)混合，并以13,000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離大約10秒鐘。除去表面清液后，重復(fù)該步驟三次。將每個(gè)蛋白質(zhì)樣本與平衡的蛋白質(zhì)A瓊脂糖微球混合，并在4℃下孵化3小時(shí)，同時(shí)旋轉(zhuǎn)，以產(chǎn)生鍵結(jié)。然后，以13,000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離反應(yīng)混合物，并使用緩沖液A將微球清洗三次。將微球與20μl緩沖液B(0.05M磷酸鈉、0.05M檸檬酸、0.3M NaCl、pH3.0)混合，并以13,000rpm的轉(zhuǎn)速離心分離，以洗提鍵結(jié)的蛋白質(zhì)。將洗提后的蛋白質(zhì)樣本與5x含有5％β-巰基乙醇的緩沖液混合，沸騰5分鐘，并進(jìn)行還原SDS-PAGE。將3.5％丙烯酰胺凝膠(0.5M Tris-HCl(pH6.8)、0.4％SDS)用作積層凝膠，并將10％丙烯酰胺凝膠(1.5M Tris-HCl(pH8.8)、0.4％SDS)用作電泳膠。電泳后，在350mA下，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到0.4-μm Westran(PVDF轉(zhuǎn)移膜，S&S)，持續(xù)2小時(shí)。使用5％脫脂乳封閉印跡，持續(xù)1小時(shí)。用漂洗液(0.1％Tween-20、1x磷酸鹽緩沖鹽水)清洗三次后，在過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG(美國(guó)KPL)的1∶2000稀釋液中將印跡孵化1小時(shí)。使用漂洗液將印跡清洗三次，并且在室溫下用15ml著色劑顯色10分鐘，該著色劑根據(jù)推薦的使用方法，使用DAB底物試劑盒(美國(guó)VECTORLABORATORIES)制備。使用三重蒸餾水終止反應(yīng)。圖3中給出了結(jié)果。
示例5測(cè)量老鼠中的糖基化CTLA4-hIgG融合蛋白的血清半衰期按照以下方式在老鼠中測(cè)量糖基化CTLA4-hIgG融合蛋白的血清半衰期。以0.2mg/kg的劑量將每種融合蛋白以腹膜內(nèi)方式注射到老鼠中(韓國(guó)Samtako公司的ICR)。在給定的時(shí)點(diǎn)收集血液樣本，最少50小時(shí)，并根據(jù)與示例3中相同的ELISA方法確定蛋白質(zhì)濃度(圖4)。
如圖4所示，G2、G3和G4變異體具有增加的血清水平，而與野生型相比，G1變異體顯示了縮短的血液循環(huán)時(shí)間。具體地說(shuō)，G2變異體具有最高的循環(huán)時(shí)間。
工業(yè)適用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明的糖基化融合蛋白能夠減小臨床應(yīng)用中的劑量和給藥頻率，因?yàn)槠渚哂泻芨叩幕铙w內(nèi)穩(wěn)定性。
序列表<110>魅德秀專有限公社(MEDEXGEN Inc.)<120>糖基化免疫球蛋白以及含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素<130>KRA1V070001317<150>KR-10-2004-0038833<151>2004-05-31<160>31<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物，寡聚CTLA4-F-EcoRI<400>1ccggaattca tgaggacctg gccc 24<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物，寡聚CTLA4-R-PstI
<400>2ctctgcagaa tctgggcacg gttcaggatc 30<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物，寡聚IgG1-F-PstI<400>3atctgcagag cccaaatctt gtgac 25<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物，寡聚IgG1-R-xbaI<400>4gctctagagc tcatttaccc ggagacaggg agag 34<210>5<211>1068<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1065)<223>IgG-wild
<400>5cag atc acc ttg aag gag tct ggt ccc acg ctg gtg aaa ccc aca cag48Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15acc ctc acg ctg acc tgc acg ttc tct gga ttc tca ctc agc aaa agt96Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser20 25 30gga gtg ggt gtg ggc tgg atc cgt cag ccc cca gga cag gcc ctg gag 144Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Ala Leu Glu35 40 45tgg ctt gca ctc att ttt tgg gat gat gat aag cgc tac agc cca tct 192Trp Leu Ala Leu Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser50 55 60ctg agg acc aga ctc acc atc acc aag gac acc tcc aaa aac cag gtg 240Leu Arg Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val65 70 75 80gtc ctt aca atg acc aac gtg gac cct gcg gac aca gcc aca tat tat 288Val Leu Thr Met Thr Asn Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr85 90 95tgt gga tac agt gtt gaa gga tat ggc caa ggt tac cgc ttt cac tcc 336Cys Gly Tyr Ser Val Glu Gly Tyr Gly Gln Gly Tyr Arg Phe His Ser100 105 110tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tgc tca gag ccc aaa tct tgt 384Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Cys Ser Glu Pro Lys Ser Cys115 120 125gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg 432Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly130 135 140gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 480Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 528Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His165 170 175gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 576Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val180 185 190cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac 624His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr195 200 205cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 672Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly210 215 220aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 720Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile225 230 235 240gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 768Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val245 250 255tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc 816Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser260 265 270ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag 864Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu275 280 285tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc 912Trp Glu ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro290 295 300gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg 960Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
305 310 315 320gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg 1008Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met325 330 335cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tcc 1056His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser340 345 350ccg ggt aaa tga 1068Pro Gly Lys355<210>6<211>355<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser20 25 30Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Ala Leu Glu35 40 45Trp Leu Ala Leu Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser50 55 60Leu Arg Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val65 70 75 80Val Leu Thr Met Thr Asn Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr85 90 95Cys Gly Tyr Ser Val Glu Gly Tyr Gly Gln Gly Tyr Arg Phe His Ser
100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Cys Ser Glu Pro Lys Ser Cys115 120 125Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly130 135 140Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met145 150 155 160Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His165 170 175Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val180 185 190His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr195 200 205Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly210 215 220Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile225 230 235 240Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val245 250 255Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser260 265 270Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu275 280 285Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro290 295 300Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met325 330 335His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser340 345 350Pro Gly Lys355<210>7<211>1071<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
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<223>引物，mg-hIgG1-CH3-1
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<223>引物，mg-hIgG1-CH3-2<400>13gcgtggtctt ggtgttgttc tccgg25<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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245 250 255Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser260 265 270Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu275 280 285Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro290 295 300Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val305 310 315 320Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met325 330 335His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser340 345 350Pro Gly Lys355<210>18<211>1068<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
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cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tcc 1056His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser340 345 350ccg ggt aaa tga 1068Pro Gly Lys355<210>19<211>355<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>19Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser20 25 30Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Ala Leu Glu35 40 45Trp Leu Ala Leu Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser50 55 60Leu Arg Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val65 70 75 80Val Leu Thr Met Thr Asn Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr85 90 95Cys Gly Tyr Ser Val Glu Gly Tyr Gly Gln Gly Tyr Arg Phe His Ser100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Cys Ser Glu Pro Lys Ser Cys115 120 125Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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<221>CDS<222>(1)..(1065)<223>Ig-G7<400>28cag atc acc ttg aag gag tct ggt ccc acg ctg gtg aaa ccc aca cag48Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln1 5 10 15acc ctc acg ctg acc tgc acg ttc tct gga ttc tca ctc agc aaa agt96Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser20 25 30gga gtg ggt gtg ggc tgg atc cgt cag ccc cca gga cag gcc ctg gag 144Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Ala Leu Glu35 40 45tgg ctt gca ctc att ttt tgg gat gat gat aag cgc tac agc cca tct 192Trp Leu Ala Leu Ile Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser50 55 60ctg agg acc aga ctc acc atc acc aag gac acc tcc aaa aac cag gtg 240Leu Arg Thr Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val65 70 75 80
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Thr Ser Cys Ser Val Met325 330 335His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Asn Lys Ser Leu Ser Leu Ser340 345 350Pro Gly Lys35權(quán)利要求
1.一種糖基化免疫球蛋白或其片段，其中，將含有一種或多種氨基酸修飾的免疫球蛋白變異體額外地糖基化，所述氨基酸修飾選自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所組成的群組。
2.如權(quán)利要求1所述的糖基化免疫球蛋白或其片段，其中，所述免疫球蛋白變異體含有SEQ ID NO19的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的糖基化免疫球蛋白或其片段，其中，所述片段是Fc部分。
4.一種對(duì)糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的DNA，其中，將含有一種或多種氨基酸修飾的免疫球蛋白變異體額外地糖基化，所述氨基酸修飾選自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所組成的群組。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA，其中，所述免疫球蛋白變異體含有SEQ ID NO19的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求4或5所述的DNA，其中，所述片段是Fc部分。
7.一種糖基化融合蛋白，其通過(guò)將(a)糖基化免疫球蛋白或其片段與(b)至少一種生物活性蛋白或其一部分鏈接而形成，其中，將具有已修飾的氨基酸序列以形成一個(gè)或多個(gè)Asn-X-Ser/Thr序列(X是不包括脯氨酸的任何氨基酸)的免疫球蛋白變異體額外地糖基化。
8.如權(quán)利要求7所述的糖基化融合蛋白，其中，免疫球蛋白變異體含有一種或多種氨基酸修飾，其選自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所組成的群組。
9.如權(quán)利要求7所述的糖基化融合蛋白，其中，所述免疫球蛋白變異體含有SEQ ID NO19的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求7所述的糖基化融合蛋白，其中，所述片段是Fc部分。
11.如權(quán)利要求7所述的糖基化融合蛋白，其中，所述生物活性蛋白的所述部分是可溶性細(xì)胞外區(qū)。
12.如權(quán)利要求7或11所述的糖基化融合蛋白，其中，所述生物活性蛋白選自由血色素、血清蛋白、細(xì)胞因子、α-、β-和γ-干擾素、集落刺激因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、磷脂酶活化蛋白(PLAP)、胰島素、植物蛋白、腫瘤壞死因子(TNF)及其突變等位基因、生長(zhǎng)因子、激素、降血鈣素、降血鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、腦啡肽、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、紅細(xì)胞生成素、丘腦下部釋放因子、泌乳刺激素、絨毛膜促性腺激素、組織纖溶酶原活化劑、生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)、胸腺體液因子(THF)、白細(xì)胞介素、干擾素和酶所組成的群組。
13.一種采用二聚物形式的糖基化融合蛋白，其中，通過(guò)鉸鏈區(qū)的二硫化鍵將如權(quán)利要求7至12中任何一項(xiàng)所述的糖基化融合蛋白的兩個(gè)分子鏈接起來(lái)。
14.一種對(duì)如權(quán)利要求7至12中任何一項(xiàng)所述的糖基化融合蛋白進(jìn)行編碼的DNA。
15.一種含有如權(quán)利要求14所述的對(duì)融合蛋白進(jìn)行編碼的DNA的重組表達(dá)載體。
16.如權(quán)利要求15所述的重組表達(dá)載體，其登記號(hào)為KCCM-10572。
17.一種使用如權(quán)利要求15或16所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
18.一種制備糖基化融合蛋白的方法，其包括培養(yǎng)如權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞以及將所述糖基化融合蛋白從所得到的培養(yǎng)物中分離出來(lái)。
19.一種含有如權(quán)利要求7至13中任何一項(xiàng)所述的糖基化融合蛋白的醫(yī)藥組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種糖基化免疫球蛋白或其片段以及一種對(duì)糖基化免疫球蛋白或其片段進(jìn)行編碼的基因，其中，將含有一種或多種氨基酸修飾的免疫球蛋白變異體額外地糖基化，所述氨基酸修飾選自由M160N、A195N、T243N、E265N、Y299T、F331T和Q346N所組成的群組。而且，本發(fā)明涉及一種糖基化融合蛋白，其通過(guò)將(a)一種糖基化免疫球蛋白或其片段與(b)至少一種生物活性蛋白或其一部分鏈接而形成，其中，將具有已修飾的氨基酸序列以形成一個(gè)或多個(gè)Asn－X－Ser/Thr序列的免疫球蛋白變異體額外地糖基化；一種對(duì)糖基化融合蛋白進(jìn)行編碼的基因；一種含有該基因的重組表達(dá)載體；一種使用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；一種制備糖基化融合蛋白的方法，其包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子或轉(zhuǎn)染子以及將該糖基化融合蛋白從培養(yǎng)物中分離出來(lái)；以及一種含有如此制備的糖基化融合蛋白的醫(yī)藥組合物。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101014626SQ200580025687
公開(kāi)日2007年8月8日 申請(qǐng)日期2005年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月31日
發(fā)明者鄭用勛, 李基完, 趙勛埴, 樸洪圭, 金光成 申請(qǐng)人:魅德秀專有限公社