專利名稱：胰島小rna及抑制其的方法
背景技術(shù)：
通常小RNA(microRNA)是長(zhǎng)度一般為約19到25個(gè)核苷酸的小RNA分子。這些小RNA為從發(fā)夾前體切下的非編碼RNA。已經(jīng)在廣大范圍的多細(xì)胞生命體的基因組中鑒定出若干個(gè)小RNA。
許多小RNA保存在關(guān)系遙遠(yuǎn)的生物體之間的序列中，并且表現(xiàn)出組織特異性或發(fā)育階段特異性表達(dá)。生物體之間的序列的保守性(保留，conservation)表明小RNA可能在生物過程中扮演重要的角色。
已報(bào)道小RNA分子在部分雜交到靶基因的mRNA的非編碼3’區(qū)后通過阻斷翻譯在多種生物體中以序列特異性方式控制基因表達(dá)。被小RNA靶向的基因大部分仍需表征。
然而，有越來越多的證據(jù)表明小RNA涉及多種疾病和病癥。例如，已表明果蠅小RNA靶向涉及細(xì)胞凋亡的基因。此外，B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病與兩種小RNA的缺失(去除)有關(guān)。
胰島細(xì)胞(也稱作郎格罕氏島)是形成和分泌激素的特化細(xì)胞群。據(jù)報(bào)道在胰島內(nèi)存在5種類型的細(xì)胞α、β、δ、PP以及D1細(xì)胞。
已報(bào)道這些細(xì)胞中的一些涉及葡萄糖的調(diào)節(jié)。例如，α細(xì)胞分泌胰高血糖素，其是涉及提高血中葡萄糖水平的激素。此外，β細(xì)胞分泌胰島素，一種幫助身體利用葡萄糖供能的激素。
葡萄糖利用的調(diào)節(jié)中的干預(yù)，尤其是分泌胰島素的β細(xì)胞的干預(yù)，可以導(dǎo)致疾病和病癥，如糖尿病。因此，闡明涉及調(diào)節(jié)在葡萄糖體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中扮演重要角色的基因的機(jī)制非常重要。例如，在現(xiàn)有技術(shù)中還不知道是否小RNA(如果存在)調(diào)節(jié)葡萄糖利用。
因此，需要能夠幫助闡明調(diào)節(jié)基因(如胰島細(xì)胞的小RNA)的功能的材料和方法。
此外，由于小RNA具有導(dǎo)致RNA降解或抑制mRNA(其編碼重要蛋白)翻譯的能力，因此還需要可抑制胰腺小RNA導(dǎo)致的剪切或靶mRNA的翻譯抑制的新分子。

發(fā)明內(nèi)容
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及獨(dú)立的DNA或RNA分子。這些分子包括具有SEQ ID NO1-20中所示的胰島小RNA中的序列的至少10個(gè)相鄰堿基，除了達(dá)到30％的這些堿基可以是擺動(dòng)堿基，達(dá)到10％的這些相鄰堿基可以是非互補(bǔ)的。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及修飾的單鏈胰島小RNA分子。這些分子包括分子主鏈上的最少10個(gè)部分(moiety)和最多50個(gè)部分，該分子主鏈包括主鏈單元，每個(gè)部分包括連接到主鏈單元的堿基，其中至少10個(gè)相鄰堿基具有與SEQ ID NO1-20中所示的胰島小RNA分子中的堿基的相鄰序列相同的序列，除了達(dá)到30％的這些堿基對(duì)可以是擺動(dòng)堿基對(duì)，達(dá)到10％的這些相鄰堿基可以是添加、缺失、錯(cuò)配、或其組合；不超過50％的這些相鄰部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元，并且至少一部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及獨(dú)立的單鏈抗-胰島小RNA分子。該分子包括分子主鏈上的最少10個(gè)部分和最多個(gè)50部分，該分子主鏈包括主鏈單元，每個(gè)部分包括連接到主鏈單元的堿基，每個(gè)堿基與互補(bǔ)堿基形成沃森-克里克堿基對(duì)，其中至少10個(gè)相鄰堿基具有與SEQ ID NO1-20中所示的胰島小RNA分子的任何一個(gè)中的堿基的相鄰序列互補(bǔ)的序列，除了達(dá)到30％的這些堿基對(duì)可以是擺動(dòng)堿基對(duì)，達(dá)到10％的這些相鄰堿基可以是添加、缺失、錯(cuò)配、或其組合；不超過50％的這些相鄰部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元；并且該分子能夠抑制小RNP活性。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于抑制細(xì)胞中小RNP活性的方法。小RNP包括胰島小RNA分子。該方法包括將單鏈抗胰島小RNA分子引入細(xì)胞中，其中抗胰島小RNA互補(bǔ)于胰島小RNA分子。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于治療需要的哺乳動(dòng)物中的糖尿病的方法。該方法包括將有效量的抗胰島小RNA分子引入哺乳動(dòng)物中，其中該抗胰島小RNA分子含有具有SEQ ID NO41或51中所示的序列的至少十個(gè)相鄰堿基。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包括根據(jù)本發(fā)明的獨(dú)立的DNA或RNA分子的獨(dú)立的小RNP。
在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包括根據(jù)本發(fā)明的獨(dú)立的單鏈胰島小RNA分子的獨(dú)立的小RNP。


圖1示出了在說明書中所述的經(jīng)修飾的核苷酸單元。B代表以下核酸堿基中的任何一種腺苷、胞啶、鳥苷、胸腺嘧啶、或尿啶。
圖2預(yù)測(cè)的小鼠miR-375的前體結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)。(A)利用Mfold 3.1版本進(jìn)行的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。miRNA序列被加了下劃線。在鼠和人序列之間有完全同源性。(B)miR-375和miR-376的組織表達(dá)。全部RNA(30μg)分離自小鼠組織用于RNA印跡(Northern blot)并用于探測(cè)所述miRNA。(C)分離自提純的胰島、MIN6細(xì)胞和總胰腺的總RNA(10μg)的RNA印跡。在小鼠的胰腺島內(nèi)檢測(cè)到較高的表達(dá)水平。tRNA探針被用作加載對(duì)照。
圖3miR-375對(duì)分泌的抑制作用。(A)除了用miRNA-375、葡萄糖激酶或熒光素酶(分別為si-375、siRNA-Gck和siRNA-luc)的同源序列的合成siRNA，MIN6細(xì)胞用100ng編碼CMV-hGH和β-gal的質(zhì)粒DNA瞬間共轉(zhuǎn)染，或(B)用與miR-375(2′-O-甲基-375)互補(bǔ)的2′-O-甲基-寡核糖核苷酸或?qū)φ?′-O-寡核糖核苷酸(2′-O-甲基-GFP)共轉(zhuǎn)染。48h后，細(xì)胞在葡萄糖的低濃度(2.8mM)和刺激濃度(25mM)下孵育。在這些條件下釋放的hGH的量通過ELISA進(jìn)行測(cè)量并對(duì)β-gal活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(*P≤0.05，**P≤0.01)。
圖4，miR-375靶基因的鑒定。(A)用Ad-miR-375感染MIN6細(xì)胞48h。根據(jù)細(xì)胞溶解，樣品通過SDS-PAGE分離，并用α-Mtpn、α-Vti1a、或α-TATA盒結(jié)合蛋白(Tbp)免疫印跡(加載對(duì)照)。(B)使用N2A細(xì)胞重復(fù)實(shí)驗(yàn)。(C)MIN6細(xì)胞用相對(duì)于Mtpn(siRNA-Mtpn)或Vti1a設(shè)計(jì)的siRNA瞬間轉(zhuǎn)染48h并溶解。在通過SDS-PAGE分析之后，將樣品對(duì)于Mtpn或Vti1a免疫印跡。(D)MIN6細(xì)胞用si-375、si-Mtpn、或si-Vti1a瞬間轉(zhuǎn)染。48h后，細(xì)胞在葡萄糖的低濃度(2.8mM)和刺激濃度(25mM)下孵育。在這些條件下釋放的hGH的量通過ELISA進(jìn)行測(cè)量并對(duì)β-gal活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(*P≤0.05，**P≤0.01)。
圖5Mtpn的3’UTR中的miR-375靶位點(diǎn)負(fù)責(zé)抑制由miR-375的基因表達(dá)。(A)插入在水母(Renilla)熒光酶的3’UTR內(nèi)的肌營(yíng)養(yǎng)素的3’UTR中的靶位點(diǎn)序列。除了破壞miR-375的5’末端處的堿基配對(duì)的5個(gè)點(diǎn)突變(粗體)，突變構(gòu)造(Mtpn-MUT)與WT構(gòu)造(Mtpn-WT)相同。(B)除了與miR-375(2′-O-甲基-375)互補(bǔ)的2′-O-甲基-寡核糖核苷酸或?qū)φ?′-O-寡核糖核苷酸(2′-O-甲基-GFP)，MIN6細(xì)胞用任一報(bào)道物構(gòu)造進(jìn)行瞬間轉(zhuǎn)染。
具體實(shí)施例方式
胰島小RNA分子本發(fā)明已經(jīng)披露了新的胰島小RNA分子。這些分子具有SEQID NO1-20。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及獨(dú)立的單鏈胰島小RNA分子。
小RNA分子在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如，Bartel，Cell，2004，116，281-297對(duì)小RNA分子的評(píng)論)。在Bartel的文章中所述的小RNA分子的定義和特征以引用方式并入本文中。這樣的分子衍生自染色體組的基因座并產(chǎn)生自特異性小RNA基因。
成熟的小RNA分子由形成局部發(fā)夾(發(fā)卡)結(jié)構(gòu)的前體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工而來。該發(fā)夾結(jié)構(gòu)通常由稱為Dicer的酶剪切，由此產(chǎn)生一個(gè)小RNA雙鏈體。參見Bartel的上述參考文獻(xiàn)。
通常，小RNA雙鏈體的雙鏈之一被包裝在小RNA核糖核蛋白復(fù)合體(小RNP)中。例如，人類的小RNP還包括蛋白eIF2C2、解旋酶Gemin3、和Gemin4。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包括具有SEQ ID NO1-20所示的序列的至少10個(gè)相鄰堿基的獨(dú)立的DNA或RNA分子，以及其等效物。優(yōu)選地，該獨(dú)立的DNA或RNA分子包括具有SEQ IDNO1-20中所示的胰島小RNA中的堿基序列的至少13個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、甚至更優(yōu)選至少20個(gè)相鄰堿基。
表A胰島小RNA和發(fā)卡前體序列。具有“hsa”前綴的小RNA的名稱表明為人類序列，具有前綴“mmu”的小RNA的名稱表明為小鼠序列。發(fā)卡前體中胰島小RNA序列部分用粗體表示。


在本說明書中，堿基指的是通常存在于天然存在的DNA或RNA中的核苷酸堿基中的任何一個(gè)。該堿基可以是嘌呤或嘧啶。嘌呤堿基的實(shí)例包括腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)。嘧啶堿基的實(shí)例包括胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。腺嘌呤可以用2，6-二氨基嘌呤置換。
本說明書中披露的未修飾的核酸分子的序列顯示具有尿嘧啶堿基。尿嘧啶堿基存在于未修飾的RNA分子中。本發(fā)明還包括未修飾的DNA分子。未修飾的DNA分子的堿基序列與未修飾的RNA分子的相同，除了未修飾的DNA分子中，尿嘧啶堿基被胸腺嘧啶堿基置換。
該序列中的每個(gè)堿基可以與互補(bǔ)堿基形成沃森-克里克(Watson-Crick)堿基對(duì)。本文中所用的沃森-克里克堿基對(duì)指的是例如，下列堿基腺嘌呤和胸腺嘧啶(A-T)；腺嘌呤和尿嘧啶(A-U)；以及胞嘧啶和鳥嘌呤(C-G)之間的氫鍵相互作用。
等效物指的是這樣的分子，其中達(dá)到30％的該至少十個(gè)相鄰堿基是擺動(dòng)堿基，并且達(dá)到10％，優(yōu)選達(dá)到5％的該相鄰堿基是非互補(bǔ)的。
在本文中使用時(shí)，擺動(dòng)堿基指的是在該分子的序列中1)用尿嘧啶置換胞嘧啶，或者2)用鳥嘌呤置換腺嘌呤。這些擺動(dòng)堿基置換通常稱為UG或GU擺動(dòng)。表B示出了該分子中相鄰堿基的數(shù)目和擺動(dòng)堿基的最大數(shù)目。
表B相鄰堿基的數(shù)目和擺動(dòng)堿基的最大數(shù)目


本文所用的術(shù)語“非互補(bǔ)的”指的是添加、缺失、錯(cuò)配或其組合。添加指的是在上述任何堿基在相鄰序列中的插入。缺失指的是在相鄰序列中去除存在的任何部分。錯(cuò)配指的是相鄰序列中的堿基之一被不同的堿基置換。
添加、缺失、或錯(cuò)配可以發(fā)生在相鄰序列中的任何地方，例如，在該分子的相鄰序列的任何一端或相鄰序列之內(nèi)。通常，如果相鄰序列相對(duì)較短，如，長(zhǎng)度為約10到約15個(gè)堿基，那么添加、缺失或錯(cuò)配發(fā)生在相鄰序列的末端。如果相鄰序列相對(duì)較長(zhǎng)，例如，最少16個(gè)相鄰序列，那么添加、缺失或錯(cuò)配可以發(fā)生在相鄰序列中的任何地方。
例如，當(dāng)相鄰堿基的數(shù)目為10到19時(shí)，相鄰堿基中沒有或其一個(gè)可以為添加、缺失或錯(cuò)配；當(dāng)相鄰堿基的數(shù)目為20到23時(shí)，最多有一個(gè)或兩個(gè)添加、缺失或錯(cuò)配是允許的。
除了胰島小RNA的至少10個(gè)相鄰核苷酸，獨(dú)立的DNA或RNA分子還可以具有一個(gè)或多個(gè)另外的核苷酸。對(duì)于另外的核苷酸的數(shù)目沒有上限。通常，不超過約500個(gè)核苷酸，優(yōu)選不超過約300個(gè)核苷酸被加入到胰島小RNA的至少10個(gè)相鄰堿基中。
可以加入任何核苷酸。另外的核苷酸可以包括上述任何堿基。因此，例如，另外的核苷酸可以是A、G、C、T、或U中的任何一個(gè)或多個(gè)。
在一種實(shí)施方式中，胰島小RNA是發(fā)夾前體序列的部分或其片段。例如，合適的發(fā)夾前體序列示于SEQ ID NO21-40中。該片段可以是在5’端和/或在3’端包含至少10個(gè)、優(yōu)選至少15個(gè)、更優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸的發(fā)夾前體序列的任何片段。優(yōu)選核苷酸序列在其中胰島小RNA存在的發(fā)夾前體中。
胰島小RNA或發(fā)夾前體可以插入到載體(如重組載體)中。通常，為了構(gòu)建包含胰島小RNA的重組載體，包含胰島小RNA序列的發(fā)夾前體序列被并入載體中。參見，例如，Chen et al.Science2004，30383-86。
該重組載體可以是任何重組載體，例如質(zhì)粒、粘粒、或噬菌體。重組載體通常具有復(fù)制起始。該載體可以是，例如，病毒載體，如腺病毒載體或腺伴隨病毒(AAV)載體。參見，例如Ledley 1996，Pharmaceutical Research 131595-1614和Verma et al.Nature 1997，387239-242。
該載體可以進(jìn)一步包括可選擇的標(biāo)記物。合適的可選標(biāo)記物包括藥物抗性標(biāo)記物，如四環(huán)素或慶大霉素，或可檢測(cè)的基因標(biāo)記物，如β-半乳糖苷酶或螢光素酶。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立的DNA或RNA分子基本上包括SEQ ID NO1-40中所示的胰島小RNA序列或發(fā)夾前體序列的任何一個(gè)。
在本說明書中，“獨(dú)立的”(isolated)指的是該分子基本上不含有其它核酸?；旧喜缓衅渌怂嶂傅氖窃摲肿又辽偌s90％、優(yōu)選至少約95％、以及更優(yōu)選至少約98％不含有其它核酸。
優(yōu)選地，該分子基本上是純的，這意味著該分子不僅不含有其它核酸，而且不含有在該分子的合成和分離中所用的其它材料。合成中所用的材料包括，例如酶。分離中所用的材料包括，例如，凝膠，如SDS-PAGE。該分子至少約90％不含這樣的材料，優(yōu)選至少約95％不含這樣的材料，更優(yōu)選至少約98％不含有這樣的材料。
胰島細(xì)胞可以是本領(lǐng)域已知的任何胰島細(xì)胞。胰島細(xì)胞的實(shí)例包括α細(xì)胞、β細(xì)胞、δ細(xì)胞、PP細(xì)胞、以及D1細(xì)胞。優(yōu)選地，該細(xì)胞為β細(xì)胞。
小RNA或發(fā)夾前體中的堿基序列是高度保守的。由于高度保守，該序列可以來自任何哺乳動(dòng)物的胰島細(xì)胞。哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括寵物動(dòng)物(如狗和貓)、家畜(如牛、馬和羊)、試驗(yàn)動(dòng)物(如大鼠、小鼠和兔子)、以及靈長(zhǎng)類(如猴子和人類)。優(yōu)選地，該哺乳動(dòng)物為人類或小鼠。
修飾的單鏈胰島小RNA分子在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及修飾的單鏈胰島小RNA分子。該修飾的單鏈小RNA分子可以為如上所述的任何胰腺小RNA分子、發(fā)夾前體分子、或其等效物，除了該修飾的分子包括至少一個(gè)修飾的部分(即，至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分)。在本實(shí)施方式中，修飾的胰島小RNA分子包括最少10個(gè)部分的數(shù)目，優(yōu)選最少13，更優(yōu)選最少15，甚至更優(yōu)選最少18，最優(yōu)選最少21個(gè)部分。
該修飾的胰島小RNA分子包括最多50個(gè)部分的數(shù)目，優(yōu)選最多40，更優(yōu)選最多30，甚至更優(yōu)選最多25，最優(yōu)選最多23個(gè)部分。部分的最少和最多數(shù)目的合適范圍可以通過組合上述最少的任何一個(gè)和上述最多的任何一個(gè)來獲得。
每個(gè)修飾的部分包括連接至主鏈單元的堿基。該主鏈單元可以為任何能夠穩(wěn)定的連接到堿基并形成寡聚鏈的分子單元。在本說明書中，修飾的部分的主鏈單元不包括通常在天然存在的DNA或RNA分子中存在的主鏈單元。
這樣的修飾的胰島小RNA分子具有增加的核酸酶抗性。因此，該分子的核酸酶抗性比僅包含未修飾的核糖核苷酸部分、未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或兩者的序列高。這樣的修飾的部分在本領(lǐng)域是熟知的，并且在例如，Kurreck，Eur.J.Biochem.270，1628-1644(2003)中評(píng)論。
被對(duì)抗的核酸酶可以是核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶或兩者。核酸外切酶可以是3’-5’核酸外切酶或5’-3’核酸外切酶。3’-5’人類核酸外切酶的實(shí)例包括PNPT1，Werner綜合征解旋酶、RRP40、RRP41、RRP42、RRP45、以及RRP46。5’-3’核酸外切酶的實(shí)例包括XRN2、和FEN1。核酸內(nèi)切酶的實(shí)例包括Dicer、Drosha、核糖核酸酶4、核糖核酸酶P、核糖核酸酶H1、DHP1、ERCC-1、以及OGG1。既具有核酸外切酶功能又具有核酸內(nèi)切酶功能的核酸酶的實(shí)例包括APE1和EXO1。
修飾的部分可以存在于胰島小RNA分子中的任何位置。例如，為了防止胰島小RNA分子受到3’-5’核酸外切酶的作用，該分子可以在該分子的3’端具有至少一個(gè)修飾的部分并優(yōu)選在3’端具有至少兩個(gè)修飾的部分。如果希望防止該分子受到5’-3’核酸外切酶的作用，該胰島小RNA分子在該分子的5’端具有至少一個(gè)修飾的部分并優(yōu)選具有至少兩個(gè)修飾的部分。該胰島小RNA分子還可以在該分子的5’端和3’端之間具有至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)修飾的部分，以提高該分子對(duì)核酸內(nèi)切酶的抗性。優(yōu)選地，至少約10％、更優(yōu)選至少約25％、甚至更優(yōu)選至少約50％、進(jìn)一步更優(yōu)選至少約75％、最優(yōu)選至少約95％的該部分是修飾的。在一種實(shí)施方式中，所有的這些部分是修飾的(如核酸酶抵抗的)。
在修飾的胰島小RNA分子的一個(gè)實(shí)例中，該分子包括至少一個(gè)修飾的脫氧核糖核苷酸部分。合適的修飾的脫氧核糖核苷酸部分在本領(lǐng)域是已知的。這樣的修飾的脫氧核糖核苷酸部分包括，例如，作為主鏈單元的硫代磷酸酯脫氧核糖(phosphorothioatedeoxyribose)組。參見圖1中的結(jié)構(gòu)1。包括硫代磷酸酯脫氧核糖核苷酸部分的修飾的胰島小RNA分子通常稱作硫代磷酸酯(PS)DNA。參見，例如，Eckstein，Antisense Nuclei Acids DrugDev.10，117-121(2000)。
修飾的脫氧核糖核苷酸部分的其它合適的實(shí)例是N’3-N’5氨基磷酸酯(phosphoroamidate)脫氧核糖核苷酸部分，其包括作為主鏈單元的N’3-N’5氨基磷酸酯脫氧核糖組。參見圖1中的結(jié)構(gòu)2。包括氨基磷酸酯脫氧核糖核苷酸部分的寡核苷酸分子通常稱作氨基磷酸酯(NP)DNA。參見，例如，Gryaznov et al.，J.Am.Chem.Soc.116，3143-3144(1994)。
在修飾的胰島小RNA分子的另一實(shí)例中，該分子包括至少一個(gè)修飾的核糖核苷酸部分。修飾的核糖核苷酸部分的合適實(shí)例為在2’位被取代的核糖核苷酸部分。在2’位的取代基可以為例如，C1～C4烷基基團(tuán)。該C1～C4烷基基團(tuán)可以是飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的。C1～C4烷基基團(tuán)的部分實(shí)例包括乙基、異丙基、和烯丙基。優(yōu)選的C1～C4烷基基團(tuán)為甲基。參見圖1中的結(jié)構(gòu)3。包含在2’位用C1～C4烷基基團(tuán)取代的核糖核苷酸部分的寡核糖核苷酸分子通常稱作2’-O-(C1-C4烷基)RNA，例如，2’-O-甲基RNA(OMe RNA)。
在修飾的核糖核苷酸部分的2’位的取代基的另一合適實(shí)例是C1～C4烷氧基-C1～C4烷基基團(tuán)。該C1～C4烷氧基和C1～C4烷基基團(tuán)可以包括上述烷基基團(tuán)中的任何一個(gè)。優(yōu)選的C1～C4烷氧基-C1～C4烷基基團(tuán)是甲氧基乙基。參見圖1中的結(jié)構(gòu)4。包含多于一個(gè)核糖核苷酸部分(其在2’位被C1～C4烷氧基-C1～C4烷基基團(tuán)取代)的寡核苷酸分子稱作2’-O-(C1～C4烷氧基-C1～C4烷基)RNA，例如，2’-O-甲氧基乙基RNA(MOE RNA)。
修飾的核糖核苷酸部分的另一合適實(shí)例是在2’-氧原子和4’-碳原子之間具有亞甲橋的核糖核苷酸。參見圖1中的結(jié)構(gòu)5。包含在2’-氧原子和4’-碳原子之間具有亞甲橋的核糖核苷酸部分的寡核糖核苷酸分子通常稱作鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)。參見，例如，Kurreck et al.，Nucleic Acid Res.30.1911-1918(2002)；Elayadi et al.，Curr.Opinion Invest.Drugs 2，558-561(2001)；Φrum et al.，Curr.Opinion Mol.Ther.3，239-243(2001)；Koshkin et al.，Tetrahedron 54，3607-3630(1998)；Obika et al.，Tetrahedron Lett.39，5401-5404(1998).鎖核酸可從Proligo(Paris，F(xiàn)rance and Boulder，Colorado，USA)商業(yè)上獲得。
修飾核糖核苷酸部分的另一合適實(shí)例是在2’位被氟基團(tuán)取代的核糖核苷酸。這樣的2’-氟代核糖核苷酸部分在本領(lǐng)域是已知的。包含2’-氟代核糖核苷酸部分的分子在本文中通常稱作2’-氟代核糖核酸(FANA)。參見圖1中的結(jié)構(gòu)7。Damha et al.，J.Am.Chem.Soc.120，12976-12977(1998)。
在修飾的胰島小RNA分子的另一實(shí)例中，分子包括至少一個(gè)包含連接到作為主鏈單元的氨基酸殘基上的堿基的修飾部分。具有至少一個(gè)連接到氨基酸殘基上的堿基的修飾部分在本文中稱作肽核酸(PNA)部分。這樣的部分是耐核酸酶的，并且在本領(lǐng)域是已知的。具有PNA部分的分子通常稱作肽核酸。參見圖1中的結(jié)構(gòu)6。Nielson，Methods Enzymol.313，156-164(1999)；Elayadi，et al，id.；Braasch et al.，Biochemistry 41，4503-4509(2002)，Nielsen etal，.Science 254，1497-1500(1991)。
氨基酸可以是任何氨基酸，包括天然或非天然的氨基酸。天然存在的氨基酸包括，例如，通常在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的二十種最常見的氨基酸，即，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、以及纈氨酸。
非天然氨基酸可以包含例如烷基、芳基、或烷芳基基團(tuán)。烷基氨基酸的部分實(shí)例包括α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸、和ε-氨基己酸。芳基氨基酸的部分實(shí)例包括鄰-、間-、和對(duì)-氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的部分實(shí)例包括鄰-、間-、和對(duì)-氨基苯乙酸、以及γ-苯基-β-氨基丁酸。
非天然存在的氨基酸還包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括，例如，將一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)添加到天然存在的氨基酸上。
例如，一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)可以被添加到苯丙氨酸或酪氨酸殘基的芳香環(huán)的2’、3’、4’、5’、或6’位中的一個(gè)或多個(gè)位置上、或添加到色氨酸殘基的苯環(huán)的4’、5’、6’、或7’位中的一個(gè)或多個(gè)位置上。該基團(tuán)可以是能夠被添加到芳香環(huán)上的任何化學(xué)基團(tuán)。這樣的基團(tuán)的一些實(shí)例包括羥基，C1-C4烷氧基，氨基，甲氨基，二甲氨基，硝基，鹵代(即，氟代、氯代、溴代、或碘代)，或支鏈或直鏈的C1-C4烷基如甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、或叔丁基。
作為天然存在的氨基酸的衍生物的非天然存在的氨基酸的其它實(shí)例包括正纈氨酸(Nva)、正亮氨酸(NIe)、以及羥基脯氨酸(Hyp)。
這些氨基酸可以相互是相同或不同的。堿基通過分子鍵被連接到氨基酸單元上。鍵的實(shí)例有亞甲基羰基、亞乙基羰基和乙基鍵(Nielsen et al.，Peptide Nucleic Acids-Protocols and Applications，Horizon Scientific Press，pages 1-19；Nielsen et al.，Science 2541497-1500.)。PNA部分的氨基酸殘基的一個(gè)實(shí)例是N-(2-氨基乙基)-甘氨酸。
PNA部分的另外的實(shí)例包括環(huán)己基PNA、逆反式PNA、膦基PNA、丙酰PNA以及氨基脯氨酸PNA部分。為了描述這些PNA部分，參見Nielsen et al.，Peptide Nucleic Acids-Protocols andApplications，Horizon Scientific Press，pages 1-19的圖5。Nielsen et al.的第7頁(yè)的圖5以引用方式并入本文中。
PNA可以通過本領(lǐng)域已知的方法化學(xué)合成，例如，通過修飾的Fmoc或tBoc肽合成方案合成。PNA具有許多理想的性質(zhì)，包括高解鏈溫度(Tm)、與核酸的高度堿基配對(duì)特異性以及不帶電荷的分子主鏈。另外，PNA在靶RNA上不提供RNA酶H敏感性，并且通常具有良好的代謝穩(wěn)定性。
肽核酸還可以從Applied Biosystems(Foster City，California，USA)商購(gòu)獲得。
在修飾的胰島小RNA分子的另一實(shí)例中，分子包括至少一個(gè)嗎啉代氨基磷酸酯核苷酸部分。包括嗎啉代氨基磷酸酯核苷酸部分的分子通常稱作嗎啉代(MF)核酸。參見圖1中的結(jié)構(gòu)8。Heasman，Dev.Biol.243，209-214(2002)。嗎啉代寡核苷酸可以從Gene Tools LLC(Corvallis，Oregon，USA)商購(gòu)獲得。
在修飾的胰島小RNA分子的其它實(shí)例中，分子包括至少一個(gè)環(huán)己烯核苷酸部分。包含環(huán)己烯核苷酸部分的分子通常稱作環(huán)己烯核酸(CeNA)。參見圖1中的結(jié)構(gòu)10。Wang et al.，J.Am.Chem.Soc.122，8595-8602(2000)，Verbeure et al.，Nucleic Acids Res.29，4941-4947(2001)。
在修飾的胰島小RNA分子的最后的實(shí)例中，該分子包括至少一個(gè)三環(huán)核苷酸部分。包括三環(huán)核苷酸部分的分子通常稱作三環(huán)核酸(tcDNA)。參見圖1中的結(jié)構(gòu)9。Steffens et al.，J.Am.Chem.Soc.119，11548-11549(1997)，Renneberg et al.，J.Am.Chem.Soc.124，5993-6002(2002)。
分子可以是嵌合修飾的胰島小RNA分子。含有任何上述部分的混合物的嵌合分子也是已知的，并可以通過本領(lǐng)域已知的方法制成。參見，例如上面引用的參考文獻(xiàn)，以及Wang et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，13989-13994(1999)，Liang et al.，Eur.J.Biochem.269，5753-5758(2002)，Lok et al.，Biochemistry 41，3457-3467(2002)，以及Damha et al.，J.Am.Chem.Soc.120，12976-12977(2002)。
本發(fā)明的修飾的胰島小RNA分子包括至少10個(gè)、優(yōu)選至少13個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)、甚至更優(yōu)選至少20個(gè)鄰接堿基，該堿基具有任何在SEQ ID NO1-20中所示的天然存在的胰島小RNA分子的相鄰(鄰接)堿基序列的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，修飾的胰島小RNA分子包括任何在SEQ ID NO1-20中所示的胰島小RNA分子的全部序列。
具有任何堿基序列的任何數(shù)目的另外部分(最大達(dá)到40個(gè)部分)可以添加到包含該相鄰堿基序列的部分，只要分子中的部分的總數(shù)目不超過50。另外的部分可以添加到相鄰序列的5’端、3’端、或兩端。另外的部分可以包括在5’端以發(fā)夾前體(胰島小RNA衍生自其)存在的堿基序列和/或在3’端以發(fā)夾前體存在的堿基序列或其任何片段。該分子中的另外的部分(如果有)，可以是上述的任何修飾或未修飾的部分。
修飾的胰島小RNA分子包括其等效物。等效物包括如上所述的擺動(dòng)堿基和非互補(bǔ)堿基。
此外，不超過50％，優(yōu)選不超過30％的相鄰部分包含脫氧核糖核苷酸主鏈單元。表C和表D示出了對(duì)于各個(gè)數(shù)目的相鄰堿基的脫氧核糖核苷酸主鏈單元的最大數(shù)目。
在另一實(shí)施方式中，除了上述擺動(dòng)堿基對(duì)和非互補(bǔ)堿基，相應(yīng)于天然存在的胰島小RNA序列中的位置11的部分可以添加、缺失或錯(cuò)配。
如上所述，修飾的胰島小RNA分子優(yōu)選是獨(dú)立的，更優(yōu)選是純化的。
表C 50％含有脫氧核糖核苷酸主鏈單元的相鄰部分


表E 30％含有脫氧核糖核苷酸主鏈單元的相鄰部分


在又一
具體實(shí)施例方式
中，帽可以連接到該分子的一端、兩端、和/或兩端之間，以增大上述本發(fā)明的修飾胰島小RNA分子或未修飾分離的DNA或RNA分子的核酸酶的抗性。增大對(duì)例如核酸外切酶和/或核酸內(nèi)切酶的抗性是理想的?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于增大核酸酶抗性的任何帽。
這樣的帽的實(shí)例包括倒置(反向的)核苷酸帽和化學(xué)帽。倒置核苷酸帽可以連接到5’和/或3’端?；瘜W(xué)帽可以連接到該分子的一端、兩端、和/或兩端之間。
倒置核酸帽指的是在5’和/或3’端連接到修飾的胰島小RNA分子或未修飾的DNA或RNA分子的核酸的3’→5’序列。對(duì)倒置帽的核苷酸的最大數(shù)目沒有限制，只要它不干預(yù)胰島小RNA分子或獨(dú)立的DNA或RNA分子結(jié)合到其靶mRNA。任何核苷酸可以用于倒置核苷酸帽。通常，核苷酸帽的長(zhǎng)度少于約40個(gè)核苷酸、優(yōu)選少于約30個(gè)核苷酸、更優(yōu)選少于約20個(gè)核苷酸、甚至更優(yōu)選少于約10個(gè)核苷酸。典型地，倒置核苷酸帽長(zhǎng)度為1個(gè)核苷酸。用于倒置帽的核苷酸通常為胸腺嘧啶，但是可以是任何核苷酸如腺苷、鳥苷、尿啶、或胞啶。
化學(xué)帽指的是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于增大核酸的核酸酶抗性的任何化學(xué)基團(tuán)。這樣的化學(xué)帽的實(shí)例包括羥烷基基團(tuán)(烷基氫氧化物)或氨基烷基基團(tuán)(烷基胺)。羥烷基有時(shí)稱作烷基二醇基團(tuán)(如乙二醇)。氨基烷基有時(shí)稱作氨基連接物。
羥基烷基基團(tuán)或氨基烷基基團(tuán)中的烷基鏈可以是直鏈或支鏈。存在于烷基鏈中的碳原子的最小數(shù)目是1個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，更優(yōu)選至少約3個(gè)碳原子。
存在于烷基鏈中的碳原子的最大數(shù)目為約18個(gè)、優(yōu)選約16個(gè)、更優(yōu)選約12個(gè)。通常烷基包括甲基、乙基、和丙基。烷基可以進(jìn)一步被一個(gè)或多個(gè)羥基和/或氨基基團(tuán)取代。
表E中示出了氨基連接物的一些實(shí)例。列于表E中的氨基連接物可以從加拿大圣地亞哥的TriLink Biotechnologies商購(gòu)獲得。
獨(dú)立的小RNP在另一方面，本發(fā)明提供了獨(dú)立的小RNP，其包括上述任何獨(dú)立的DNA或RNA分子或上述的修飾的胰島小RNA分子。
抗胰島小RNA分子在另一方面，本發(fā)明提供了抗胰島小RNA分子。除了抗胰島小RNA分子的堿基序列與獨(dú)立的DNA或RNA分子或修飾的胰島小RNA分子的堿基序列是互補(bǔ)的之外，該抗胰島小RNA分子可以是任何上述的獨(dú)立DNA或RNA分子或上述的修飾的胰島小RNA分子。
抗胰島小RNA分子的序列的實(shí)例在表F中示出。
表E來自TriLink Biotechnologies的氨基連接物

表F抗胰島小RNA序列


抗胰島小RNA分子可以如上所述被修飾用于修飾的胰島小RNA分子。在一種實(shí)施方式中，抗胰島小RNA分子中相鄰部分與相應(yīng)的胰島小RNA分子互補(bǔ)。抗胰島小RNA分子的互補(bǔ)程度受到與上述對(duì)于修飾的胰島小RNA分子的相同的限制，包括涉及擺動(dòng)堿基對(duì)的限制、以及涉及添加、缺失和錯(cuò)配的限制。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果抗胰腺小RNA分子僅包括未修飾的部分，那么抗胰島小RNA分子包括在至少十個(gè)相鄰堿基中的至少一個(gè)堿基(其與胰島小RNA不互補(bǔ))和/或包括化學(xué)帽。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果抗胰島小RNA分子中的至少十個(gè)相鄰堿基完全(即，100％)互補(bǔ)于胰島小RNA分子，那么抗胰島小RNA分子包含在至少10個(gè)相鄰堿基中的至少一個(gè)修飾的部分和/或包括化學(xué)帽。
在又一實(shí)施方式中，在抗胰島小RNA分子中的對(duì)應(yīng)于天然存在的胰島小RNA的位置11的位置處的部分是非互補(bǔ)的。在抗胰島小RNA分子中的相應(yīng)于天然存在的胰島小RNA的位置11的部分可以通過引入如上所述的添加、缺失、或錯(cuò)配來使得是非互補(bǔ)的。
應(yīng)用本發(fā)明的胰島小RNA分子和抗胰島小RNA分子在體外、離體、和體內(nèi)具有大量的應(yīng)用。
例如，本發(fā)明的小RNA分子和/或抗小RNA分子可以引入細(xì)胞中以研究小RNA的功能。上述的任何胰島小RNA分子和/或抗胰島小RNA可以被引入到細(xì)胞中以研究它們的功能。
在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞中的小RNA用合適的抗胰島小RNA分子進(jìn)行抑制。可替換地，細(xì)胞中胰島小RNA分子的活性可以通過將一個(gè)或多個(gè)另外的小RNA分子引入細(xì)胞來提高?？梢酝ㄟ^觀察與抑制和/或提高細(xì)胞內(nèi)小RNA的活性相關(guān)的變化來推知小RNA的功能。
在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明涉及用于抑制細(xì)胞中小RNP活性的方法。用于抑制細(xì)胞中小RNP活性的方法包括將單鏈抗胰島小RNA分子引入細(xì)胞內(nèi)。該小RNP包括胰腺小RNA分子。任何抗胰島小RNA分子可以用于抑制細(xì)胞中小RNP活性的方法，只要該抗胰島小RNA分子與存在于小RNP中的胰島小RNA是互補(bǔ)的(受上述限制)。
本發(fā)明的抗胰島小RNA分子能夠通過結(jié)合到宿主細(xì)胞小RNP中的胰島小RNA來抑制小RNP的活性。小RNP活性指的是靶序列的切割或翻譯抑制。靶序列可以是任何部分或完全與胰島小RNA中的堿基序列互補(bǔ)的序列。靶序列可以為例如控制葡萄糖利用的基因。
例如，胰島細(xì)胞可以產(chǎn)生小RNA，該小RNA互補(bǔ)于涉及葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的基因。該小RNA分子(其裝配在小RNP中)將抑制葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的有利效應(yīng)。因此，抗小RNA分子的引入抑制了小RNP活性，從而通過恢復(fù)該基因的功能而減少損害。
可替換地，不引入上述的抗小RNA分子，而是將另外的小RNA分子引入胰島細(xì)胞中。因此，用于葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的基因?qū)⒈灰种?，從而降低該?xì)胞應(yīng)答葡萄糖而分泌胰島素的能力。
小RNA分子和/或抗小RNA分子可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法被引入細(xì)胞中。例如，小RNA分子和/或抗小RNA分子可以通過如顯微注射直接注入細(xì)胞中。可替換地，該分子與細(xì)胞接觸，優(yōu)選借助于遞送系統(tǒng)。
有用的遞送系統(tǒng)包括，例如脂質(zhì)體和帶電荷的脂質(zhì)。脂質(zhì)體通常將寡核苷酸分子封裝在它們的水性中心。帶電荷的脂質(zhì)一般由于相反電荷形成脂質(zhì)-寡核苷酸分子復(fù)合物。
這些脂質(zhì)體-寡核苷酸分子復(fù)合物或脂質(zhì)-寡核苷酸分子復(fù)合物通常通過胞吞作用而在細(xì)胞中內(nèi)在化。這些脂質(zhì)體或帶電荷的脂質(zhì)通常包括輔助脂質(zhì)，其破壞內(nèi)體膜并釋放寡核苷酸分子。
用于將小RNA分子或抗小RNA引入細(xì)胞中的其它方法包括利用遞送載體，如樹形化合物、可生物降解的聚合物、氨基酸的聚合物、糖的聚合物、以及寡核苷酸結(jié)合的納米顆粒。此外，作為儲(chǔ)存庫(kù)(depot reservoir)的普郎尼克酸凝膠(pluoronic gel)可以用于長(zhǎng)期遞送抗小RNA寡核苷酸分子。上述方法描述在，例如，Hughes etal.，Drug Discovery Today 6，303-315(2001)；Liang et al.Eur.J.Biochem.269 5753-5758(2002)；and Becker et al.，In AntisenseTechnology in the Central Nervous System(Leslie，R.A.，Hunter，A.J.&Robertson，H.A.，eds)，pp.147-157，Oxford University Press.
將小RNA分子或抗小RNA分子靶向特定的細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行。例如，小RNA分子或抗小RNA分子可以軛合至由細(xì)胞上的受體特異性識(shí)別的抗體或配體。例如，該配體可以為GLP-1(胰高血糖素類肽)，其結(jié)合在胰腺β細(xì)胞上表達(dá)的GLP受體?？商鎿Q地，可以采用GLP-1的抗體。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于治療需要其的哺乳動(dòng)物中的糖尿病的方法。該方法包括將有效量的抗胰島小RNA分子引入哺乳動(dòng)物中，其中抗胰島小RNA分子具有在SEQ ID NO41或51中所示序列的至少十個(gè)相鄰堿基。有效量可以通過內(nèi)科醫(yī)師和臨床醫(yī)師熟悉的方法在臨床前試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)期間加以確定。
抗胰島小RNA分子可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法引入哺乳動(dòng)物中。例如，上述用于將抗胰島分子引入細(xì)胞的方法也可以用于將該分子引入哺乳動(dòng)物中。
該分子可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法給予哺乳動(dòng)物。合適的給予方式的一些實(shí)例包括口服和系統(tǒng)給予。系統(tǒng)給予可以是經(jīng)腸的或腸道外的?？梢允褂靡后w或固體(如片、明膠膠囊)制劑。
該分子的腸道外給予包括例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、和皮下注射。例如，本領(lǐng)域已知的，分子可以通過緩釋方式給予哺乳動(dòng)物。緩釋給予一種使藥物在一定時(shí)間內(nèi)達(dá)到一定水平的藥物遞送方法。
其它給予途徑包括口服、局部、支氣管內(nèi)、或鼻內(nèi)給予。對(duì)于口服給藥，可以使用液體或固體制劑。適用于口服給藥劑型的一些實(shí)例包括片劑、明膠膠囊、丸劑、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、和糯米紙囊劑(wafer)。支氣管內(nèi)給藥可以包括吸入器噴霧。對(duì)于鼻內(nèi)給藥，本發(fā)明分子的給予可以通過噴霧器或液體噴霧來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的分子可以處于合適的藥物載體中。在本說明書中，藥物載體被認(rèn)為與本領(lǐng)域的實(shí)踐者理解的載體(媒介物)或賦形劑同義。載體的實(shí)例包括淀粉、奶、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物油脂或油、樹膠以及二醇。
藥物載體還可以包括下述物質(zhì)中的一種或多種穩(wěn)定劑、表面活性劑、優(yōu)選非離子型表面活性劑、以及可選的鹽和/或緩沖劑。
穩(wěn)定劑可以為例如氨基酸，如甘氨酸；或寡糖，如蔗糖、四糖、乳糖或葡聚糖。可替換地，穩(wěn)定劑可以是糖醇，如甘露醇；或其組合。優(yōu)選地，穩(wěn)定劑或穩(wěn)定劑的組合占該分子重量的約0.1％到約10％的重量。
表面活性劑優(yōu)選非離子型表面活性劑，如聚山梨醇酯。合適的表面活性劑的一些實(shí)例包括吐溫20，吐溫80；聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙烯二醇，如為約從0.001％(w/v)到約10％(w/v)的Pluronic F-68。
鹽或緩沖劑可以分別為任何鹽或緩沖劑，例如分別是氯化鈉或磷酸鈉/磷酸鉀。優(yōu)選地，緩沖劑將本發(fā)明分子的pH維持在約5.5到約7.5的范圍內(nèi)。鹽和/或緩沖劑也可以用于將摩爾滲透壓濃度維持在適于給于至哺乳動(dòng)物的水平。優(yōu)選地，鹽或緩沖劑以粗略地約150mM到約300mM的等滲濃度存在。
藥物載體還可以另外地包含一種或多種常規(guī)的添加劑。這樣的添加劑的一些實(shí)例包括增溶劑，如甘油；抗氧化劑，如殺藻胺(季銨化合物的混合物，稱為“quart”)、苯甲醇、氯惹酮或氯代丁醇；麻醉劑，如嗎啡衍生物；或等滲劑等，如上面所述的。作為針對(duì)氧化或其它酸敗的進(jìn)一步的防范，可以將該分子儲(chǔ)存在氮?dú)夥障碌挠梅菨B透性的塞子密封的小瓶中。
實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法小RNA克隆和RNA印跡分析利用TRIZOL試劑(Invitrogen)從MIN6細(xì)胞培養(yǎng)物中分離600μg的全部RNA并根據(jù)前述(Lagos-Quintana，Current Biol.)進(jìn)行小RNA克隆化。設(shè)計(jì)反義探針以補(bǔ)充克隆的小RNA序列并根據(jù)前述(Lagos-Quintana，CurrentBiol.)將該反義探針用于RNA印跡分析。
細(xì)胞培養(yǎng)用含有25mM葡萄糖、15％胎牛血清、以及5.5μM2-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MIN6細(xì)胞。用含有25mM葡萄糖和10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)N2A細(xì)胞。
胰島素分泌研究在進(jìn)行測(cè)定前，將MIN6細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)2天，并且用改性的Krebs-Ringer緩沖液(KRBH)(0.9mMCaCl2、2.68mM KCl、1.46Mm KH2PO4、0.5mM MgCl2·6H2O、135mMNaCl、8mM Na2HPO4×7H2O、20mM Hepes、以及0.2％BSA)沖洗。在用含有5.5mM的葡萄糖的KRBH預(yù)先孵育30分鐘，漂洗細(xì)胞并將細(xì)胞在具有或者2.8mM葡萄糖、25mM葡萄糖、30mM KCl、500mM甲苯磺丁脲、或5mM丙酮酸甲酯的KRBH孵育60分鐘。利用RIA(Linco Research)測(cè)量上清液中胰島素的濃度。
重組腺病毒的產(chǎn)生用于過度表達(dá)miR-375的重組腺病毒通過利用引物5’-CCCCAAGGCTGATGCTGAGAAGCCGCCCC-3’和5’-GCCGCCCGGCCCCGGGTCTTC-3’擴(kuò)增miRNA前體序列的PCR產(chǎn)生。該片段被亞克隆入pcDNA 3(Invitrogen)中，用HindIII和Xbal切除并插入Ad5CMV-K NpA穿梭載體。通過Viraquest Inc.(North Liberty，IA)進(jìn)行腺病毒的擴(kuò)增。Ad-GFP(ViraQuest Inc.)不含有轉(zhuǎn)基因并用作對(duì)照。
電生理學(xué)和Ca2+測(cè)量利用膜片鉗技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)全細(xì)胞構(gòu)造在感染包含對(duì)照-GFP或miRNA208-GFP的腺病毒后，在單分散的B細(xì)胞上進(jìn)行≥24小時(shí)的胞吐和向內(nèi)Ca2+電流的測(cè)量。利用基于軟件的鎖定脈沖實(shí)現(xiàn)(lock-in implementation of Pulse)(Heka Electronics.Lamprecht/Pfalz，Germany)，以細(xì)胞電容的變化檢測(cè)胞吐作用。所施加的正弦波的頻率為500Hz，峰值振幅為20mV。在利用a-p/4方案數(shù)字地除去漏電流和電容瞬態(tài)(capacitive transient)后測(cè)量Ca2+電流。胞外溶液包含(以mM計(jì))118NaCl、20mM氯化四乙銨(TEA-Cl)、5.6KCl、2.6CaCl2、1.2MgCl2、5HEPES(pH＝7.4)和5葡萄糖。在胞吐被電壓鉗去極化引發(fā)的試驗(yàn)中，胞內(nèi)溶液(以mM計(jì))由125Cs-谷氨酸鹽、10CsCl、10NaCl、1MgCl2、5HEPES(pH＝7.15，用CsOH)、0.05EGTA、3Mg-ATP和0.1環(huán)狀A(yù)MP組成。在一系列試驗(yàn)中，用(以mM計(jì))由125Cs-谷氨酸鹽、10KCl、10NaCl、1MgCl2、3Mg-ATP、0.1cAMP、10HEPES、10EGTA和9CaCl2構(gòu)成的培養(yǎng)基滲析細(xì)胞內(nèi)部引起胞吐。估計(jì)該溶液的游離Ca2+濃度為1.5μM。該試驗(yàn)在功能性鑒定的α-和β-細(xì)胞上進(jìn)行。細(xì)胞的鑒定如前所述完成。
游離細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)通過別處所述的雙重激發(fā)波長(zhǎng)熒光光譜法進(jìn)行測(cè)量。在存在0.007％w/v普盧蘭尼克酸(pluronicacid)(分子探針)下，轉(zhuǎn)染的(胰)島用3μM fura-2在37℃加載40分鐘。染料在350nm和365nm被激發(fā)。后一波長(zhǎng)用于替換380nm以便避免GFP的激發(fā)。在510nm處收集發(fā)射光。在這些試驗(yàn)期間，(胰)島通過固定吸液管而保持在原位并用含有(以mM計(jì))140NaCl、3.6KCl、2NaHCO3、0.5NaH2PO4、0.5MgSO4、2.6CaCl2、5HEPES(pH＝0.74，mM，用NaOH)和5mM葡萄糖的培養(yǎng)基連續(xù)傾注。葡萄糖濃度增加到15mM并且根據(jù)指示加入濃度為0.1mM磺脲甲苯磺丁脲。當(dāng)(胰)島用高細(xì)胞外K+(加入30mM KCl)去極化時(shí)，NaCl濃度也相應(yīng)降低以維持等摩爾滲透壓濃度。所有的電生理學(xué)試驗(yàn)和Ca2+測(cè)量都在32-34℃下進(jìn)行。
利用共焦顯微鏡并利用fluo-3而不是fura-2來評(píng)估(胰)島的感染和Ca2+指示劑加載。利用Zeiss LSM510顯微鏡(Carl Zeiss，Jena，Germany)的488nm光線來進(jìn)行eGFP和fluo-3的激發(fā)。通過利用共焦顯微鏡的META裝置分離發(fā)射光并利用40×水物鏡觀察發(fā)射光。
熒光素酶活性的測(cè)定利用以下引物5’TCCATCATTTCATATGCACTGTATC3’和5’TCATATCGTTAAGGACGTCTGGAAA3’對(duì)野生型小鼠肌營(yíng)養(yǎng)素(myotrophin)3’UTR靶位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并亞克隆入pCR 2.1 TOPO(Invitrogen)。用SpeI和XbaI去除該片段并隨后亞克隆入pRL-TK(Promega)中緊接終止密碼子下游的XbaI位點(diǎn)。該構(gòu)造用于根據(jù)方案(Stratagene)，利用引物5’AAGTTTCGTGTTGCAAG C TGGAATAAACTTGAATTGTGC3’和5’GCACAATTCAAGTTTATTCCA G CTTGCAA CACGAA ACTT3’產(chǎn)生突變小鼠肌營(yíng)養(yǎng)素質(zhì)粒；粗體和下劃線的表示突變的核苷酸。MIN6細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)2天并用0.4μg編碼Rr-luc的pRL-TK報(bào)道載體和0.1μg編碼Pp-luc的pGL3對(duì)照載體加以轉(zhuǎn)染(Promega)。轉(zhuǎn)染后30-36小時(shí)收集細(xì)胞并進(jìn)行測(cè)定。
miR-375靶的鑒定為了鑒定miR-375靶，我們采用了最近開發(fā)的算法[N.Rajewsky and N.D.Socci，Developmental Biology 267，529-535(2004)]。該算法由兩個(gè)步驟組成(a)尋找在小RNA和mRNA的3’UTR中的公認(rèn)靶序列之間的連續(xù)互補(bǔ)堿基的富GC串(核)和(b)預(yù)測(cè)的小RNAmRNA雙鏈體的自由能的硅評(píng)估。我們對(duì)Refseq數(shù)據(jù)集采用該算法。從Refseq注解提取3’UTR。該數(shù)據(jù)集包括18199人和13371小鼠的長(zhǎng)度為至少30個(gè)核苷酸的3’UTR。根據(jù)[Lewis BP，Shih 1H，Jones-Rhoades MW，Bartel DP，Burge CB，Prediction of mammalian microRNA targets.Cell 787-98(2003)]，我們限制該核的位置在從小RNA的5’端的2個(gè)堿基范圍內(nèi)。設(shè)定了核劃線的捷徑以便保留頂端8％的采樣數(shù)。然后這些采樣數(shù)借助于MFOLD通過其預(yù)測(cè)的mRNAmiRNA雙鏈體自由能進(jìn)行劃線(Zuker，NAR 3406-15，2003詳細(xì)參見Rajewsky and Socci)。
siRNA和2’-O-甲基寡核糖核苷酸由Dharmacon Research(Lafayette，Co)合成了合成的小RNA和siRNA。從小鼠肌營(yíng)養(yǎng)素(NM_008098)和小鼠Vti1A(NM_016862)序列設(shè)計(jì)siRNASMARTPOOL。如前所述(Meister et al.，RNA)合成所有的2’-O-甲基寡核糖核苷酸。利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)以200nM的濃度將所有的試劑轉(zhuǎn)染到MIN6細(xì)胞中。
抗體用于蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)的抗體從多種不同來源獲得α-肌營(yíng)養(yǎng)素(由Masato Taoka捐贈(zèng))、α-Vtila(BDTransduction Laboratoties)、α-p38 MAPK(Cell Signaling)、α-MCT8(由Andrew Halestrap捐贈(zèng))、α-TATA盒結(jié)合蛋白(由R.Roeder捐贈(zèng))。
RNA印跡分析利用TRIZOL試劑(Invitrogen)提取全部RNA并加載到15％聚丙烯胺或瓊脂糖凝膠上。在電泳后，將RNA轉(zhuǎn)移到Hybond膜(Amersham)并探測(cè)。用于小鼠肌營(yíng)養(yǎng)素的DNA探針利用引物5’GTGGGCCCTGAAAAACGGAGACTTG3’和5’CCCTTTGACAGAAGCAATTTCACGC3’生成。
實(shí)施例2胰島小RNA來自MIN6細(xì)胞的小RNA，葡萄糖應(yīng)答鼠胰腺β-細(xì)胞系被克隆。我們獲得了全部301個(gè)小RNA克隆體，其含有55種不同的小RNA。在55種不同的小RNA中，92％為先前鑒定的小RNA而8％為至今還未鑒定的小RNA。通過Blast序列分析鑒定了在各種基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知和新的miRNA，并通過交叉物種同源性(cross-species homology)和它們形成典型的發(fā)夾前體結(jié)構(gòu)的能力被證實(shí)。
全部9種新的小RNA被鑒定并且單一小RNA(miR-375)占＞50％的全部新的克隆體(圖2a)。接下來我們通過RNA印記分析考查了新型小RNA的表達(dá)。通過RNA印記分析僅小RNA375和376可以從MIN6細(xì)胞和胰島中檢測(cè)到(圖2b)。這兩種小RNA的表達(dá)限于MIN6細(xì)胞和胰島，并且沒有在其它組織(包括肝、肺、腸、腦、腎和睪丸)中發(fā)現(xiàn)(圖2b、c)。這些數(shù)據(jù)表明我們已經(jīng)鑒定了新的胰島小RNA。
實(shí)施例3miR-375對(duì)分泌的抑制作用為了分析具有高表達(dá)水平和對(duì)胰腺β細(xì)胞的相對(duì)組織特異性的小RNA的作用，我們檢測(cè)了具有與小RNA-375和-376同源序列的合成siRNA在轉(zhuǎn)染后對(duì)MIN6細(xì)胞中的葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的作用。除了這些siRNA，我們?cè)贑MV啟動(dòng)子控制下共轉(zhuǎn)染了表達(dá)人生長(zhǎng)激素(hGH)的載體(CMV-hGH)。先前已表明異源表達(dá)的hGH靶向胰腺β-細(xì)胞系的分泌顆粒并且在胞外分泌(胞吐作用)啟動(dòng)后與胰島素共同釋放。這種方法允許我們選擇性地監(jiān)測(cè)來自瞬變(過渡)轉(zhuǎn)染的MIN6細(xì)胞(轉(zhuǎn)染效率20-30％)的胞外釋放。作為正和負(fù)對(duì)照，將靶向葡糖激酶基因(Gck)或載酯蛋白M(apoM)(一種在胰腺β細(xì)胞中不表達(dá)的基因)的siRNA用CMV-hGH共轉(zhuǎn)染入MIN6細(xì)胞。
在轉(zhuǎn)染有si-Gck和si-375的細(xì)胞中，響應(yīng)25mM葡萄糖刺激的生長(zhǎng)激素分泌顯著降低(圖3)。針對(duì)apoM的合成siRNA或與若干其它小RNA(包括miR-376、miR-124、-129、-130、和-210)同源的siRNA的轉(zhuǎn)染對(duì)基本的或葡萄糖刺激的胰島素分泌沒有影響(圖3，數(shù)據(jù)未示出)。
基于反義的方案目前已顯示出特異性地抑制在培養(yǎng)細(xì)胞中的miRNA的功能。我們用載體CMV-hGH共轉(zhuǎn)染了對(duì)miR-375的核酸酶抗性的2’-O-甲基反義寡核糖核苷酸并測(cè)量了響應(yīng)葡萄糖刺激的胰島素分泌。我們注意到與對(duì)照抗-GFP 2’-O-甲基寡核糖核苷酸相比，轉(zhuǎn)染有抗-miR-375的細(xì)胞在葡萄糖刺激的胰島素分泌方面增加(圖3b)。綜合起來，這些數(shù)據(jù)表明miR-375是胰島素分泌的抑制劑。
隨后我們?cè)贑MV5啟動(dòng)子的控制下，通過克隆含有前體序列的123bp片段生成了表達(dá)miR-375的重組腺病毒。HEK細(xì)胞感染有表達(dá)eGFP的對(duì)照腺病毒(Ad-GFP)或表現(xiàn)出miR-375表達(dá)劑量依賴性增加的增大濃度的Ad-375顆粒。我們還利用腺病毒感染在MIN6細(xì)胞中表達(dá)了miR-375。與感染有對(duì)照腺病毒的細(xì)胞相比，表達(dá)miR-375的MIN6細(xì)胞在葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌上表現(xiàn)出40％的減少(圖4)。胰島素分泌的缺陷似乎不是由缺陷性胰島素產(chǎn)生所引起，因?yàn)樵贏d-375和Ad-eGFP感染的MIN6細(xì)胞和胰島中的胰島素含量等價(jià)。
實(shí)施例4細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)化和全細(xì)胞鈣電流需要糖解流量(glycolytic flux)和線粒體氧化磷酸化的增加以通過借助于胞質(zhì)ATP/ADP比率的增加而誘導(dǎo)ATP敏感的K+通道(KATP)的關(guān)閉來產(chǎn)生用于葡萄糖所致的胰島素分泌的第二信號(hào)。這導(dǎo)致膜去極化和Ca++通過電壓依賴性Ca++通道的流量。[Ca++]I的升高是胰島素顆粒胞外分泌的必要先決條件?；请逅幬?如格列本脲(glibenclamide))通過直接阻斷KATP而刺激胰島素分泌。KCl導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞的直接去極化并且導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)性胰島素顆粒的最大脫粒。在甲苯磺丁脲和KCl刺激的Ad-375感染的MIN6細(xì)胞中，我們測(cè)量了胰島素分泌。與Ad-eGFP感染的細(xì)胞相比，用這些促分泌素對(duì)胰腺β細(xì)胞的刺激表明Ad-375感染的細(xì)胞中的胰島素分泌受損。此外，與Ad-eGFP感染的MIN6細(xì)胞相比，Ad-375表達(dá)也損害響應(yīng)GLP-1(一種有效的通過活化camp的葡萄糖依賴性胰島素分泌的刺激劑)的胰島素分泌。這些數(shù)據(jù)表明miR-375的過度表達(dá)導(dǎo)致涉及胰島素分泌的末端步驟(distal steps)的缺陷，可能影響胰腺β細(xì)胞中胞質(zhì)Ca++的增加或干預(yù)胞外分泌。
為了檢測(cè)是否miR-375損害了對(duì)于觸發(fā)胰島素胞外分泌所需的第二信號(hào)的產(chǎn)生，我們測(cè)量了在感染有Ad-375或?qū)φ誂d-eGFP的胰島中的細(xì)胞內(nèi)Ca++濃度[Ca2+]i。通過三種不同的刺激物刺激每個(gè)胰島以提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。在對(duì)照和Ad-375表達(dá)胰島中，葡萄糖濃度從5mM增加到15mM產(chǎn)生了Ca2+濃度的振蕩。用甲苯磺丁脲刺激時(shí)也可以觀察到同樣的振蕩。在對(duì)照和Ad-375表達(dá)胰島中，靜止[Ca2+]i分別平均為0.13±0.01μM和0.12±0.01μM。在存在15mM葡萄糖的情況下，時(shí)間平均[Ca2+]i在對(duì)照胰島中總計(jì)達(dá)0.42±0.12μM而在表達(dá)Ad-375的胰島中總計(jì)達(dá)0.39±0.05μM。在存在甲苯磺丁脲的情況下，相應(yīng)的值在對(duì)照胰島中為0.53±0.11μM而在Ad-375感染的胰島中為0.55±0.11μM。最后，用高細(xì)胞外K+去極化增加對(duì)照和Ad-375-感染的胰島中的[Ca2+]i至同樣程度，并且峰[Ca+]i平均值分別為0.85±0.24μM和1.01±0.31μM(數(shù)據(jù)未示出)。利用非比率計(jì)染料fluo-3(參見上述)獲得定性的類似觀察結(jié)果。此外，當(dāng)在eGFP表達(dá)的孤立細(xì)胞上進(jìn)行測(cè)定時(shí)，除了更深的非感染細(xì)胞層的貢獻(xiàn)，在葡萄糖響應(yīng)方面同樣沒有觀察到區(qū)別(數(shù)據(jù)未示出)。胰島周圍富集了非β細(xì)胞。然而，在5mM葡萄糖處沒有觀察到震蕩以及升高至15mM時(shí)增加了[Ca2+]i的事實(shí)表明我們已選擇了β細(xì)胞富集區(qū)，因?yàn)棣募?xì)胞在低濃度下已經(jīng)有活性和α細(xì)胞在高濃度下應(yīng)被抑制。
調(diào)節(jié)從MIN6細(xì)胞和孤立胰島的胰島素分泌的的表征表明，miR-375表達(dá)可能影響胰島素分泌下游的[Ca2+]i信號(hào)化，可能在胞外分泌的水平上。為了說明這種假設(shè)，我們采用容量測(cè)量以功能性地鑒定β細(xì)胞。胞外分泌通過一連串的10個(gè)在1Hz施加的從-70mV至0mV的500ms去極化加以誘導(dǎo)(圖3A)。在β細(xì)胞中，該一連串去極化在對(duì)照條件下誘導(dǎo)了膜容量增加837±244fF(n＝9)。在用Ad-375感染的細(xì)胞中，相應(yīng)的增加限于94±27fF(n＝10；P＜0.01)，少了85％。一旦通過用1.5μM的游離Ca2+濃度代替Ca2+/EGTA緩沖液來誘導(dǎo)胞外分泌，也可以獲得類似的結(jié)果(圖2D-E)，并且這些實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照細(xì)胞相比，在Ad-375感染的細(xì)胞中容量增加的比率減少63％(P＜0.01；n＝15-17)。
實(shí)施例5靶基因的鑒定我們采用了將RNARNA雙鏈體相互作用的基于熱動(dòng)力學(xué)的模式與比較序列分析組合的算法以預(yù)測(cè)跨越多個(gè)基因組保存的小RNA靶。根據(jù)64個(gè)推定的miR-375靶基因的編譯列表，我們基于其在胰島素分泌/島差異化方面的可能作用選擇6個(gè)基因用于確認(rèn)研究。
這些基因包括卷曲的同族體-4(Fzd4)，通過與t-SNARE酵母同族體1A(Vti-1a)相互作用傳輸?shù)呐菽?、V-1/肌營(yíng)養(yǎng)素(V-1/Mtpn)、p38有絲分裂原活化的蛋白質(zhì)激酶(Mapk11)、一元羧酸傳輸膜8(Slc16A2)和配對(duì)的盒蛋白質(zhì)Pax-6。這些基因的表達(dá)通過在用Ad-375或Ad-eGFP感染的MIN6和N2A細(xì)胞中進(jìn)行的免疫印跡技術(shù)進(jìn)行研究。miR-375在N2A細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(其不表達(dá)內(nèi)源性miR-375)導(dǎo)致Mtpn和Vti-1a的表達(dá)水平降低(圖4A、5B)。
相反，F(xiàn)zd4、Mapk11和Slc16A2的基因表達(dá)在Ad-375和Ad-eGFP感染的細(xì)胞中相當(dāng)。利用重組腺病毒Ad-375在MIN6細(xì)胞中過度表達(dá)miR-375還降低了Mtpn的蛋白水平，但對(duì)Vti-1a、Fzd4、Mapk11和Slc16A2的表達(dá)沒有作用。
為了考查在Mtpn mRNA的3’UTR中的預(yù)測(cè)miR-375靶位點(diǎn)是否負(fù)責(zé)由miR-375表達(dá)的Mtpn的噪聲抑制，我們克隆了包括推定的3’UTR靶位點(diǎn)下游的水母熒光酶ORF(pRL-Mtpn)的289nt3’UTR片段，并將這種報(bào)道載體用對(duì)照反義2′-O-甲基寡核糖核苷酸或miR-375反義2′-O-甲基寡核糖核苷酸(2′-O-miR-375)共轉(zhuǎn)染入MIN6細(xì)胞內(nèi)。與用對(duì)照2′-O-miRNA和pRL-Mtpn共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用2′-O-miR-375感染的細(xì)胞的熒光素酶活性增加了約2倍。此外，在miR-375靶位點(diǎn)的核內(nèi)形成點(diǎn)突變，從而降低在同源性miR-375和V-1/肌營(yíng)養(yǎng)素靶位點(diǎn)之間的互補(bǔ)性，消除2′-O-miR-375對(duì)熒光素酶活性的刺激作用(圖5)。因此，Mtpn是胰腺β細(xì)胞內(nèi)miR-375的靶并且Mtpn基因表達(dá)的抑制是通過在Mtpn基因的3’UTR中的單個(gè)miR-375靶位點(diǎn)來調(diào)節(jié)的。
為了檢測(cè)在MIN6細(xì)胞中Mtpn表達(dá)的降低是否可以有助于在Ad-375感染細(xì)胞中觀察到的葡萄糖誘導(dǎo)胰島素分泌的缺陷，將MIN6細(xì)胞用靶向阿樸脂蛋白M(對(duì)照)和Mtpn的siRNA轉(zhuǎn)染，并且將蛋白質(zhì)表達(dá)水平用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行測(cè)定。靶向Mtpn和Vti-1a的siRNA降低了這些基因的＞50％的表達(dá)(圖4c)。這些基因的基因噪聲抑制對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的作用通過siRNA和質(zhì)粒pCMV-hGH各自的共轉(zhuǎn)染來研究。響應(yīng)于25mM葡萄糖刺激的胰島素分泌在轉(zhuǎn)染2天后進(jìn)行測(cè)量。與用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，在用靶向Mtpn的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中胰島素分泌降低了約30％(圖4d)。Vti-1a的RNA噪聲抑制對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌沒有作用。
序列表<110>洛克菲勒大學(xué)<120>胰島小RNA及抑制其的方法<130>1119-14<140>10/824,633<141>2004-04-13<160>68<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>RNA<213>智人<400>1uuuguucguu cggcucgcgu ga22<210>2<211>21<212>RNA<213>智人<400>2aucauagagg aaaauccacg u 21<210>3<211>22<212>RNA<213>智人<400>3aucacacaaa ggcaacuuuu gu22<210>4<211>22<212>RNA<213>智人<400>4cuccugacuc cagguccugu gu22<210>5<211>19<212>RNA<213>智人<400>5ugguagacua uggaacgua19<210>6<211>19<212>RNA<213>智人<400>6ugguugacca uagaacaug19<210>7<211>22<212>RNA<213>智人
<400>7uauacaaggg caagcucucu gu22<210>8<211>22<212>RNA<213>智人<400>8gaaguuguuc gugguggauu cg22<210>9<211>22<212>RNA<213>智人<400>9agaucagaag gugacugugg cu22<210>10<211>20<212>RNA<213>智人<400>10auuccuagaa auuguucaua 20<210>11<211>22<212>RNA<213>鼠<400>11uuuguucguu cggcucgcgu ga22<210>12<211>21<212>RNA<213>鼠<400>12aucguagagg aaaauccacg u 21<210>13<211>22<212>RNA<213>鼠<400>13aucacacaaa ggcaacuuuu gu22<210>14<211>22<212>RNA<213>鼠<400>14cuccugacuc cagguccugu gu22<210>15<211>19<212>RNA<213>鼠<400>15ugguagacua uggaacgua19
<210>16<211>19<212>RNA<213>鼠<400>16ugguugacca uagaacaug 19<210>17<211>22<212>RNA<213>鼠<400>17uauacaaggg caagcucucu gu 22<210>18<211>22<212>RNA<213>鼠<400>18gaaguuguuc gugguggauu cg 22<210>19<211>22<212>RNA<213>鼠<400>19agaucagaag gugacugugg cu 22<210>20<211>20<212>RNA<213>鼠<400>20auuccuagaa auuguucaca20<210>21<211>64<212>RNA<213>智人<400>21ccccgcgacg agccccucgc acaaaccgga ccugagcguu uuguucguuc ggcucgcgug60aggc 64<210>22<211>68<212>RNA<213>智人<400>22uaaaagguag auucuccuuc uaugaguaca uuauuuauga uuaaucauag aggaaaaucc60acguuuuc 68<210>23<211>69<212>RNA<213>智人<400>23uugagcagag guugcccuug gugaauucgc uuuauuuaug uugaaucaca caaaggcaac60
uuuuguuug69<210>24<211>66<212>RNA<213>智人<400>24ggggcuccug acuccagguc cuguguguua ccucgaaaua gcacuggacu uggagucaga60aggccu 66<210>25<211>67<212>RNA<213>智人<400>25agagauggua gacuauggaa cguaggcguu augauuucug accuauguaa caugguccac60uaacucu 67<210>26<211>61<212>RNA<213>智人<400>26aagaugguug accauagaac augcgcuauc ucugugucgu auguaauaug guccacaucu60u61<210>27<211>75<212>RNA<213>智人<400>27uacuuaaagc gagguugccc uuuguauauu cgguuuauug acauggaaua uacaagggca60agcucucugu gagua 75<210>28<211>76<212>RNA<213>智人<400>28uacuugaaga gaaguuguuc gugguggauu cgcuuuacuu augacgaauc auucacggac60aacacuuuuu ucagua76<210>29<211>73<212>RNA<213>智人<400>29cuccucagau cagaagguga uuguggcuuu ggguggauau uaaucagcca cagcacugcc60uggucagaaa gag 73<210>30<211>88<212>RNA<213>智人
<400>30uguuaaauca ggaauuuuaa acaauuccua gacaauaugu auaauguuca uaagucauuc60cuagaaauug uucauaaugc cuguaaca88<210>31<211>64<212>RNA<213>鼠<400>31ccccgcgacg agccccucgc acaaaccgga ccugagcguu uuguucguuc ggcucgcgug60aggc 64<210>32<211>68<212>RNA<213>鼠<400>32uaaaagguag auucuccuuc uaugaguaca auauuaauga cuaaucguag aggaaaaucc60acguuuuc 68<210>33<211>68<212>RNA<213>鼠<400>33ugagcagagg uugcccuugg ugaauucgcu uuauugaugu ugaaucacac aaaggcaacu60uuuguuug 68<210>34<211>66<212>RNA<213>鼠<400>34ggggcuccug acuccagguc cuguguguua ccucgaaaua gcacuggacu uggagucaga60aggccu 66<210>35<211>66<212>RNA<213>鼠<400>35agagauggua gacuauggaa cguaggcguu auguuuuuga ccuauguaac augguccacu60aacucu 66<210>36<211>61<212>RNA<213>鼠<400>36aagaugguug accauagaac augcgcuacu ucugugucgu auguaguaug guccacaucu60u61<210>37<211>75<212>RNA
<213>鼠<400>37uacuuaaagc gagguugccc uuuguauauu cgguuuauug acauggaaua uacaagggca60agcucucugu gagua 75<210>38<211>76<212>RNA<213>鼠<400>38uacuugaaga gaaguuguuc gugguggauu cgcuuuacuu gugacgaauc auucacggac60aacacuuuuu ucagua76<210>39<211>70<212>RNA<213>鼠<400>39cucagaucag aaggugacug uggcuuuggg uggauauuaa ucagccacag cacugccugg60ucagaaagag 70<210>40<211>88<212>RNA<213>鼠<400>40uguuaaauca ggaauuguaa acaauuccua ggcaaugugu auaauguugg uaagucauuc60cuagaaauug uucacaaugc cuguaaca 88<210>41<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>41ucacgcgagc cgaacgaaca aa22<210>42<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>42acguggauuu uccucuauga u 21<210>43<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>43acaaaaguug ccuuugugug au22
<210>44<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>44acacaggacc uggagucagg ag22<210>45<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>45uacguuccau agucuacca19<210>46<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>46cauguucuau ggucaacca19<210>47<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>47acagagagcu ugcccuugua ua22<210>48<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>48cgaauccacc acgaacaacu uc22<210>49<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>49agccacaauc accuucugau cu22<210>50
<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>50uaugaacaau uucuaggaau20<210>51<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>51ucacgcgagc cgaacgaaca aa 22<210>52<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA序列<400>52acguggauuu uccucuacga u 21<210>53<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>53acaaaaguug ccuuugugug au 22<210>54<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>54acacaggacc uggagucagg ag 22<210>55<211>19<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>55uacguuccau agucuacca 19<210>56<211>19<212>RNA<213>人工序列
<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>56cauguucuau ggucaacca19<210>57<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>57acagagagcu ugcccuugua ua22<210>58<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA序列<400>58cgaauccacc acgaacaacu uc22<210>59<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>59agccacaguc accuucugau cu22<210>60<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>抗胰島小RNA分子<400>60ugugaacaau uucuaggaau 20<210>61<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>61tccatcattt catatgcact gtatc 25<210>62<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>62tcatatcgtt aaggacgtct ggaaa 25<210>63<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>63aagtttcgtg ttgcaagccc ccctggaata aacttgaatt gtgc44<210>64<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>64gcacaattca agtttattcc aggggggctt gcaacacgaa actt44<210>65<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>65gtgggccctg aaaaacggag acttg 25<210>66<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>66ccctttgaca gaagcaattt cacgc 25<210>67<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>67ccccaaggct gatgctgaga agccgcccc 29<210>68<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>68gccgcccggc cccgggtctt c 2權(quán)利要求
1.一種獨(dú)立的DNA或RNA分子，包括具有在SEQ ID NO1-20中示出的胰島小RNA中的序列的至少十個(gè)相鄰堿基，除了達(dá)到30％的所述堿基可以是擺動(dòng)堿基，達(dá)到10％的所述相鄰堿基可以是非互補(bǔ)的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獨(dú)立分子，進(jìn)一步包括在SEQ IDNO21-40中示出的發(fā)夾前體序列的任何一個(gè)中存在的位于5’端的堿基序列和/或位于3’端的堿基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獨(dú)立分子，其中所述發(fā)夾前體序列為其中存在胰島小RNA的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獨(dú)立分子，其中所述胰島小RNA被并入載體中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獨(dú)立分子，其中所述獨(dú)立分子為DNA分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獨(dú)立分子，其中所述獨(dú)立分子為RNA分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獨(dú)立分子，其中所述獨(dú)立分子進(jìn)一步包括帽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的獨(dú)立分子，其中所述帽是倒置核苷酸帽。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的獨(dú)立分子，其中所述帽是化學(xué)帽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獨(dú)立分子，其中所述獨(dú)立分子基本上由SEQ ID NO1-20中示出的胰島小RNA的任何一個(gè)序列組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獨(dú)立分子，其中所述獨(dú)立分子基本上由SEQ ID NO21-40中示出的任何一個(gè)序列組成。
12.一種修飾的單鏈胰島小RNA分子，包括在分子主鏈上的最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包括主鏈單元，每個(gè)所述部分包括結(jié)合到所述主鏈單元的堿基，其中至少10個(gè)所述相鄰堿基具有與在SEQ ID NO1-20中示出的胰島小RNA分子中的堿基的相鄰序列相同的序列，除了達(dá)到30％的所述堿基對(duì)可以是擺動(dòng)堿基對(duì)，達(dá)到10％的所述相鄰堿基可以為添加、缺失、錯(cuò)配、或其組合；不超過50％的所述連續(xù)部分含有脫氧核糖核苷酸主鏈單元，以及至少一個(gè)部分不是未修飾的脫氧核糖核苷酸部分或未修飾的核糖核苷酸部分。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分子，進(jìn)一步包括在SEQ ID NO21-40中示出的任何一個(gè)發(fā)夾前體序列中存在的位于5’端的堿基系列和/或位于3’端的堿基序列或其任何片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分子，其中所述發(fā)夾前體序列為其中存在胰島小RNA的序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分子，其中所述胰島是哺乳動(dòng)物的胰島。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分子，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分子，其中所述分子被修飾以增大核酸酶抗性。
18.一種獨(dú)立的單鏈抗-胰島小RNA分子，包括在分子主鏈上的最少10個(gè)部分和最多50個(gè)部分，所述分子主鏈包括主鏈單元，每個(gè)所述部分包括結(jié)合到主鏈單元的堿基，每個(gè)所述堿基與互補(bǔ)堿基形成沃森-克里克堿基對(duì)，其中至少10個(gè)所述相鄰堿基具有與在SEQ ID NO1-20中示出的任何一個(gè)胰島小RNA分子中的堿基的相鄰序列互補(bǔ)的序列，除了達(dá)到30％的所述堿基對(duì)可以是擺動(dòng)堿基對(duì)，達(dá)到10％的所述相鄰堿基可以為添加、缺失、錯(cuò)配、或其組合；不超過50％的所述相鄰部分含有脫氧核糖核苷酸主鏈單元；以及所述分子能夠抑制小RNP活性。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中在對(duì)應(yīng)于所述小RNA的位置11的位置處的所述部分是非互補(bǔ)的。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中達(dá)到5％的所述相鄰部分與所述胰島小RNA中的堿基的相鄰序列可以是非互補(bǔ)的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的分子，其中所述非互補(bǔ)的部分為添加、缺失、錯(cuò)配、或其組合。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，具有在SEQ ID NO41-60中示出的任何一個(gè)抗胰島小RNA序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一個(gè)是修飾的脫氧核糖核苷酸部分。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的分子，其中所述修飾的脫氧核糖核苷酸是硫代磷酸酯脫氧核糖核苷酸部分。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的分子，其中所述修飾的脫氧核糖核苷酸是N’3-N’5氨基磷酸酯脫氧核糖核苷酸部分。
26.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一個(gè)為修飾的核糖核苷酸部分。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的分子，其中所述修飾的核糖核苷酸在2’位被取代。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分子，其中在2’位的所述取代基是C1～C4烷基基團(tuán)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的分子，其中所述烷基基團(tuán)是甲基。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的分子，其中所述烷基基團(tuán)是烯丙基。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分子，其中在2’位的所述取代基是C1～C4烷氧基-C1～C4烷基。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的分子，其中所述C1～C4烷氧基-C1～C4烷基是甲氧基乙基。
33.根據(jù)權(quán)利要求26所述的分子，其中所述修飾的核糖核苷酸在2’-氧原子和4’-碳原子之間具有亞甲橋。
34.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一個(gè)是肽核酸部分。
35.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一個(gè)是2’-氟代核糖核苷酸部分。
36.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一個(gè)是嗎啉代氨基磷酸酯核苷酸部分。
37.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一個(gè)是三環(huán)核苷酸部分。
38.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中所述部分的至少一個(gè)是環(huán)己烯核苷酸部分。
39.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中所述分子為嵌合分子。
40.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中所述分子包括至少一個(gè)用于提高核酸酶抗性的修飾的部分。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的分子，其中所述核酸酶是核酸外切酶。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分子，其中所述分子包括在5’端的至少一個(gè)修飾的部分。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分子，其中所述分子包括在5’端的至少兩個(gè)修飾的部分。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分子，其中所述分子包括在3’端的至少一個(gè)修飾的部分。
45.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分子，其中所述分子包括在3’端的至少兩個(gè)修飾的部分。
46.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分子，其中所述分子包括在5’端的至少一個(gè)修飾的部分和在3’端的至少一個(gè)修飾的部分。
47.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分子，其中所述分子包括在5’端的至少兩個(gè)修飾的部分和在3’端的至少兩個(gè)修飾的部分。
48.根據(jù)權(quán)利要求41所述的分子，其中所述分子包括在所述分子的5’端、3’端、或兩端的帽。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的分子，其中所述分子包括化學(xué)帽。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的分子，其中所述分子包括倒置核苷酸帽。
51.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中所述核酸酶是核酸內(nèi)切酶。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的分子，其中所述分子包括在5’端和3’端之間的至少一個(gè)修飾的部分。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的分子，其中所述分子包括5’端和3’端之間的化學(xué)帽。
54.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分子，其中所述部分的全部是核酸酶抗性的。
55.一種用于抑制細(xì)胞中小RNP活性的方法，所述小RNP包括胰島小RNA分子，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求18所述的單鏈抗胰島小RNA分子引入所述細(xì)胞中，其中所述抗胰島小RNA對(duì)胰島小RNA分子是互補(bǔ)的。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中在對(duì)應(yīng)于所述小RNA的位置11的位置處的所述抗胰島小RNA分子中的所述部分是非互補(bǔ)的。
57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述胰島是哺乳動(dòng)物的胰島。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
59.一種用于治療需要其的哺乳動(dòng)物的糖尿病的方法，所述方法包括將有效量的具有至少十個(gè)相鄰堿基的抗胰島小RNA分子引入所述哺乳動(dòng)物，其中所述相鄰堿基具有在SEQ ID NO41或51中示出的序列。
60.一種獨(dú)立的小RNP，包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的獨(dú)立DNA或RNA分子。
61.一種獨(dú)立的小RNP，包括根據(jù)權(quán)利要求12所述的獨(dú)立的單鏈胰島小RNA分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及獨(dú)立的DNA或RNA胰島小RNA分子。本發(fā)明還涉及修飾的單鏈胰島小RNA分子或獨(dú)立的單鏈抗胰島小RNA分子。本發(fā)明還提供了用于抑制細(xì)胞中小RNP活性的方法。
文檔編號(hào)C07H21/02GK101031579SQ200580019154
公開日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2005年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月13日
發(fā)明者馬庫(kù)斯·施托費(fèi)爾, 馬修·N·波伊, 托馬斯·H·圖斯赫爾 申請(qǐng)人:洛克菲勒大學(xué)