專利名稱：取代的氮雜卟啉作為熒光標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及熒光照相術(shù)，熒光測定方法和熒光探針。
背景技術(shù)：
本文引用的出版物及其它參考資料在這里引入作為參考。以下對本發(fā)明背景技術(shù)的描述目的在于幫助對本發(fā)明進(jìn)行理解，但是并不等于承認(rèn)其描述或構(gòu)成了本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
卟啉，酞菁及其它氮雜卟啉以及特定的其它含氮的大環(huán)芳香烴的近紅外吸收和發(fā)射有時(shí)候使得這些化合物可用作熒光標(biāo)記的有前景的候選物。
酞菁，尤其基于它們強(qiáng)烈地近紅外吸收(摩爾消光系數(shù)約200,000)它們的高量子產(chǎn)率以及對常見金屬酞青色素退色的抗性，使得人們進(jìn)行了許多的努力來利用它們作為熒光標(biāo)記。然而，按此方式的早期研究并沒有產(chǎn)生完全合格的產(chǎn)品，很大程度上是因?yàn)樘籍惡鯇こ５貜?qiáng)烈傾向于相互結(jié)合，尤其是通過堆積面對面聚集，以及強(qiáng)烈地結(jié)合到各種其它分子表面(非特異性的結(jié)合)。
由于分子內(nèi)堆積未取代的酞菁在有機(jī)的和水性的溶劑中具有非常低的溶解度。眾所周知，通過導(dǎo)入電荷基團(tuán)，諸如磺酸酯可降低堆積的傾向。
而具有這種取代基的酞菁可能在水中以及電解質(zhì)的水溶液中具有高溶解度，非特異性結(jié)合的傾向基本上仍持續(xù)。大部分熒光標(biāo)記的科學(xué)意義集中在與生物材料諸如組織切片，細(xì)胞，細(xì)胞片段，蛋白，包括乙二醇-和脂-蛋白，肽，寡-和聚-糖，寡-和聚-核苷酸以及脂類有關(guān)的應(yīng)用?？赡芡ㄟ^目的特異性相互作用的部分屏蔽來干擾在涉及這些材料的熒光分析中的結(jié)合非特異性的傾向。在治療藥物的分析中，可通過將酞菁染料連接到一或多種聚氧烴基，典型地為端甲氧基-聚(乙二醇)，(PEG)的將非特異性的結(jié)合以及堆積傾向降低到可忽略的水平。同時(shí)，這種基團(tuán)的連接保持了理想的吸收和發(fā)射特性。相同的技術(shù)對各種其它的近紅外色素也是有效的。參見，美國專利5,403,928。
對免疫分析相關(guān)參數(shù)的測定已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步。例如，利用描述在Dandliker等，美國專利5,302,349，名稱為″Transient StateLuminescence Assay Apparatus″中的技術(shù)(在這里全文引入作為參考，包括所有的附圖)，可以均一分析的形式實(shí)現(xiàn)對結(jié)合以及游離形式的組分的濃度進(jìn)行測定，即不需要對結(jié)合的以及游離的形式進(jìn)行分離。
盡管在熒光標(biāo)記領(lǐng)域以及數(shù)據(jù)分析方面取得了顯著的和有希望的改進(jìn)，但本領(lǐng)域仍需要其他具有必要的優(yōu)點(diǎn)但也很容易制備并且具有更高化學(xué)穩(wěn)定性的色素。其他人公開的密切相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)參見美國專利5,135,717，5,346,670和5,494,793。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明詳細(xì)說明并描述了對于某些酞菁可被轉(zhuǎn)化成用于制備熒光探針的熒光染料的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。這些可通過提供具有合適的攜帶僅具有幾個(gè)原子的軸向配體的金屬原子的酞菁。這些變化大大地消除了分子堆積(面對面聚集)并非特異性結(jié)合于其它攜帶相同信號的電荷的分子表面。
發(fā)明簡述本發(fā)明基于如果平面分子的兩個(gè)這種基團(tuán)之一存在于分子平面的一側(cè)，并且如果整個(gè)分子的凈電荷足夠地大，即使非常小的基團(tuán)諸如-OH也可產(chǎn)生針對非特異性結(jié)合以及平面分子堆積的有效保護(hù)的出乎意料的結(jié)果。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是通過與聚氧烴基結(jié)合而非通過兩個(gè)非常小的軸向配體(諸如-OH)可以實(shí)現(xiàn)所設(shè)計(jì)的酞菁及其它熒光染料所希望的效果，條件是染料上的凈電荷足夠多。在大多數(shù)情況下，凈電荷優(yōu)選為負(fù)電荷，因?yàn)樵谏韕H范圍中大多數(shù)生物材料包括蛋白以及DNA也將攜帶負(fù)凈電荷。因此，我們發(fā)現(xiàn)某些磺化的二羥基硅二羧基酞菁，尤其是La Jolla藍(lán)-3(LJB-3)當(dāng)用于標(biāo)記抗體時(shí)將提供高活性以及特異性的結(jié)合物。LJB-3比攜帶軸向聚乙二醇(PEG)的染料/熒光團(tuán)更容易制備，此外，LJB-3在化學(xué)性質(zhì)上更穩(wěn)定。

圖1顯示了(LJB-3)推測的結(jié)構(gòu)?；腔奈恢貌淮_定，但是可以想像在任一未取代的苯環(huán)上。LJB-3的最大近紅外吸光度是在679nm處。
通過量測游離染料，即不是在完整熒光探針中的染料可以部分評價(jià)熒光團(tuán)(熒光部分)的性能。這種檢驗(yàn)中有意義的參數(shù)包括熒光強(qiáng)度和偏振/向異性，當(dāng)熒光團(tuán)暴露于諸如存在于血清中的不同離子強(qiáng)度的特異性離子或生物分子時(shí)這些參數(shù)通常改變。這些效果可以被認(rèn)為是“溶劑效應(yīng)”，并且可通過熒光團(tuán)的分子之間相互作用的改變從而改變聚集狀態(tài)或者在熒光團(tuán)分子之間以及溶劑組成的改變(非特異性結(jié)合，NSB)產(chǎn)生。
本發(fā)明的染料結(jié)構(gòu)以及先前試圖使用酞菁(Pc′S)作為熒光探針的標(biāo)記的染料結(jié)構(gòu)之間的比較可以通過NSB的檢驗(yàn)形式得以認(rèn)識，在NSB的檢驗(yàn)形式中向血清中添加游離的染料并測定所產(chǎn)生的偏振或向異性。如果發(fā)生非特異性結(jié)合將產(chǎn)生偏振增加，因?yàn)榻Y(jié)合后分子量的增加引起轉(zhuǎn)動布朗運(yùn)動速率的下降。
表1中，可以通過熒光強(qiáng)度(I)的改變，和/或水平穿過表進(jìn)行的偏振的改變(mp，毫偏振單位)判斷任一染料的性能。無論溶劑組成如何，“理想的”熒光標(biāo)記對于這些參數(shù)將具有相同的值。
正常人血清中與甘油中性能的比較可以提供有益的信息，因?yàn)樵谘宕嬖谙掠蒒SB將提供對可能的偏振變化損失的測定。對于所列舉的5種染料而言，甘油中和正常人血清中偏振之間的差異值分別為60.4，73.6，103，12，61和44.1。這些差異顯示Si作為中心原子顯著的有益效果并且還指出LJB-3為基團(tuán)的最佳選擇。甘油中的強(qiáng)度除以正常人血清中的強(qiáng)度的比值也是有象征性的。顯示在表中為1.46，1.27，1.51，2.91，4.82和0.42，再次顯示Si相比Al顯著的優(yōu)越性以及LJB-3非常優(yōu)秀的性能。
另外，LJB-3兼具羧基和磺酸酯基團(tuán)并且可以多種方式被“激活”，即轉(zhuǎn)化為在生理pH以及室溫下與待標(biāo)記的生物分子上的基團(tuán)(通常氨基)自發(fā)反應(yīng)從而共價(jià)連接的結(jié)構(gòu)。我們使用了兩種用于標(biāo)記抗體的活化試劑，即羰基二咪唑以及琥珀酰亞胺基四甲基脲四氟硼酸酯(STUT)。我們發(fā)現(xiàn)后者在容易處理以及結(jié)果的再現(xiàn)性方面都是優(yōu)選的。這可能是由于當(dāng)使用STUT時(shí)，中間體染料的UHS酯的較強(qiáng)的穩(wěn)定性。另外，用STUT激活的最佳溶劑是DMSO。可以使用DMF但是可能會受不可避免的痕量胺的困擾。
對于給定應(yīng)用熒光團(tuán)的最明確的合格性試驗(yàn)是將染料摻入完整的探針并測試探針。以上對游離染料的血清試驗(yàn)可以作為有用的指導(dǎo)，但還不能完全代替對特異性探針的試驗(yàn)。
表2和3顯示了利用LJB-3標(biāo)記的抗-人IgG作為ANA(抗核抗體)的探針的說明性結(jié)果?？梢酝ㄟ^FIU(陽性/陰性)(或FIU[+/-])值，即來自陽性樣品的信號與來自陰性對照(正常的)的比值測定性能的質(zhì)量。7或更高的值是有用的；隨著技術(shù)的發(fā)展獲得了這些表中的數(shù)據(jù)；在常規(guī)應(yīng)用中可以預(yù)見將一致地產(chǎn)生較高的FIU(+/-)值。
發(fā)明詳述一般討論本發(fā)明基于如果平面分子在兩個(gè)這種基團(tuán)之一存在于分子平面在一側(cè)，并且凈電荷足夠多的話，即使非常小的基團(tuán)諸如-OH也可在水溶液中產(chǎn)生針對非特異性結(jié)合以及平面分子堆積的有效保護(hù)的出乎意料的結(jié)果。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是通過與聚氧烴基結(jié)合而非通過兩個(gè)非常小的軸向配體(諸如-OH)可以實(shí)現(xiàn)所設(shè)計(jì)的酞菁及其它熒光染料所希望的效果，條件是染料上的凈電荷足夠多。在大多數(shù)情況下，凈電荷優(yōu)選為負(fù)電荷，因?yàn)樵谏韕H范圍中大多數(shù)生物材料包括蛋白以及DNA也將攜帶負(fù)凈電荷。因此，我們發(fā)現(xiàn)某些磺化的二羥基硅二羧基酞菁(尤其是LJB-3，圖1)對血清蛋白具有如PEG-結(jié)合的未磺化染料一樣低的非特異性結(jié)合。
此外，存在的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于不存在由PEG形成的膠束。
在10-4以及以上的染料濃度的PEG工程化染料的表現(xiàn)很像大分子，因?yàn)槠渫ㄟ^設(shè)計(jì)用于阻止30K道爾頓以上或更大的分子通過的膜受到很大的限制。并且，染料在設(shè)計(jì)用于從小分子分離大分子的凝膠滲透層析的空隙體積中移動。相比之下，LJB-3的表現(xiàn)就像所希望的其分子量的分子一樣。
當(dāng)染料暴露于例如稀釋的人血清LJB-3時(shí)，通過熒光偏振和強(qiáng)度改變測定的非特異性結(jié)合的表現(xiàn)與PEG結(jié)合的染料幾乎相同。在這方面，重要的是要注意到負(fù)電荷本身對非特異性結(jié)合的減少有顯著的影響，因?yàn)槲椿腔亩u基二羥基二羧基硅酞菁顯示明顯的非特異性結(jié)合。羥基鋁酞菁三磺酸酯不僅對離子強(qiáng)度顯示強(qiáng)烈的敏感性而且具有強(qiáng)烈的非特異性結(jié)合。似乎酞菁分子在分子平面的兩側(cè)必須具有軸向的配體，但是如果凈電荷足夠多的話-OH基團(tuán)足夠大到全部消除非特異性的結(jié)合。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是由-OH或其它小的可溶性軸向配體連同高電荷工程化的染料在化學(xué)性質(zhì)上更具活性(在標(biāo)記反應(yīng)中)，盡管被標(biāo)記的分子，例如蛋白和寡核苷酸本身帶負(fù)電荷。這就意味著PEG配體參與分子的標(biāo)記，盡管通常很容易進(jìn)行半抗原及其它小分子的標(biāo)記。
本發(fā)明在羥基鋁酞菁三磺酸酯的強(qiáng)烈非特異性結(jié)合方面本發(fā)明是非常出乎意料的，由此，可以設(shè)想具有較少負(fù)凈電荷的二羥基二羧基硅酞菁將比鋁染料顯示更強(qiáng)的非特異性結(jié)合。本發(fā)明部分上是基于顯示正好相反的發(fā)現(xiàn)。其它小軸向配體諸如-OCH3，-O-CH2OH，Cl，-Br和-F的效果也是有用的。OPO3H2-的特性也是顯著的并暗示了其它可能有用的配體諸如硼酸酯和硫酸酯。
許多其他的含氮大環(huán)可以用具有類似結(jié)果的基團(tuán)14的原子金屬化。這種大環(huán)包括卟啉，氮雜卟啉，corroles，sapphyrins，pentaphyrins，porphycenes及其它具有廣泛的離域π電子系統(tǒng)的類似大環(huán)的衍生物以及結(jié)構(gòu)變體。鑒于它們包括許多所希望的特性，大環(huán)特別優(yōu)選的類型含有氮雜卟啉衍生物以及結(jié)構(gòu)變體氮雜卟啉衍生物包括單，二以及三氮雜卟啉和prophyrazine。任一的這些大環(huán)可以任選具有稠合芳烴環(huán)。這種氮雜卟啉衍生物以及變體包括酞菁，苯并三氮雜卟啉以及naphthaloyanine及其衍生物和其氧雜，硫代，或氮雜結(jié)構(gòu)變體。某些非-大環(huán)芳族結(jié)構(gòu)，例如氧雜蒽衍生物也可以具有上述列舉的類型的必要的熒光特性(Daltrozzo等，美國專利6,552,199，4月，22，2003)。
因此本發(fā)明涉及標(biāo)記組分，熒光探針，天然以及合成的治療藥物，抗原，半抗原，抗體，寡核苷酸，利用這種產(chǎn)物的雜交分析以及免疫測定以及這種產(chǎn)物的制造方法。根據(jù)本發(fā)明，提供了可檢測性標(biāo)記的標(biāo)記，組分，其包含結(jié)合于兩個(gè)或更多通常軸向的小的可溶性配體的熒光團(tuán)部分，所述軸向被定義為由中心金屬原子形式的八面體幾何形狀的復(fù)合物，所述中心金屬原子優(yōu)選減少或解決了溶劑敏感性以及非特異性結(jié)合的問題。
在分析中使用這種可檢測的標(biāo)記或標(biāo)記組分是有益的，因?yàn)檫@些標(biāo)記在諸如血清的生物材料存在以及缺少的條件下具有大體上相同強(qiáng)度的平行以及垂直的熒光發(fā)射組分。因此，利用這些標(biāo)記的測定法能夠檢測生物流體中或生物表面諸如組織樣品或培養(yǎng)細(xì)胞上低濃度的分析物，靶分析物或其類似物。術(shù)語“分析物”是指分析中的化合物或待測定的化合物，可以是天然存在受體或可以制備的任何一種化合物，為單或多表位的，抗原的或半抗原的單個(gè)或多種化合物，其至少共享通用的表位位點(diǎn)或受體。術(shù)語“靶分析物”是指分析中的化合物或待測定的化合物，可以是天然存在受體或者可以制備的任何一種化合物，為單或多表位的，抗原的或半抗原的，單個(gè)或多種化合物，其共享至少一個(gè)通用的表位或受體。靶分析物的“類似物”是指能與靶分析物競爭結(jié)合受體的化合物。術(shù)語“受體”是指能夠特異性識別或由靶分析物或其類似物識別的分子復(fù)合物。例如，抗體可以是抗原的受體。
這些標(biāo)記組分可以用作標(biāo)記分析物，抗原，抗體或者其它分子的標(biāo)記。這些標(biāo)記組分可以被任選地功能化以便包括使標(biāo)記組分與分析物，抗原，抗體或者其它分子連接的連接臂。適于這個(gè)目的的多種連接臂描述在Kricka，J.J.；Ligand Binder Assays，Labels and AnalyticalStrategies；1551頁；Marcel Dekker，Inc.，New York，NY(1985)。利用傳統(tǒng)方法將標(biāo)記組分連接于分析物，抗原，抗體或者其它分子。
在本發(fā)明的一個(gè)方面提供了可檢測性標(biāo)記的標(biāo)記組分，其包括(1)含有大體上呈平面分子結(jié)構(gòu)的發(fā)光結(jié)構(gòu)的熒光部分，優(yōu)選具有至少約550nm的激發(fā)波長以及(2)連接的兩個(gè)或更多小的溶解性軸向配體以及(3)具有足夠多的負(fù)凈電荷。優(yōu)選的熒光團(tuán)，小的溶解性軸向配體以及二者的鍵合的實(shí)例詳細(xì)描述于此。此外，提供了證明軸向配體以及凈電荷在減少溶劑敏感性以及非特異性結(jié)合的有效性方面的證據(jù)。
術(shù)語“溶劑敏感性”是指取決于所使用的溶劑系統(tǒng)分子熒光特性方面的改變，最顯著的是指與有機(jī)溶劑(諸如DMF)相比在水溶液中熒光特性的差異。許多在諸如DMF的有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出高熒光強(qiáng)度的熒光團(tuán)在在水溶液中顯示出顯著降低的熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度與樣品濃度以及激發(fā)輻射的強(qiáng)度有關(guān)。特定染料的熒光強(qiáng)度可以與其特征吸光度(消光系數(shù))以及熒光量子效率以及環(huán)境因素有關(guān)。這些標(biāo)記組分也顯示出加強(qiáng)的衰減時(shí)間，接近于其放射或者未淬滅的壽命。我們使用的術(shù)語“衰減時(shí)間”是指為了使受激分子的濃度從其起始濃度降低到l/e的值必須消耗的時(shí)間。有關(guān)壽命的術(shù)語的用法會有所改變，參見例如，Demos，J.N.，Excited State.Lifetime Measurements，Academic Press，紐約，N.Y..(1983)，10，35，44，158頁。
通過量測游離染料，即不是在完整熒光探針中的染料可以部分評價(jià)熒光團(tuán)(熒光部分)的性能。這種檢驗(yàn)中有意義的參數(shù)包括熒光強(qiáng)度和偏振/向異性，當(dāng)熒光團(tuán)暴露于諸如存在于血清中的不同離子強(qiáng)度的特異性離子或生物分子時(shí)這些參數(shù)通常改變。這些效果可以被認(rèn)為是“溶劑效應(yīng)”，并且可通過熒光團(tuán)的分子之間相互作用的改變從而改變聚集狀態(tài)牛生物分子在熒光團(tuán)分子之間以及溶劑組成的改變(非特異性結(jié)合，NSB)產(chǎn)生。
本發(fā)明染料結(jié)構(gòu)以及先前的使用酞菁(Pc’S)作為熒光探針的標(biāo)記的染料結(jié)構(gòu)之間的比較可以通過上述NSB的模型得以認(rèn)識，其中向血清中添加游離染料并測定了所產(chǎn)生的偏振或者向異性。如果發(fā)生非特異性結(jié)合就會產(chǎn)生偏振的增加，因?yàn)榻Y(jié)合后分子量的增加引起轉(zhuǎn)動布朗運(yùn)動速率的下降。
表1中，可以通過熒光強(qiáng)度(I)的改變，和/或水平穿過表進(jìn)行的偏振的改變(mp，毫偏振單位)判斷任一染料的性能。無論溶劑組成如何，“理想的”熒光標(biāo)記對這些參數(shù)的每一個(gè)具有相同的值。
正常人血清中與甘油中性能的比較可以提供有益的信息，因?yàn)樵谘宕嬖谙掠蒒SB將提供對可能的偏振變化損失的測定。對于所列舉的5種染料而言，甘油中和正常人血清中偏振之間的差異值分別為60.4，73.6，103，12，61和44.1。這些差異顯示Si作為中心原子顯著的有益效果并且還指出LJB-3為基團(tuán)的最佳選擇。甘油中的強(qiáng)度除以正常人血清中的強(qiáng)度的比值也是有象征性的。顯示在表中為1.46，1.27，1.51，2.91，4.82和0.42，再次顯示Si相比Al顯著的優(yōu)越性以及LJB-3(結(jié)構(gòu)顯示于圖1)非常優(yōu)秀的性能。
另外，LJB-3兼具羧基和磺酸酯基團(tuán)并且可以多種方式被“激活”，即轉(zhuǎn)化為在生理pH以及室溫下與待標(biāo)記的生物分子上的基團(tuán)(通常氨基)自發(fā)反應(yīng)從而共價(jià)連接的結(jié)構(gòu)。我們使用了兩種用于標(biāo)記抗體的活化試劑，即羰基二咪唑以及琥珀酰亞胺基四甲基脲四氟硼酸酯(STUT)。我們發(fā)現(xiàn)后者在容易處理以及結(jié)果的再現(xiàn)性方面都是優(yōu)選的。這可能是由于當(dāng)使用STUT時(shí)，中間體染料的UHS酯的較強(qiáng)的穩(wěn)定性。另外，用STUT激活的最佳溶劑是DMSO?？梢允褂肈MF但是可能會受不可避免的痕量胺的困擾。
試驗(yàn)結(jié)果對于給定應(yīng)用熒光團(tuán)的最明確的合格性試驗(yàn)是將染料摻入完整的探針并測試探針。以上對游離染料的血清試驗(yàn)可以作為有用的指導(dǎo)，但還不能完全代替對特異性探針的試驗(yàn)。
表2和3顯示了利用LJB-3標(biāo)記的抗-人IgG作為ANA(抗核抗體)的探針的說明性結(jié)果?？梢酝ㄟ^FIU(陽性/陰性)(或FIU[+/-])值，即來自陽性樣品的信號與來自陰性對照(正常的)的比值測定性能的質(zhì)量。7或更高的值是有用的；隨著技術(shù)的發(fā)展獲得了這些表中的數(shù)據(jù)；在常規(guī)應(yīng)用中可以預(yù)見將一致地產(chǎn)生較高的FIU(+/-)值。
表1.
通過測定取代的酞菁對溶劑組成改變的敏感性確定熒光強(qiáng)度(I)和偏振(mp)的改變

縮寫mp103(偏振)；TDx緩沖液用于熒光偏振分析的商用緩沖液；Pc酞菁；BBS硼酸鹽緩沖鹽水(0.25M NaCl，0.0232M硼酸和0.00179M四硼酸鈉。pH最終用1M NaOH調(diào)節(jié)至8.0+/-0.05。當(dāng)試驗(yàn)血清時(shí)，將25μl的全血清添加到1ml的BBS(含有已經(jīng)添加的25μl的染料)。注意不同熒光團(tuán)的相對濃度是未知的，因此只有當(dāng)在水平方向進(jìn)行時(shí)熒光強(qiáng)度的比較才是有意義的。在水溶液中操作LJB-3的BBS可以用硼酸鹽緩沖液KCl(BBKCl)代替，通過混合33.1ml的0.70M硼酸，4.0ml的0.50M K2B4O7，75ml的4.0M KCl和水制備1升pH ca.8.1。
熒光測定在瞬態(tài)偏光熒光計(jì)(FAST-1，Hyperion，Inc.Miami，F(xiàn)L)中進(jìn)行。
表2.LJB-3-標(biāo)記的山羊抗-人IgG與患者抗核血清抗體(ANA)的特異性結(jié)合。
A染料制備由羰基二咪唑激活的LJB-3(1)

(1)每一標(biāo)記中1mg的蛋白(Comassie Blue)。
(2)FIUANA檢驗(yàn)中觀察到的熒光強(qiáng)度的比率；反差測量樣品/陰性對照。
(3)兩種不同的抗體制備D和J。
B染料制備由STUT*激活的LJB-3

*琥珀酰亞胺基四甲基脲四氟硼酸酯詳細(xì)的背景和范圍這些標(biāo)記組分可用作用于摻入熒光探針的熒光標(biāo)記。術(shù)語“熒光探針”是指含有熒光團(tuán)部分的標(biāo)記組分，直接或者經(jīng)連接臂鍵合或者配位到分析中使用的分析物，抗原，半抗原，抗體或者其它分子，所述分析諸如為熒光免疫分析從而測定目的物質(zhì)的存在和/或量。這些標(biāo)記組分的一些可用作磷光標(biāo)記，本發(fā)明的組分也可用作用于體內(nèi)顯影的試劑的標(biāo)記以及用作體內(nèi)腫瘤治療中使用的試劑的標(biāo)記。
因?yàn)檫@些標(biāo)記組分尤其適用于利用生物流體樣品的分析，優(yōu)選使用的是具有近紅外區(qū)激發(fā)和/或發(fā)射波長的熒光團(tuán)，從而使來自其它樣品組分的周圍環(huán)境熒光的干擾最小化。當(dāng)使用的激發(fā)波長小于500nm時(shí)，諸如血清的一些樣品可以顯示出來自黃素，flavoproteiris，NADH等相當(dāng)大的干擾背景熒光。
對于某些應(yīng)用而言，諸如熒光偏振免疫測定，優(yōu)選的熒光團(tuán)當(dāng)為結(jié)合形式時(shí)也可以顯示出高水平的熒光偏振，優(yōu)選大于約10％的可見偏振理論最大值。術(shù)語“結(jié)合的”是指在分子及其特異性結(jié)合伴侶酯鍵已經(jīng)形成結(jié)合相互作用的條件。無疑，諸如熒光瞬態(tài)分析的應(yīng)用，優(yōu)選熒光團(tuán)的特征在于在約1毫微秒到約50毫微秒范圍內(nèi)測定的熒光衰減時(shí)間，優(yōu)選在約5到約20毫微秒的范圍內(nèi)。對于其它應(yīng)用，諸如磷光標(biāo)記，可以使用甚至具有更長衰減時(shí)間的熒光團(tuán)。
優(yōu)選的小可溶的軸向配體包括-OH，-O-叔-丁基(可用于存在有機(jī)溶劑時(shí))，-OCH2OH，-OCH2CH2OH，OCH2CHOHCH2OH，-OCH2CH2-OCH2CH2OH，-OCH2CH2-CH2-O-CH2-CH2CH2OH，-OPO3H2，-OB(OH)2，Cl，Br和F。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，熒光團(tuán)部分具有一個(gè)平面，多齒的大環(huán)配體配位于能夠與兩個(gè)小的可溶的軸向配體配位的中心原子。為用作熒光結(jié)合分析中的標(biāo)記組分，合適的中心原子為那些可配位兩個(gè)軸向配體且其沒有充分高的原子序數(shù)來通過躍遷為三重態(tài)引起廣泛熒光猝火。對于中心原子而言，優(yōu)選的成分包括硅，鍺以及錫，尤其優(yōu)選的是硅和鍺。
本發(fā)明的這些可檢測標(biāo)記或標(biāo)記組分在免疫測定中的應(yīng)用是有益的，因?yàn)檫@些標(biāo)記在存在和缺少生物液體諸如血清時(shí)具有大體上相同的平行和垂直組分的熒光發(fā)射強(qiáng)度。因此，利用這些標(biāo)記的測定方法能夠檢測生物液體中低濃度的靶分析物。
本發(fā)明的方法尤其適用于發(fā)明名稱為“熒光計(jì)檢測系統(tǒng)”的美國專利5,323,008中描述的改進(jìn)的熒光檢測系統(tǒng)。
在利用本發(fā)明的熒光標(biāo)記的競爭性抑制分析方法中，目的在于提供一種通過將含有靶分析物的待測樣品與已知量的添加的靶分析物或其類似物接觸來測定靶分析物存在量的方法，所述的靶分析物或其類似物連接于包括由熒光部分組成的可檢測標(biāo)記組分的熒光探針，其中熒光部分包括結(jié)合于兩個(gè)小的可溶的軸向配體的發(fā)光平面分子結(jié)構(gòu)，一個(gè)位于平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè)且具有足夠的負(fù)凈電荷，將混合物與能夠特異性識別目標(biāo)結(jié)構(gòu)的受體接觸并且測定結(jié)合于受體或者游離的熒光探針的量。未知樣品中分析物的量可由空白樣品以及含有已知量的靶分析物的讀數(shù)來推斷。
在另一方面，本發(fā)明提供了進(jìn)行“夾心”或“二-位點(diǎn)”免疫測定的方法，包括步驟(a)將含有靶分析物的待測樣品與能夠特異性識別目標(biāo)的受體接觸來形成靶分析物和第一受體的復(fù)合物，第一受體用具有熒光團(tuán)部分的熒光探針標(biāo)記，其中熒光團(tuán)部分具有一個(gè)與兩個(gè)小的可溶的軸向配體結(jié)合的發(fā)光的基本上呈平面的分子結(jié)構(gòu)，可溶的軸向配體中的一個(gè)位于平面分子結(jié)構(gòu)的任一側(cè)面上同時(shí)具有足夠高的負(fù)凈電荷；(b)將復(fù)合物與能夠特異性識別目標(biāo)-分析物或第一受體的第二受體接觸，第二受體結(jié)合于固體載體，來形成第一標(biāo)記受體，目標(biāo)-分析物和結(jié)合于固體載體的第二受體的復(fù)合物；和(c)測定標(biāo)記的與固體載體結(jié)合的第一受體的量或測定未反應(yīng)的標(biāo)記的第一受體的量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，分析可包括額外的步驟使在未知樣品中測定的標(biāo)記第一受體的量與在不含靶分析物的對照樣品中測定的標(biāo)記的第一受體的量相關(guān)聯(lián)，或與在含有已知的靶分析物的量的樣品中測定的標(biāo)記的第一受體的量相關(guān)聯(lián)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了可用于測定靶分析物的夾層式熒光免疫測定方法，其中可使用能夠被分析物獨(dú)立地識別而不互相干擾的兩種不同受體。各受體用不同的染料標(biāo)記。例如，一個(gè)受體是用分別具有最大680nm和690nm的吸收和發(fā)射的第一染料標(biāo)記的受體，且其它受體用分別具有最大695和705nm的吸收和發(fā)射的第二染料標(biāo)記?？衫梅€(wěn)態(tài)或瞬態(tài)測定來檢測和定量分析分析物。在兩種情況下，對于所給的實(shí)例而言，激發(fā)應(yīng)在680nm處并且檢測應(yīng)在705nm處。這種類型的分析基于能量轉(zhuǎn)移并且具有一致性的優(yōu)點(diǎn)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)記和探針最有益地用于通過譜近紅外區(qū)的瞬態(tài)，光偏振熒光監(jiān)控的均一混合和讀數(shù)分析中。這些組合形式產(chǎn)生了非常迅速的方法，其可以容易地大量進(jìn)行并且容易自動操作來產(chǎn)生讀數(shù)。這些分析具有固有的特征，因?yàn)橥ㄟ^近紅外波長(低偶發(fā)的熒光)和瞬態(tài)技術(shù)(避免瑞利和拉曼散射)提供的低背景干擾，使得這些分析具有精確性和準(zhǔn)確性。
本發(fā)明目的在于提供對生物液體的免疫測定，生物液體包括血清，血漿，全血，尿液和完整細(xì)胞，后者，例如，作為懸浮液或置于固體表面上用于熒光顯微術(shù)。在測定全血時(shí)，通常在通過賴氨酸試劑諸如硬脂酰-溶血卵磷脂，棕櫚酰溶血卵磷脂或十四酰溶血卵磷脂分析之前溶解紅血球是有益的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，靶分析物是藥物或藥物的代謝產(chǎn)物藥物可以是類固醇，激素，抗生素，免疫抑制劑，止喘藥，抗腫瘤藥，抗心律失常藥，抗驚厥藥，治風(fēng)濕藥，抗抑郁藥或強(qiáng)心苷。這些藥物的實(shí)例包括地高辛，毛地黃毒苷，茶堿，苯巴比妥，甲狀腺素，N-acetulprocainamide，麥蘇林，氨丁卡霉素，慶大霉素，netilmicin，托普霉素，酰胺咪嗪，乙琥胺，丙戊酸，達(dá)舒平，利多卡因，普魯卡因酰胺，奎尼丁，氨甲喋呤，阿米替林，mortriptyline，丙咪嗪，去郁敏，萬古霉素和環(huán)孢素。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶分析物是肽生物分子或其片段。這些肽生物分子包括，例如，肽類激素諸如促黃體生成激素，促卵泡激素，人絨毛膜促性腺激素，促甲狀腺激素，血管緊張素I，血管緊張素II，催乳激素胰島素，腫瘤標(biāo)記物諸如癌胚抗原或病毒諸如風(fēng)疹病毒。
本發(fā)明的方法提供了測定由約10-5M到約10-13M濃度的靶分析物的方式，并且尤其在約10-9M到約10-12M的濃度范圍內(nèi)。這些測定對樣品或受體制劑中的偶發(fā)熒光的量以及對熒光發(fā)射的強(qiáng)度是非常敏感的。通常，可以肯定地說，將波長移成近紅外以及利用瞬態(tài)檢測是有益的，但是各種樣品存在雜質(zhì)的差異要求在分析過程中優(yōu)化每一種的分析。
本發(fā)明的主要目的是提供具有大大加強(qiáng)的可靠性以及便利性的改進(jìn)的基于熒光的分析。本發(fā)明的另一目的是提供快速以及精確測定的方法，常常在幾分鐘內(nèi)解決問題。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能夠測定非常低濃度的熒光標(biāo)記或標(biāo)志的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供因?yàn)榭焖俸蜏?zhǔn)確，相對低成本以及能夠使用未修飾的生物樣品諸如全血所以可用于臨床的方法。這些目的通過如下手段得以實(shí)現(xiàn)1)優(yōu)化熒光標(biāo)志的光學(xué)特性，2)檢測系統(tǒng)的高靈敏性以及穩(wěn)定性，3)使用除去瑞利以及拉曼散射的瞬態(tài)檢測，4)使分析均一消除分離以及提供簡單的混合物以及讀出過程以及5)使設(shè)備以及樣品大小小型化。
本發(fā)明還提供了通過將熒光團(tuán)部分與活性形式的可溶的軸向配體反應(yīng)合成標(biāo)志組分的方法。本發(fā)明還表征了具有本發(fā)明的標(biāo)志組分的熒光探針，所述標(biāo)志組分與特異性結(jié)合對或類似物的靶分析物的一個(gè)成員相連。術(shù)語“特異性結(jié)合對”是指兩個(gè)不同的分子(或成分)，其中一個(gè)分子具有表面上或腔中的區(qū)域，其特異性識別以及結(jié)合于其它分子(或包括其它分子的分子復(fù)合物)的特定的空間以及極性構(gòu)成。
本發(fā)明的熒光染料可應(yīng)用于DNA技術(shù)的若干領(lǐng)域以及研究。大體上，這些應(yīng)用是那些其中必須標(biāo)記單鏈DNA以便能夠在加工或檢驗(yàn)中示蹤以及觀察的應(yīng)用。例如，在DNA序列測定的雙脫氧測序法中，引物分子(互補(bǔ)于模板的3’末端的短的部分的短序列DNA)被末端標(biāo)記(在所述引物的5’末端上)。具有4個(gè)核苷酸三磷酸的DNA聚合酶用于向模板的5’端延伸引物序列的3’端產(chǎn)生互補(bǔ)于模板的新鏈。反應(yīng)進(jìn)行很遠(yuǎn)之前，將反應(yīng)混合物分成4個(gè)相等的部分，每一部分分別用4(A，T，G或C)種二脫氧核苷酸三磷酸處理隨機(jī)終止鏈延伸以及由此產(chǎn)生新的不同長度序列的混合物，所述不同長度的序列終止于在所使用的二脫氧核苷酸三磷酸的相同的堿基(A，T，G或C)。通過根據(jù)鏈長進(jìn)行分離的PAGE電泳分離新的不同長度的鏈的混合物，所述PAGE電泳可以通過Southern印跡進(jìn)行觀察，在Southern印跡中通過“印跡”將條帶譜轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上用于觀察。
在其它使用Southern印跡的情況中，通常通過高pH對DNA進(jìn)行變性因此是單鏈的。在任一這些情況，與攜帶本發(fā)明的熒光標(biāo)記的互補(bǔ)探針雜交提供了從Southern印跡觀察DNA的高靈敏性以及特異性的方式。DNA指紋分析是另一個(gè)預(yù)計(jì)越來越重要的領(lǐng)域。在一個(gè)指紋方法中，測試探針(標(biāo)記的單鏈序列)與來自待鑒定樣品的限制酶降解的DNA的Southern印跡中的單鏈材料雜交。在所應(yīng)用的這些方法中，熒光標(biāo)記提供了與目測結(jié)合的高靈敏性。
本發(fā)明熒光染料的獨(dú)特特性可產(chǎn)生完全新型的對微量DNA的分析。這些分析將利用具有數(shù)字讀數(shù)的瞬態(tài)熒光偏振(TSFP)。這些分析的突出的優(yōu)點(diǎn)是它們可以簡單的混合和通過微升等級的讀數(shù)分析來進(jìn)行而不需必須分離。用于檢測和識別DNA的標(biāo)準(zhǔn)分析如下1.收集可能含有待測DNA的樣品。
2.通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增樣品。
3.將用本發(fā)明的熒光染料標(biāo)記的單鏈DNA添加到擴(kuò)增混合物中并隨時(shí)間進(jìn)行TSPF(也許幾分鐘)。如果互補(bǔ)于標(biāo)記DNA探針的DNA存在于試驗(yàn)樣品中，則將發(fā)生雜交并且偏振將隨時(shí)間而增加。
本發(fā)明的目的也在于提供新的染料-寡核苷酸結(jié)合物以及它們的合成和使用方法。使用這些結(jié)合物或探針的方法可能涉及核酸雜交，核酸擴(kuò)增以及核酸測序的方法。染料-寡核苷酸共軛物的染料部分是本發(fā)明的熒光標(biāo)記。這些標(biāo)記可能具有各種與DNA或RNA結(jié)合的功能性基團(tuán)。這些功能性基團(tuán)包括羧基，氨基和N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS酯)。
“寡核苷酸”是指相對短鏈的核苷酸殘基。典型地，本發(fā)明使用的寡核苷酸具有5到50個(gè)核苷酸的長度。用于本發(fā)明方法寡核苷酸探針包括DNA，RNA或任意其他種類可與核酸序列雜交的序列的多核苷酸?？梢岳斫膺@樣的核酸序列可包括堿基類似物以及自然存在的堿基胞嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶。這樣的堿基類似物包括次黃嘌呤，2.6-，二氨基嘌呤和8-azguanine。探針可以是雙鏈的或單鏈的形式，但優(yōu)選為單鏈形式。它們可通過直接合成，聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)或通過克隆或任意其他方便的方法來制備?！斑B接的”是指通過與兩個(gè)部分連接的中間分子進(jìn)行的化學(xué)結(jié)合。
可利用縮合反應(yīng)導(dǎo)致例如形成酰胺，酯，腙，縮氨基脲，縮氨基硫脲，尿素和硫脲鍵來實(shí)現(xiàn)將寡核苷酸或多核苷酸與標(biāo)記相連接。例如，接頭可以氨基，優(yōu)選初級氨基終止。其他的接頭可以羧基終止。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備特定的染料-共軛的寡核苷酸的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的方法包括步驟(a)將具有以氨基終止的結(jié)合接頭的寡核苷酸與可檢測標(biāo)記的標(biāo)記組分的N-羥基琥珀酰亞胺酯或咪唑化物(imidazolide)反應(yīng)，其中標(biāo)記組分包括一個(gè)含有與兩個(gè)小的可溶的軸向配體結(jié)合實(shí)質(zhì)上發(fā)射熒光的平面分子結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)部分，一個(gè)位于平面分子結(jié)構(gòu)的各側(cè)面并具有足夠的額外的負(fù)電荷以降低兩者的聚集和非特異性結(jié)合，來形成共軛物；以及由未反應(yīng)的寡核苷酸或多核苷酸以及由未反應(yīng)的染料分離步驟(a)中形成的共軛物。可利用二胺或氨基醇來完成接頭與寡核苷酸的連接。優(yōu)選地，可檢測的標(biāo)記組分包括隔離的(caged)二羧基硅酞菁染料。
或者，可通過下述反應(yīng)；來制備染料-共軛物寡核苷酸在羥基苯并三唑和寡核苷酸或多核苷酸存在下，將標(biāo)記組分與碳二亞胺反應(yīng)來形成共軛物以及由反應(yīng)混合物的其他組分分離產(chǎn)生的共軛物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測樣品中靶核酸序列的方法，該方法包括步驟將樣品核酸與具有用本發(fā)明的熒光標(biāo)記標(biāo)記的寡核苷酸接觸，所述的寡核苷酸能夠與所述的靶核酸序列在均質(zhì)溶液中雜交，以及通過瞬態(tài)(或穩(wěn)態(tài))偏振熒光檢測此種雜交的存在或量。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測或定量測定靶核酸的方法，其中靶核酸是核酸擴(kuò)增的產(chǎn)物。核酸擴(kuò)增方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)，自主序列復(fù)制(3SR)以及基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)。
當(dāng)與時(shí)間-相關(guān)的瞬態(tài)檢測系統(tǒng)一起使用時(shí)，本發(fā)明的方法是尤其有用的，如Studholme等，發(fā)明名稱為“熒光檢測系統(tǒng)”的美國專利5,323,008所描述的，該系統(tǒng)的特征在于瞬態(tài)檢測實(shí)現(xiàn)了直接閱讀樣品的時(shí)間依賴的偏振作用。該系統(tǒng)利用了可以非常高的頻率例如兆赫調(diào)節(jié)的激光二極管，并且顯示出高的輸出功率。典型地，激光“接通”時(shí)間大約是2-3納秒。使用以單光子計(jì)數(shù)模式運(yùn)行的光電倍增管檢測溶液的光子。與激光脈沖時(shí)間比較，測定了光子現(xiàn)象以及光子現(xiàn)象的相對時(shí)間。通過存儲個(gè)體的光子現(xiàn)象次數(shù)，產(chǎn)生作為時(shí)間函數(shù)的光子的頻率的柱狀圖。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于監(jiān)控核酸擴(kuò)增過程的動力學(xué)，和/或定量測定目標(biāo)樣品中核酸的方法。例如，在PCR擴(kuò)增過程中，由已被加帽并用本發(fā)明的熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸組成的探針可直接添加到PCR反應(yīng)中?！凹用薄笔侵?′末端已與二脫氧核苷酸三磷酸反應(yīng)。因此熒光隨時(shí)間變化的瞬態(tài)檢測可用于跟蹤反應(yīng)的發(fā)展。
在每個(gè)冷卻階段，可動態(tài)跟蹤與擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交。因?yàn)閿U(kuò)增產(chǎn)物的濃度增加，探針與擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合率也增加以及定量測定擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度。循環(huán)數(shù)相關(guān)的信息定量顯示了擴(kuò)增前樣品中原先存在的DNA的量。
發(fā)明的另一個(gè)方面是對熒光計(jì)的任何構(gòu)思、變化或修改的寬泛的應(yīng)用范圍。在下文中的特定類型裝置的實(shí)例中對適用性的范圍進(jìn)行了較好的說明。在非吸收性介質(zhì)中，光波穿越由較低折射率的第二介質(zhì)B包圍的介質(zhì)A時(shí)，如果入射角大于臨界角則光波在介質(zhì)A的邊緣全部內(nèi)反射。然而，全反射光的穿透邊緣短的距離并且在那里可以產(chǎn)生物理作用諸如激發(fā)位于鄰近A與B之間接觸面的熒光分子。
這些作用能夠同質(zhì)，基于熒光的分析其中特異性反應(yīng)發(fā)生在固定于介質(zhì)A表面上的分子上且因此可發(fā)生在激發(fā)熒光唯一位置的接觸面處。普通玻璃或塑料板充當(dāng)入射光的光波導(dǎo)管并且作為特異性受體的載體預(yù)先放置在表面上的已知位置處。此方法已被命名為“瞬逝光熒光免疫分析”(Herron等美國專利5,512,492)。
有益地，本發(fā)明包括利用基于含有N的大環(huán)(下面所列舉的類型)的熒光染料的非常大的Strokes位移的特征，其中大環(huán)通常具有近UV激發(fā)區(qū)域以及在光譜的近紅外區(qū)發(fā)射。這些染料適用于穩(wěn)態(tài)或瞬態(tài)方式的免疫/受體分析。激發(fā)源包括水銀弧光，氮激光器和氮激光器泵激的染料激光器?；蛘撸@些相同的染料可在近紅外用二極管激光器激發(fā)來實(shí)現(xiàn)用脈沖式激發(fā)和瞬態(tài)檢測得到的優(yōu)異結(jié)果。放射源的選擇取決于對于所討論的特定染料而言的吸收譜帶的位置，優(yōu)選的激發(fā)和檢測方式，是否穩(wěn)態(tài)或瞬態(tài)以及是否依賴于空間需要。
這些在化學(xué)作用中的特征的內(nèi)含以及為“瞬態(tài)光熒光免疫分析″而設(shè)計(jì)的裝置應(yīng)具有非常低的背景以及高的信號水平且因此有助于-高含量敏感性。
本發(fā)明上面描述的概述是非限制性的，且本發(fā)明的其他和優(yōu)點(diǎn)可從下面的優(yōu)選方案以及權(quán)利要求的描述中很容易看出。
優(yōu)選標(biāo)記組分的吸光度和偏振特性這些包括中心原子(例如，硅)與兩個(gè)小的可溶的軸向配體結(jié)合的標(biāo)記組分可通過測定瞬態(tài)熒光來表征。在這些測定中，在約3倍標(biāo)記組分衰減時(shí)間的時(shí)間內(nèi)，監(jiān)控極化的或者平行或垂直于激發(fā)脈沖的極化方向的兩個(gè)組分的強(qiáng)度。這些曲線反映消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，衰減時(shí)間以及偏振態(tài)并且提供關(guān)于標(biāo)記組分的化學(xué)和物理狀態(tài)的敏感性指示。例如，如果激發(fā)態(tài)被減活或轉(zhuǎn)變?yōu)槿貞B(tài)，則總體強(qiáng)度降低了并且衰減時(shí)間縮短了。如果分子的轉(zhuǎn)動布朗運(yùn)動被通過增加粘度或者通過結(jié)合于大分子而改變，則平行于垂直部分的強(qiáng)度的比率增加了。
本發(fā)明的某些標(biāo)記組分顯示，在約5％的實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)，在DMF(有機(jī)溶劑)中與在SAP(鹽疊氮化物磷酸酯，水化的中性緩沖液)中具有相同的強(qiáng)度，衰減時(shí)間和偏振。在某種程度，與其它的標(biāo)記組分制劑共用這些特性。本發(fā)明標(biāo)記組分的與眾不同的和重要的特性是對血清中組分的敏感性(以及缺少結(jié)合于)，其通過缺少任意顯著的血清對熒光的極化組分的強(qiáng)度，衰減時(shí)間或相對值的測定作用而被證明。這些特性對于用于利用生物材料的應(yīng)用諸如分析的標(biāo)記組分是至關(guān)重要的。
優(yōu)選標(biāo)記組分的制備根據(jù)本發(fā)明的制備優(yōu)選標(biāo)記組分的一種方法，按照常規(guī)的反應(yīng)方案在配體交換反應(yīng)中將具有羥基-或鹵化物基團(tuán)的適當(dāng)?shù)臒晒鈭F(tuán)部分作為軸向配體與增溶部分的活性形式反應(yīng)Mcl--CA-(X)2+2(SM) Mcl-CA-(SM)2+2X其中Mcl表示大環(huán)配體，CA為中心原子，X為取代的配體以及SM為增溶部分。如需要，這些反應(yīng)可在溶劑中進(jìn)行。適當(dāng)?shù)娜軇┌ㄠ?，THF，DMF，咪唑(當(dāng)溶于其他所列舉的溶劑之一中時(shí))等等。適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度可取決于大環(huán)原材料以及增溶基的特性來變化。反應(yīng)通常在大約2分鐘到大約24小時(shí)內(nèi)完成。反應(yīng)混合物可以方便地通過回流通過例如沙浴的方式來加熱。為方便起見，反應(yīng)可以在環(huán)境壓力下進(jìn)行。確信此反應(yīng)分兩步驟進(jìn)行，每次用一個(gè)聚氧烴基配位作為軸向配體。
當(dāng)在熒光免疫測定中用作熒光時(shí)，這些標(biāo)記組分可連接于特異性結(jié)合對(“標(biāo)記的結(jié)合對”)的一個(gè)成員或此成員的類似物。術(shù)語“結(jié)合對”是指能夠或特異性識別或被特異性分子或分子復(fù)合物識別的分子或分子復(fù)合物。標(biāo)記組分可直接地結(jié)合或連接或通過連接臂結(jié)合或連接。
實(shí)用性本發(fā)明的標(biāo)記組分可用作熒光標(biāo)記用于熒光探針和用于熒光結(jié)合分析以及用作活體內(nèi)顯影和活體內(nèi)腫瘤治療的標(biāo)記。
這些標(biāo)記組分可有利地用作傳統(tǒng)熒光結(jié)合分析中的熒光標(biāo)記，包括熒光偏振免疫測定分析。當(dāng)如此使用時(shí)，這些標(biāo)記組分可連接于特異性結(jié)合對(“標(biāo)記的結(jié)合對”)的一個(gè)成員或此成員的類似物。標(biāo)記組分可直接地結(jié)合或連接或通過連接臂結(jié)合或連接。
這些標(biāo)記結(jié)合對用于各種形式的分析，例如涉及分析物或分析物結(jié)合對競爭的分析(如果使用了標(biāo)記分析物或分析物-類似物)并且可用于同源或異源分析。
考慮到它們在水溶液中有益的避免了聚集和缺少溶劑敏感性(表明不可檢測的聚集)以及缺少與血清組分及其它生物學(xué)大分子非特異性的結(jié)合，這些標(biāo)記尤其適用于分析檢測含有生物液體諸如血清的樣品中的分析物。因此，這些標(biāo)記組分可用作檢測溶液中分析物的熒光探針的標(biāo)記，其中溶液中血清組分的非特異性結(jié)合會嚴(yán)重地影響分析的敏感性，影響其準(zhǔn)確性和精確性。
或者，這些標(biāo)記組分可用作活體內(nèi)顯影的試劑。當(dāng)用作顯影劑時(shí)，將這些標(biāo)記組分連接到標(biāo)記結(jié)合部分的特異性結(jié)合對的一個(gè)成員上。標(biāo)記結(jié)合對被導(dǎo)入到動物中。如果存在特異性結(jié)合對的其他成員，標(biāo)記結(jié)合部分會與其結(jié)合并且可測定和定位識別通過標(biāo)記組分產(chǎn)生的信號。
這些標(biāo)記組分可同時(shí)用于活體內(nèi)腫瘤治療。例如，光動力學(xué)治療包括使用標(biāo)記組分作為光敏感性藥物。將標(biāo)記組分(熒光標(biāo)記)連接到可特異性識別的結(jié)合部分并結(jié)合于腫瘤細(xì)胞的組分。
本發(fā)明提供了核酸探針以及制備與使用該探針的方法。新核酸探針的使用方法包括現(xiàn)在已知的或隨后發(fā)展的不同核酸雜交序列技術(shù)，以及已知的或隨后發(fā)展的各種核酸擴(kuò)增技術(shù)。本發(fā)明的探針(在這里也稱為結(jié)合物)和方法使得在同源雜交分析中實(shí)現(xiàn)了1fmole的靈敏度；這個(gè)靈敏度相當(dāng)于通過電流同源雜交測定技術(shù)獲得的靈敏度。如上所述，然而，目前的異源分析具有一些缺點(diǎn)，其是由分析中涉及的許多步驟導(dǎo)致的，包括增加的污染危險(xiǎn)和實(shí)施分析要求增加的次數(shù)。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，通過參見在這里提供的實(shí)施例很容易理解本發(fā)明組合物和方法的其他優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例為有助于本發(fā)明，下列實(shí)施例包括了描述一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果的實(shí)施例。下列關(guān)于本發(fā)明的實(shí)施例不應(yīng)被理解為是對本發(fā)明的特異性限制，本發(fā)明現(xiàn)在已知的或隨后發(fā)展的在本領(lǐng)域技術(shù)人員理解范圍內(nèi)的變化應(yīng)被理解為落在本發(fā)明在這里描述的以及在后面的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1由1，2，4，5-四氰基苯(TCNB)合成四二亞氨基均苯四甲酸(tetradiiminopyromellitic)酸二酰亞胺。
將3-頸，11細(xì)頸瓶中的TCNB，20.0g(0.112摩爾)在真空中干燥約1hr。長頸瓶配置緩慢的高轉(zhuǎn)矩，聚四氟乙烯葉片攪拌器，用于在氨水中起泡或添加液體的進(jìn)口，以及一個(gè)水冷式冷凝器。用氮?dú)鉀_洗整個(gè)裝置后，添加400ml的甲醇，在室溫開始攪拌并且慢慢地使氨水起泡。
氨水吸收是非常有效的并且?guī)追昼姾髴腋∫鹤兂沙吻宓臏\綠色溶液。幾分鐘后(伴隨恒定添加氨水)溶液變的渾濁且溫度微微升高。由開始添加氨水40分鐘后，反應(yīng)混合物變得難以攪動并在攪拌下添加200ml的甲醇并且繼續(xù)添加氨水。此時(shí)通過懸浮液的表面缺少氣泡浮起可表明氨水吸收仍然非常的有效。100分鐘后必須添加另外175ml的甲醇來進(jìn)行攪拌。125min后，大量氨水開始從冷凝器溢出，并在持續(xù)攪拌和加熱下將反應(yīng)混合物置于45℃的水浴中并添加氨水另外240分鐘。冷卻后，將反應(yīng)混合物在4℃儲存24小時(shí)。然后通過Whatman #_42紙吸收過濾并真空干燥。產(chǎn)率23.2g(0.109moles)。
實(shí)施例2雙-氯代(2；3二羧基酞菁)硅(IV)的合成將二亞氨基異二氫吲哚(30.0g；0.207摩爾)和四二亞氨基均苯四甲酸二酰亞胺(10.5g；0.050摩爾)一起研磨并在1升的3頸長頸瓶中真空干燥。長頸瓶裝有聚四氟乙烯葉片混合器，隔膜，溫度計(jì)和具有硅膠干燥管的回流冷凝器。用干燥氮?dú)鉀_洗裝有攪拌反應(yīng)物的裝置，并且在氮?dú)庵刑砑?00ml喹啉并在氮?dú)饬髦谢旌?0分鐘。獲得了均一的液體懸浮液。其后，在5分鐘時(shí)間內(nèi)通過隔膜慢慢添加60ml的四氯化硅。溶液顏色變深并在不加熱情況下繼續(xù)攪拌15分鐘。
然后，連續(xù)地?cái)嚢?，將預(yù)熱到195℃的油浴增加到使長頸瓶沉浸到其容量以上的水平的位置。5分鐘后，油浴溫度降低到175攝氏度并且在15分鐘后穩(wěn)定在185-190攝氏度并維持另外60分鐘。油浴然后下降并且使反應(yīng)混合物冷卻大約15分鐘。然后通過氮?dú)饬鞒ネㄟ^濕潤的pH試紙?jiān)诶淠鞒隹跈z測到的未反應(yīng)的四氯化硅。通風(fēng)大約45分鐘后，將現(xiàn)在為100℃的浴器繼續(xù)慢慢加熱到大約130℃以促進(jìn)四氯化硅的去除，當(dāng)僅僅喹啉煙明顯時(shí)，在額外70分鐘后進(jìn)行上述測定時(shí)顯示四氯化硅被完全除去。
然后除去油浴并且當(dāng)反應(yīng)混合物冷卻到大約80℃時(shí)在攪拌下添加424ml水和424ml濃鹽酸的混合物。熱被放出且最終的混合物是酸性的。將反應(yīng)產(chǎn)物在室溫下放置過夜。第二天攪拌下添加另外的424水和424ml濃鹽酸，并且將混合物在室溫下澄清過夜。
然后通過Buchner漏斗(24cm紙)過濾反應(yīng)混合物，用水沖洗并且在遮光板中空氣干燥隔夜。將濕潤的過濾濾餅在一升的丙酮中攪拌并過濾。將沖洗物質(zhì)在遮光板中干燥2天時(shí)間。在巖缽中用丙酮研磨干燥物質(zhì)(50g)并且攪拌混合物，過濾和真空干燥后留下47.9g的黑色精細(xì)分離的固體。
實(shí)施例3雙-氯代(2；3-二羧基酞菁)硅(IV)，(二羧基二氯代染料)的水解。
利用長莖漏斗將濃硫酸(98ml)置入250ml的圓底燒瓶中以避免潤濕長頸瓶的頸部。磁力攪拌下通過較短莖的漏斗添加16.3g的二羧基二氯代染料。添加延續(xù)大約一小時(shí)時(shí)間來在添加固體前實(shí)現(xiàn)分散染料的塊。將干燥管連接于長頸瓶且在油浴中加熱混合物并在50℃維持24小時(shí)。
從油浴中移開反應(yīng)燒瓶并在冰中冷卻。小心地添加小部分的水(75ml)并且不冷卻，在80℃油浴中攪拌加熱混合物20小時(shí)。冷卻后，將混合物傾入一升燒杯中的冰中并攪拌。
在室溫下2000×g離心混合物30分鐘。將沉淀物懸浮在水(大約250ml)中并再次離心。再次重復(fù)沖洗，收集沉淀物并懸浮在300ml 1MK2CO3中。在覆蓋表玻璃的燒杯中攪拌加熱混合物。在10分鐘內(nèi)，溫度達(dá)到90℃并且繼續(xù)在大約93℃繼續(xù)加熱50分鐘。用濃HCl酸化仍然很熱的混合物并允許冷卻以及在室溫下放置2天。
然后通過11cm帶有Whatman#_42紙的Buchner漏斗收集固體，過濾花費(fèi)大約1小時(shí)。通過用3×100ml的水沖洗漏斗上的固體并且在遮光板中空氣干燥。然后打碎固體并且在真空中通過P2O5和KOH干燥。產(chǎn)量13.3g(87％)。
實(shí)施例4通過硅土吸附色譜法純化雙-羥基(2，3二羧基酞菁)硅IV(二羧基染料)。
將實(shí)施例3制備的粗二羧基染料，3.0g置于250ml瓶中，向其中添加100ml包含2％(v/v)乙基二異丙基胺(DIEA)的甲醇并且攪拌混合物30分鐘。此后添加43g硅土(EM Science)并且手工振蕩混合物來形成黑色漿糊。20分鐘后，添加具有2％DIEA的100ml MeOH，將瓶子反轉(zhuǎn)幾次并且攪拌內(nèi)容物20分鐘。通過添加EtOH和MeOH與DIEA調(diào)節(jié)溶劑特性改變了所提取的染料的成分并實(shí)現(xiàn)了單一組分的提取。然后通過燒結(jié)玻璃漏斗(微孔性，6.5cm直徑)在減壓下過濾固體。為防止MeOH的巨大損失，通過連接到部分排氣的柜中保持減壓。過夜過濾后，用2×50ml的MeOH+DIEA沖洗殘余物大約30hr。將濾液(230ml)置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至接近干燥。將殘余物溶于14ml MeOH+DIEA，將溶液均分并置入兩個(gè)40ml的尖底離心管中。
用200ul濃縮的HCl酸化各管中的內(nèi)容物，并添加水至幾乎裝滿管。通過反轉(zhuǎn)混合內(nèi)容物并搖動數(shù)次，以及約650×g離心30分鐘。丟棄褐色清液層并且用0.01M HCl沖洗沉淀物三次。將沉淀物轉(zhuǎn)入100圓底燒瓶并通過循環(huán)蒸發(fā)干燥，然后通過H2SO4和KOH在真空中干燥。干重是304mg(純凈的二羧基染料)。
實(shí)施例5通過氯磺酸磺化純化的二羧基染料。
稱取161mg的純凈二羧基染料(實(shí)施例4)置入50ml具有磁力混合器的長頸燒瓶中。室溫在N2下添加3.4ml的ClSO3H。連接具有N2氣瓶的小空氣冷凝器并且在110℃油浴中加熱長頸瓶和內(nèi)容物大約3.7小時(shí)，在該時(shí)間點(diǎn)取出μl樣品用于分析。然后繼續(xù)在110℃加熱另外3.3小時(shí)，停止加熱并取出第二個(gè)樣品。向兩個(gè)樣品中添加冰并且分別用390mg的水稀釋。然后向各樣品中添加2ml 1M的NaHCO3并且通過測定用2ml的中性緩沖液烯釋10μl的烯釋樣品來測定各樣品的吸光度。兩樣品的Amax為690nm，3.7小時(shí)樣品的讀數(shù)為0.650以及7小時(shí)樣品的讀數(shù)為0.490顯示在最后3.3小時(shí)加熱時(shí)間內(nèi)有大約25％的染料被破壞。或者，可通過在ClSO3H中70℃加熱純化的二羧基染料36小時(shí)進(jìn)行磺化。
以小部分向燒杯中的冰上添加主要的反應(yīng)混合物；并以約700×g離心冷混合物30分鐘。丟棄非常微弱顏色的上層液體。將沉淀物懸浮在30ml的冰水中，與水一起轉(zhuǎn)入到250nm錐形瓶中，用大約40ml的1M KHCO3使其堿性化并在室溫下攪拌過夜。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)入燒杯中，用濃縮的HCl酸化并且在室溫下攪拌6小時(shí)以及在室溫下儲存48小時(shí)。
以約700×g離心混合物；保留有色的上清液并將沉淀物溶于1MNaHCO3中以及攪拌2小時(shí)。將暗綠色溶液通過Sep Pak(2g大小，Rainin25)并將酸化后的濾液與離心獲得的上清液合并。總體積約為400ml。深藍(lán)色酸性溶液吸附在Sep Pak上，通過3N HCl沖洗柱并用MeOH洗脫。用MeOH和3N HCl沖洗后的Sep Pak可以反復(fù)使用。通過循環(huán)蒸發(fā)和通過H2SO4和KOH在真空中干燥含有染料的MeOH洗脫物。產(chǎn)量158mg。通過硅土色譜法純化這些物質(zhì)產(chǎn)生La Jolla Blue-3(LJB-3)。
結(jié)果顯示于表1和2中，且表明了通過熒光強(qiáng)度和偏振尺寸來評價(jià)的三種染料的非特異性結(jié)合和溶劑敏感性，關(guān)于強(qiáng)度，特性要求為溶劑組分與高熒光產(chǎn)量無關(guān)。另一方面，偏振理想地應(yīng)在低粘度的介質(zhì)中保持低并且在粘性溶劑例如甘油中是盡可能的高。
表1表明酞菁三磺酸鋁的熒光強(qiáng)度是極其溶劑-敏感性的。不可比較地，二羥二羧基硅酞菁磺酸酯顯示出與在緩沖液，緩沖液加血清或單獨(dú)甘油中的熒光產(chǎn)量幾乎相同的顯著提高的特性。通過和二羥-二羧基-硅-酞菁(沒有磺化基團(tuán))比較這些提高可被注意到應(yīng)取決于磺化，其中二羥-二羧基-硅-酞菁本身與鋁化合物相比對血清和溶劑具有較小的敏感性。
表2更強(qiáng)烈地表明僅僅存在中心硅原子導(dǎo)致當(dāng)與鋁作為中心原子比較時(shí)對環(huán)境的敏感性降低了。這些差異很可能由于硅具有兩個(gè)軸向配體并可以因此“保護(hù)”染料的平面結(jié)構(gòu)不受溶劑效應(yīng)的影響，因?yàn)椤氨Ｗo(hù)基團(tuán)”存在于分子平面的各側(cè)面上。鋁僅僅存在一個(gè)軸向配體且因此分子平面的一側(cè)易受溶劑效應(yīng)的影響。在圖2中，由這些相互作用的結(jié)果可清楚地看出鋁染料的偏振有非常大的增加，幾乎增加到通過將染料置于甘油中可得到的最大值(其表明如果自轉(zhuǎn)幾乎終止則對偏振有相應(yīng)的限制)。
結(jié)論上述關(guān)于本發(fā)明的示例性應(yīng)用不應(yīng)被為對本發(fā)明范圍的限制?，F(xiàn)在已知的或以后發(fā)展的落入本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的范圍中的本發(fā)明的這些變化，應(yīng)被理解為落在下文中權(quán)利要求的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
說明書中提及的所有專利和出版物是本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平的表現(xiàn)。所有的專利和出版物在這里引入作為參考，其與各個(gè)體出版物被特異性和分別地引入作為參考是相同的。
本發(fā)明在這里說明性地適當(dāng)?shù)拿枋隹稍谌狈θ我庠蛞恍┰那闆r下來實(shí)施，局限性沒有在這里特異性地公開。因此，例如，在這里的各實(shí)例中任意術(shù)語“含有”，“基本上包含”和“包含”可被任何其它兩個(gè)術(shù)語替換。已使用的術(shù)語與措辭用作說明性的術(shù)語但并非限制，且并非意欲在使用這些術(shù)語與措辭時(shí)排除所顯示的和描述的特征或其部分的任意等價(jià)物，但是應(yīng)能理解各種修飾落在本發(fā)明權(quán)利要求所述的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)能理解盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選的實(shí)施方案和任選的特征特定地公開，在這里公開的概念的修飾和變化可被本領(lǐng)域技術(shù)人員利用，且這些修飾和變化被認(rèn)為落在所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.具有中心金屬原子的大環(huán)熒光配體，所述原子具有兩個(gè)軸向配體在大環(huán)的每一側(cè)各有一個(gè)，所述軸向配體獨(dú)立地選自烷氧基，鹵化物，羥基，硼酸酯，硫酸酯或磷酸酯，所述大環(huán)具有一或多個(gè)苯并基團(tuán)并且作為苯環(huán)上的環(huán)取代基的兩個(gè)鄰羧基或者一個(gè)羧基連同一個(gè)其它的不是羧基但是在pH 5或以上的水溶液中帶負(fù)電荷的基團(tuán)，以及作為在大環(huán)的任意其它可能位置的其它的環(huán)取代基的一或多個(gè)不是羧基但是在pH 5或以上的水溶液中帶負(fù)電荷的基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的大環(huán)熒光配體，其中大環(huán)是酞菁，中心金屬原子是Si或Ge，軸向配體是羥基，環(huán)取代基是兩個(gè)在一個(gè)環(huán)上的鄰-羧基，以及在其它環(huán)中之一上的一個(gè)磺基。
3.標(biāo)記組分，含有結(jié)合于兩個(gè)增溶基的發(fā)光的、大體上呈平面的部分，根據(jù)需要一個(gè)增溶基連同所述大體上呈平面部分的取代基位于平面部分的一側(cè)來控制標(biāo)志組分的凈電荷以及將標(biāo)志組分結(jié)合于其它分子。
4.權(quán)利要求3的標(biāo)志組分，其中發(fā)光的、大體上呈平面的部分是具有1到4個(gè)苯并基團(tuán)的三氮雜卟啉。
5.權(quán)利要求3的標(biāo)志組分，其中發(fā)光的、大體上呈平面的部分是具有1到4個(gè)苯并基團(tuán)的二氮雜卟啉。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的標(biāo)志組分，其中發(fā)光的、大體上呈平面的部分是具有1到4個(gè)苯并基團(tuán)的單氮雜卟啉。
7.熒光探針，含有權(quán)利要求4，5或6的結(jié)合于諸如抗原，半抗原，抗體，寡肽或寡核苷酸或天然或合成藥物的生物分子的發(fā)光部分。
8.權(quán)利要求7的熒光探針，具有諸如適于通過測定瞬態(tài)熒光偏振/向異性進(jìn)行的分析中的熒光強(qiáng)度，偏振以及衰減時(shí)間的特性。
9.標(biāo)志組分，根據(jù)需要由結(jié)合于兩個(gè)增溶基的發(fā)光的、大體上呈平面的部分連同所述大體上呈平面的部分的取代基構(gòu)成來控制標(biāo)志組分的凈電荷以及將標(biāo)志組分與其它分子結(jié)合，所述兩個(gè)增溶基之一位于平面部分的一側(cè)。
10.具有中心金屬原子的大環(huán)熒光配體，所述原子具有兩個(gè)軸向配體在大環(huán)的每一側(cè)各有一個(gè)，所述軸向配體獨(dú)立地選自烷氧基，鹵化物，羥基，硼酸酯，硫酸酯或磷酸酯，所述大環(huán)為具有一或多個(gè)攜帶能夠結(jié)合以及控制凈電荷的取代基的單氮雜卟啉。
11.具有中心金屬原子的大環(huán)熒光配體，所述原子具有兩個(gè)軸向配體在大環(huán)的每一側(cè)各有一個(gè)，所述軸向配體獨(dú)立地選自烷氧基，鹵化物，羥基，硼酸酯，硫酸酯或磷酸酯，所述大環(huán)是具有能夠結(jié)合以及控制凈電荷的取代基的咕啉，sapphyrin，porphycene或者naphthalocyanine衍生物。
12.具有中心金屬原子的大環(huán)熒光配體，所述原子具有兩個(gè)軸向配體在大環(huán)的每一側(cè)各有一個(gè)，所述軸向配體獨(dú)立地選自烷氧基，鹵化物，羥基，硼酸酯，硫酸酯或磷酸酯，所述大環(huán)是具有能夠結(jié)合以及控制凈電荷的取代基的27-苯基四苯并三氮雜卟啉或27-(對-甲基苯基)四苯并三氮雜卟啉衍生物。
13.基于熒光的分析，利用本文公開的熒光標(biāo)志或熒光探針。
14.勻質(zhì)混合物以及包括利用在本文公開的熒光標(biāo)志或探針的核酸雜交的讀數(shù)分析。
15.標(biāo)志組分，其中熒光部分選自(1)醌型染料(2)陰丹士林染料(3)1，4-二氨基蒽醌-2，3-二羧酰胺(4)四氨基蒽醌(5)吖嗪染料(6)吡喃翁或硫代吡喃翁染料以及(7)萘醌甲基化物。
16.產(chǎn)生抗非特異性結(jié)合以及平面分子堆積的有效保護(hù)的方法，包括a)提供至少兩個(gè)小的軸向配體，b)將一個(gè)或多個(gè)所述配體置于由所述分子限定的分子平面的對側(cè)，c)確保整個(gè)分子的凈電荷足以產(chǎn)生所述的保護(hù)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述軸向配體由-OH組成。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述配體選自-OH，-O-叔丁基，-OCH2OH，-OCH2CH2OH，OCH2CHOHCH2OH，-OCH2CH2-OCH2CH2OH，-OCH2CH2-CH2-O-CH2CH2OH，-OPO3H2，-OB(OH)2，Cl，Br以及F。
全文摘要
本發(fā)明涉及標(biāo)記組分，熒光探針，寡核苷酸，雜交分析和利用這種產(chǎn)物進(jìn)行的免疫測定，以及制備這種產(chǎn)物的方法。根據(jù)本發(fā)明，所提供的可檢測性標(biāo)記的標(biāo)記組分包含與兩個(gè)小的增溶基結(jié)合的熒光部分，一個(gè)在分子平面的各側(cè)面上，所述熒光部分具有調(diào)控凈電荷的取代基以便減少或消除溶劑敏感性和非特異性結(jié)合的問題。
文檔編號C07H21/04GK101035800SQ200580019590
公開日2007年9月12日 申請日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月14日
發(fā)明者沃爾特·B·丹利克, 徐茂麟, 威廉·P·小墨菲 申請人:漢約爾格·黑雷特