專利名稱：紅細(xì)胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白及其合成方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紅細(xì)胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白及其合成方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞生成素是一種糖蛋白激素。它是骨髓內(nèi)的紅細(xì)胞母細(xì)胞刺激生長因子。體內(nèi)絕大多數(shù)的紅細(xì)胞生成素是由人的腎臟皮質(zhì)分泌的，同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)在胚胎的肝臟，腦組織及子宮也產(chǎn)生紅細(xì)胞生成素。由于腎臟內(nèi)的腎小管毛細(xì)血管的間質(zhì)細(xì)胞缺氧，因而刺激紅細(xì)胞生長素的生成。至于紅細(xì)胞生長素具體在腎臟什么細(xì)胞和部位合成，尚無明確的結(jié)論。一種假設(shè)是腎小管上皮細(xì)胞分泌紅細(xì)胞生成素。由于貧血的血液是不能把氧從腎小管周圍毛細(xì)血管輸送到耗氧很高量的腎小管細(xì)胞，因而刺激了紅細(xì)胞生成素的合成。
如同其他的蛋白激素，紅細(xì)胞生成素是通過與靶細(xì)胞漿膜上的紅細(xì)胞生成素受體相結(jié)合而發(fā)生效用的，靶細(xì)胞即骨髓內(nèi)的紅細(xì)胞，母細(xì)胞被刺激而轉(zhuǎn)化成熟為紅細(xì)胞，如此增加了循環(huán)的紅細(xì)胞數(shù)目。它反映在增加的紅細(xì)胞容積，血紅蛋白和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)上面。結(jié)果導(dǎo)致腎內(nèi)氧水平的升高，而紅細(xì)胞生成素減少。
由于腎臟是紅細(xì)胞生成素的主要來源，慢性腎功能衰竭通常造成紅細(xì)胞生成素的缺陷，造成紅細(xì)胞生成不足性貧血。
紅細(xì)胞生成素基因于1985年被成功的克隆并被成功的表達(dá)。目前已有人工基因合成的重組紅細(xì)胞生成素用于臨床，以刺激紅細(xì)胞的生成并取代輸血治療由于慢性腎功能衰竭引起的貧血，以及由于其他疾病引起的紅細(xì)胞生成障礙的疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是用基因工程方法，將血紅細(xì)胞生成素與免疫球蛋白Fc段基因相融合，提供一種基因重組合成紅細(xì)胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白及其合成方法和臨床應(yīng)用，且為了保持或加強(qiáng)紅細(xì)胞生成素的全部生物活性，同時(shí)延長其在體內(nèi)的循環(huán)半衰期，簡化生產(chǎn)提純工序，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到表達(dá)。
本發(fā)明目的是這樣實(shí)現(xiàn)的紅細(xì)胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白，這種新型的EPO/Fc融合蛋白基因結(jié)構(gòu)，包括Human·CD5(或其他蛋白的)leading基因序列。其功能為啟動(dòng)EPO/Fc的轉(zhuǎn)錄，及分泌蛋白的轉(zhuǎn)譯。EPO/Fc基因包括了165個(gè)EPO成熟分泌蛋白的氨基酸基因序列，以及232個(gè)人免疫球蛋白IgG2Fc或IgGlFc段氨基酸的基因序列。完整的EPO/Fc的基因系列繼而克隆進(jìn)哺乳動(dòng)物蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒pRc/CMV，表達(dá)質(zhì)粒包括CMV起動(dòng)子(promotor)，Poly-A序列，以及抗菌素耐藥基因Genecin序列。全部成熟分泌的EPO/Fc蛋白為397個(gè)氨基酸。預(yù)計(jì)蛋白分子量為44.39KD(圖1EPO融合蛋白的結(jié)構(gòu))。EPO/Fc融合蛋白為雙體，由Fc的連接部Hinge的雙硫鍵將兩個(gè)單鏈EPO/Fc相結(jié)合，紅細(xì)胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白合成方法，攜帶上述人EPO/Fc基因的質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)進(jìn)入了哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)的細(xì)胞，通過NS.1小鼠的不分泌免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞株或中國，鼠卵巢細(xì)胞CHO進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并使用常規(guī)的蛋白A或蛋白B親和層析柱的成熟分離蛋白的工藝進(jìn)行蛋白的純化。
紅細(xì)胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白應(yīng)用用于慢性腎功能衰竭引起的貧血，以及紅細(xì)胞生成障礙的疾病。
本發(fā)明特點(diǎn)是創(chuàng)造出一種新型的EPO/Fc融合蛋白，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到表達(dá)。保持或加強(qiáng)紅細(xì)胞生成素的全部生物活性，同時(shí)延長其在體內(nèi)的循環(huán)半衰期，而且具有簡化的生產(chǎn)提純的工序，本發(fā)明的治療和應(yīng)用效果更好。


圖1是本發(fā)明紅細(xì)胞生成素-免疫球蛋白Fc融合蛋白基因結(jié)構(gòu)示意2是本發(fā)明免疫球蛋白Fc融合蛋白相增加糖蛋白成分的示意3是本發(fā)明小鼠體內(nèi)小劑量注射后血清樣本測定，其體內(nèi)半衰期曲線具體實(shí)施方式
如圖所示，攜帶人EPO/Fc基因的質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)進(jìn)入了哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)的細(xì)胞，NS.1(小鼠的不分泌免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞株)或CHO(中國，鼠卵巢細(xì)胞株)，通過結(jié)抗菌素Genetin的選擇及多次的篩選挑出單克隆的高表達(dá)細(xì)胞株效果更好。
由于EPO/Fc滴合蛋白具有Fc段，因而可以使用常規(guī)的蛋白A或蛋白B親和層析柱的成熟分離蛋白的工藝進(jìn)行蛋白的純化。工藝成熟，分離純度可高達(dá)99％以上，而且方法標(biāo)準(zhǔn)化，使生產(chǎn)成本大大降低。
經(jīng)SDS PAGE蛋白電泳分析，提純的EPO/Fc融合蛋白為雙體，由Fc的連接部Hinge的雙硫鍵將兩個(gè)單鏈EPO/Fc相結(jié)合，其分子量為130KD左右，其單鏈分子量為65KD左右。與其推測的44.39KD相增加部分為糖蛋白成分(圖2所示)，其純度超過99％。
經(jīng)小鼠體內(nèi)小劑量注射后血清樣本測定，其體內(nèi)半衰期為30小時(shí)(圖3所示)。由于測定采用雙特異性酶免疫分析方法(ELISA)，第一抗體使用抗人IgGFc抗體，而檢測第二抗體為抗人EPO抗體。此種方法能夠特異性的測出EPO/Fc的濃度，而IgG或EPO單體則無干擾的可能性。
進(jìn)而使用EPO/Fc對小鼠的失血性貧血進(jìn)行治療，而對照的小鼠相比較EPO/Fc能夠顯著的增加紅細(xì)胞容積及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。如此我們創(chuàng)制出一種新型的EPO/Fc蛋白，其保留EPO的全部生物活性，且具有長半衰期，蛋白由哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成，糖蛋白及結(jié)構(gòu)與天然蛋白相同，產(chǎn)量高，提純工藝成熟，簡單，成本低，適用于工業(yè)化大批量生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.紅細(xì)胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白，其特征是EPO/Fc融合蛋白基因結(jié)構(gòu)，起碼包括人CD5leading基因序列，還包括EPO/Fc基因，EPO/Fc基因包括165個(gè)EPO成熟分泌蛋白的氨基酸基因序列，以及232個(gè)人免疫球蛋白IgG2Fc或IgG1 Fc段氨基酸的基因序列，EPO/Fc融合蛋白為雙體，由Fc的連接部Hinge的雙硫鍵將兩個(gè)單鏈EPO/Fc相結(jié)合。
2.紅細(xì)胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白合成方法，其特征是將上述人EPO/Fc基因的質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)進(jìn)入了哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)的細(xì)胞，通過NS.1小鼠的不分泌免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞株或中國鼠卵巢細(xì)胞CHO進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并使用常規(guī)的蛋白A或蛋白B親和層析柱的成熟分離蛋白的工藝進(jìn)行蛋白的純化。
3.紅細(xì)胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白應(yīng)用用于慢性腎功能衰竭引起的貧血，以及紅細(xì)胞生成障礙的疾病。
全文摘要
紅細(xì)胞生成素/免疫球蛋白Fc融合蛋白，EPO/Fc融合蛋白基因結(jié)構(gòu)，起碼包括人CD5leading基因序列，還包括EPO/Fc基因，EPO/Fc基因包括165個(gè)EPO成熟分泌蛋白的氨基酸基因序列，以及232個(gè)人免疫球蛋白IgG2Fc或IgG1Fc段氨基酸的基因序列，EPO/Fc融合蛋白為雙體，由Fc的連接部Hinge的雙硫鍵將兩個(gè)單鏈EPO/Fc相結(jié)合。本發(fā)明創(chuàng)造出一種新型的EPO/Fc融合蛋白，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到表達(dá)。保持或加強(qiáng)紅細(xì)胞生成素的全部生物活性，同時(shí)延長其在體內(nèi)的循環(huán)半衰期，而且具有簡化的生產(chǎn)提純的工序，本發(fā)明的治療和應(yīng)用效果更好。
文檔編號(hào)A61P13/12GK1786032SQ20051009474
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月10日
發(fā)明者鄭心校, 張辰宇 申請人:南京大學(xué)