專利名稱：核酸分析方法
核酸分析方法相關(guān)申請的交叉引用本申請要求以下美國專利申請的優(yōu)先權(quán)10/772,996， 10/773,000， 二者均于2004年2月5日提交；10/651,362， 10/651,355， 10/651582， 10/651,558，均于2003年8月29日提交；10/358,818，于2003年2月5 日提交；10/113,030， 10/113,025， 二者均于2002年4月2日提交； 10/230,576, 2002年8月29日提交；和美國臨時專利申請60/578,789, 于2004年6月10日提交；將其公開內(nèi)容全文引入本文供參考.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及樣品中多核苷酸的測序方法，所述方法基于使用 標(biāo)記的核苷酸作為核酸聚合酶的底物. 發(fā)明背景DNA聚合醉是適用于許多重組DNA技術(shù)的蘇類，諸如通過聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)("PCR")的核酸擴(kuò)增、自動維持序列復(fù)制("3 SR")和DNA 測序.熱穩(wěn)定性DNA聚合酶類是特別有用的.因?yàn)榧訜岵粫茐木酆?酶活性，所以不需要在每次變性步驟后添加另外的聚合酶.已知在其催化性循環(huán)中， 一旦"正確的"dNTP或ddNTP在活性位 點(diǎn)結(jié)合，則形成的DNA聚合務(wù)DNA復(fù)合物進(jìn)行從"開放"到"閉合" 態(tài)的限速、構(gòu)象轉(zhuǎn)變.在"閉合"態(tài)中，Mg^ (或其它金屬離子)介導(dǎo) 了一種快速化學(xué)步驟，其涉及由引物末端的3 '羥基親核置換焦褲酸. 一旦焦砩酸釋放則該酶回到"開放"態(tài)并且易位發(fā)起下一輪反應(yīng)，盡管 該三元復(fù)合物(蘇-DNA-dNTP (或ddNTP))可在沒有Mg^ (或其它 金屬離子)的情況下形成，但是其僅在存在Mg^ (或其它金屬離子)的 情況下才撞長于核苷酸的化學(xué)加成.缺乏Mg^ (或其它金屬離子)的條 件往往導(dǎo)致第一 "正確"的dNTP在緊密三元復(fù)合物中的非共價(物理) 發(fā)合(Doublie等(1999年2月15日)Structure Fold. Des" 7(2):R31-5),發(fā)明概要本發(fā)明利用以上觀察，采用該閉合復(fù)合物在DNA合成期間冷凍聚 合酶，捕獲與下一模板核苷酸互補(bǔ)的核苷酸，從而允許確定下一個正確 核苷酸的身份.其隨后可作為復(fù)合物的一部分被在適當(dāng)位置(in place)
鑒定，或者當(dāng)反應(yīng)循環(huán)由二價金屬離子的加入而完成時隨著染料從復(fù)合物洗脫而被鑒定.DNA的按順序存在的核苷酸可通過這種方式被鑒定， 從而有效確定DNA序列.該方法可用于模板核酸的單個分子或用于同 一 (或幾乎同一)序列的集合如PCR產(chǎn)物或克隆.若需要的話，多個模 板可被平行測序，尤其是它們被有效地固定在例如平板或珠粒的固體支 持物上時. 圖簡述

圖1描述了在目標(biāo)陣列的閉合復(fù)合物階段通過磷酸標(biāo)記的核苷酸中 止進(jìn)行平行測序的反應(yīng)方案.復(fù)合物在沖洗和掃描的全部時間范圍內(nèi)是 穩(wěn)定的.圖2描述了在閉合復(fù)合物階段通過礴酸標(biāo)記的核苷酸中止進(jìn)行測序 的反應(yīng)和檢測方案.復(fù)合物在沖洗和檢測的全部時間范閨內(nèi)是穩(wěn)定的.圖3描述了在閉合復(fù)合物階段通過砩酸標(biāo)記的核苷酸中止進(jìn)行測序 的反應(yīng)和檢測方案.復(fù)合物在沖洗和檢測的全部時間范圍內(nèi)僅是部分穩(wěn) 定的。獲得的序列不能區(qū)分序列中M倍數(shù)(A、 AA、 AAA等)。圖4描述了在目標(biāo)陣列的閉合復(fù)合物階段通過褲酸標(biāo)記的核苷酸中 止進(jìn)行平行測序的反應(yīng)方案.復(fù)合物在沖洗和檢測的全部時間范圍內(nèi)僅 是部分穩(wěn)定的.獲得的序列不能區(qū)分序列中堿基倍數(shù)(A、 AA、 AAA等).圖5顯示了采用熒光標(biāo)記的核苷酸形成穩(wěn)定閉合復(fù)合物的證據(jù).其 清楚地論證了該復(fù)合物可以如本文所述被檢測，圖6展示了 SDS是如何破壞閉合復(fù)合物的.圖7展示了閉合復(fù)合物的聚合酶滴定。定義本文定義的術(shù)語"核普"是包括噪呤，去氮雜噪呤，嘧啶或在l'位 或等價位置上連接到糖或糖取代基(substitute),如碳的環(huán)或非環(huán)的部 分上的經(jīng)修飾械基，包括2'-脫氧和2'-羥基以及2'，3'-二脫氧形式以及其 它取代。本文定義的術(shù)語"核苷酸"是指核苷的鱗酸酴，其中的酯化位點(diǎn)通 常對應(yīng)于連接到戊糖的C-5位上的羥基。本文定義的術(shù)語"寡核苷酸"包括核苷酸或其衍生物(包括脫氣核 糖核苷、核糖核苷等)的線性低聚體。在通篇說明書中，除非另有說明， 只要寡核苷酸是用字母的序列表示的，核苷酸都是從左到右的5'-3'的順
序，其中A是脫氧腺苷，C是脫氧胞苷，G是脫氧鳥苷，T是胸苷.
術(shù)語"引物"是指線性寡核苷酸，它以特異性方式退火到獨(dú)特的核 酸序列上，允許該獨(dú)特序列的擴(kuò)增.
用語"目標(biāo)核酸序列"等指下述核酸，其序列的身份或核苷的順序 或位置由本發(fā)明的一種或幾種方法確定.
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明
本發(fā)明涉及對樣品中多核苷酸加以鑒定的方法，其中使用方便的試 驗(yàn)，通過核酸聚合酶活性來監(jiān)測RNA或DNA的合成.核酸聚合蘇通過 將核苷單磷酸醋從核苷三褲酸酯(NTP)或脫氧核苷三褲酸酯(dNTP)轉(zhuǎn)移 到增長的寡核苷酸鏈的3'羥基上來合成核酸分子.該反應(yīng)也釋放無機(jī)焦 褲酸根，已知在聚合酶反應(yīng)的催化性循環(huán)期間，在"正確的"dNTP或 ddNTP在活性位點(diǎn)結(jié)合之后，形成的DNA聚合務(wù)DNA復(fù)合物進(jìn)行從 "開放"到"閉合"態(tài)的限速、構(gòu)象轉(zhuǎn)變，在沒有Mg^ (或其它金屬離 子)的情況下，三元復(fù)合物(務(wù)DNA-dNTP (或ddNTP))可形成，但 是dNTP或ddNTP并未加到該正在增長的核酸分子.這導(dǎo)致下一個"正 確"的dNTP在緊密三元復(fù)合物中的非共價(物理)螯合.本發(fā)明利用 這一觀察，采用該閉合復(fù)合物在核酸合成期間冷凍該聚合酶，捕獲與下 一模板核苷酸互補(bǔ)的核苷酸，從而允許確定下一個正確核苷酸的身份. 通過這種方式，DNA或RNA分子的序列可以一次一個核苷酸地被建立 起來。
在某些實(shí)施方案中，聚合酶是DNA聚合酶，例如DNA聚合酶I、 II 或HI或DNA聚合酶ot、 (3、 y，或末端脫氣核普酸轉(zhuǎn)移酶或端粒末端轉(zhuǎn) 移酶。在其它實(shí)施方案中，合適的聚合酵包括但是不限于依賴于DNA 的RNA聚合酶、引發(fā)酶或依賴于RNA的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)。當(dāng) 采用RNA聚合酶時，可由RNA聚合酶識別的啟動子序列含于核酸模板 或引物序列中.
用于本發(fā)明方法中測序的核酸模板可包括RNA或DNA模板.當(dāng) RNA用作模板時，核酸聚合酶可以是逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA聚合酶.
本發(fā)明提供的方法使用核苷多辨酸酯，如脫氧核苷多磷酸酯、二脫 氧核苷多蜂酸醋、碳環(huán)核苷多磷酸酯或非環(huán)核苷多礴酸酯類似物，其具 有生色染料或熒光標(biāo)記.這些核苷酸多蜂酸酯中的堿基選自由尿嘧啶、 胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、鳥嚷呤、7-脫氮鳥嚷呤、次黃嚷呤、7-脫氮次黃嘌呤、腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤及其類似物構(gòu) 成的組。為鑒定結(jié)合的核苷酸，核苷酸由熒光染料或生色染料或其它可 檢測標(biāo)志物進(jìn)行標(biāo)記。合適的熒光染料可選自夾氧雜蒽染料、花青染料、 merrocynine染料、偶氮染料、卟啉染料、香豆素染料、bodipy染料和 其衍生物構(gòu)成的組.合適的生色染料可選自偶氮染料、merrocynine染 料、花青染料、夾氧雜蒽染料、卟啉染料、香豆素染料、bodipy染料和 其衍生物構(gòu)成的組.這些染料是眾所周知的，并且商業(yè)來源廣泛。如上所述，本發(fā)明的方法可用于檢測單個分子或分子同種群 (homogeneous population)的序列.盡管該方法可用于對未知模板測序， 但是除此以外其也可確認(rèn)已知序列，鑒定單一核苷酸多態(tài)性，并且進(jìn)行 單一堿基延伸反應(yīng)。該方法多個步稞的循環(huán)致使能檢測同一分子的其它 序列，每次循環(huán)檢測一個.當(dāng)旨在對單一分子，或分子的同種群測序時， 可以順序方式在流通(flow through)或停流(stop flow)系統(tǒng)中執(zhí)行各 步驟.在這種流通或停流系統(tǒng)中，聚合酶-模板-核苷酸的三元復(fù)合物可 以固定于珠粒上，并且該珠?？晌挥谖⑼ǖ赖囊徊糠謨?nèi).備選地，如下所述，本發(fā)明方法也可適用于執(zhí)行大量平行反應(yīng)，從 而同時對多個模板測序。對于多元檢測，聚合醉-模板-核苷酸的三元復(fù) 合物可以固定于處于栽體(如毛細(xì)管)限定位置內(nèi)的珠粒上，或其可以 固定于微通道的內(nèi)表面上，或固定于栽玻片表面上，等等。栽玻片表面 可以是平坦的表面或經(jīng)涂戾的表面.此外，該表面可包括多個微特征， 其布置于空間上離散的區(qū)域中以在表面上產(chǎn)生紋理，其中，與無紋理表 面相比，該具有紋理的表面提供了增加的表面積.本發(fā)明的方法需要模板-聚合酶-核苷酸復(fù)合物固定到支持物表面. 預(yù)期該固定可發(fā)生于三元復(fù)合物形成之前或之后.當(dāng)固定發(fā)生于三元復(fù) 合物形成之前時，數(shù)種組分之一可被固定。這包括引物、核酸模板、核 酸聚合醉，或引物-模板復(fù)合物.當(dāng)固定發(fā)生于三元復(fù)合物形成之后時， 復(fù)合物自身被固定。對于很多樣品模板的多元分析而言，固定的物種(引 物、核酸模板、核酸聚合酵，或引物-模板復(fù)合物，或三元復(fù)合物)可在 支持物表面上形成有序圖案。該物種也可隨機(jī)固定于表面上.然而，每 個不同物種位于離散位置，使得來自結(jié)合于一個復(fù)合物(或復(fù)合物的同 種群)的任何染料的信號容易與來自附近固定的復(fù)合物的另一信號區(qū)分.三元復(fù)合物的穩(wěn)定性發(fā)生變化.如下所示，F(xiàn)Y7DNA聚合酶(美國
專利6479267)可與模板和染料標(biāo)記的核苷酸形成非常穩(wěn)定的復(fù)合物. 在這種情況下，使用標(biāo)記的dNTP來對核酸單個分子進(jìn)行逐步測序是可 行的.當(dāng)這一方法以多元模式使用時，可允許在極短的時間內(nèi)同時對數(shù) 萬個模板進(jìn)行測序或?qū)﹂LDNA區(qū)域測序.以下更加詳細(xì)地描述了這些 方法。在分析核酸模板目標(biāo)區(qū)域的方法的一個實(shí)施方案中，其步驟包括a) 通過形成反應(yīng)混合物，在支持物上啟動核酸聚合反應(yīng)，該反應(yīng)混合物包 含核酸模板、引物、核酸聚合酶、和四種各自含有不同標(biāo)記的末端褲酸 標(biāo)記的核苷酸，其中該反應(yīng)混合物的組分或兩種或多種所述組分的笫一 復(fù)合物被固定在該支持物上，并且所述一種或多種組分選自所述核酸模 板、引物和核酸聚合酶，且其中所述四種末端礴酸標(biāo)記的核苷酸各自均 含有與四種天然存在的堿基中的每一種互補(bǔ)的堿基；b)通過溫育反應(yīng)混合物以形成包含核酸模板、引物、核酸聚合醃、和末端褲酸標(biāo)記的核苦 酸的笫二復(fù)合物來進(jìn)行核酸聚合反應(yīng)，其中所述末端-酸標(biāo)記的核苷酸含 有與聚合位點(diǎn)處模板威基互補(bǔ)的威基；c)除去未結(jié)合的末端褲酸標(biāo)記的 核苷酸和反應(yīng)混合物的其它組分；d)檢測來自第二復(fù)合物的末端砩酸標(biāo) 記的核苷酸的標(biāo)記；且由此鑒定結(jié)合的核苷酸.在該實(shí)施方案中，用于核酸聚合酶反應(yīng)的^l板是單分子，或分子同 種群。至于對笫一4 ^之后的其它堿基的測序，除了以上(a) - (d)的 步驟以外，執(zhí)行以下步驟e)加入二價陽離子以完成該聚合反應(yīng)(此時 沒有游離核苷酸)；f)除去二價陽離子和來自該聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物； 和g)重復(fù)步驟(a) - (f)，以確定序列中的其它核苷酸.任選地，可在步驟(a) - (d)中的所有或任一步驟中，尤其是步緣 (f)中加入過量餐合刑(例如EDTA)，以螯合可能存在于反應(yīng)混合物 中的任何殘余二價陽離子.為了相同目的，預(yù)期可以在任何需要的時候 將螯合劑加入本發(fā)明公開的每一種方法.整合刑的加入不會干擾模板-聚 合酶-dNTP (或ddNTP)三元復(fù)合物的形成.這試驗(yàn)性地顯示于以下提 供的實(shí)施例中，通it^入二價陽離子(例如錳或鎂)來去除這些螯合劑， 這樣能使聚合酶反應(yīng)循環(huán)完成.當(dāng)采用以上實(shí)施方案來鑒定核酸模板的核酸序列時，有時可采用少 于四種的末端罅酸標(biāo)記的核苷酸.例如，當(dāng)鑒定樣品模板的雙等位基因 SNP時，僅需要兩種末端褲酸標(biāo)記的核苷酸，當(dāng)確定樣品模板中特定核
酸序列的存在時，僅需要單一的末端褲酸標(biāo)記的核苷酸.當(dāng)以多元模式使用這些實(shí)施方案時，可允許在極短的時間內(nèi)同時對數(shù)萬個模板進(jìn)行測序或?qū)﹂LDNA區(qū)域測序.因此，在本文提供的、對 多個核酸模板的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行平行鑒定的一個實(shí)施方案中，步驟包括a) 在支持物結(jié)構(gòu)上固定多種引物或核酸模板，其中各引物或模板均含有獨(dú) 特的序列，且其中各引物(或同一引物的多個拷貝)或模板均位于支持 物結(jié)構(gòu)上的可識別的離散位置；b)通過形成反應(yīng)混合物，在支持物結(jié)構(gòu) 上啟動多個核酸聚合反應(yīng)，該反應(yīng)混合物包含多種引物、多種核酸模板、 核酸聚合酶、和至少一種各自含有不同標(biāo)記的末端褲酸標(biāo)記的核苷酸， 其中每一種末端褲酸標(biāo)記的核苷酸均含有與四種天然存在的堿基中的每 一種互補(bǔ)的堿基；c)進(jìn)行核酸聚合反應(yīng)，通過溫育反應(yīng)混合物以形成多 種復(fù)合物，其各自均含有多種引物之一、多種核酸模板之一、核酸聚合 酶、和末端褲酸標(biāo)記的核苷酸，其中末端鱗酸標(biāo)記的核苷酸含有與聚合 位點(diǎn)處模^U^基互補(bǔ)的堿基；d)除去未結(jié)合的末端磷酸標(biāo)記的核苷酸和 反應(yīng)混合物的其它組分；e)在各可識別的離散位置檢測來自該復(fù)合物的 末端砩酸標(biāo)記的核苷酸的不同標(biāo)記.此外，檢測結(jié)構(gòu)任選被記錄到數(shù)據(jù) 儲存介質(zhì)；且結(jié)果被轉(zhuǎn)化為所述四種核苷酸序列之一，在該方法中，用于核酸聚合酶反應(yīng)的模板(或引物)每種都是單分 子，或分子同種群.至于對第一堿基之后的其它堿基的測序，除了以上 步驟(a) - (e)以外，執(zhí)行以下步驟f)加入二價陽離子以完成該聚合 反應(yīng)；g)除去二價陽離子和來自該聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物；和h)重復(fù) 步驟(a) - (g)，以鑒定多個核酸模板的每個另外的核苷酸，圖1描述 了4^發(fā)明的多元實(shí)施方案.在本文提供的對核酸模板目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測序的方法的另一實(shí)施方案 中，其步驟包括a)通過形成反應(yīng)混合物，在支持物上啟動核酸聚合反 應(yīng)，該反應(yīng)混合物包含核酸模板、引物、核酸聚合酶、和至少一種各自 含有不同標(biāo)記的末端褲酸標(biāo)記的核苷酸，其中該反應(yīng)混合物的組分或兩 種或多種所述組分的第一復(fù)合物被固定在該支持物上，并且所述一種或 多種組分選自所迷核酸模板、引物和核酸聚合酶，且其中該至少一種末 端褲酸標(biāo)記的核苷酸各自均含有與四種天然存在的堿基互補(bǔ)的堿基；b)進(jìn)行核酸聚合反應(yīng)，通過溫育反應(yīng)混合物以形成包含核酸模板、引物、 核酸聚合酶、和末端礴酸標(biāo)記的核苷酸的笫二復(fù)合物，其中該末端褲酸
標(biāo)記的核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模;fet^基互補(bǔ)的威基；c)除去未結(jié)合的 末端褲酸標(biāo)記的核苷酸和反應(yīng)混合物的其它組分；d)加入二價陽離子以 完成該聚合反應(yīng)；e)檢測來自笫二復(fù)合物的末端褲酸標(biāo)記核苷酸的標(biāo)記； O鑒定該結(jié)合的核苷酸；g)除去二價陽離子和來自該聚合反應(yīng)的其它 終產(chǎn)物；和h)重復(fù)步驟a) -g)以確定序列中每一個另外的核苷酸.在該實(shí)施方案中，用于核酸聚合酶反應(yīng)的模板是單個分子，或分子同種群。 本發(fā)明還提供了在連續(xù)流動或停止-流動體系中采用上述步碟對目 標(biāo)序列進(jìn)行測序的方法，其中通過本領(lǐng)域任何一種已知方法將固定材料 保持在適當(dāng)?shù)奈恢茫煌脑噭┖途彌_液從體系的一端泵入，從體系的 另 一端排出。試劑和緩沖液可以連續(xù)流動或在適當(dāng)?shù)奈恢帽３忠欢〞r間， 以便進(jìn)行聚合反應(yīng).在困2中展示了所述方法的困解說明.如圖2所示， 在微通道內(nèi)的珠粒給反應(yīng)復(fù)合物的固定提供了支持物表面.隨著緩沖液 和試刑沿該系統(tǒng)移動通過，從聚合酶反應(yīng)釋放的染料定向朝著微通道的 出口端移動?？稍谙到y(tǒng)內(nèi)的大量位置，甚至在由于二價陽離子的加入染 料從核苷酸釋放之后，進(jìn)行對由聚合酶捕獲的染料標(biāo)記的dNTP (或 ddNTP)的檢測.這些位置包括珠粒被保持的位置(在加入二價陽離子 之前或之后)，或者在珠粒被保持位置的下游但是在染料離開該系統(tǒng)之 前.備選地，含染料的溶液可以先隨著其離開該系統(tǒng)被收集，然后被檢 測.若閉合復(fù)合物(其可處于例如pH或溫度的反應(yīng)條件)的穩(wěn)定性使 得其僅為數(shù)秒而非數(shù)分鐘，該方法仍可用于對單一分子測序.檢測技術(shù) 涉及觀察復(fù)合物位點(diǎn)處熒光的顯微"閃光"，這將顯示下一個正確的核苷 酸(標(biāo)記的)的暫時(持續(xù)數(shù)秒)結(jié)合(導(dǎo)致該DNA-DNA聚合酶復(fù)合 物的有色"閃爍").既然僅與下一個正確的核普酸形成的"閉合復(fù)合物" 具有至少10倍于>^有不正確的下一個核苷酸的開放復(fù)合物的壽命，則其 熒光將主導(dǎo)該復(fù)合位點(diǎn)處觀察到的信號.這很容易與僅在復(fù)合位點(diǎn)保持 極短暫時間，尤其是低濃度存在的游離核苷酸的熒光區(qū)別，在可使用末 端碑酸標(biāo)記的dNTP或ddNTP的同時，堿基標(biāo)記的ddNTP也可使用. 結(jié)果是鑒別出在引物3，端出現(xiàn)的單一 "下一個"核苷酸，若選擇的引物 鄰近感興趣的位置例如SNP，該信息可能是單獨(dú)存在即有用的.以下更詳細(xì)地描述本發(fā)明.在本文提供的對核酸模板的目標(biāo)區(qū)域進(jìn) 行分析的方法一個實(shí)施方案中，其步騍包括a)通過形成反應(yīng)混合物，
在支持物上啟動核酸聚合反應(yīng)，該反應(yīng)混合物包含核酸模板、引物、核 酸聚合酶、和至少一種各自含有不同標(biāo)記的核苷酸，其中該反應(yīng)混合物的組分或兩種或多種所述組分的笫一復(fù)合物被固定在該支持物上，并且 該一種或多種組分選自該核酸模板、引物和核酸聚合醃，且其中所述至少一種標(biāo)記核苷酸之一含有與聚合位點(diǎn)出現(xiàn)的模板堿基互補(bǔ)的堿基；b) 溫育反應(yīng)混合物以形成包含核酸模板、引物、核酸聚合酶、和至少一種 標(biāo)記的核苷酸之一的笫二復(fù)合物，其中該標(biāo)記的核苷酸含有與聚合位點(diǎn) 處模板堿基互補(bǔ)的堿基，且其中該標(biāo)記的核苷酸在第二復(fù)合物內(nèi)處于動 態(tài)平衡；c)檢測該標(biāo)記的核苷酸的標(biāo)記；d)基于檢測的不同標(biāo)記鑒定核苷酸.在該方法中，用于核酸聚合酶反應(yīng)的模板是單分子，或分子同種群. 至于分析笫一^之后的其它威基，除了以上步稞(a) - (d)以外，執(zhí) 行以下步碟e)除去至少一種標(biāo)記的核苷酸和反應(yīng)混合物的其它組分； f)向反應(yīng)混合物加入核酸聚合醃、二價陽離子、和含有與聚合位點(diǎn)的模 板堿基互補(bǔ)的堿基的核苷酸；g)通過溫育反應(yīng)混合物一段時間來完成該 聚合反應(yīng)；h)除去該二價陽離子、核苷酸和來自該聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn) 物；和I)針對待分析的每個另外的核苷酸重復(fù)步驟(a) - (h).該方法的缺點(diǎn)可能會是相同堿基的輪次(nm)可能沒有被充分測序。 例如，序列GGGTTTCCTCTC (SEQ ID NO: l)可能被讀取為GTCTCTC (SEQ ID NO: 2),但是這一信息在很多情況下是有用的，尤其是當(dāng)確認(rèn) 已知序列時。當(dāng)這一 方法以多元模式使用時，可允許在極短的時間內(nèi)同時對數(shù)萬 個模板進(jìn)行測序或?qū)﹂LDNA區(qū)域測序.因此，在本文提供的對多個核 酸模板的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行平行鑒定的一個實(shí)施方案中，步驟包括a)在支 持物結(jié)構(gòu)上固定多種引物，其中各引物均含有獨(dú)特的序列，且其中各引 物(或同一引物的多個拷貝)均位于支持物結(jié)構(gòu)上的可識別的離散位置； b)通過形成反應(yīng)混合物，在支持物結(jié)構(gòu)上啟動多個核酸聚合反應(yīng)，該反應(yīng)混合物包含多種固定引物、多種核酸模板、核酸聚合酶、和四種各自 含有不同標(biāo)記的標(biāo)記核苷酸，其中該四種標(biāo)記的核苷酸中的每一種均含有與四種天然存在的械基中的每一種互補(bǔ)的堿基；c)溫育反應(yīng)混合物以 形成多種第二復(fù)合物，其各自均含有多種固定引物之一、多種核酸模板 之一、核酸聚合酵、和標(biāo)記核苷酸，其中標(biāo)記核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處
模板堿基互補(bǔ)的堿基，且其中所述標(biāo)記核苷酸在笫二復(fù)合物內(nèi)處于動態(tài)平衡；d)在各可識別的離散位置檢測標(biāo)記核苷酸的標(biāo)記；e)將從步驟 d)獲得的數(shù)據(jù)記錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì)；和f)通過將記錄的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為所 述四種核苷酸之一，鑒定出該多個核苷酸模板中的每一個的目標(biāo)序列。在該方法中，用于核酸聚合酶反應(yīng)的模板(或引物)是單分子，或 分子同種群.該方法的缺點(diǎn)可能會是相同減基的存在可能沒有被充分測 序。例如，如上所述，序列GGGTTTCCTCTC (SEQ ID NO: l)可能被 讀取為GTCTCTC (SEQ ID NO: 2)，但是這一信息在很多情況下是有用 的.盡管該方法只能提供笫一威基的序列信息，但對類似方法的循環(huán)可 提掩葉對各模板的多個威基的序列信息.可以多元模式使用的另 一方法也允許在極短的時間內(nèi)同時對數(shù)萬個 模板進(jìn)行測序或?qū)﹂LDNA區(qū)域測序.該方法可用于從同一模板獲得多 個堿基的序列，也存在同樣限制.同樣堿基的輪次可能不容易被檢測到 (例如序列GGGTTTCCTCTC (SEQ ID NO: l)可能被讀取為 GTCTCTC (SEQ ID NO: 2).因此，在本文提供的對多個核酸模板的目 標(biāo)區(qū)域進(jìn)行平行鑒定的另一個實(shí)施方案中，步驟包括a)在支持物結(jié)構(gòu) 上固定多種引物，其中各引物均含有獨(dú)特的序列，且其中各引物均位于 支持物結(jié)構(gòu)上的可識別的離散位置；b)通過形成反應(yīng)混合物，在支持物 結(jié)構(gòu)上啟動多個核酸聚合反應(yīng)，該反應(yīng)混合物包含多種固定引物、多種 核酸模板、核酸聚合酶、和一種標(biāo)記核苷酸；c)溫育反應(yīng)混合物以形成 多種第二復(fù)合物，其各自均含有多種固定引物之一、多種核酸模板之一、 該核酸聚合醉、和該標(biāo)記核苷酸，其中標(biāo)記核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模 板堿基互補(bǔ)的堿基，且其中所述標(biāo)記核苷酸在第二復(fù)合物內(nèi)處于動態(tài)平 衡；d)在可識別的離散位置檢測標(biāo)記核苷酸的標(biāo)記；e)將從檢測步驟 獲得的數(shù)據(jù)記錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì)；和f)除去標(biāo)記的核苷酸和反應(yīng)混合物 的其它組分；g)向反應(yīng)混合物加入核酸聚合酶、二價陽離子、和標(biāo)記核 苷酸的未標(biāo)記等同物；h)通過溫育反應(yīng)混合物一段時間來完成該聚合反 應(yīng)；i)除去該二價陽離子和來自該聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物；j)用其它三 種核苷酸之一重復(fù)步稞(a ) - (i )，直到所有四種核苷酸均被測試；和k) 重復(fù)步驟a) -j)以確定另外的核苷酸序列.在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中通過合適的算法對從該方法獲得的數(shù)據(jù)(染料標(biāo)記 信息)進(jìn)行處理。在數(shù)據(jù)產(chǎn)生的同時或者在試驗(yàn)反應(yīng)的末尾，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)
化為四種核苷酸中每一種的序列信息。該序列隨后針對多個核苷酸模板 中的每一個被裝配.應(yīng)當(dāng)注意，標(biāo)記核苷酸的加入次序可以以預(yù)設(shè)循環(huán) 出現(xiàn)，但這并非必需的，以下實(shí)施例闡述了采用以上方法測定兩種模板核酸分子序列的方法.假定待分析的序列是(a) GGGTTTCCTCTC (SEQ ID NO: l)和(b) CTCTCCTTTTGGG(SEQ ID NO: 3 )，并且與G、 C、 A、 T互補(bǔ)的核苷 酸以該次序加入.在以上步驟(j)的第一次循環(huán)中，加入了與G互補(bǔ)的 核苷酸。從模板上下一個核苷酸堿基是G的位置上(在SEQ ID NO: 1 的情況中)檢測到信號.^板上下一個核苷酸堿基不是G的位置上(在 SEQ ID NO: 3的情況，其含有下一個C)沒有檢測到信號.將該信息記 錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì)。在第二次循環(huán)中，加入與C互補(bǔ)的核苷酸，現(xiàn)在， 從含有SEQ ID NO: 3模板的位置上(具有下一個C)檢測到信號.從 含有SEQ ED NO: 1模板的位置上(具有下一個T)沒有檢測到信號.同 樣，將該信號記錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì).隨著循環(huán)的繼續(xù)，獲得關(guān)于這兩條 模板的數(shù)據(jù)。若通過所述四種核苷酸的每一種進(jìn)行的反應(yīng)的完全循環(huán)沒 有給出可檢測信號，則表明該模板序列被全部測序，對于SEQIDNO:l 模板，來自該反應(yīng)的最終結(jié)果讀取為GTCTCTC (SEQ ID NO: 2 )，而 對于SEQ ID NO: 3模板,來自該反應(yīng)的最終結(jié)果讀取為CTCTCTG( SEQ ID NO: 4 )。若閉合復(fù)合物的穩(wěn)定性使得其僅能被測量數(shù)秒到幾分鐘，則該方法 仍可用于測序單一分子.檢測技術(shù)涉及觀察復(fù)合物位點(diǎn)處的顯微"閃光"， 這將顯示下一個正確的核苷酸(標(biāo)記的)的暫時(持續(xù)數(shù)秒到數(shù)分鐘) 結(jié)合'在可使用末端褲酸根標(biāo)記的dNTP或ddNTP的同時，堿基標(biāo)記 的ddNTP也可使用.該技術(shù)的唯一缺點(diǎn)可能是相同械基的輪次可能沒有 被充分測序，例如，序列GGGTTTCCTCTC (SEQ ID NO: l)可能被讀 取為GTCTCTC (SEQ ID NO: 2)，但是這一信息是有用的.以下更詳細(xì)地描述這些方法.在本文提供的對核酸模板目標(biāo)區(qū)域進(jìn) 行分析的方法的一個實(shí)施方案中，其步驟包括a)通過形成反應(yīng)混合物， 在支持物上啟動核酸聚合反應(yīng)，該反應(yīng)混合物包含核酸模板、引物、核 酸聚合酶、和至少一種各自含有不同標(biāo)記的核苷酸，其中該反應(yīng)混合物 的組分或兩種或多種所述組分的第 一復(fù)合物被固定在該支持物上，并且 該一種或多種組分選自該核酸模板、引物和核酸聚合酶，且其中該至少
一種標(biāo)記核苷酸之一含有與聚合位點(diǎn)的模^ba基互補(bǔ)的堿基；b)溫育反 應(yīng)混合物以形成包含核酸模板、引物、核酸聚合酶、和至少一種標(biāo)記核 苷酸之一的第二復(fù)合物，其中該標(biāo)記的核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模板堿 基互補(bǔ)的堿基，且其中該標(biāo)記的核苷酸在第二復(fù)合物內(nèi)處于動態(tài)平衡；c) 從反應(yīng)混合物中除去所述至少 一種標(biāo)記核苷酸的未結(jié)合部分和反應(yīng)混合 物的其它組分；d)檢測標(biāo)記的核苷酸的標(biāo)記；和e)基于檢測到的不同 標(biāo)記鑒定核酸序列.在該方法中，用于核酸聚合酶反應(yīng)的模板是單分子，或分子同種群. 至于分析第一堿基之后的其它堿基，除了以上步碟(a) - (e)以外，執(zhí) 行以下步驟f)向反應(yīng)混合物加入核酸聚合蘇、二價陽離子、和含有經(jīng) 鑒定的堿基序列的未標(biāo)記的核苷酸；g)通過溫育反應(yīng)混合物一段時間來 完成該聚合反應(yīng)；h)除去該二價陽離子和來自該聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物； 和i)針對每一個另外的待測核苷酸，重復(fù)步驟(a) - (h).若標(biāo)記的核 苷^i堿基標(biāo)記的，則優(yōu)選在步驟f)之前執(zhí)行額外的洗滌步碟以除去模 板-引物-聚合酶復(fù)合物捕獲的標(biāo)記核苷酸.附圖3描述了如上詳述的在閉合復(fù)合物階段通過躊酸標(biāo)記的核苷酸 中止進(jìn)行測序的反應(yīng)和檢測方案.該方法的唯一缺點(diǎn)可能是相同堿基的 輪次可能沒有被充分測序.例如，序列GGGTTTCCTCTC(SEQIDNO: l)可能被讀取為GTCTCTC (SEQ D) NO: 2)，但是這一信息在很多情況 下是有用的.當(dāng)這些方法以多元模式使用時，可允許在極短的時間內(nèi)同時對數(shù)萬 個模板進(jìn)行測序或?qū)﹂LDNA區(qū)域測序.因此，在本文提供的對多個核 酸模板的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行平行鑒定的一個實(shí)施方案中，步驟包括a)在支 持物結(jié)構(gòu)上固定多種引物，其中各引物均含有獨(dú)特的序列，且其中各引 物(或同一引物的多個拷貝)均位于支持物結(jié)構(gòu)上的可識別的離散位置； b)通過形成反應(yīng)混合物，在栽體結(jié)構(gòu)上啟動多個核酸聚合反應(yīng)，該反應(yīng) 混合物包含多種固定引物、多種核酸模板、核酸聚合酵、和四種各自含 有不同標(biāo)記的標(biāo)記核苷酸，其中所述四種標(biāo)記的核苷酸中的每一種均含 有與四種天然出現(xiàn)的堿基中的每一種互補(bǔ)的堿基；c)溫育反應(yīng)混合物以 形成多種第二復(fù)合物，其各自均含有多種固定引物之一、多種核酸模板 之一、核酸聚合酶、和標(biāo)記核苷酸，標(biāo)記核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模板 堿基互補(bǔ)的堿基，且所述標(biāo)記核苷酸在第二復(fù)合物內(nèi)處于動態(tài)平衡；d)從反應(yīng)混合物中除去未結(jié)合的標(biāo)記核苷酸和反應(yīng)混合物的其它組分；e) 在各可識別的離散位置檢測標(biāo)記核苷酸的標(biāo)記；f)將獲得的關(guān)于標(biāo)記的 信息記錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì)；和g)通過將記錄的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為所述四種核 苷酸之一，鑒定出所述多個核苷酸模板中的每一個的目標(biāo)序列.在該方法中，用于核酸聚合酶反應(yīng)的模板(或引物)是單分子，或 分子同種群，圖4描述了以上詳述的平行測序反應(yīng)方案.該方法的缺點(diǎn)可能是相同堿基的輪次可能沒有被充分測序.例如，如上所述，序列 GGGTTTCCTCTC (SEQ ID NO: l)可能被讀取為GTCTCTC (SEQ ID NO: 2)，但是這一信息在很多情況下是有用的.盡管該方法只能提供第 一威基的序列信息，M類似方法的循環(huán)可提供針對各模板的多個堿基 的序列信息，可以多元模式使用的另一方法也允許在極短的時間內(nèi)同時對數(shù)萬個 模板進(jìn)行測序或?qū)﹂LDNA區(qū)域測序.該方法可用于從同一模板獲得多 個堿基的序列.因此，在本文提供的對多個核酸模板的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行平 行鑒定的另一個實(shí)施方案中，步驟包括a)在支持物結(jié)構(gòu)上固定多種引 物，其中各引物均含有獨(dú)特的序列，且其中各引物均位于栽體結(jié)構(gòu)上的 可識別的離散位置；b)通過形成反應(yīng)混合物，在支持物結(jié)構(gòu)上啟動多個 核酸聚合反應(yīng)，該反應(yīng)混合物包含多種固定引物、多種核酸模板、核酸 聚合酶、和至少一種標(biāo)記核苷酸；c)溫育反應(yīng)混合物以形成多種第二復(fù) 合物，其各自均含有多種固定引物之一、多種核酸模板之一、該核酸聚 合酶、和該至少一種標(biāo)記核苷酸之一，其中各標(biāo)記核苷酸均含有與聚合 位點(diǎn)處模板堿基互補(bǔ)的堿基，且其中所述標(biāo)記核苷酸在笫二復(fù)合物內(nèi)處 于動態(tài)平衡；d)從反應(yīng)混合物中除去未結(jié)合的標(biāo)記核苷酸和反應(yīng)混合物 的其它組分；e)在可識別的離散位置檢測標(biāo)記核苷酸的標(biāo)記；f)將從檢測步築獲得的數(shù)據(jù)記錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì)；g)向反應(yīng)混合物加入核酸聚 合酶、二價陽離子、和標(biāo)記核苷酸的未標(biāo)記等同物；h)通過溫育反應(yīng)混合物一段時間來完成該聚合反應(yīng)；i)除去該二價陽離子和來自該聚合反 應(yīng)的其它終產(chǎn)物；j)用其它三種核苷酸之一重復(fù)步驟a) -i)，直到所有 四種核苷酸均被測試；和k)重復(fù)步驟a) -j)以確定另外的核苷酸序列。 若標(biāo)記的核苷酸是堿基標(biāo)記的，則優(yōu)選在步驟g)之前執(zhí)行額外的洗滌 步猓以除去模板-引物-聚合蘇復(fù)合物捕獲的標(biāo)記核苷酸。在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中通過合適的算法對從該方法獲得的數(shù)據(jù)(染料標(biāo)記
信息)進(jìn)行處理.在數(shù)據(jù)產(chǎn)生的同時或者在試驗(yàn)反應(yīng)的末尾，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn) 化為四種核苷酸中每一種的序列信息。該序列隨后針對多個核苷酸模板 中的每一個被裝配.應(yīng)當(dāng)注意，標(biāo)記核苷酸的加入次序可以以預(yù)設(shè)循環(huán) 出現(xiàn)，但這并非必需的。實(shí)施例以下實(shí)施例陳述了本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案，但是無意于闡述所 有的實(shí)施方案.這些實(shí)施例不應(yīng)被認(rèn)為是對所附權(quán)利要求和/或本發(fā)明范 圍的限制.實(shí)施例1:展示"閉合復(fù)合物"的形成附圖5陳述了采用熒光標(biāo)記的核苷酸形成該類型穩(wěn)定閉合復(fù)合物的 證據(jù).其清楚地展示了復(fù)合物可如本文所述被檢測.聚合酶反應(yīng)(20M1) 在(25 mM Tris:硼酸鹽，pH=7.5, 0.1 mM EDTA， 10%甘油)中進(jìn) 行并且含有所示50 pmole引發(fā)的模板，+/-20 pmole標(biāo)記的、帶正電 的ddGTP和/或ddATP; +/-3 pmole FY7 DNA聚合酶.反應(yīng)產(chǎn)物在50mM Tris:硼酸鹽，pH=7.5中的7%PAGE上分離.僅當(dāng)聚合酶、引物模板、 和正確的核苷酸存在時才觀察到復(fù)合物形成.附圖6展示了 "閉合復(fù)合物"可在多達(dá)50mM EDTA中形成，可被 SDS破壞、且與"冷"竟?fàn)幬锞範(fàn)?反應(yīng)(20M1)在(25 mM Tris:硼 酸鹽，pH=7.5，或附圖上所示的O.l mM EDTA，和10%甘油)中進(jìn)行 并且含有由T作為下一模板核苷酸的50 pmole引發(fā)的模板，20 pmole 標(biāo)記的、帶正電的ddATP (下一個正確的核苷酸)；所示+/-3 pmole FY7 DNA聚合酶.在允許形成復(fù)合物之后，如附圖所示加入4 mM ddATPJf 且樣品被加熱到951C持續(xù)30秒并且在如附圖所示上樣之前允許冷卻， 反應(yīng)產(chǎn)物被上樣到50mM Tris:硼酸鹽，pH=7.5中的7%PAGE上進(jìn)行 分離。ddATP-模板-FY7 DNA聚合酶的閉合復(fù)合物可以在50mM EDTA 和0.1mM EDTA下形成。然而，閉合復(fù)合物在0.1 %SDS的存在下被破 壞，并與未標(biāo)記的"冷"ddATP竟?fàn)?附圖7展示了閉合復(fù)合物的聚合酶滴定。反應(yīng)(20 p 1 )在(25 mM Tris: 硼酸鹽，pH=7.5，或5mMEDTA，和10%甘油)中進(jìn)行并且含有由 T作為下一模板核苷酸的20pmole引發(fā)的模板，10pmole標(biāo)記的、帶正
電的ddATP (下一個正確的核苷酸)；所示FY7 DNA聚合酶.通過使 用50mM Tris:硼酸鹽，pH=7.5中的7%PAGE來分離反應(yīng)產(chǎn)物.下一 正確核苷酸通過FY7 DNA聚合酶的結(jié)合形成了穩(wěn)定的"閉合復(fù)合物"， 其可以由非變性PAGE分離.通過FY7 DNA聚合酶的增加，觀察到閉 合復(fù)合物形成以近線性方式增加.顯然可以在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下作出如上所述的本發(fā) 明的很多改變和變型。所述具體實(shí)施方案僅是以實(shí)施例的方式給出，且 本發(fā)明僅由所附權(quán)利要求的術(shù)語限制.
權(quán)利要求
1.一種鑒定核酸模板的目標(biāo)區(qū)域的方法，包括a)通過形成反應(yīng)混合物，在支持物上啟動核酸聚合反應(yīng)，所述反應(yīng)混合物包含核酸模板、引物、核酸聚合酶、和至少一種各自含有不同標(biāo)記的末端磷酸標(biāo)記的核苷酸，其中所述反應(yīng)混合物的組分或兩種或多種所述組分的第一復(fù)合物被固定在所述支持物上，并且一種或多種所述組分選自所述核酸模板、所述引物和所述核酸聚合酶，且其中所述至少一種末端磷酸標(biāo)記的核苷酸各自均含有與四種天然存在的堿基中的每一種互補(bǔ)的堿基；b)進(jìn)行核酸聚合反應(yīng)，通過在沒有二價陽離子的情況下溫育所述反應(yīng)混合物以形成包含所述核酸模板、所述引物、所述核酸聚合酶、和末端磷酸標(biāo)記的核苷酸的第二復(fù)合物進(jìn)行，其中所述末端磷酸標(biāo)記的核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模板堿基互補(bǔ)的堿基；c)除去未結(jié)合的末端磷酸標(biāo)記的核苷酸和所述反應(yīng)混合物的其它組分；和d)檢測來自所述第二復(fù)合物的所述末端磷酸標(biāo)記的核苷酸的標(biāo)記。
2. 權(quán)利要求l的鑒定核酸模板的目標(biāo)區(qū)域的方法，還包括e) 加入二價陽離子以完成所述聚合反應(yīng)；f) 除去所述二價陽離子和來自所述聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物；和g) 重復(fù)步驟(a) - (f)以確定序列中類外的核苷酸，
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟在流通或停止-流動系統(tǒng)中以 順序方式執(zhí)行.
4. 權(quán)利要求l的方法，其中所述支持物是珠粒形式.
5. —種對多個核酸模板的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行平行鑒定的方法，包括a) 在支持物結(jié)構(gòu)上固定多種引物或核酸模板，其中各引物或模板均 含有獨(dú)特的序列，且其中各引物或模板的多個拷貝位于所述支持物結(jié)構(gòu) 上的可識別的離散位置；b) 通過形成反應(yīng)混合物，在所述支持物結(jié)構(gòu)上啟動多個核酸聚合反 應(yīng)，所述反應(yīng)混合物包含所述多種引物、所述多種核酸模板、核酸聚合 酶、和至少一種各自含有不同標(biāo)記的末端褲酸標(biāo)記的核苷酸，其中每一 種所述至少一種末端砩酸標(biāo)記的核苷酸均含有與四種天然存在的堿基中 的每一種互補(bǔ)的堿基； C)進(jìn)行所述核酸聚合反應(yīng)，通過溫育所述反應(yīng)混合物以形成多種復(fù) 合物，其各自均含有所述多種引物之一、所述多種核酸模板之一、所述 核酸聚合酶、和末端磷酸標(biāo)記的核苷酸，其中所述末端磷酸標(biāo)記的核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模^U^互補(bǔ)的威基；d) 除去未結(jié)合的末端褲酸標(biāo)記的核苷酸和所述反應(yīng)混合物的其它組分；e) 在所述各可識別的離散位置檢測來自所述復(fù)合物的所述末端褲酸 標(biāo)記的核苷酸的不同標(biāo)記；f) 將從步驟e)獲得的數(shù)據(jù)記錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì)；和g) 通過將所述數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為所述四種核苷酸序列之一，鑒定出所述多 個核苷酸模板的每一個的所述目標(biāo)區(qū)域序列.
6. 權(quán)利要求5的對多個核酸模板的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行平行鑒定的方法， 還包括h) 加入二價陽離子以完成所述聚合反應(yīng)；i) 除去所述二價陽離子和來自所述聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物；和j)重復(fù)步驟(a) - (i)以鑒定出所述多個核酸模板的每一另外的核 苷酸。
7. 權(quán)利要求5的方法，其中所述支持物結(jié)構(gòu)是珠粒，且其中攜帶 一種引物的所述珠粒與攜帶不同引物的所述珠粒以可識別的方式分開，
8. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述支持物結(jié)構(gòu)是顯微栽玻片的 第一表面。
9. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述末端磷酸標(biāo)記核苷酸中所述 標(biāo)記是熒光染料或生色染料.
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述熒光染料選自夾氣雜蒽染料、花 青染料、merrocynine染料、偶氮染料、卟啉染料、香豆素染料、bodipy 染料和其衍生物構(gòu)成的組.
11. 權(quán)利要求9的方法，其中所述生色染料選自偶氮染料、 merrocynine染料、花青染料、夾氧雜蒽染料、卟啉染料、香豆素染料、 bodipy染料和其衍生物構(gòu)成的組，
12. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述核酸聚合酶是FY7 DNA聚合酶.
13. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述核酸聚合酶選自DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、末端脫氣核苷酸轉(zhuǎn)移酶、引發(fā)酵或端粒末端轉(zhuǎn) 移酶.
14. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所述核酸聚合酶選自DNA聚合 酶I， T4DNA聚合酶，AmplitaqFS， T7DNA聚合酶，Phi29DNA聚 合酶，KIenowexo-， Sequenase， TaqDNA聚合醉，Thermo Sequenase I, ThermoSequenase II， FY7 DNA聚合酶，ThemoSequenase E681 M, i: /t"ogea (Thy B)， 7T "ea/^///a/m (Tne)， 訓(xùn)6te/ra/tea (Tsu)， 7^amss" (Tba)， 份orafc (NEB Vent)， 刃/rorfatoaews/s (Novagen)， / (Strategene)， P. GB-D (NEB Deep Vent)， Human Pol beta, Tsp JSI， AMV畫 逆轉(zhuǎn)錄酶，MMLV-逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV-逆轉(zhuǎn)錄酶，或這些酶的外切核酸酶 缺陷型變體，
15. 權(quán)利要求1或5的方法，其中所迷啟動步驟中的所述反應(yīng)混合 物還包括EDTA。
16. 權(quán)利要求2或6的方法，其中所述二價陽離子是鎂。 H.權(quán)利要求2或6的方法，其中所述二價陽離子是錳.
17.
18. —種鑒定核酸模板目標(biāo)區(qū)域的方法，包括a) 通過形成反應(yīng)混合物，在支持物上啟動核酸聚合反應(yīng)，所述反應(yīng) 混合物包含核酸模板、引物、核酸聚合酶、和至少一種各自含有不同標(biāo) 記的末端磷酸標(biāo)記的核苷酸，其中所述反應(yīng)混合物的組分或兩種或多種 所述組分的笫一復(fù)合物被固定在所述支持物上，并且所述一種或多種組 分選自所述核酸模板、所述引物和所述核酸聚合酶，且其中所述至少一 種末端褲酸標(biāo)記的核苷酸各自均含有與四種天然存在的堿基互補(bǔ)的堿 基；b) 進(jìn)行所述核酸聚合反應(yīng)，通過在沒有二價陽離子的情況下溫育所 述反應(yīng)混合物以形成包含所述核酸模板、所述引物、所述核酸聚合酶、 和末端磷酸標(biāo)記的核苷酸的第二復(fù)合物，其中所述末端礴酸標(biāo)記的核苷 酸含有與聚合位點(diǎn)處模M基互補(bǔ)的堿基；c) 除去未結(jié)合的末端磷酸標(biāo)記的核苷酸和所述反應(yīng)混合物的其它組分；d) 加入二價陽離子以完成所述聚合反應(yīng)；和e) 檢測來自所述笫二復(fù)合物的所述末端磷酸標(biāo)記核苦酸的標(biāo)記，
19. 權(quán)利要求18的鑒定核酸模板目標(biāo)區(qū)域的方法，還包括 f) 除去所述二價陽離子和來自所述聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物；和g) 重復(fù)步驟a) -f)以確定每一個另外的核苷酸序列.
20. 權(quán)利要求18的方法，其中所述步緣在流通或停止-流動系統(tǒng)中 以順序方式執(zhí)行.
21. 權(quán)利要求18的方法，其中所述支持物是珠粒形式.
22. —種對核酸模板的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行分析的方法，包括a) 通過形成反應(yīng)混合物，在支持物上啟動核酸聚合反應(yīng)，所述反應(yīng) 混合物包含核酸模板、引物、核酸聚合酶、和至少一種各自含有不同標(biāo) 記的核苷酸，其中所述反應(yīng)混合物的組分或兩種或多種所述組分的第一 復(fù)合物被固定在所述支持物上，并且所述一種或多種組分選自所述核酸 模板、所述引物和所述核酸聚合酶，且其中所述至少一種標(biāo)記核苷酸之 一含有與聚合位點(diǎn)出現(xiàn)的模板M互補(bǔ)的4^;b) 溫育所述反應(yīng)混合物以形成包含所述核酸模板、所述引物、所述 核酸聚合蘇、和所述至少一種標(biāo)記的核苷酸之一的第二復(fù)合物，其中所 述標(biāo)記的核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模板威基互補(bǔ)的堿基，且其中所述標(biāo) 記的核苷酸在第二復(fù)合物內(nèi)處于動態(tài)平衡；c) 檢測所述標(biāo)記的核苷酸的標(biāo)記；和d) 基于檢測到的不同標(biāo)記鑒定出序列.
23. 權(quán)利要求22的對核酸模板的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行分析的方法，還包括e) 從所述反應(yīng)混合物除去所述至少一種標(biāo)記的核苷酸和所述反應(yīng)混 合物的其它未結(jié)合組分；O向所述反應(yīng)混合物加入核酸聚合酶、二價陽離子、和含有與聚合 位點(diǎn)的模M基互補(bǔ)的威基的核苷酸；g) 通過溫育所述反應(yīng)混合物一段時間來完成所述聚合反應(yīng)；h) 除去所述二價陽離子和來自所述聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物；和i) 針對每一個另外的待測序核苷酸重復(fù)步驟(a) - (h).
24. —種對多個核酸模板進(jìn)行平行鑒定的方法，包括a) 在支持物結(jié)構(gòu)上固定多種引物，其中各引物均含有獨(dú)特的序列， 且其中各引物的多個拷貝位于所述支持物結(jié)構(gòu)上的可識別的離散位置；b) 通過形成反應(yīng)混合物，在所述支持物結(jié)構(gòu)上啟動多個核酸聚合反 應(yīng)，所述反應(yīng)混合物包含所述多種固定引物、多種核酸模板、核酸聚合 酶、和四種各自含有不同標(biāo)記的標(biāo)記核苷酸，其中所述四種標(biāo)記的核苷 酸中的每一種均含有與四種天然存在的堿基中的每一種互補(bǔ)的堿基；c) 溫育所述反應(yīng)混合物以形成多個第二復(fù)合物，其各自均含有所述 多種固定引物之一、所述多種核酸模板之一、所述核酸聚合酶、和標(biāo)記 核苷酸，其中所述標(biāo)記核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模板堿基互補(bǔ)的堿基， 且其中所述標(biāo)記核苷酸在所述笫二復(fù)合物內(nèi)處于動態(tài)平衡；d) 在所述各可識別的離散位置檢測所述標(biāo)記核苷酸的所述標(biāo)記；e) 將從步驟d)獲得的數(shù)據(jù)記錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì)；和f) 通過將所述記錄的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為所述四種核苷酸之一，鑒定出所述 多個核苷酸模板中的每一個的所述目標(biāo)序列.
25. —種對多個核酸模板進(jìn)行平行鑒定的方法，包括a) 在支持物結(jié)構(gòu)上固定多種引物，其中各引物均含有獨(dú)特的序列， 且其中各引物均位于所述支持物結(jié)構(gòu)上的可識別的離散位置；b) 通過形成反應(yīng)混合物，在支持物結(jié)構(gòu)上啟動多個核酸聚合反應(yīng)， 所述反應(yīng)混合物包含所述多種固定引物、多種核酸模板、核酸聚合酶、 和一種標(biāo)記核苦酸；c) 溫育反應(yīng)混合物以形成多種笫二復(fù)合物，其各自均含有所述多種 固定引物之一、所述多種核酸模板之一、所述核酸聚合酶、和所述標(biāo)記 核苷酸，其中所述標(biāo)記核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模板堿基互補(bǔ)的堿基， 且其中所述標(biāo)記核苷酸在所述笫二復(fù)合物內(nèi)處于動態(tài)平衡；d) 在所述可識別的離散位置檢測所述標(biāo)記核苷酸的標(biāo)記；e) 將從所述檢測步驟獲得的數(shù)據(jù)記錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì)；和f) 從所述反應(yīng)混合物除去所述標(biāo)記的核苷酸和所述反應(yīng)混合物的其 它組分；g) 向所述反應(yīng)混合物加入核酸聚合醉、二價陽離子、和所述標(biāo)記核 苷酸的未標(biāo)記等同物；h) 通過溫育所述反應(yīng)混合物一段時間來完成所述聚合反應(yīng)；i) 除去所述二價陽離子和來自所述聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物；j)用其它三種核苷酸之一重復(fù)步驟(a) - (i),直到所有四種核苷 酸均被測試；和k)重復(fù)步琛a) -j)以確定其它核苷酸序列。
26. 權(quán)利要求2S的方法，進(jìn)一步包括步驟1)通過將所述記錄數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為所述四種核苷酸之一的序列，鑒定所述多個核苷酸模板的所述目標(biāo)序列，且針對所述多個核苷酸模板中的每 一個裝配所述目標(biāo)序列.
27. —種對核酸模板目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行分析的方法，包括a) 通過形成反應(yīng)混合物，在支持物上啟動核酸聚合反應(yīng)，所述反應(yīng) 混合物包含核酸模板、引物、核酸聚合醉、和至少一種各自含有不同標(biāo) 記的核苷酸，其中所述反應(yīng)混合物的組分或兩種或多種所述組分的第一 復(fù)合物被固定在所述支持物上，并且所述一種或多種組分選自所述核酸 模板、所述引物和所述核酸聚合酶，且其中所述至少一種標(biāo)記核苷酸之 一含有與聚合位點(diǎn)的模^U^互補(bǔ)的^^;b) 溫育所述反應(yīng)混合物以形成包含所述核酸模板、所述引物、所述 核酸聚合酶、和所述至少一種標(biāo)記核苷酸之一的第二復(fù)合物，其中所述 標(biāo)記的核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模板堿基互補(bǔ)的堿基，且其中所述標(biāo)記 的核苷酸在第二復(fù)合物內(nèi)處于動態(tài)平衡；c) 從所述反應(yīng)混合物中除去所述至少一種標(biāo)記核苷酸和所述反應(yīng)混 合物的其它組分；d) 檢測所述標(biāo)記的核苷酸的標(biāo)記；和e) 基于檢測到的不同標(biāo)記鑒定核酸序列，
28. 權(quán)利要求27的對核酸^l板目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行分析的方法，進(jìn)一步包括f) 向所述反應(yīng)混合物加入核酸聚合酵、二價陽離子、和含有與在聚 合位點(diǎn)的模M基互補(bǔ)的威基的核苷酸；g) 通過溫育所述反應(yīng)混合物一段時間來完成所述聚合反應(yīng)；h) 除去所述二價陽離子和來自所述聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物；和i) 針對每一個另外的待測序核苷酸重復(fù)步猓(a) - (h)。
29. —種對多個核酸模板的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行平行鑒定的方法，包括a) 在支持物結(jié)構(gòu)上固定多種引物，其中各引物均含有獨(dú)特的序列， 且其中各引物位于所述支持物結(jié)構(gòu)上的可識別的離散位置；b) 通過形成反應(yīng)混合物，在所述支持物結(jié)構(gòu)上啟動多個核酸聚合反 應(yīng)，所述反應(yīng)混合物包含所述多種固定引物、多種核酸模板、核酸聚合 酶、和四種各自含有不同標(biāo)記的標(biāo)記核苷酸，其中所述四種標(biāo)記的核苷 酸中的每一種均含有與四種天然存在的堿基中的每一種互補(bǔ)的堿基；c) 溫育所述反應(yīng)混合物以形成多種第二復(fù)合物，其各自均含有所述多種固定引物之一、所述多種核酸模板之一、所述核酸聚合酶、和標(biāo)記核苷酸，其中所述標(biāo)記核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模;feL減基互補(bǔ)的堿基，且其中所述標(biāo)記核苷酸在所述笫二復(fù)合物內(nèi)處于動態(tài)平衡；d) 從所述反應(yīng)混合物中除去所述標(biāo)記核苷酸和反應(yīng)混合物的其它組分；e) 在所述各可識別的離散位置檢測所述標(biāo)記核苷酸的標(biāo)記；f) 將從步驟e)獲得的數(shù)據(jù)記錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì)；和g) 通過將所述記錄的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為所述四種核苷酸之一，鑒定出所述 多個核苷酸模板中的每一個的所述目標(biāo)序列.
30. —種對多個核酸模板進(jìn)行平行鑒定方法，包括a) 在支持物結(jié)構(gòu)上固定多種引物，其中各引物均含有獨(dú)特的序列， 且其中各引物均位于支持物結(jié)構(gòu)上的可識別的離散位置；b) 通過形成反應(yīng)混合物，在所述支持物結(jié)構(gòu)上啟動多個核酸聚合反 應(yīng)，所述反應(yīng)混合物包含所述多種固定引物、多種核酸模板、核酸聚合 酶、和至少一種標(biāo)記核苷酸；c) 溫育所述反應(yīng)混合物以形成多種第二復(fù)合物，其各自均含有所述 多種固定引物之一、所述多種核酸模板之一、所述核酸聚合酶、和所述 標(biāo)記核苷酸，其中所述標(biāo)記核苷酸含有與聚合位點(diǎn)處模板堿基互補(bǔ)的堿 基，且其中所述標(biāo)記核苷酸在第二復(fù)合物內(nèi)處于動態(tài)平衡；d )從所述反應(yīng)混合物中除去所述標(biāo)記核苷酸和所iL^應(yīng)混合物的其 它組分；e) 在可識別的離散位置檢測所述標(biāo)記核苷酸的所述標(biāo)記；f) 將從所述檢測步驟獲得的數(shù)據(jù)k錄到數(shù)據(jù)儲存介質(zhì)；g) 向所述反應(yīng)混合物加入核酸聚合酶、二價陽離子、和所述標(biāo)記核 苷酸的未標(biāo)記等同物；h) 通過溫育所述反應(yīng)混合物一段時間來完成所述聚合反應(yīng)；i) 除去所述二價陽離子和來自所述聚合反應(yīng)的其它終產(chǎn)物；j)用其它三種核苷酸之一重復(fù)步驟a) -i)，直到所有四種核苷酸均 被測試；和k)重復(fù)步驟a) -j)以確定另外的核苷酸序列.
31. 權(quán)利要求30的方法，進(jìn)一步包括步驟1)通過將所述記錄數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為所述四種核苷酸之一的序列，鑒定所述多個核苷酸模板的所述目標(biāo)序列，針對所述多個核苷酸模板中的每一 個裝配所述目標(biāo)序列.
32.權(quán)利要求30的方法，其中標(biāo)記核苷酸的加入次序以預(yù)設(shè)的循環(huán) 方式出現(xiàn).
全文摘要
本發(fā)明提供了核酸分析方法。核酸模板、核苷酸和聚合酶的閉合復(fù)合物在聚合酶反應(yīng)期間形成，不含二價陽離子。其用于在閉合復(fù)合物中捕獲與下一模板核苷酸互補(bǔ)的標(biāo)記核苷酸。對標(biāo)記的檢測允許確定下一正確核苷酸的身份。鑒定可作為復(fù)合物的一部分被在適當(dāng)位置鑒定，或者當(dāng)反應(yīng)循環(huán)由二價金屬離子的加入而完成時隨著染料從復(fù)合物洗脫而被鑒定。DNA的按順序存在的核苷酸可通過這種方式被鑒定，從而有效確定DNA序列。該方法可用于核酸單分子或用于同一或幾乎同一序列的集合如PCR產(chǎn)物或克隆。多個模板可被平行測序，尤其是如果它們被固定在固體支持物上時。
文檔編號C07H21/02GK101120098SQ200580019164
公開日2008年2月6日 申請日期2005年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月10日
發(fā)明者C·W·福勒, J·R·納爾遜 申請人:通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生物科學(xué)公司