專利名稱：用于治療或預(yù)防類風濕性關(guān)節(jié)炎的含有抗-4-1bb抗體的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合物，所述藥物組合物是含有一種用于治療和預(yù)防類風濕性關(guān)
節(jié)炎的藥物組合物。
背景技術(shù)：
類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，是一種慢性，退化性系統(tǒng)炎性疾病，其特征是關(guān)節(jié)增生及炎 性細胞的產(chǎn)生，關(guān)節(jié)內(nèi)纖維蛋白的沉積，和在其晚期，軟骨和骨質(zhì)破損。盡管對RA的病原學(xué) 仍舊存在爭論，但似乎已經(jīng)建立了該疾病發(fā)病的事件順序以及末期效應(yīng)機理。CD4+輔助性 T細胞控制最初的炎性損傷。巨噬滑膜內(nèi)襯細胞以及并指滑膜成纖維使大量的II類主要組 織相容性復(fù)合體(MHC)增殖及表達?；钚缘妮o助T細胞似乎驅(qū)使B細胞滲入到滑膜中以產(chǎn) 生免疫球蛋白。大多數(shù)這些局部合成的抗體的專一性未知，但是一些是與其他IgG分子在 關(guān)節(jié)處結(jié)合形成免疫復(fù)合體的IgG類風濕因子。最終，中性粒細胞和巨噬細胞的大量補充 和侵入，一連串降解酶的合成以及腫瘤壞死因子a (TNF-a)，IL-l和IL-6的產(chǎn)生將侵蝕類 風濕關(guān)節(jié)的軟骨禾口其他組分(Moreland，L. W. et al. Treatment of rheumatoid arthritis with a recombinant human tumor necrosis factorrec印tor(p75)_Fc fusion protein. N. Engl. J. Med. 337， ppl41_147， 1997)。 有可能這些不同的疾病路線匯集成一條普通路徑進行破壞。 在RA上應(yīng)用最廣泛的動物模型是II型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)，它是DBA/1 小鼠關(guān)節(jié)的Thl細胞依賴性慢性炎癥。這一模型由于其可重復(fù)性以及定義明確而被接 受，并且已經(jīng)證明在開發(fā)RA新療法方面很有用，例如TNF-a中和治療(Williams, R. 0.， Mason， L. J. ， Feldma皿，M. &Maini， R. N. Synergybetween anti-CD4 and anti_TNF in the amelioration of establishedcollagen—induced arthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92，pp2762-2766， 1994)。適應(yīng)性免疫的兩種細胞，T細胞和B細胞，在CIA的病原發(fā)生學(xué)上 起著核心的作用，但是它們在引動免疫激活以及關(guān)節(jié)損傷方面的相對重要性還不清楚。B細 胞的主要作用是產(chǎn)生至關(guān)節(jié)炎抗-CII抗體，現(xiàn)已清楚的顯示該抗體與CII作用可以同軟骨 結(jié)合并誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。T細胞在CIA中的作用更復(fù)雜并且可以分成兩種主要途徑，這兩種途徑 在關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過程中是協(xié)同作用的。首先，T細胞在B細胞產(chǎn)生至關(guān)節(jié)炎抗-CII抗體中 提供幫助。第二， T細胞自身通過產(chǎn)生細胞因子及活化其他細胞而在關(guān)節(jié)炎癥方面起作用。
目前大多數(shù)的治療是針對于矯正可能引起滑膜細胞增殖及軟骨侵蝕的免疫畸變。 本發(fā)明的關(guān)節(jié)炎治療包括用于控制疼痛和發(fā)炎的一線藥物，這類藥物列為非類固醇消炎藥 (NSAIDs)，例如，阿司匹林，布洛芬，萘普生，甲氨蝶呤等。二線治療藥包括皮質(zhì)激素，慢作用 抗風濕藥(SAARDs)和疾病改善藥物(DMs)，例如，青霉胺，環(huán)磷酰胺，金鹽類，疊氮胸苷，左 旋咪唑等。然而，至今大多數(shù)有效的甾類激素都被報道有各種不同的副作用，例如色素沉著 過度，閉經(jīng)，痤瘡，肌張力缺乏等。近來，已嘗試新的抗關(guān)節(jié)炎治療法，該方法利用遺傳重組 技術(shù)生產(chǎn)在炎癥機理上起重要作用的TNF受體。然而，至今仍需要用以治療和減輕各種綜合癥，例如，炎癥，水腫，血管生成異常以及骨和軟骨侵蝕的先進治療藥物。
4-lBB，一種TNF受體，作用于主要存在于T淋巴細胞中的協(xié)同剌激受體并且在T 細胞收到抗原_特異性信號時被誘導(dǎo)。而且，有報道4-lBB通過其他淋巴樣和骨髓樣細胞 譜系，例如NK(自然殺傷)細胞，CD4+CD25+常規(guī)T細胞，單核細胞及其他乳頭狀細胞(DCs)。 4-lBB協(xié)同剌激T細胞以實現(xiàn)效應(yīng)功能，例如消除腫瘤的產(chǎn)生，擴大初級CD8+T細胞應(yīng)答，和 增強抗原特異性CD8+T細胞的記憶池。另外，4-lBB介導(dǎo)的信號主要通過抑制CD4+導(dǎo)致炎 性和T-細胞-依賴性抗體應(yīng)答的這一 T細胞功能，改善自身免疫疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼 瘡(SLE)和實驗性自體免疫性腦炎(EAE)。 對于吲哚胺2，3-加雙氧酶(IDO)-介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的重要性已在Munn etal的開 倉寸性工作中重新發(fā)現(xiàn)(Mu皿，D. H. ，et al. Prevention of allogeneic fetalrejection by tryptophan catabolism. Science 281，ppll91_1193，1998)。 因此，本發(fā)明的發(fā)明人力圖研究4-lBB的生理作用并確認4-lBB-介導(dǎo)的RA抑制 是由于以一種抗原-依賴性方式誘導(dǎo)CDllc+CD8+T細胞而產(chǎn)生的。另外，我們發(fā)現(xiàn)這一組新 的誘導(dǎo)的T細胞產(chǎn)生一種豐富的IFN-y， IFN-y反過來誘導(dǎo)DCs中的ID0以及巨噬細胞，而抗 原_特異性CD4+T細胞被ID0-依賴的機制所抑制。因此，通過確認抗4-lBB抗體在治療或 預(yù)防關(guān)節(jié)炎疾病上是有用的完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 如前所說，本發(fā)明的一個目的是提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有有 效量的抗4-lBB抗體作為活性成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述抗4-lBB抗體通過 CDllc+CD8+T細胞增殖和誘導(dǎo)CD4+T細胞抑制以預(yù)防和治療類風濕性關(guān)節(jié)炎。
技術(shù)方案 所述用于治療關(guān)節(jié)炎疾病的藥物組合物可以含有基于組合物總重量的大約 0.01 80w/w^，優(yōu)選0. 1 50w/w^的上述本發(fā)明的抗4-lBB抗體。 本發(fā)明公開的抗4-lBB抗體可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備。例如，雜 交瘤細胞生產(chǎn)4-lBB(3H3)和4-lBBL(TKS-l)抗體可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制 備，例如，文獻中公開的制備方法(Shuford， W. W. et al. 4-1BB constimulatory signals preferentially induce CD8+T cell proliferation andlead to amplification in vivo of cytotoxic T cell responses. J. Exp. Med. 186， pp47_55，1997 ;Futagawa， T. et al. Expression and function of 4-lBBligand on murine dendritic cells. Int. Immunol. 14， pp275_286，2002)。 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，為了理解抗4-lBB在膠原誘導(dǎo)性CIA過程中的 作用，對CIA誘導(dǎo)的小鼠給予激動性抗4-1BB抗體(3H3)并且觀察了關(guān)節(jié)炎癥的平均臨床 評分指數(shù)。在結(jié)果中，通過激動性抗4-lBB給藥強烈抑制了疾病的發(fā)展。CIA的所有特點， 例如過度關(guān)節(jié)增生，血管翳形成，軟骨破壞和骨侵蝕以及各種類風濕性關(guān)節(jié)炎因子的表達， 例如，MCP-1， MCP-2，酸性細胞趨化素，MIP-la， RANTES等趨化性細胞因子和細胞因子IL-6， IL-5， TNF-a或IL-1 P ，均未發(fā)現(xiàn)并且它誘導(dǎo)抗原特異性抑制反應(yīng)，該反應(yīng)完全抑制了在 抗體與抗-CII作用再生的IgG和IgG2b。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，就在類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中，抗4-lBB降低 了疾病指數(shù)并抑制了抗-CII抗體的再生，這使得可以通過4-1BB交聯(lián)來抑制CIA。
由于抗4-1BB抗體治療的活性抑制機制抑制了 CD4+T細胞的誘導(dǎo)并導(dǎo)致淋巴結(jié)細 胞內(nèi)的CDllc+CD8+T細胞的增加。所誘導(dǎo)的CDllc+CD8+T細胞是新的CD8+T淋巴細胞，表達 不同于其他白細胞表面標記，例如CDllc—CD8+，CDllc+CD8+，CD8—CDllc+，DCs細胞的CD3+，TCR VP +， Thyl. l+， CDllc和II型抗原1-Aq。當CDllc+CD8+T細胞被分離并且被繼承性轉(zhuǎn)移后， 它們抑制CIA的發(fā)展。因此由抗4-lBB-處理所誘導(dǎo)的CDllc+CD8+T細胞的增加可以抑制關(guān) 節(jié)性關(guān)節(jié)炎癥。那時，CDllc+CD8+T細胞產(chǎn)生在CDllb+巨噬細胞和CDllc+乳頭細胞中誘導(dǎo) IDO(吲哚胺2， 3-加雙氧酶)表達的IFN-y，而1-甲基色氨酸處理使抗4-1BB的效應(yīng)復(fù)原。 CDllc+CD8+T細胞增殖引起CIA的抑制和表達的IFN_Y的IDO-依賴反應(yīng)抑制了抗原_特異 性CD4+T細胞。 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了抗4-lBB抗體在制備治療和預(yù)防哺乳動物類風 濕性關(guān)節(jié)炎的治療藥劑上的應(yīng)用，所述哺乳動物包括需要的人。 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了治療或預(yù)防哺乳動物關(guān)節(jié)炎疾病的方法，所述
方法包括向所述哺乳動物給予有效量的抗4-1BB抗體，以及其藥學(xué)上可接受的載體。 本發(fā)明的組合物按照使用方法可以另外包括常規(guī)的載體，佐劑或稀釋劑。按照用
法和給藥方法，優(yōu)選所述載體作為適宜的物質(zhì)，但不限于此。適宜的稀釋劑在Remington的
藥物科學(xué)一文中列出(Mack Publishing co， Easton PA)。 下文中，下述制劑方法和賦形劑僅僅是示例且并不限制本發(fā)明。 根據(jù)本發(fā)明的組合物可以作為藥物組合物，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的載
體，佐劑或稀釋劑，例如乳糖，葡萄糖，蔗糖，山黎醇，甘露醇，木糖醇，赤蘚醇，麥芽糖醇，淀
粉，洋槐膠，藻酸鹽，明膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，聚乙烯基吡咯烷酮，水，羥
甲基苯甲酸鹽，羥丙基苯甲酸鹽，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。所述制劑可以另外含有填充物，
抗凝結(jié)劑，潤滑劑，濕潤劑，香味劑，乳化劑，防腐劑等等。本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域
技術(shù)人員公知的制備方法制成以提供活性成分在給藥于患者后速效，長效或緩釋的制劑。 例如，本發(fā)明的組合物可以溶于油，丙二醇或其他通常用于生產(chǎn)注射劑的溶劑。載
體適宜的例子包括生理鹽水，聚乙二醇，乙醇，植物油，異丙基豆蔻酸鹽等，但并不限于此。
對于局部給藥，本發(fā)明的復(fù)合物可以制成軟膏和霜的形式。 含有本發(fā)明組合物的藥物制劑可以以任何形式制備，例如口服劑型(粉末，片劑， 膠囊，軟膠囊，液體藥物，酏劑，香粉，顆粒)，或者局部制劑(霜，軟膏，乳液，膠，油膏，塞片， 涂膠，噴霧，溶液，氣霧劑等)，或者注射制劑(溶液，懸浮液，乳化液)。 本發(fā)明的組合物的藥學(xué)劑型可以以其藥學(xué)上可接受的鹽的形式使用，也可以獨自
使用或者以適宜的組合，以及和其他藥學(xué)上活性復(fù)合物結(jié)合的形式使用。 本發(fā)明組合物的理想劑量由于患者的情況和體重，病情，藥物形式，給藥途徑和時
間的不同而變化，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。然而，為了獲得理想的效果，通常建議
以按重量/天計的0. 01 10g/kg本發(fā)明的抗體復(fù)合物給藥，優(yōu)選1 5g/kg。所述劑量可
以每日一次或者一日多次給藥。就組合物而言，本發(fā)明的組合物應(yīng)該以按重量計基于組合
物總重量的0. 01 80% ，優(yōu)選0. 5 50%的量存在。 本發(fā)明的藥物組合物可以通過不同途徑給藥于被試動物，例如哺乳動物(大鼠，小鼠，家畜或人類)。可以考慮所有給藥方式，例如，可以口服給藥，直腸給藥或者通過靜脈，
肌肉，皮下，皮內(nèi)，鞘內(nèi)，硬腦膜或腦室內(nèi)注射。 有益效果 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供抗4-1BB抗體在制備治療和預(yù)防哺乳動物類風濕 性關(guān)節(jié)炎的治療藥劑上的應(yīng)用，所述哺乳動物包括需要的人。 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種治療或預(yù)防哺乳動物關(guān)節(jié)炎疾病的方法， 所述方法包括給予所述哺乳動物有效量的抗4-1BB抗體，以及其藥學(xué)上可接受的載體。


圖1 :顯示經(jīng)免疫原攻擊后每個測試組分別的臨床分數(shù)(a)和爪厚度(b)，測試組 即對照IgG，抗+1BBL和抗+1BB ; 圖2 :顯示對CIA誘導(dǎo)的小鼠注射對照IgG(a)，抗-4-lBBL(b)和抗-4-lBB(c)后， 踝關(guān)節(jié)的組織病理； 圖3 :顯示RPA法(RNase保護試驗)對每個測試組踝關(guān)節(jié)細胞因子表達的測定， 測試組即對照IgG，抗-4-1BBL和抗-4-1BB ; 圖4 :顯示抗-CII抗體的產(chǎn)生以及通過ELISA法測定的分別用抗-CII IgGja)和 抗-CII IgG2b(b)處理的各組的血清水平，測試組即對照IgG，抗-4-lBBL和抗-4-lBB ;
圖5 :顯示每個測試組分別的CIA(膠原蛋白型II誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎)臨床分數(shù)，測試 組即對照IgG，抗-4-1BBL和抗+1BB ; 圖6 :顯示通過ELISA測定的每個測試組分別的抗-CII IgGl (a)和 抗-CIIIgG2b(b)水平，測試組即對照IgG，抗-4-lBBL和抗-4-lBB ; 圖7 :顯示通過[3H]標記測定的每個測試組分別的CII-特異的CD4+T細胞，測試 組即對照IgG，抗+1BBL和抗+1BB ; 圖8 :顯示FACS(熒光活性細胞分類儀)觀察的用CII+抗-4-1BB(a) ， CII+對照 IgG(b)，基因剔除小鼠中的CII+抗-4-lBB(c)， CII-抗-4-lBB的F(ab， )2片斷(d)以及 CFA+抗-4-lBB(e)處理的CIA誘導(dǎo)的小鼠的照片； 圖9 :顯示FACS觀察的CDllc—CD8+T細胞(a) ， CDllc+CD8+T細胞(b)和
CD8a—CDllc+DCs細胞(c)的細胞表面標記表達； 圖10 :顯示誘導(dǎo)CDllc+CD8+T細胞的TCR VP表達譜； 圖11 :顯示每個測試組分別在HSV-1處理后注射抗-4-1BB抗體后的CDllc+CD8+T 細胞誘導(dǎo)，測試組即對照IgG，抗-4-1BBL和抗-4-1BB ; 圖12 :顯示在對DBA/1小鼠注射CII抗原和抗-4-1BB抗體后，每個測試組分別 在每個時間點CDllc+CD8+T細胞(a)和CDllc—CD8+T細胞(b)的增加，測試組即對照IgG， 抗-4-1BB ; 圖13 :顯示通過激光共聚焦顯微觀察觀察到的誘導(dǎo)的CDllc+CD8+T細胞的類型 (綠色抗<03，紅色CDllc) ((a)枝狀大細胞；(b)中型枝狀細胞；(C)沒有枝狀結(jié)構(gòu)的小 細胞；(d)無枝狀結(jié)構(gòu))； 圖14 :顯示在用CII+對照IgG(a)和CII+抗-4-1BB(b)處理后用碘化丙啶染色 的淋巴結(jié)切片；
圖15 :顯示對測試組分別由抗-4-1BB處理所誘導(dǎo)的CDllc+CD8+T細胞的IFN_Y產(chǎn) 生，該處理包括觀察細胞內(nèi)染色(a)和通過ELISA法測定的上清培養(yǎng)物(b)，測試組即對照 IgG和抗-4-1BB ; 圖16 :顯示由與CDllc+CD8+T細胞和CDllc—CD8+T細胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的[3H]標記測定 的每個測試組分別的CII-特異的CD4+T細胞抑制反應(yīng)，測試組即無轉(zhuǎn)化，CDllc—CD8+T/對照 IgG， CDllc—CD8+T/抗-IgG和CDllc+CD8+T/抗_IgG ; 圖17 :顯示將CDllc+CD8+T細胞和CDllc—CD8+T細胞轉(zhuǎn)化到新的DBA/1小鼠后，每 個測試組的臨床分數(shù)，測試組即無轉(zhuǎn)化，CDllc—CD8+T/對照IgG， CDllc—CD8+T/抗-IgG和 CDllc+CD8+T/抗-IgG ; 圖18 :通過RT-PCR和電泳，展示在抗-4-lBB處理和ID0， iN0S以及GAPDH誘導(dǎo)之 間的相關(guān)性(泳道l :CDllb+T細胞用對照IgG處理，泳道2 :CDllc—CD8+T細胞用抗-4-lBB處 理，泳道3 :CDllc+CD 8+T細胞用抗-4-1BB處理，泳道4 :CDllb+T細胞用對照IgG處理，泳道 5 :CDllb+T細胞用抗-4-lBB處理，泳道6 :CDllchigh T細胞用對照IgG處理，泳道7 :CDllchigh T細胞用抗-4-1BB處理； 圖19 :通過RT-PCR和電泳顯示IFN- y在誘導(dǎo)IDO和iNOS的作用(泳道1 :CDllb+T 細胞用對照IgG處理，泳道2 :CDllb+T細胞用對照IgG和抗-IFN- y處理，泳道3 :CDllb+T 細胞用抗-4-lBB處理，泳道4 :CDllb+T細胞用抗-IFN-y和抗-4-1BB處理，泳道5 :IFN-y 處理作為陽性對照)； 圖20 :顯示通過BrdU摻入法測定的每個測試組在抗IFN_ y處理和CII-特異 性CD4+T細胞增殖之間的相關(guān)性；測試組即對照IgG，對照IgG， /抗IFN- y ，抗+1BB， 抗-4-1BB/抗IFN-y ; 圖21 :顯示對CIA誘導(dǎo)的小鼠進行對照IgG，抗-4-lBB，抗-4-lBB和抗IFN-y處 理后的臨床分數(shù)； 圖22 :顯示通過4-lBB處理后，1-甲基-D， L-色氨酸(1-MT)CIA的CIA抑制效 果，包括(a)每個測試組分別的劑量依賴型1-MT的平均臨床分數(shù)，測試組即對照IgG， 抗-4-1BB/1-MT,抗-4-1BB/1-MT,抗-4-1BB/安慰劑，和(b)每個測試組抗-4-1BB-處 理_依賴的的平均臨床分數(shù)，測試組即對照IgG/l-MT，抗-4-1BB/1-MT,抗-4-1BB/安慰劑。
最佳實施方式 很明顯，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對組合物進行各種修飾和改變，可以在不背離本發(fā) 明的精神和范圍的前提下使用和制備本發(fā)明。 通過下面的圖和實例對本發(fā)明進行了更具體的解釋，然而，應(yīng)該理解為本發(fā)明并 不以任何方式限制于這些實例。
發(fā)明實施方式 通過下面的圖和實例對本發(fā)明進行了更具體的解釋，然而，應(yīng)該理解為本發(fā)明并 不以任何方式限制于這些實例。
實施例1抗體的制備產(chǎn)生4-lBB(3H3)和4_1BB(TKL_1)抗體的雜交瘤細胞分別由Drs. RobertMittler(Emory university, Atlanta, Georgia) 禾口 Hideo Yagita 以 及 Ko0kumura(Jimtendo university, Tokyo, Japan)惠貝曾。通過蛋白G—柱(sigma， St丄ouis，
7Missouri)從艾氏腹水癌細胞中純化抗體。LAL(Cambrex， Walkersville, Maryland)測定 內(nèi)毒素水平低于0. 05單位，在抗-CD3mAb-剌激的T細胞或4-1BBL轉(zhuǎn)染的P815細胞中 檢測mAbs的結(jié)合活性。在用胃蛋白酶消化抗體后使用S印hacryl s-200HR柱(sigma) 純化3H3的F(ab' )2片段，購自Sigma的純化的鼠IgG作為對照抗體。隨后的mAbs購 自BDPharMingen (San Diego， California)用于流式細胞儀分析FITC-， PE-. PerCP-， 和生物素-抗_CD8(53-6. 7) ;PE-抗_CD4(GK1. 5) ;PE-和生物素_抗-CDllc(HL3); FITC-和生物素-抗-CD1 lb (Ml/70) ;PE-抗-1L12 (C15. 6);生物素_抗_H_2Kg(KH14); 生物素-抗-l-Aq(KH116);生物素-抗-CD80(16-10Al);生物素_抗-CD86 (GL1);生物 素-抗-CD40 (3/23);生物素-抗-CD45RA (14. 8);純化的抗-CD16/CD32 (2. 4G2) ;PE-， FITC-和Cy-鏈霉親和素；和含有FITC-標記的mAb的抗V P 2， 3， 4， 5. 1/5. 2， 6， 7， 8. 1/8. 2， 8. 3，9， 10b， 11， 12， 13， 14和17TCRs的鼠VP TCR篩板。FITC-抗-DEX205 (NLDG-145)購 自Serotec (Kidlington， Oxford, United Kingdom)。 DX5購自eBioscience(SanDiego， California)。實施例2CIA誘導(dǎo)和抗4-1BB處理 為了理解4-1BB在CIA過程中的作用，檢測了是激動性抗4-1BB抗體(3H3)還是 阻斷抗4-1BB配體可以改變CIA過程。 通過對6-7周的DBA/1雄性小鼠尾巴底部皮內(nèi)注射100D CFA乳化的牛膠原 II(CII) (Chondrex， Redmond, Washington)弓I起CIA。通過M. tuberculosisH37RA(2. Omg/ ml， Chondrex)補充抗原。每日對小鼠關(guān)節(jié)的炎癥進行檢查并按下述方法計分O，正常；1， 局限于踝關(guān)節(jié)的紅斑和輕度腫脹；2，延伸到踝關(guān)節(jié)外的紅斑和輕度腫脹；3，延伸到踝關(guān)節(jié) 外的紅斑和中度腫脹；4，延伸到踝關(guān)節(jié)外的紅斑和重度腫脹；每個爪子最大的關(guān)節(jié)炎評分 是4，而每只小鼠最大的疾病評分是16。 使用對照IgG處理的小鼠在后免疫(PI)大約28天患上重度關(guān)節(jié)炎。在PI第 42天得到關(guān)節(jié)炎嚴重程度的峰值(嚴重程度=13. 4±2. 7 ;發(fā)病率=9/10 ;爪子厚度= 3. 5±0. 26)。使用抗-4-1BBL處理阻斷4-1BB和4-1BBL相互作用的小鼠也患上關(guān)節(jié)炎， 盡管比IgG處理對照組的程度輕(嚴重程度=9. 6±3. 2， P < 0. 05 ;發(fā)病率=8/10 ;爪子 厚度=2. 7±0. 25，P < 0. 05)。激動性抗4-1BB處理強烈抑制了疾病的發(fā)展(嚴重程度= 1. 6±1. 6， P < 0. 0001 ;發(fā)病率=2/10 ;爪子厚度=1. 7±0. 2， P < 0. 001)(見圖1)。
實施例3組織學(xué)和免疫染色 將免疫原性后爪固定于10%福爾馬林中，脫鈣并裝入石蠟中。制備關(guān)節(jié)切片 (5-7D)并用常規(guī)方法進行蘇木精和曙紅染色。光學(xué)顯微鏡檢測切片。對于雙熒光染色， 將純化的CDllc+CD8+T細胞于L-賴氨酸包被的載片上37t:培養(yǎng)l小時。隨后用ID未標 記的2. 4G2抗-FcyR Ab(BD PharMingen)阻斷。用FITC-抗-CD3加上PE-抗-CD8或者 FITC-抗-CD3加上PE-抗-CD1 lc或者FITC-抗-CD8加上PE-抗-CD1 lc對細胞著色。在最 終清洗后，載片被裝載到GVA使用支架上(Zymed，San Francisco,California)并使用激光 掃描共聚焦顯微鏡觀察(FV500, Olympus， Tokyo, Japan)。對于DLN的免疫染色，用PBS清洗 DLN切片(8D)，用FITC-抗-CD3加上PE-抗-CD1 lc或者FITC-抗-CD8加上PE-抗-CD1 lc 染色。載片按上述方法處理。為了使雙色樣品通道間的交擾最小化，使用一次只能引發(fā)一 種染料的順次掃描技術(shù)。
組織學(xué)檢測顯示同型_或者抗4-1BBL-處理的小鼠大量滲入白細胞并且產(chǎn)生關(guān)節(jié)增生，血管翳形成，軟骨破壞和骨侵蝕等所有CIA的特征。相反，抗4-lBB-處理的小鼠表現(xiàn)正常并且無疾病，反映為低的嚴重程度分數(shù)(見圖2)。
實施例4細胞因子表達 為了檢測含有IL-6， IL-5，TNF-a和IL-1 P等周知的類風濕性關(guān)節(jié)炎特征的高水平細胞因子是否可以表達，通過從小鼠關(guān)節(jié)組織中分離RNA，利用RPA對細胞因子表達進行了分析。 RNA酶保護試驗 使用TRIzolK(InVitrogen， Carlsbad, California)從每一組免疫40天后的小鼠踝組織中分離總RNA，按照操作指南(Riboquant， BD PharMingen)利用RNA酶保護試驗定量測定細胞因子和趨化性細胞因子mRNA水平。簡言之，15D總RNA與[32P]UTP_標記的RNA探針(mCK-l和mCK-5 ;BD PharMingen)雜交，56。C過夜。雜交后，通過RNA酶處理消化未雜交的單鏈RNA。保護的RNA通過酚/氯仿提取和乙醇沉淀進行純化。將樣品進行6%聚丙烯酰胺AM尿素膠電泳。將膠干燥并進行放射自顯影分析。
RT-PCR 通過使用SuperscriptII (XifeTechnologies， Gaithersburg， Maryland)禾口oligo (dT)引物從ID總RNA中合成單鏈cDNA， cDNA隨后用10單位的RNase-H處理(LifeTechnologies)。在含有0. 5D cDNA和每種引物0. 5 ii M的20D反應(yīng)混合物中進行PCR反應(yīng)。使用下述引物
〈IL-1 P >
序列號1 :5，
序列號2:5，
-CTGAAAGCTCTCCACCTC-3'(正義引物)-GGTGCTGATGTACCAGTTC-3'(反義引物)
〈TNF_ a >序列號3 :5'
序列號4:5'
〈GAPDH〉序列號5 :5'
序列號6 :5'
CCACCACGTCTTTG-3'(正義引物)-ATGGGCTCATACCCAGGG-3'(反義引物)
-GAACGGGAAGCTTGTCATCAA-3'(正義引物)-CTAAGCAGTTGGTGGTGCAG-3'(反義引物)關(guān)節(jié)組織細胞因子產(chǎn)物圖譜也反映疾病嚴重程度對照IgG或者抗-4-1BBL-處理的小鼠檢測到高水平趨化性細胞因子，包括MCP-1， MCP-2，酸性細胞趨化素，MIP-la，RANTES，而抗-4-1BB-處理的小鼠的上述趨化性細胞因子的量低至檢測不到的水平。對照IgG-處理的小鼠顯示高水平的IL-6，IL-5，TNF-a禾P IL-lmRNA。有趣的是，抗-4-1BBL-處理的小鼠產(chǎn)生高水平的IL-5，TNF-a和IL-lmRNA，但是IL-6mRNA的水平卻非常低。相反，抗-4-1BB-處理的小鼠上述細胞因子的量低至檢測不到的水平。高水平的表達IL-113 ，TNF-a和IL-6是類風濕性關(guān)節(jié)炎眾所周知的特征。(見圖3)
實施例5膠原特異性抗體的測定 接下來測定了抗-4-1BB處理是否可以抑制抗-CII抗體產(chǎn)生。 通過酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)測定了抗-牛CII IgG" IgG2a， IgG2b， IgG2， IgM和
IgE的血清濃度。簡言之，使用牛CI I (10D/ml ， Chondrex)包被微量滴定板，封閉并用一系列
9稀釋的測試乳清培養(yǎng)。通過和HRP-標記的鼠-抗鼠IgGp IgG2a， IgG2b， IgG3， IgM或IgE(BDPharMingen)以及底物，四甲基聯(lián)苯胺培養(yǎng)而檢測到邊際IgG。使用ELISA讀板器(Wallac，Turku， Finland)在450nm處測定光密度。 在PI第19，28，35和42天測定抗-CII抗體的血清水平?？?4-1BB處理完全抑制了抗-CII IgGjP IgG2b(p < 0.001)的產(chǎn)生，而抗-4-lBBL處理某種程度上減少了抗-CI1抗體的產(chǎn)生(P < 0. 05)。其他同型的CII的IgG， IgA和IgE則幾乎檢測不到(數(shù)據(jù)沒有顯示)。這些結(jié)果再次反映了疾病的嚴重程度。 對于CIA模式研究的結(jié)果提示用抗-4-1BB引發(fā)4_1BB可誘導(dǎo)與阻斷4-1BB/4-1BBL相互作用不同的活性抑制機制。(見圖4)
實施例6抗4-lBB(3H3)改善已確診的CIA 在DBA/1小鼠中誘導(dǎo)CIA，在PI第28天將小鼠分成三組以至于每組的平均關(guān)節(jié)炎評分相等，在PI第28， 30， 32， 34和36天對它們進行對照IgG，抗+1BB或抗+1BBL處理。(見圖5) 只有用抗-4-lBB處理組的關(guān)節(jié)炎消退；這一效果在PI第52天更為顯著(p< 0. 05)。也檢測了 CII-特異抗體的水平?？?4-1BB處理迅速并且?guī)缀跬耆宄搜蹇?CII抗體(p < 0. 001)。這些數(shù)據(jù)再次說明交聯(lián)4-1BB誘導(dǎo)抗CIA的抑制機制。(見圖6)實施例7抗-4-1BB抑制CII-特異CD4+T細胞增殖 測試抗-4-1BB處理所誘導(dǎo)的活性抑制是否針對于CD4+T細胞。從PI第14天CII-免疫的小鼠的引流淋巴結(jié)(DLN)分離CD4+T細胞并且在體外測定CD4+T細胞對CI1的記憶應(yīng)答。利用磁珠(MiltenylBiotech)純化DLN(腋和腹股溝淋巴結(jié))的CD4+T細胞，其來源于CII免疫后第12天的對照IgG，抗4-1BB或抗-4-1BBL mAb-處理的小鼠。純化的CD4+T細胞(1X105)在變性CII(O. 5D/ml)存在或不存在的情況下和絲裂霉素c (sigma)處理(50D/ml，37°C，20min)的同基因型脾APCs (2X 105)共培養(yǎng)。在5% C02中37"培養(yǎng)72小時后，培養(yǎng)物在最后的12小時中用[3H]胸腺嘧啶脈沖(l.OiiCi/well) (Amersham Pharmacia,Piscataway， New Jersey)。使用閃爍計數(shù)器(Wallac)計算摻入的放射性。按照操作指南的建議，通過ELISA法使用Endogen的細胞因子-特異抗體對評估上述培養(yǎng)物中的細胞因子產(chǎn)物。 經(jīng)抗-4-1BB-處理的小鼠的CD4+T細胞沒有顯示記憶應(yīng)答，而作為對CII的應(yīng)答，
對照IgG-處理的小鼠的CD4+T細胞大量增殖。在CIA模式中源于抗-4-1BBL-處理的小鼠
的CD4+T細胞顯示比對照IgG-處理組更低的記憶應(yīng)答(p < 0. 05)。這些數(shù)據(jù)表明CIA模
式中抗-4-1BB-介導(dǎo)的抑制是針對于CD4+T細胞(見圖7)。實施例8抗-4-1BB處理誘導(dǎo)DLN中CDllc+CD8+T細胞群體的膨脹 8-1流式細胞術(shù) 為研究在CIA模式中抗-4-1BB-介導(dǎo)的CD1 lc+CD8+T細胞抑制機制，對PI第12天，源于DLN和脾臟的白細胞亞群進行了分析。和對照IgG-處理組相比，期待在抗-4-lBB處理組找到淋巴細胞的特殊群體的增加或者減少?？?4-lBBL處理組對于結(jié)果提供了進一步的對照和確認。 從DLN中獲得紅細胞游離單核細胞懸浮液，并將白細胞(100D中有1Xl(f細胞)
10在首先用1D未標記的抗-Fcy R Ab(BD PharMingen)封閉步驟后和指示的熒光標記抗體在4t:進行流式細胞儀分析，隨后進行FaCSCalibur (BDBioscicnecs)分析。對于細胞內(nèi)的細胞因子染色，將細胞用CII(50D/ml)或者CII加PMA(50ng/ml ;Sigma)以及鈣離子導(dǎo)入劑(500ng/ml ;Sigma)剌激18小時。在最后的6小時加入GolgiPlug(BD PharMingen)。細胞首先用表面標記著色，固定，透化，并按照操作指南的說明用FITC-標記的抗-IFN-y ，抗-TGF-P ，抗-IL-4，抗-IL-10或IL-12mAb的Cytofix/Cytoperm試劑盒(BD PharMingen)培養(yǎng)。 按照操作指南說明進行BrdU摻入法測定(BrdU流式試劑盒，BDPharMingen)。簡言之，在CII(50D/ml)存在下培養(yǎng)DLN細胞(2X105)。細胞經(jīng)PE-標記的抗-CD4染色，固定，透化，DNaseI處理并進一步用FITC-標記的抗-BrdU(BD PharMingen)培養(yǎng)。樣品立即通過FaCSCalibur (BDBioscicnecs)分析。 利用FACS檢測了白細胞表面標記的多種組合并發(fā)現(xiàn)CDllc+CD8+細胞在抗_4_1BB處理的小鼠的DLN和脾臟中都顯著的膨脹。這一群體的CDllc表達水平比CDllc+DCs的要低。(盡管這一群體的表型是CDllClQWCD8+，為了簡單則認為這些細胞是CDllc+CD8+細胞群體。)在對照IgG-處理組沒有發(fā)現(xiàn)CDllc+CD8+細胞的膨脹。 接下來試圖確定引起CDllc+CD8+細胞膨脹的條件。如上文所述，當DBA/1小鼠用CII和對照IgG免疫后，CDllc+CD8+細胞并沒有膨脹。當4-lBB KO小鼠用CII和對照IgG免疫后，CDllc+CD8+細胞也沒有膨脹。當DBA/1小鼠用CII免疫和注射抗4-lBB的(Fab'^片段后，CD1 lc+CD8+群體沒有膨脹，膨脹需要通過與完整的抗-4-lBB mAb交聯(lián)而產(chǎn)生的4-lBB信號。最后，當DBA/1小鼠用抗-4-lBB和完整的不含CI1的Fre皿d佐劑免疫后，也沒有膨脹。CDllc+CD8+細胞的膨脹僅發(fā)生在當CII禾P4-lBB信號同時存在時。因此，CDllc+CD8+細胞的膨脹是一個4-lBB-依賴以及抗原驅(qū)動的效應(yīng)。(見圖8)
8-2 CDllc+CD8+細胞的表型 為了確定CDllc+CD8+細胞的表型，對于CDllc—CD8+T細胞，CDllc+CD8+T細胞以及CD8a—CDllc+DCs的表面標記的表達進行了比較。CDllc+CD8+細胞表達T細胞標記，例如，CD3+， TCR VP +和Thyl.2+。這些細胞由于他們除了表達CDllc和II型抗原l_Aq還表達33D1乳頭細胞標記而與常規(guī)的CDllc—CD8+T細胞不同。他們由于不表達DC標記，如CD205,B220和CD40以及不吸收熒光葡糖顆粒而與CDllc+CD8+DCs也不同。
結(jié)論是這一新型細胞群體是CD8+T淋巴細胞的亞型。 對于CDllc+CD8+T細胞的TCR VP表達圖譜也進行了確定。用CII免疫小鼠以誘導(dǎo)CIA，隨后用對照抗4-lBB處理小鼠。從DLN細胞中分離CDllc—CD8+T細胞，CDllc+CD8+T細胞以及CD4+T細胞。TCR單克隆抗體在板上染色并通過FaCSCalibur (BD Bioscicnecs，San Jose， California)分析。在結(jié)果中，30^以上的細胞表現(xiàn)VP8. 1/8. 2并且每個VP8. 3，VP5. 1/5. 2和VP7為28%，22%和17%。 CD4+T細胞的VP表達譜和CDllc+CD8+T細胞中的類似(見圖IO)。
8-3 HSV-1感染后的CDllc+CD8+T細胞產(chǎn)物。 確定了即使在細胞已經(jīng)收到由外部抗原引起的免疫原性后給予其抗-4-lBB抗體，是否誘導(dǎo)CDllc+CD8+T細胞產(chǎn)物。 通過腹腔注射鹽酸氯胺酮(lmg/kg，維生素；Phoenix Scientific Inc.，
11St. Jos印h，Missouri)禾口甲苯噻嗪(0. 5mg/kg，Ben Venue Laboratories,Bedford, Ohio)麻 醉小鼠，并在每只后爪墊注射含4X 105PFU HSV-1的20D的PBS。在第0和2天對HSV-1-感 染的小鼠腹腔注射純化的抗-4-lBB(3H3，200D)或鼠IgG。在PI第5天從DLN制備單核細胞 懸浮液。細胞首先用2. 4G2培養(yǎng)然后用PE-標記的抗-鼠CDllc和Cy-標記的抗-CD8mAbs 染色。染色后的細胞利用FaCSCalibur(BD Bioscicnecs， San Jose， California)分析。將 一部分已經(jīng)用對照IgG或抗-4-1BB處理的HSV-1-感染的小鼠細胞置于96孔板中并在ID/ ml gB肽存在或不存在的情況下培養(yǎng)3天。細胞用10iiM BrdU標記l小時并用PE-抗-CD4 或PE-抗-CD8mAb染色，隨后用FITC-抗-BrdU細胞內(nèi)染色。 CDllc+CD8+T細胞也由其他抗原誘導(dǎo)，包括HSV-1感染，當抗原和抗_4_1BB —起出 現(xiàn)時，抗-4-1BB再次在很大程度上減少CD4+T細胞對HSV-1的記憶應(yīng)答，盡管和IgG-處理 組相比CD8+T細胞應(yīng)答增強了 。 8-4膨脹的動力學(xué)和CDllc+CD8+T細胞的特性 對于注射了 CII的DBA/1小鼠的CDllc+CD8+T細胞膨脹的時間過程也進行了調(diào)查。
CDllc+CD8+T細胞膨脹的時間過程由注射了 CII和抗-4-lBB的DBA/1小鼠決定。 膨脹從PI第5天開始并在第12天達到峰值；在第18天細胞再次小到無法檢測。當在第24 天再次給予抗-4-1BB時，膨脹在4天的滯后調(diào)整后重新開始。常規(guī)CDllc+CD8+T細胞的百 分含量也有所增加(見圖12)。 通過使用抗-CD3和抗-CD8或者抗-CD3和抗-CDllc或者抗-CD8和抗-CDllc染 色，共聚焦顯微觀察到CDllc+CD8+T細胞。所有這些標記-CD3，CD8和CDllc—均在細胞表面 檢測到并且可以消失。CDllc的膨脹水平比CD3和CD8要低(圖3bl)。碘化丙啶染色以 及FACS分析表明CDllc+CD8+T細胞的DNA含量為2N(圖3b2)。在淋巴結(jié)切片上發(fā)現(xiàn)大量 CDllc+CD8+T細胞；在其峰值，這些細胞占總DLN細胞的將近22X (圖13禾P 14)。
通過細胞內(nèi)染色和ELISA，使用經(jīng)過帶有CIICDllc+CD8+T細胞剌激后的培養(yǎng)懸浮 液測定了 CDllc+CD8+T細胞產(chǎn)生的細胞因子。IFN-v是CDllc+CD8+T細胞產(chǎn)物中最豐富的。
8-5通過CDllc+CD8+T細胞繼承性轉(zhuǎn)移治療CIA 對CDllc+CD8+T細胞繼承性轉(zhuǎn)移是否可以抑制CII-特異性CD4+T細胞進行了測 定。由CII-免疫的和抗-4-1BB-處理的小鼠的DLN制備CDllc+CD8+T細胞和CDllc—CD8+T 細胞，并且通過對CII-免疫的和對照IgG-處理的小鼠純化得到CDllc—CD8+T細胞。這些細 胞被繼承性轉(zhuǎn)移到也在同一天接受了 CII免疫的新的DBA/1小鼠中。7天后，從每一組小 鼠中制備DLN中的CD4+T細胞并且在CII (50D/ml)存在或者不存在的情況下用y-照射抗 原提呈細胞(APCs)培養(yǎng)72小時。將脾臟切成小段并在II型膠原酶(lmg/ml ;Sigma)和 DNaseI (15D/ml ;Roche)存在下37。C孵育40min。引流淋巴結(jié)在lmg/ml膠原酶和5mM EDTA 存在下37t:孵育5min。制備單核細胞懸浮液并通過MACS分離柱(Miltenyi Biotec)分離 CDllc+CD8+T細胞。由于CDllc+CD8+T細胞對于CD4， F4/80, CD40和B220細胞為陰性，而常 規(guī)CDllc+DCs并不是(數(shù)據(jù)沒有顯示)，通過免疫磁性檢測CD4， F4/80, CD40和B220群體 而完成CDllc+CD8+T細胞的純化，所述CD4， F4/80, CD40和B220群體在含有這些分子抗體 的混合物中孵育。在一些實驗中，CD49b特異的DX5在混合物中孵育。陰性選擇細胞(DC—) 進一步和抗_鼠CDllc (N418)-微珠孵育并分成CDllc+CD8+和CDllc—細胞。上述步驟得到 的陰性細胞部分(CDllc—)與抗-鼠CD8 (Ly-2)微珠孵育并且通過MACS柱完成CDllc—CD8+細胞的分離。選擇的細胞群體的純度為87-90%。對于繼承性轉(zhuǎn)移，5Xl(f純化的細胞通 過靜脈注射轉(zhuǎn)移到DBA/1小鼠中。 在結(jié)果中，來源于小鼠的接受了 CDllc+CD8+T細胞的CD4+T細胞并沒有表明出CII 的增殖記憶應(yīng)答，而來源于小鼠的接受了 CDllc—CD8+T細胞的CD4+T細胞表現(xiàn)出正常的CII 的增殖記憶應(yīng)答(見圖16)。 然后對CDllc+CD8+T細胞繼承性轉(zhuǎn)移是否可以抑制CIA的發(fā)展進行了調(diào)查。制備來
源于抗-4-1BB-處理的小鼠的CDllc+CD8+T細胞或來源于抗-4-1BB-處理或者對照IgG-處
理的小鼠的CD1 lc—CD8+T細胞并且在PI第0， 10， 25和35天繼承性轉(zhuǎn)移到CII-免疫的DBA/1
小鼠中。CDllc+CD8+T細胞改善了 CIA的發(fā)展(P < 0. 001)(見圖17)。實施例9抗-IFN- y抵消了抗-4-lBB-介導(dǎo)的ID0和iN0S的誘導(dǎo)并且抑制CD4+T
細胞 由于CDllc+CD8+T細胞產(chǎn)生IFN- y ，對于IFN- y誘導(dǎo)效應(yīng)分子例如ID0和誘導(dǎo)一 氧化氮合成酶(iN0S)是否在DLN細胞產(chǎn)生進行了調(diào)查。ID0(吲哚胺2，3-加雙氧酶)表達 細胞控制了在妊娠期由母系T細胞發(fā)生的免疫反應(yīng)。 具體地，將CII+對照IgG和CII+抗-4-1BB用于小鼠，14天后，從用對照IgG處理 的小鼠中分離CD8+T細胞，CDllb+單核細胞和CDllc+DCs。從用CII和抗-4-1BB處理的小 鼠中分離CDllc—CD8+T細胞，CDllc+CD8+T細胞，CDllb+單核細胞和CDllc+DCs。從純化的細 胞中提取RNA并且使用IDO， iNOS和GAPDH-特異性引物進行RT-PCR。使用引物如下
〈IDO〉序列號5 :5' -CACTGTACCAGTGCAGTAG-3'(正義引物)
序列號6 :5' -ACCATTCACACACTCGTTAT-3'(反義引物)
〈iNOS〉序列號7 :5' -AAGTCAAATCCTACCAAAGTGA-3'(正義引物)
序列號8 :5' -CCATAATATGGTTGATGAACT-3'(反義引物)
〈GAPDH〉 序列號9 :5' -GAACGGGAAGCTTGTCATCAA-3'(正義引物)
序列號10 :5' -CTAAGCAGTTGGTGGTGCAG-3'(反義引物) 將處理的小鼠的脾臟切成小片并在II型膠原酶(lmg/ml ;Sigma)和DNaseI (15D/ ml ;Roche Biomedical,Mannhein，Germany)存在下37。C孵育40min。清洗后，使用抗CD-llb 免疫磁珠純化巨噬細胞并隨后在MACS柱(MiltenyiBiotec， Auburn, California)上分離。 對于分離的DCs，將細胞在抗CD-90微珠上孵育并在MACS上再次選擇。陰性選擇細胞群體 (CDllc+CD8-)進一步用抗CD-11微珠孵育，從而分離出CDllc+DCs。分離的巨噬細胞和DCs 的純度為87-90%。 在結(jié)果中，對照IgG處理的小鼠并不產(chǎn)生任何IDO和iNOS mRNA并且不同于IDO， iNOS在CDllc+CD8+T細胞中表達。IgG處理的對照小鼠的CDllc+DC低水平地表達IDO和 iN0S。然而，IDO和iNOS mRNA在CDllb+單核細胞和CDllc+DC中被強烈的誘導(dǎo)，而他們都 是用抗-4-1BB處理的(見圖18)。實施例10抗-IFN-y逆轉(zhuǎn)了抗-4-lBB-介導(dǎo)的IDO和iNOS的誘導(dǎo)并且抑制 CD4+T細胞
對于ID0和iN0S是否由IFN-y介導(dǎo)進行了檢測。用抗_IFN_ y結(jié)合IgG或者 抗-4-lBB處理CII-免疫的或者未免疫的小鼠。從每組小鼠的淋巴結(jié)中制備巨噬細胞和 DCs并檢測其IDO和iNOS mRNA的表達。 具體地，用CII免疫DBA/1誘導(dǎo)CIA，然后用對照IgG或者抗-4-1BB結(jié)合 抗-IFN-y處理小鼠。在PI第14天收獲DLN細胞中的CDllb+單核細胞并且使用從對照 IgG處理的CDllb+細胞中分離的每個RNA對IDO， iNOS和GAPD進行RT-PCR。對照IgG和 抗-IFN- y ，抗-4-1BB,抗-4-1BB和抗-IFN- y以及用抗-IFN- y處理的264個原始細胞 作為陽性對照。 結(jié)果表明抗-IFN- y Ab中和了抗-4-1BB-介導(dǎo)的IDO和iN0S，這表明抗_IFN_ y Ab 抑制CDllb+單核細胞中的IDO和iNOS的表達。 為了進一步明確IFN-y在抑制抗-4-1BB-處理的小鼠中CD4+T細胞對CII的應(yīng) 答，用CII免疫DBA/1誘導(dǎo)CIA，然后用對照IgG或者抗-4-lBB結(jié)合抗-IFN-y處理小鼠。 在PI第14天收獲總DLN細胞并在體外用CII剌激。 用BrdU滲入法測定CII-特異的CD4+T細胞。來源于抗_4_1BB-處理的小鼠的 CD4+T細胞在對CII應(yīng)答時并沒有增殖。當抗-IFN- y和抗-4-1BB —起給藥時，這種抑制 被逆轉(zhuǎn)。 這些數(shù)據(jù)表明由抗-4-lBB發(fā)揮的抗-關(guān)節(jié)炎效應(yīng)主要由IFN-y的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。 IFN- y看起來由CDllc+CD8+T細胞產(chǎn)生，所述CDllc+CD8+T細胞由抗-4-1BB和抗原引起膨 脹。 為了確定抗-IFN-y是否逆轉(zhuǎn)抗-4-1BB-介導(dǎo)CIA的抑制，將三組DBA/1小鼠用 CII免疫并用對照IgG，抗-4-1BB或者抗-4-1BB加抗-IFN- y處理。結(jié)果表明抗-IFN- y 中和了抗-4-1BB-介導(dǎo)的CIA的改善(見圖21)。實施例111-甲基色氨酸(1-MT)完全逆轉(zhuǎn)4-1BB-介導(dǎo)的CIA的抑制 由于施加抗-4-lBB可以誘導(dǎo)IDO，而IDO可以是IFN-y的分子效應(yīng)器，因此調(diào)查
了抗-4-1BB-介導(dǎo)的CD4+T細胞和CIA的抑制中是否包括IDO。 每只小鼠在PI第0， 2，4，6和8天腹腔注射200D純化的抗-4-1BB(3H3，鼠IgGl)， 抗-4-lBBL(TKS-l，鼠IgGl)，或者對照鼠IgG。通過測量抗-4-1BB的血清IFN-y水平檢測體 內(nèi)抗體的劑量應(yīng)答并且檢測了對抗-4-lBBL記憶應(yīng)答的抑制。當以每只小鼠150-200D的劑 量給予抗體時觀察到最大效應(yīng)。為了治療確診的CIA，在PI第28， 30， 32， 34和36天注射。 為了阻斷IFN- y ，對小鼠在PI第0， 4， 8和12天每隔4天腹腔注射500D純化的R4_6A2。再 次用鼠IgG作為對照。 為了抑制IDO的活性，在免疫前1天將混有l(wèi)-MT(10mg/天釋放率)或者安慰劑 (I皿ovativeResearch of America, Sarasota, Florida)的緩釋聚合顆粒由指背皮膚注人。 在一些實驗中，各含有210mg l-MT的兩種顆粒分別注入每只小鼠，并在21-天的周期內(nèi)提 供20mg/天的劑量。由于相對于小鼠的小體積，這些顆粒的尺寸大，又進行了另外的實驗， 即對每只小鼠注入兩種較小的顆粒(10mg/天釋放率)，每個含有120mg的1_MT，并在12-天 的周期內(nèi)提供20mg/天的劑量。在第13天，再次注入2粒顆粒，持續(xù)24天的總計量周期。
在結(jié)果中，1-MT 20mg/天的劑量完全逆轉(zhuǎn)了抗-4-lBB對CIA的抑制效果。由于用 5mg/天處理小鼠時的逆轉(zhuǎn)是不完全的，故而該逆轉(zhuǎn)是劑量_依賴型的。l-MT對3H3效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)被延遲；在1-MT處理的小鼠中，直到PI第48天，才可見該疾病的發(fā)生，而對照小鼠在 PI第30天就有該疾病的跡象。(見圖22)。 在這些實驗中，1-MT對抗-4-1BB抑制效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)導(dǎo)致這些小鼠表現(xiàn)出與同時處
理的對照小鼠一樣的CIA。實施例12毒性試驗 為了檢測抗-4-1BB抗體的細胞毒性，按下述方法進行實驗
方法 使用抗-4-1BB抗體對平均體重為108. 3-126的SPF Sprague-Dawley鼠 (Bopgenomi cs)的急性毒性進行測定。每組由5只小鼠組成，口服給予8000mg/kg的 抗-4-lBB抗體并觀察14天。這些試驗按照韓國食品藥品管理局發(fā)布的藥品安全性評估檢 測指南(通告號1999-61)和韓國食品藥品管理局發(fā)布的藥物非臨床研究優(yōu)良實驗室規(guī)范 法規(guī)(通告號2000-63)以及優(yōu)良實驗室規(guī)范的OECD原理實行。
結(jié)果 在使用8000mg/kg抗-4-lBB抗體的任何組或者每種性別中均沒有發(fā)現(xiàn)死亡率，臨 床體征，體重改變以及總數(shù)的治療相關(guān)效應(yīng)。這些結(jié)果表明本發(fā)明制備的復(fù)合物是有效并 安全的。 因此，將對制備方法和各種賦形劑進行描述，但是本發(fā)明并不限于此。典型的制備
實例描述如下 灃射劑制備 抗-4-1BB抗體lOOmg 偏重亞硫酸氫鈉3. Omg 苯甲酸甲脂O. 8mg 羥苯甲酸丙脂O. lmg 注射用蒸餾水適宜量 通過溶解活性物質(zhì)，控制pH在大約7. 5然后將所有組分填入2安瓿中，通過常規(guī) 注射制劑制備方法消毒以制備注射制劑。粉劑制備抗-4-1BB抗體500mg玉米淀粉lOOmg乳糖lOOmg滑石10mg通過混合上述組分并裝入密封包中制備粉末制劑。片劑制備抗-4-1BB抗體200mg玉米淀粉lOOmg乳糖lOOmg硬脂酸鎂適宜量通過混合上述組分并壓片制備片劑。膠囊制備
抗-4-1BB抗體lOOmg 乳糖50mg 玉米淀粉50mg 滑石2mg 硬脂酸鎂適宜量 通過混合上述組分并用常規(guī)的膠制備方法裝入膠質(zhì)膠囊中制備膠囊。 液體制備 抗-4-1BB抗體lOOmg 蔗糖加g 多糖20g 檸檬香料20g 通過溶解活性組分，然后將所有組分填入1000D安瓿中，通過常規(guī)液體制劑制備 方法消毒以制備液體制劑。 顯而易見，本發(fā)明如此的描述，可以以多種方式變化。這些變化不被認為背離本發(fā) 明的精神和范圍，并且這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯見的修飾包括在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍 內(nèi)。
權(quán)利要求
一種藥物組合物，包含有效量的抗4-1BB抗體作為活性成分，以及一種藥學(xué)上可接受的載體，所述抗4-1BB抗體通過CD11c+CD8+T細胞增殖和誘導(dǎo)CD4+T細胞抑制以預(yù)防和治療類風濕性關(guān)節(jié)炎疾病。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述組合物含有基于組合物總重量的大約 0. 01 50w/w^的抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l的藥物組合物，其中所述類風濕性關(guān)節(jié)炎疾病是膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎。
4. 抗-4-lBB抗體在制備治療和預(yù)防哺乳動物類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療藥物中的應(yīng)用， 所述哺乳動物包括需要的人。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物含有有效量的抗4-1BB抗體作為活性成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述抗4-1BB抗體通過CD11c+CD8+ T細胞的增殖和誘導(dǎo)CD4+ T細胞抑制以預(yù)防和治療類風濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的組合物在通常免疫應(yīng)答中無毒性并且可以通過誘導(dǎo)抗原特異性的免疫抑制顯著地減輕進行性，炎性的或者自體-免疫性關(guān)節(jié)炎癥狀。因此在預(yù)防或治療關(guān)節(jié)炎疾病上很有用，并且沒有副反應(yīng)。
文檔編號C07K16/28GK101720230SQ200580018787
公開日2010年6月2日 申請日期2005年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月9日
發(fā)明者權(quán)炳世 申請人:蔚山大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團